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UNIVERSIDAD DE NARIO

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES


DEPARTAMENTO DE BIOLOGA
BIOTECNOLOGA
Efecto del tipo de sustrato sobre la produccin de biomasa en Escherichia
coli y Saccharomyces cerevisiae.

Angela lvarez; Alfonso Bentez; Diego Jimnez; Daniel Pantoja

Introduccin.

La determinacin de la biomasa es una de las variables ms importantes en un bioproceso ya que


con la cuantificacin de esta, nos lleva a la comprensin de la eficiencia del mismo. Se trata de una
variable clave para establecer las tasas de produccin, de consumo de nutrientes y el clculo de los
balances de masa de cualquier proceso biolgico. Los mtodos clsicos de determinacin de
biomasa son mtodos directos que se basan en el nmero de clulas o en el peso celular. Los
mtodos de enumeracin celular son mtodos de observacin, basados en propiedades fsicas o en
la actividad biolgica (Arniz et al 2000).

La medida de la masa de los constituyentes de la clula bacteriana es utilizada frecuentemente


como base para la medida de una actividad metablica, o de un constituyente metablico o qumico
(Alberts 2004). se puede realizar esta medicin gracias a mtodos indirectos y mtodos directos los
cuales estn basados en tcnicas como la espectrofotometra que mira la existencia de la relacin
directa entre el nmero total de microorganismos presentes en una muestra y el valor de turbidez
(Stainier et al 1996), los mtodos microscpicos de recuento celular en cmaras un mtodo no muy
exacto debido a las irregularidades en la distribucin de la muestra (Gil 2013)y el mtodo
gravimtrico que mide la produccin de biomasa presente en una muestra en trminos de peso
seco por unidad de volumen, ya sea como slidos en suspensin totales (SST) o slidos en
suspensin voltiles (SSV);Las clulas se separan del lquido bien por centrifugacin o por
filtracin(Arniz et al 2000).

En el siguiente trabajo se evalu la produccin de biomasa tanto de Escherichia coli como tambin
de saccharomyces cerevisiae por medio del mtodo gravimtrico, bajo diferentes fuentes de
carbono y concentracin de sacarosa; se us la glucosa, importante monosacrido de seis carbonos
que es degradada por los organismos para ser aprovechada en forma de ATP, la galactosa y dos
disacridos tales como la sacarosa y la lactosa.

Objetivos

- Evaluar el efecto de la fuente de carbono en la produccin de biomasa de E.coli y Saccharomyces


cerevisiae en un sistema Batch.
-Evaluar la concentracin de sustrato en la produccin de biomasa de E.coli y S. cerevisiae en un
sistema batch

Materiales y mtodos

Efecto de la fuente de carbono sobre la produccin de biomasa

Se inoculo 10 mL de E.coli y S.cerevisiae en medios que contenan glucosa 20g/L (medio A), sacarosa
20g/L (medio B), lactosa20g/L (medio C), galactosa 20g/L (medio D); cada medio adems contena:
extracto de levadura 10g/L y peptona 20g/L. los inculos se incubaron a 30 0C por ocho das

Efecto de la concentracin de sustrato sobre la produccin de biomasa

Se inocularon 10mL de E.coli y S.cerevisiae en caldos de cultivo que contenan extracto de levadura
10g/L, peptona20g/L y sacarosa al 10%, 20%, 30% y 40% respectivamente; posteriormente se
dejaron ocho das en incubacin a 300C.

Determinacin de biomasa

Se pesaron 48 tubos eppendorf vacos y se rotularon, se transfirieron 20mL de los caldos en tubos
falcn de 50mL haciendo tres replicas, se centrifugaron por 5 minutos a 5000rpm, se elimin el
sobrenadante y se agreg 1mL de agua destilada al pellet se agit hasta desprender el botn y se
transfiri el contenido en cada tubo eppendorf, se centrifugaron a 5000 rpm por 5 minutos en
microcentrfuga se elimin el sobrenadante y el pellet se pes en hmedo; se realiz la diferencia
en cuanto el peso del tubo ms biomasa y tubo vaci, se promediaron las rplicas y se procedi a
realizar grficas para su posterior discusin.

Resultados y discusin

1. Tabla1. Efecto de la fuente de carbono sobre la produccin de biomasa

E.coli S. cerevisiae
Medio Prod. biomasa Medio Prod. biomasa
Glucosa 0,136g Glucosa 0,142g
Sacarosa 0,077g Sacarosa 0,071g
Lactosa 0,143g Lactosa 0,125g
Galactosa 0,071g Galactosa 0,087g

En la anterior tabla, respecto a la fuente de carbono sobre la produccin de biomasa, se puede


observar que los medios ms ptimos son la glucosa y la lactosa con valores decimales altos en el
rendimiento de la produccin como tal, se tiene en cuenta los dems resultados obtenidos en la
siguiente grfica, que se muestra a continuacin:
Produccion de Biomasa
0.16
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
glucosa sacarosa lactosa galactosa

E. coli S. sereviciae

Grafica 1. Produccin de biomasa en gramos, segn la fuente de carbono aplicada,


estudiada en E.coli y S. cerevisiae.
Como se puede observar en el anterior grfico, en trminos de rendimiento y eficiencia los medios
que ms produccin de biomasa aportaron en los experimentos fueron los enriquecidos con glucosa
y lactosa, tanto para E. coli con valores de 0.136 g para glucosa y 0.143 g para lactosa, mientras que
los otros dos medios de sacarosa y galactosa fueron casi iguales relativamente, encontrando valores
de 0.077 g para sacarosa y 0.071 para galactosa. Por otro lado para S. cerevisiae los valores de
glucosa y lactosa fueron de 0.142 g y 0.125 g respectivamente.

En comprensin a los resultados antes descritos se parte inicialmente de la composicin de las


clulas bacterianas, esto depende del tipo de bacteria. En la tabla 1.1 se muestra la composicin en
peso de Escherichia coli.

Tabla 1.1 Composicin elemental de Escherichia coli en base seca. Tomado de (Cuellas, 2007)
Como se puede observar el carbono es el elemento que representa el mayor porcentaje en peso de
una clula base seca y los elementos que constituyen su fuente de obtencin de energa para
cumplir sus funciones vitales de crecimiento (bajo la perspectiva del metabolismo) y reproduccin
estn compuestos de carbono principalmente, como es el caso de los medios con azucares utilizados
en este laboratorio; Aunque los valores observados en la anterior tabla corresponden solamente a
E. coli la composicin elemental de las bacterias no difieren mucho, como se indica a continuacin:
Tabla 1.2. Composicin elemental de biomasa para E.coli y S. cerevisiae.
Microorganismo Composicin elemental
SACCHAROMYCES CEREVISIAE CH1.82O0.58N0.16
ESCHERICHIA COLI CH1.94O0.52N0.25P0.025

Por lo anterior expuesto en trminos de composicin elemental de biomasa, se puede decir que
esta puede ser una causa del por qu los valores obtenidos en los 4 medios no distan mucho unos
de otros, as como tambin se tiene en cuenta que las rutas metablicas que puedan tomar ambos
microorganismos para el aprovechamiento de estos azucares puede diferir, por ejemplo, la sacarosa
es la fuente disacrida que menor biomasa produjo, segn Varela (2009) La habilidad para utilizar
sacarosa como nica fuente de carbono es un fenmeno altamente variable en diferentes bacterias
entricas. Ms del 90% de las cepas tipo silvestre de Klebsiella spp pero menos del 50% de E. coli.

La mayora de las bacterias entricas sacarosa positivas capturan y fosforilan la sacarosa va un


sistema fosfotrasnferasa (PTS) especfico, el cual genera sacarosa-6-fosfato intracelular que
posteriormente es hidrolizado por una sacarosa-6-fosfato hidrolasa en D-glucosa-6-fosfato y D-
fructosa, esta ltima es fosforilada por una fructokinasa dependiente de ATP. Las cepas de E. coli
son capaces de utilizar sacarosa; sin embargo la captura y metabolismo de la sacarosa en estas cepas
es un sistema no dependiente de PTS en su lugar la sacarosa es transportada al interior de la clula
por una protena tipo simporter sacarosa, lo que genera un bajo rendimiento metablico en estos
microorganismos (Forero y Snchez 2008).

2. Efecto de la concentracin de sustrato sobre la produccin de biomasa

E.coli S. cerevisiae
concentracin Prod. biomasa Medio Prod. biomasa
Sacarosa 10% 0,191g Sacarosa 10% 0,212g
Sacarosa 20% 0,147g Sacarosa 20% 0,168g
Sacarosa 30% 0,256g Sacarosa 30% 0,195g
Sacarosa 40% 0,302g Sacarosa 40% 0,147g

En la anterior tabla, se puede observar que la mayor produccin de biomasa se da en la


concentracin de 40% de sacarosa con una produccin de 0.302 g para E. coli, mientras que para s.
cerevisiae la mayor produccin de biomasa se da en 10% de sacarosa con una produccin de 0.212
g, se tiene en cuenta que los dems valores fueron altos en el sentido del rendimiento del sistema
aplicado (tipo batch).
Una posible explicacin del por qu las diferencias en las concentraciones de sacarosa al 40% en e.
coli y al 10% en s. cerevisiae, puede deberse a las rutas metablicas implicadas entre un
microorganismo y otro, para empezar la ruta metablica de la sacarosa en E. coli cumple un tipo de
fermentacin Formica o acido mixta (Puerta, 2010), en donde a partir de la glucosa Escherichia coli
produce etanol, acido succnico, lctico, actico, formico y gases H2 y CO2, Las bio-reacciones
enzimticas que se llevan a cabo en clulas como la cepa Escherichia coli, requieren la regeneracin
in situ del cofactor (NADPH) . Un factor importante en el crecimiento celular. De esta manera se ha
encontrado que comparando dos fuentes de carbono (glucosa y glicerol), hubo una diferencia
significativa en la biomasa, as lo reportaron Anzurez, Et al (2011).

Por otra parte la ruta metablica que sigue S. cerevisiae corresponde a un tipo de fermentacin
alcohlica que produce etanol y CO2. Cuando hay oxigeno las levaduras realizan la respiracin,
crecen, oxidan completamente la glucosa y as obtienen el ATP, pero en condiciones de anaerobiosis
estos microorganismos fermentan azucares, como la glucosa y algunas la lactosa mayormente; as
la glucosa se transforma en acido pirvico, siguiendo la secuencia de reacciones de la glucolisis.
(Puerta, 2010) Desde el punto de vista funcional algunas caractersticas importantes en las cepas de
levadura son: capacidad de flocular, capacidad de producir alcohol, tolerancia al alcohol, tolerancia
a las altas temperaturas, capacidad y vigor en la fermentacin de azucares, esto se ve evidenciado
en la poca produccin de biomasa en contraste con E. coli.

Finalmente para que una poblacin bacteriana crezca en un determinado medio, se debe dar
nutrientes al sistema que respeten las frmulas promedio de las bacterias. Los elementos traza son
tambin necesarios, por esta razn suele agregarse al medio de cultivo extracto de levadura
(bacterias muertas que contienen todos los elementos que garantizan el crecimiento celular), tal
como ocurri en este laboratorio al lado de la pectona. (Cuellas, 2007)
Conclusiones.

- El efecto de la fuente de carbono sobre la produccin neta de biomasa est estrechamente


relacionado con la biomasa en base seca, Se asume que el microorganismo crece usando
una fuente de carbn y una fuente de nitrgeno, la cual puede contener carbn, y produce
biomasa y productos conteniendo carbn y nitrgeno. La biomasa es una copia exacta del
organismo, es decir con la misma composicin elemental. Adems, durante el crecimiento se
intercambian con el medio ambiente bixido de carbono (C02), agua (H20) y oxgeno.
- Respecto al efecto de la concentracin de sustrato sobre la produccin de biomasa, la
concentracin cambia entre los microorganismos utilizados, vindose implicadas
principalmente las rutas metablicas y como estas varan de un microorganismo a otro.

Bibliografa.

Anzurez, M., Torres, R ., Huerta, S. 2011. Universidad Autnoma. Metropolitana Unidad-


Iztapalapa, Departamento de Biotecnologa, Mxico, Distrito Federal, C.P. 09340
Determinacin de la biomasa en procesos biolgicos. Carmen Arniz, Laura Isac y Julin
Lebrato. 2000.
Biologa molecular de la celula. Bruce Alberts; Omega, 2004
Microbiologia. Roger Y. Stanier y Julio R. Villanueva; Reverte, 1996
Cultivo de clulas animales y humanas. Aplicaciones en medicina regenerativa. Pablo E.
Gil-Loyzaga; Editorial Visin Libros, Feb 1, 2013
Cuellas A. Biorreactores Teora. Ingeniera de alimentos. Universdidad Nacional de Quilmes.
2007
Forero A y Snchez S. 2008. Represin catablica por carbono de Bacterias Gram-negativas.
Instituto de Investigaciones Biomedicas. Universidad Nacional Autnoma de Mxico.
Puerta G. fundamento del proceso de fermentacin en el beneficio del caf. Programa de
investigacin cientfica. Fondo Nacional del caf. 2010
Varela G. 2009. Fisiologa y metabolismo microbiano. Sociedad Argentina de Investigacin
Clnica.