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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE 1

FACULDADE DE FARMCIA - MAF


LABORATRIO DE TOXICOLOGIA
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LABORATRIO DE TOXICOLOGIA

SUMRIO

Prticas Pgina
03
Extrao e identificao de frmacos cidos e neutros
04
Extrao e identificao de frmacos bsicos e neutros
Extrao e identificao de inseticidas por CCD 06
Avaliao de ALA na urina 07
10
cido Hiprico
11
Metemoglobinas
Dapsona 13
15
Nitrato e Nitrito
18
Avaliao da colinesterase em soro/plasma
21
Fenobarbital
23
Ensaios Toxicogenticos (Microncleo)
25
Ensaios Toxicogenticos (Ames)
27
Reagentes
28
Modelo de relatrio
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Roteiro de Aula Prtica Mdulos 1 e 2 (extrao e TLC)

Extrao e identificao de frmacos de carter cido e neutro em urina

1) Preparao da soluo padro (1mg / mL em metanol)


cido saliclico
Sulfametoxazol
Fenobarbital
Diazepam
2) Preparao da amostra fortificada
- Acrescentar 50L de cada soluo padro a 5mL de urina (concentrao final = 10g/mL).

3) Ativao das placas de CCD


- Cortar 3 placas de CCD ( 10 x 4 cm) e ativar em estufa a 110 C por 1 hora.

3) Procedimento de extrao das urinas (branco e amostra fortificada)


- Aliquotar 5 mL da amostra de urina para tubo de centrfuga
- Ajustar o pH para 3,5 com gotas de soluo de HCl ou H2SO4
- Adicionar 100 mg de NaCl e agitar no vrtex para dissolver o sal
- Acrescentar 5 mL de ter e tampar o tubo.
- Misturar por inverso os tubos durante 15 min.
- Centrifugar (3000rpm por 10 min) (verificar se as fases esto bem separadas)
- Transferir o sobrenadante para um bcher de 10 mL
- Evaporar o solvente no banho-maria a 45C , sob leve corrente de ar, para obteno do
resduo seco.

4) Procedimento de identificao por CCD


- Ressuspender o resduo obtido da evaporao do solvente com 100L de metanol
- Aplicar o resduo (10 vezes com capilar, no mesmo ponto de aplicao), do branco e da
amostra fortificada.
- Aplicar 10 microlitros da soluo padro, conforme o esquema abaixo.

A
A BB CC
m
pa
ze
dia

- Sistema solvente de desenvolvimento Placa A = acetato de etila:metanol:amnia (8,5:1:0,5)


Placas B e C = clorofrmio:acetona (8:2)
- Aps o desenvolvimento, secar a placa na capela por 5 minutos, sob corrente de ar.
- Localizar as manchas examinando a placa sob luz ultravioleta (254nm e 366 nm)
- Reagentes cromognicos Placa A = Soluo de cloreto frrico, seguido de Dragendorff
Placa B = Soluo de nitrato mercuroso
Placa C = Soluo de p-dimetilaminobenzaldedo (PAB)
- Anote todos os resultados e calcule os Rfs.
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Roteiro de Aula Prtica Mdulos 1 e 2 (extrao e TLC)

Extrao e identificao de frmacos de carter bsico e neutro em urina

1) Preparao da soluo padro (soluo metanlica a 1mg/mL)


Clorpromazina
Amitriptilina
4-N-metilaminoantipirina (MAA) produto de hidrlise cida da dipirona
Diazepam

2) Preparao da amostra fortificada


Amostra A = acrescentar 50L da soluo padro de clorpromazina e MAA a 5mL de urina
(concentrao final = 10g/mL).
Amostra B = acrescentar 50L da soluo padro de amitriptilina e diazepam a 5mL de urina
(concentrao final = 10g/mL

3) NaOH 5M.

4) Ativao das placas de CCD


- Cortar 2 placas de CCD ( 10 x 5 cm) e ativar em estufa a 110 C por 1 hora.
- A placa B dever ser previamente nebulizada com soluo de KOH 1% em metanol, seca e ento
ativada.

5) Procedimento de extrao das urinas (branco e amostra fortificada)


- Aliquotar 5 mL da amostra de urina para tubo de centrfuga
- Alcalinizar a amostra com 3 gotas da soluo de NaOH 5M (~pH 11,5)
- Acrescentar 5mL do solvente extrator diclorometano:isopropanol (9:1); tampar o tubo.
- Misturar por inverso durante 15 minutos.
- Centrifugar (3000rpm por 10 min) (verificar se as fases esto bem separadas)
- Descartar o aquoso e transferir o solvente para um pequeno becher, filtrando sobre papel de filtro
previamente umedecido com diclorometano
- Evaporar no banho-maria a 45C na capela, sob leve corrente de ar, para obteno do resduo seco.

6) Procedimento de identificao por CCD (placa alcalina)


- Ressuspender o resduo obtido da evaporao do solvente com 100L de metanol
- Aplicar o resduo (10 vezes com capilar, no mesmo ponto de aplicao), do branco e da amostra
fortificada.
- Aplicar 10 microlitros da soluo padro, conforme o esquema abaixo.
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- Sistema solvente de desenvolvimento: Placa A - metanol:amnia (10 : 0,15)


Placa B clorofrmio:metanol (90:10)
- Aps o desenvolvimento, secar a placa na capela por 5 min, sob corrente de ar
- Localizar as manchas examinando a placa sob luz ultravioleta (254nm)
- Reagente cromognico Placa A: reagente FPN e, depois, reagente de Dragendorff
Placa B: soluo de Iodo Platinado acidificada
- Anote os resultados e calcule o Rf.
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Roteiro de Aula Prtica Mdulos 1 e 2 (extrao e TLC)

Extrao e identificao de inseticidas

1) Preparao da soluo padro (soluo em acetato de etila a 1mg/mL)


aldicarb
metilparation

2) Preparao da amostra fortificada


Preparar arroz cozido apenas em gua. Fortificar uma poro do arroz com preparaes comerciais dos
inseticidas (um ou ambos).

3) Ativao das placas de CCD


- Cortar 1 placa de CCD ( 10 x 7 cm)

4) Procedimento de extrao (branco de matriz e matriz fortificada)


- Com auxlio de uma esptula, transferir uma alquota da amostra para dois tubos de centrfuga (at
mais ou menos a altura que corresponde a 2 mL).
- Adicionar a um tubo 5mL de acetonitrila e a outro 5 mL de ter de petrleo ou hexano.
- Misturar por inverso durante 15 minutos.
- Centrifugar (3000rpm por 10 min) (verificar se as fases esto bem separadas)
- Transferir o solvente para um pequeno bcher
- Evaporar no banho-maria a 45C na capela, sob leve corrente de ar, para obteno do resduo seco.

5) Procedimento de identificao por CCD


- Ressuspender os resduos obtidos da evaporao do solvente com 100L de acetona.
- Aplicar os resduos na placa (10 vezes com capilar, no mesmo ponto de aplicao), do branco e da
amostra fortificada.
- Aplicar 10 microlitros da soluo padro, conforme o esquema abaixo
2
co 2
tion
arb
co

stra

stra
Bran

Aldic
para

Bran
Amo

Amo
Metil

- Sistema solvente de desenvolvimento: Placas A = Hexano:acetona 8:2


- Aps o desenvolvimento, secar a placa na capela por 5 min, sob corrente de ar
- Localizar as manchas examinando a placa sob luz ultravioleta (254nm)
- Aplicar o reagente cromognico soluo de cloreto de paldio
- Anote os resultados e calcule o Rf.
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Roteiro de Aula Prtica Mdulo 3 (aplicao da colorimetria na anlise toxicolgica)

Avaliao do cido aminolevulnico em urina (ALA-U)

Material:

1. Espectrofotmetro para a regio do visvel (553nm)


2. Soluo-estoque de ALA
Em balo volumtrico de 100mL, dissolver 6,4 mg de cloridrato de ALA e completar volume (concentrao
final de 50mg/L). Essa soluo estvel por mais de 2 meses quando refrigerada e protegida da luz.

Curca de calibrao em gua:


Separar 5 bales volumtricos de 10mL. Em cada balo adicionar, respectivamente, os seguintes volumes de
soluo-estoque de ALA: 0,1 0,2 0,5 1 2 mL. Avolumar com gua destilada. Concentraes obtidas:
0,5 1 2,5 5 e 10 mg/L.

3. Tampo acetato, pH 4,6.


Em balo volumtrico de 1L, dissolver 136g de acetato de sdio triidratado em 700mL de gua destilada e
adicionar 57 mL de cido actico glacial. Completar volume.

4. Reativo de EHRLICH modificado (preparado no dia da utilizao)


Em balo volumtrico de 25 mL, dissolver 0,5g de p-dimetilaminobenzaldedo em cerca de 15 mL de cido
actico glacial. Adicionar 2,5 mL de HClO4 60% e 2,5 mL de gua destilada. Completar volume com cido
actico.

5. Acetato de etila e acetoacetato de etila

Procedimento para o GRUPO A (preparo da amostra e do branco)


1. Colocar em cada um de dois tubos de ensaio, 1mL de urina e 1mL de tampo acetato. Rotular um tubo
como amostra e outro como branco.
2. Adicionar 0,2 mL de acetoacetato de etila no tubo da amostra e agitar por 5 segundos.
3. Manter os tubos em banho de gua fervente durante 10 minutos.
4. Esfriar e adicionar 3ml de acetato de etila aos dois tubos: agitar manualmente (aprox. 50 inverses).
5. Centrifugar a 2000 rpm/4 min, se necessrio, e transferir a camada orgnica superior para outro tubo
(tanto o branco quanto a amostra).
6. Adicionar 2 mL de reativo de EHRLICH a cada tubo e misturar. AGUARDAR 10 minutos, at que a
reao se complete.
7. Determinar a absorvncia, usando o branco para zerar o equipamento.

Procedimento para o GRUPO B (preparo da curva de calibrao). Preparar em duplicata.


1. Colocar no tubo de ensaio, 1mL de cada soluo de ALA preparada de acordo com a tabela acima.
2. Adicionar 1 mL de tampo acetato.
3. Adicionar 0,2 mL de acetoacetato de etila e agitar por 5 segundos.
4. Manter os tubos em banho de gua fervente durante 10 minutos.
5. Esfriar e adicionar 3ml de acetato de etila aos dois tubos: agitar manualmente (aprox. 50 inverses).
6. Centrifugar a 2000 rpm/4 min, se necessrio, e transferir a camada orgnica superior para outro tubo.
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7. Adicionar 2mL de reativo de EHRLICH a cada tubo e misturar. AGUARDAR 10 minutos at que a reao
se complete.
8. Enquanto isso, preparar branco de reagentes misturando 3mL de acetato de etila com 2mL de reativo
de EHRLICH. Zerar o equipamento com o branco de reagentes.
9. Determinar a absorvncia das duplicatas de cada concentrao, iniciando pela concentrao mais baixa.
10. Construir a curva de calibrao (absorvncia x concentrao de ALA) usando planilha EXCEL. Obter
equao da reta atravs de regresso linear.

Procedimento para o GRUPO C (dosagem da creatinina) (KIT LABTEST)


1. Fazer a diluio prvia da amostra misturando 0,2mL de urina com 4,8 mL de gua destilada
2. Tomar 3 tubos de ensaio e proceder como descrito no quadro 1.
Quadro 1. Esquema analtico para a dosagem da creatinina.
Branco Teste Padro
Tampo 2 mL 2 mL 2 mL
Amostra 0,25 mL
Agua deionizada 0,25 mL
Padro 0,25 mL
cido pcrico 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL
Misturar e incubar em banho-maria a 37C durante 10 minutos
Selecionar o comprimento de onda do espectrofotmetro para 510nm e zerar o aparelho com o
branco.
Determinar a absorvncia do teste (A1) e do padro.
Acidificante (colocado na cubeta) 0,1 mL 0,1 mL
Homogeneizar e deixar temperatura ambiente por 5 minutos
Zerar o equipamento com o branco e determinar a absorvncia do teste (A2)

3. Calcular a concentrao de creatinina urinria atravs da frmula:


4. Creatinina (mg/dL) = 4 x [(A1 A2) / Abs padro ] x 25

Para todos os grupos:


Calcular a concentrao de ALA na amostra com auxlio da curva de calibrao.

mg/L ALA
= mg ALA/g creatinina Valor de referncia (NR-7): at 4,5mg/g creatinina
g/L creatinina

Baseado em: Tomokuni, K; Ogata, M. Simple Method for Determination of Urinary -aminoleculinic acid as
na Index of Lead Exposure. Clinical Chemistry, v. 18: 1534 36, 1972.
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Mecanismo da reao:

O OCH2CH3 O OCH2CH3
C C HOOCCH2CH2 O
OH CH2CH2COOH
CH2 CH
CH2

CH3 O H3C OH H2N H NH2

ACETOACETATO DE ETILA ACIDO -AMINOLEVULNICO

H2O

CH3CH2O C CH2CH2COOH

H3C N
H

CIDO 2-METIL-3-CARBETOXI-4-PROPIONICOPINOL

H
N(CH3)2
O

p-DIMETILAMINOBENZALDEDO
OCH2CH3

O C CH2CH2COOH

H3C C N(CH3)2
N H
H

Complexo vermelho
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Roteiro de Aula Prtica Mdulo 3 (aplicao da colorimetria na anlise toxicolgica)

Avaliao do cido hiprico urinrio no diagnstico do uso abusivo de tolueno

Princpio do mtodo:
O cido hiprico reage com o cloreto de benzenosulfonila, na presena de piridina, formando um composto
rseo-avermelhado, de max = 410nm, cuja intensidade de colorao proporcional concentrao de cido
hiprico presente na amostra.
O O
+
S O
Cl -
O
O
OH
N N
H
O

N
cido hiprico
Material:
1. cido hiprico
2. Cloreto de benzenosulfonila (cuidado; corrosivo trabalhar com culos de proteo e luvas, na capela e
adicionar lentamente ao tubo escorrendo pelas paredes do tubo).
3. Piridina (cuidado: odor pungente, cancergeno - trabalhar na capela, com luvas e culos de proteo).

Curva de calibrao em gua (0,25 a 2,5 mg/mL):


Soluo estoque a 2,5mg/mL: pesar 62,5 mg de cido hiprico em um becker e adicionar 20 mL de gua
deionizada (para auxiliar na dissoluo, coloque o becker no ultra-som com gua aquecida a 50C). Deixe
esfriar, e transfira quantitativamente para balo volumtrico de 25 mL, avolumando com gua deionizada.
Preparar diluies da soluo estoque em gua nas seguintes concentraes: 0,25, 0,5, 1, 1,5, 2 e 2,5
mg/mL.

Quadro 1. Esquema analtico para dosagem do cido hiprico:


Amostra / reagente Tubo da amostra Tubo da curva de Tubo do branco de
ml calibrao reagentes
Urina 0,2 - -
Soluo de calibrao - 0,2 -
Piridina 0,5 0,5 0,5
CBS 0,2 0,2 0,2
gua destilada 2 2 2,2
Aguardar de 5 10 minutos

Tabela 1. Valores de absorvncia obtidos para a curva de calibrao.


mg/mL Absorvncia
Concentrao de cido hiprico na amostra (mg/mL):
2,5
2
Concentrao de creatinina (mg/dL):
1,5
1
Resultado final:
0,5
0,25
Interpretao: valor de referncia: at 1,5 g/g creatinina
I.B.M.P (NR-7): at 2,5 g/ g creatinina
Baseado em Yoshida, M. et al. Simple colorimetric semiquantitation method of hippuric acid in urine for
demonstration of toluene abuse. Legal Medicine, v. 7: 198 200, 2005.
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Roteiro de Aula Prtica Mdulos 3 (espectrofotometria no visvel)

Dosagem de Metemoglobina

A oxidao do ferro contido na hemoglobina para a forma frrica inviabiliza a ligao da hemoglobina com o
oxignio. Vrias substncias qumicas so capazes de promover essa converso, entre elas: medicamentos
(antipirina, dapsona, metoclopramida, anestsicos locais), conservantes de alimentos (nitratos, nitritos e
cloratos), e agentes como anilina, nitrobenzeno, hidrazinas, polifenis. Algumas patologias esto associadas
com aumento de metemoglobina (hemoglobinose M e indivduos deficientes de glicose-6-P desidrogenase ou
de NADH diaforase).

Princpio do mtodo: o percentual de globinas na forma de metemoglobina (MetHb) avaliado atravs da


diferena de absorvncia obtida com a converso da MetHb existente (A1) cianometemoglobina (A3). O
total de globinas avaliado depois de sua converso metemoglobina (A 2) e posteriormente
cianometemoglobina A4). Obs.: a absoro mxima da metemoglobina ocorre a 632 nm.

0,8 mL de sangue heparinizado


em tubo de centrfuga

2,2 mL de gua destilada


1 mL de soluo tampo fosfato
1 gota de TRITON X-100
Centrifugar a 4.000 rpm/30 min

2,4 mL sobrenadante 0,2 mL


+ 2,2 mL reativo
ferricianeto-fosfato
A1 Ler as absorvncias a 632 nm (A1 e A2) A2

Adicionar 80 L reativo cianeto

Aguardar 1 minuto

A3 Ler as absorvncias a 632 nm (A3 e A4) A4

% Metemoglobina = 100 x A1 A3
(A2 A4) x 12

Valor de referncia (NR-7): < 2%

Solues
A. Soluo de ferricianeto de potssio a 5%
B. Soluo tampo fosfato 0,5 M pH 7,2 (juntar 10 mL de soluo 0,5 M de NaH 2PO4 com
7 mL soluo de NaOH 0,5 M).

Reativo de ferricianeto-fosfato: em tubo de ensaio graduado misturar 0,2 mL de soluo A


com 2,5 mL de soluo B e completar volume q.s.p. 10 mL com gua destilada (preparo
dirio).
C. Soluo de cianeto de sdio a 10% (preparo recente)
D. Soluo de cido actico a 12%
Reativo cianeto: em tubo de ensaio misturar 1 mL da soluo C com 0,9 mL da soluo D.
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Figura 1. Diferentes espectros de absoro com comprimento de ondas especficos (nm) de


oxiemoglobina, deoxiemoglobina, metemoglobina e cianometemoglobina.
Fonte: Naoum, P.C. et al. Revista Brasileira de Hematologia e Hemoterapia, v. 26(1): 19 - 22, 2004.

Referncia da metodologia :
Hegesh, E. et al. Clin. Chim. Acta, v. 30: 679 82, 1970.
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Roteiro de Aula Prtica Mdulo 3 (espectrofotometria no visvel)

Determinao da Dapsona no plasma / soro

A dapsona um frmaco quimioterpico empregado principalmente no


tratamento da hansenase e na preveno da infeco respiratria por P. carinii
em pacientes aidticos e crianas com leucemia linfoblstica aguda. Principais
produtos de bioativao: monoacetildapsona (ADDS) e mono-N-hidroxidapsona
(NHDDS). Ela tambm atua sobre o P. falciparum sendo indicada na profilaxia da
malria
Os efeitos adversos so mais comuns em concentraes plasmticas superiores a 0,01 mg / mL e incluem
anemia hemoltica e formao de metemoglobina. Reaes de hipersensibilidade cutnea podem estar
presentes em at 17% dos pacientes. Esto sob risco maior os indivduos deficientes de NADH-citocromo
b5-redutase (heterozigotos) que podem chegar a mais de 10% de MetHb em 3 10 semanas de tratamento.
A avaliao dos nveis plasmticos de dapsona til para o diagnstico da intoxicao medicamentosa e para
ajuste da dose. Nveis teraputicos: 0,5 5 g/mL.

Princpio do mtodo:
A dapsona, em meio cido, forma um complexo colorido com o PAB.

Procedimento:
1. Soluo padro de DDS 1mg/mL Pesar 0,01g de DDS e dissolver em etanol absoluto utilizando balo
volumtrico de 10mL. Acondicionar a soluo em vidro mbar e conservar em geladeira.
2. Curva de calibrao em plasma ou soro.
Transferir quatro alquotas (0,01, 0,02, 0,04 e 0,06mL) da soluo padro de DDS para quatro tubos de
centrfuga. Evaporar o solvente e acrescentar 2 mL de plasma. Levar ao vortex por 1 minuto. Fazer cada
concentrao em triplicata. Em paralelo, separar 2 mL de plasma para o branco.
3. Reativo de Ehrlich
Pesar 3 g de 4-dimetilaminobenzaldedo (PAB) e diluir em etanol absoluto. Completar ao volume para 100mL.
Acondicionar em vidro mbar e conservar sob refrigerao.
4. Seguir o procedimento analtico esquematizado abaixo.

2mL de plasma ou soro

2 gotas de soluo KOH 6% (para obter pH 10 11)


10 mL de CHCl3
Agitar muito lentamente por 10 minutos, e centrifugar a 4000 rpm/10min

Fase aquosa Fase orgnica

Filtrar
desprezar
5 mL de HCl 3N / agitar lentamente por 10
minutos e centrifugar a 4000 rpm/10 min

Fase orgnica Fase aquosa


(4 mL)
desprezar 2 mL etanol absoluto
2 mL de reativo Ehrlich
Agitar por 20 s
Ler absorvncia a 470 nm
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5. Montar uma planilha Excel com os resultados (absorvncia x concentrao). Obter a


equao da curva de calibrao atravs de regresso linear.

Avaliao da recuperao (exatido):

Tomar duas alquotas de soluo padro (0,010 e 0,040) e colocar cada uma em um tubo de
centrfuga. Fazer triplicata desse procedimento. Adicionar 4 mL de HCl 3N em cada tubo.
Homogeneizar. Adicionar 2mL de etanol absoluto e 2 mL de reativo de Ehrlich. Agitar por
20 segundos e ler a absorvncia. Obter a mdia dos valores de absorvncia (M2). Construir
a curva de calibrao (Absorvncia x microgramas dapsona).

Obter a mdia dos valores de absorvncia obtidos para anlise de plasma fortificado a
10g/mL. Anotar o valor de absorvncia correspondente (A1). Avaliar a massa de dapsona
correspondente a essa absorvncia utilizando a curva Abs x massa dapsona [M1].

M1 = massa de dapsona realmente extrada


M2 = massa de dapsona teoricamente extrada [(10 g x 2) x 4/5]
Clculo de rendimento %: [M1 / M2] x 100

Avaliao da preciso intra-srie:


Calcular o Coeficiente de Variao (CV) dos resultados para cada concentrao da curva de
calibrao atravs da formula:
CV% = (desvio-padro / mdia) x 100

Como voc estudaria a especificidade/ seletividade ?

A tcnica tem sensibilidade adequada para monitorar concentraes txicas de DDS ?

Como voc avaliaria a linearidade desse mtodo?

Baseado em:
Revista Brasileira de Cincias Farmacuticas, (SP), v. 25, n. 2, p. 177-178, 1989.
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Roteiro de Aula Prtica Mdulo 4 (aplicao da enzimologia na anlise toxicolgica)

Dosagem de nitrito e nitrato em alimento


Nitratos e nitritos so usualmente empregados como conservantes para alimentos. Quando ingerido pelo
homem, o nitrato sofre ao da flora microbiana sendo reduzido a nitrito. Por reagir com aminas e amidas
presentes no meio, os nitritos geram nitrosaminas e nitrosamidas, sabidamente carcinognicas,
mutagnicas e teratognicas. O nitrito tambm interage com a oxiemoglobina, oxidando o ferro e gerando
aumento nas taxas de metemoglobina segundo a reao: 2 O2Fe2+ + 3NO2- + 2H+ = 2Fe3+ + 3NO3- + H2O.

Princpio do mtodo: O nitrito quantificado por reao com o Reagente de Griess, formando um
composto rseo-violeta, com max = 540 nm. O nitrato quantificado como nitrito aps ser reduzido pelo
vandio trivalente. A diferena entre as duas dosagens expressa a concentrao real de nitrato presente
na amostra.

Mecanismo da reao de Griess

Preparo de solues e reagentes:

1. Soluo estoque de Nitrato e de Nitrito a 1mg/mL Pesar 0,050g de nitrato ou nitrito de sdio e
dissolver em gua destilada utilizando balo volumtrico de 50mL. Armazenar por no mximo duas semanas.

2. Solues de trabalho (A. B e C) de nitrato e nitrito: em bales volumtricos de 100 mL diluir os seguintes
volumes das solues estoque: Soluo A: 5 mL ; Soluo B: 1 mL ; Soluo C: 0,1 mL

3. Reagente de Griess (dosagem do nitrito)


Pesar 200 mg de sulfanilamida e 10 mg de N-(1-naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride (NEED)
e dissolver em 150 mL de HCl 1M. Armazenar em vidro mbar e conservar sob refrigerao por no
mximo um ms.

4. Reagente de Griess com redutor (dosagem do nitrato):


Pesar 400 mg de VCl3 (pesar em capela de exausto) e diluir com 50 mL de HCl 1M. Pesar 200 mg
de sulfanilamida e 10 mg de (NEED) e dissolver em 100 mL de HCl 1M. Misturar as duas solues.
Armazenar em vidro mbar e conservar sob refrigerao por no mximo um ms.

5. Curva de calibrao do nitrito. Preparar triplicata de cada concentrao. Em tubos de ensaio adicionar os
seguintes volumes de soluo de nitrito, gua destilada e reagente de Griess.
Massa de nitrito Soluo de trabalho gua destilada Reagente de Griess
(g) (mL) (mL)
Branco de reagentes - 1 1
0,25 250 L da soluo C 0,75 1
0,5 50 L da soluo B 0,95 1
1 100 L da Soluo B 0,90 1
2,5 50 L da Soluo A 0,95 1
5 100 L da Soluo A 0,90 1
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6. Montar uma planilha Excel com os resultados (absorvncias x massas). Obter as equao
da curva de calibrao atravs de regresso linear.

7. Preparo da amostra:

Pesar cerca de 10 g de lingia triturada

- 70 ml de gua destilada
- Banho-maria de 80 C por 35 min
- Esperar esfriar
- Transferir para um balo volumtrico de 250 mL
- Lavar o bquer com 30 mL de gua destilada quente
e juntar ao balo
- 2 mL da soluo de ferrocianeto de potssio a 15%
- 2 mL da soluo de sulfato de zinco a 30%
- Completar volume com gua destilada
- Esperar 5 minutos
- Filtrar em papel pregueado Whatmann n 4

Filtrado

250 L 250 L

Adicionar 750 L de gua destilada

Nitrato Nitrito

- 1mL do reagente de Griess - 1mL do reagente de Griess


com VCl3 sem VCl3
- Aquecer a 48,5C por 70 min - Aguardar 15 min

Ler absorvncia a 540 nm Ler absorvncia a 540 nm


(nitritos totais = nitrato + nitrito) (nitrito real na amostra)

8. Calcular a massa de nitrito presente nas alquotas atravs da equao da curva de calibrao.

9. Calcular a concentrao de nitrato levando em considerao que:


a) Nitritos totais nitrito real = nitrito que veio do nitrato
b) 5 mg de nitrato geram 4 mg de nitrito aps a reduo
c) a massa de nitrito estava contida em 250 mL; uma alquota mil vezes menor foi tomada para o
ensaio (250 L); ento a massa obtida deve ser multiplicada por 1000;
d) a seguir, a massa encontrada estava na quantidade pesada de lingia, ento faa uma regra de
trs para saber quanto teria em 1000g (Kg) da amostra.
e) a concentrao de nitrito deve ser expressa em mg/Kg (ppm).

10. Comparar os valores mximos permitidos pelo Ministrio da Sade e da Agricultura descritos
no D.O.U, Braslia, 28 de junho de 1976, p. 8904: 500 ppm para nitrato e 200 ppm para nitrito. O
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Ministrio da Sade, atravs da Portaria n 1004, de 11 de Dezembro de 1998, reduziu esses


limites para 150 ppm de nitrito e 300 ppm de nitrato

Referncias bibliogrficas:
1. Doane T. A. e Horwth W. R. Analytical Letters, v. 36, n. 12, p. 27132722, 2003.
2. Miranda K. M., Espey M. G. e Wink D. A. Nitric Oxide: Biology and Chemistry , v. 5, n. 1, p. 6271, 2001.
3. Governo do Brasil. Ministrio da Agricultura. Instruo Normativa n 20, de 21/07/1999.
4. Rodkey, F. L. Clinical Chemistry, v. 22, n. 12, p. 1986 1990, 1976.
5. AOAC Official Method 993.03 Nitrate in Baby Foods. J.AOAC Int., v. 77, p. 425, 1994.
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Avaliao da atividade da colinesterase em soro / plasma

Princpio do mtodo: a atividade da enzima colinesterase presente no plasma / soro avaliada frente ao
substrato adicionado (acetiltiocolina) amostra. A hidrlise da acetiltiocolina produz cido actico e
colina. A colina reage com o DTNB formando o TNB que absorve na regio do visvel (400 420 nm).

Preparo dos reagentes

1. Tampo fosfato 52 mM - pH 7,2


Preparar soluo 0,104 M de fosfato de sdio monobsico (NaH 2PO4) e 0,104 M de fosfato de sdio
dibsico (Na2HPO4). Misturar 84 mL da primeira com 216 mL da segunda. Acrescentar 300 mL de gua
destilada.

2. Soluo de DTNB (cido 5,5-ditiobis-2-nitrobenzico) a 0,26 mM em tampo fosfato pH 7,2


Pesar 51,5 mg do cido e dissolver no tampo fosfato em balo volumtrico de 500 mL. Completar
volume.
Esta soluo estvel por 6 semanas em frasco mbar na geladeira.

3. Soluo de iodeto de acetiltiocolina 28 mM


Pesar 451,2 mg do sal e dissolver em gua destilada em balo volumtrico de 10 mL.

Obteno do soro
Colher cerca de 2mL de sangue em tubo sem anticoagulante. Centrifugar suavemente a 3000 rpm por 10
minutos. Com auxlio de uma pipeta automtica, transferir cerca de 0,2 ml do sobrenadante, de cor
amarelo claro (soro), para um outro tubo graduado.

Diluio da amostra
Diluir o soro 1:10 com gua deionizada imediatamente antes da anlise. Homogeneizar.

Quadro 1. Esquema analtico para dosagem da colinesterase (todos os reagentes devero estar
estabilizados a 25C).
Reagentes Tubo da Tubo do branco de
amostra reagentes
(L) (L)
Amostra diluda 20 -
gua deionizada - 20
DTNB 3000 3000
Acetiltiocolina 100 100

Misturar manualmente. Depois de 2 minutos, anotar o primeiro valor de absorvncia obtido a 405 nm.
Realizar mais trs leituras em intervalos de 30 segundos.

Nota.: o primeiro valor de absorvncia no pode exceder 0,5. Se a variao de absorvncia (30s) for
maior que 0,2 ser necessrio diluir a amostra com gua deionizada.
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Tabela 1. Incrementos de absorvncia obtidos na avaliao da atividade da colinesterase plasmtica

Abs Abs Abs (mdia)


A0 -
A 30
A 60
A 90

Clculos:

Abs x V1 Abs x [3,12 / 0,02 mL]


= = mmoles produto / min . L
t . . d V2 1 1
0,5 min x 1,33 L x mmol x mm x 10 mm

Onde:
Abs / t = incremento mdio de absorvncia por minuto
= absortividade molar do corante a 405 nm = 13300 L. mol 1 . cm 1
d = caminho tico (mm) Lembre-se: A = bc (onde b = 1 cm e c = moles / L)
V1 = volume final da preparao em mL
V2 = volume da amostra em mL

Definir a atividade da enzima em U / L ou moles produto / min . L

Colinesterase plasmtica ou pseudocolinesterase - Valores normais por essa tcnica:


Mulheres: 1700 a 3700 U / L
Homens: 1900 3800 U / L

Variao normal de atividade da colinesterase plasmtica em um mesmo indivduo: at 30% por conta de
flutuaes fisiolgicas ou no ritmo circadiano. Uma reduo em mais de 30% da atividade basal do
indivduo pode ser devida a contato com inibidores da colinesterase.

ndice Biolgico Mximo Permitido (NR7 Brasil): at 50% de reduo do valor basal do indivduo para
colinesterase plasmtica.

Baseado em:
Analyses of Hazardous Substances in Biological Materials. Angerer, J; Schaller, K.H. eds. VCH Weinheim.
V.3. p.45 62, 1991.
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O Enzima
+ +
(CH3)3NCH2CH2SC CH3 (CH3)3NCH2CH2S - + CH3COO- + 2H+
ACETILTIOCOLINA TIOCOLINA ACIDO ACTICO

O 2N S S NO2

COOH DTNB COOH

+
(CH3)3NCH2CH2S

HS NO2
O 2N S
COOH
COOH TNB
( = 13.600 para = 412nm)

Figura 1. Principais reaes qumicas no mtodo de Ellman.


Fonte: Ellman, G.L. Archives of Biochemistry and Biophysics, v. 82, p. 70 - 77, 1959.
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Determinao do Fenobarbital no Plasma

O fenobarbital um derivado barbitrico, agonista de receptores GABAA, que aumenta a


resposta inibitria ps - sinptica. principalmente indicado para a preveno do aparecimento de
convulses em indivduos com epilepsia e crises convulsivas de outras origens. A determinao de seus
nveis sricos importante para o diagnstico da intoxicao aguda e para a monitorizao teraputica.
Materiais utilizados:
1. Espectrofotmetro para a regio do UV (260nm)
2. Soluo padro de Fenobarbital 1mg/mL em metanol
3. Tampo Acetato de Sdio 0,1N e pH 5,4
Preparao: 29 mL de soluo de cido actico 0,1N + 171 mL de soluo de acetato de sdio 0,1N.
4. Soluo de NaOH 0,45N
5. Soluo de NH4Cl 16%
6. Pool de Plasma obtido com o uso de EDTA ou citrato como anticoagulante (branco de matriz)
7. Amostras para controle de qualidade (QC)
8. Amostra autntica (a simulao dever ser fornecida pelo professor)

Procedimento para preparao da Curva Analtica:


- Separe cinco tubos de centrfuga e prossiga como indicado na tabela abaixo.

TABELA 1: Esquema analtico para fortificao da matriz.

CONCENTRAO 10 g/mL 25 g/mL 50 g/mL 75 g/mL 100 g/mL


Plasma 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL
PADRO DE 10L 25L 50L 75L 100L
FENOBARBITAL
METANOL 90L 75L 50L 25L -
Leve cada tubo ao vrtex.

Procedimento para preparao das amostras de QC:

Baixo Mdio Alto


CONCENTRAO
15 g/mL 45 g/mL 90 g/mL
Plasma 1mL 1mL 1mL
PADRO DE 15L 45L 90L
FENOBARBITAL
METANOL 85L 55L 10L
Leve cada tubo ao vrtex.

Procedimento para extrao das amostras:


- Adicione 1 mL de Tampo de Acetato pH 5,4 em cada tubo
- Adicione 10 mL de Diclorometano em cada tubo.
- Misture por inverso suave por 15 minutos.
- Centrifugue os tubos a 4000 rpm por 15 minutos.
- Com auxlio de pipeta Pasteur, descarte o sobrenadante.
- Filtre a fase orgnica em papel de filtro Watman n1, recolhendo o filtrado em outro tubo de centrfuga
graduado.
- Anote o volume de diclorometano recuperado.
- Adicione aos tubos 5 mL de NaOH 0,45N.
- Misture por inverso intensa por 15 minutos.
- Centrifugue os tubos a 3000 rpm por 15 minutos.
- Transferir 2 mL de cada sobrenadante para dois tubos de ensaio (A e B).
- Aos tubos A, acrescentar 1 mL de NaOH 0,45N.
- Aos tubos B, acrescentar 1 mL de NH4Cl 16%

Leitura: Curva Analtica e Amostra


- Separe trs cubetas de Quartzo.
- Utilizando o espectrofotmetro para UV, ajuste o comprimento de onda para 260nm.
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- Na cubeta de referncia (posio 1), adicionar 1 mL de NaOH 0,45N e 1 mL de NH 4Cl 16%. Nas outras
duas cubetas, colocar as solues A e B.
- Calcule a diferena entre as absorvncias obtidas na cubeta A e na cubeta B.
- Em uma planilha Excel, construir uma tabela relacionando cada concentrao respectiva diferena de
absoro das solues A e B. Obter o grfico de correlao linear, a equao da reta e coeficiente de
determinao (R2).
- Use a equao da reta para calcular a concentrao das amostras de QC.
- Aceite o valor obtido para a amostra autntica se as concentraes das amostras de QC corresponderem
a 15% dos valores-alvo respectivos.

Valores de Referncia:
- Concentrao teraputica: 15-40 g/mL
- Concentrao txica: >40 g/mL

Referncias:
- JEREMIC,V.; Nikolic, R. Na Improved UV-Spectrophotometric Method for Routine Barbiturate
Monitoring. Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry v 14: 479 483, 1976
- MOREAU, R. L de M. ; SIQUEIRA, M.E. Cincias Farmacuticas. Toxicologia Analtica. Rio de
Janeiro: Guanabara Koogan, 2008, pginas 261 264.
- HAMMET-STABLER, CA; DASGUPTA, A. Therapeutic Drug Monitoring Data: A concise guide.
AACC Press. 3 Ed. 2007, pginas 63-65.
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Ensaio de Microncleo em Mucosa Oral

- Solues: - Material e equipamentos:


Soluo de Giemsa (3gotas/ 2 ml) Abaixador de lngua
Soluo de Cloreto de sdio 0,9% (SF) Lmina
Metanol Lamnula
gua destilada Tubos
Centrfuga
Vortex, Chapa e Banho-maria
Microscpio ptico

PROCEDIMENTOS

1. Coleta do material:
Preencher os tubos com 3 ml de SF e guardar sob refrigerao at o momento da coleta.
No momento da coleta: raspar a mucosa lateral interior da boca com o abaixador de lngua. Aps
a raspagem, colocar o abaixador dentro do tubo com SF e proceder mistura no vortex por 30 segundos.

2. Centrifugao das amostras:


Centrifugar todos os TUBOS em centrfuga comum por 5 minutos / 3000 rpm > Desprezar o
sobrenadante e ressuspender o precipitado com 3 ml de SF no vortex > Repetir o procedimento por 2
vezes. Aps a ltima centrifugao, deixar apenas um volume de 200 microlitros tubo.

3. Montagem da lmina:
Colocar as lminas limpas na estufa, numa temperatura de 37 C / 30 minutos antes do
procedimento > Adicionar sobre cada lmina o volume de 200 microlitros de material obtido na etapa 02
> Deixar secar as lminas em chapa aquecedora (60C) ou banho-maria fervente por +/- 5 min..

4. Fixao das amostras:


Fixar as lminas obtidas na etapa 03 em Metanol Absoluto por 2 minutos, cobrindo toda a
lmina > Descartar o Metanol e deixar as lminas secando a temperatura ambiente.

5. Procedimentos de colorao:
Cobrir as lminas com Soluo de Giemsa por 10 min > descartar o Giemsa e lavar em gua corrente.

6. Montagem das lminas:


Colocar a lmina obtida na etapa 05 sobre uma superfcie reta > Colocar uma gota de gua
destilada no centro da lmina > Cobrir com uma lamnula > retirar o possvel excesso de agua com papel
toalha > LER.

PROCEDIMENTO DE LEITURA
Cdigo da Alteraes observadas
Anormalidades
lmina MCN BN BE NF

MCN: Microncleo; BN: Binucleada; BN: Broto nuclear; NF: Ncleos fragmentados.
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ALTERAES OBSERVADAS

Figura Diagrama esquemtico de diferentes tipos de clulas bucais e os possveis mecanismos para sua origem.
Fonte: Adaptado de Holland e colaboradores (2008).
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Ensaio Salmonella/microssoma Teste de Ames

Protocolo da Pr - Incubao

O teste de mutagenicidade com Salmonella typhimurium um teste de curta


durao utilizado para detectar substncias que podem causar mutaes de ponto.
As linhagens de Salmonella usadas no teste sofrem mutaes nos genes
responsveis pela biossntese da histidina e como resultado no conseguem
produzir esse aminocido. Outra mutao necessria para fornecer subsdios s
clulas bacterianas e permitir que elas cresam na ausncia do referido
aminocido. Essa mutao ocorre quando as bactrias usadas so expostas a
agentes mutagnicos.

Solues:

- gar mnimo
Soluo de glicose 10%.................................................................200 mL
Soluo de agar..............................................................................780 mL
Soluo de Vogel Bonner.................................................................20 mL
Soluo de histidina/biotina 0,5 mM..................................................12mL

- gar de superfcie
Bacto agar...............................................................................................6g
NaCl........................................................................................................5g
gua destilada.....................................................................q.s.p. 1000 mL

- Caldo nutriente
Nutriente Broth n 2 OXOID..................................................................25g
gua destilada.....................................................................q.s.p. 1000 mL

-Mistura S9 4% v/v:
gua destilada estril.....................................................................39,5 mL
Tampo fosfato 0,2 ..........................................................................50 mL
NADP 0,1 M........................................................................................4 mL
Glicose-6-fosfato 1,0 M....................................................................0,5 mL
Soluo de sais (KCl 1,65 M e MgCl2 0,4 M.......................................2 mL
Frao S9............................................................................................4 mL

- Tampo fosfato de sdio 0,2M (Na2HPO4 + NaH2PO4.H2O)

Procedimento de ensaio (figura 1)

- Inocular 1 colnia individualizada de Salmonella proveniente de placas de cultivo


em 20 mL de caldo nutriente e deixar crescer por 16 horas a 37C sob agitao de 150 a
170 rpm.

- Em tubos previamente esterilizados colocar 100 L da cultura bacteriana, 100 L


de diferentes concentraes das amostras a serem testadas e 500 L de tampo fosfato
0,2 M para o ensaio na ausncia de ativao metablica ou o mesmo volume da mistura
S9 para o ensaio na presena de ativao metablica.
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- Homogeneizar os tubos e incub-los a 37C por 30 minutos sob agitao. Aps


esse tempo adicionar 2,0 mL de gar de superfcie, homogeneizar a mistura e vert-la
em placa de Petri com 20 mL de gar mnimo.

- Incubar as placas invertidas, por 66 horas em temperatura de 37C.

- Aps esse perodo fazer a contagem do nmero de revertentes nas placas.

- A amostra ser considerada mutagnica quando o nmero de revertentes no


ensaio for, pelo menos, duas vezes maior que o nmero de revertentes espontneos
(observados no controle negativo), gerando um ndice de mutagenicidade maior ou igual
a dois (IM 2), apresentar ANOVA significativa e a resposta for dependente da dose.

FIGURA 1: Ensaio Salmonella / microssoma - Protocolo da pr-incubao

Referncia bibliogrfica:

MARON, D.M; AMES, B.N. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test.
Mutation Research, Amsterdam, v.113, p.173-214, 1983.
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Reagentes
(Clarkes Analysis of Drugs and Poisons, 2004)

Reagente de Van Urk


Dissolver 1 g de p-dimetilaminobenzaldeido em 100 mL de etanol e adicione 10 mL de cido clordrico.
Nebulizar a placa com o reagente e aquecer em estufa a 100 C por 5 minutos.
Manchas amarelas so produzidas por reao com sulfonamidas e meprobamato, Manchas azuis so
produzidas com alcalides do ergot. Manchas rosa e violeta so produzidas por reao com outros
compostos, como por exemplo, fenazona.

Soluo de cloreto frrico


Dissolver 5 g de cloreto frrico em 100 mL de gua deionizada
Manchas azuis ou violetas so obtidas na reao com fenis. Essa soluo pode ser nebulizada sobre
uma placa previamente revelada com o reagente de Van Urk.

O OH
O OH
Fe3+
OH + FeCl3 - + 3 HCl
O

Soluo de Nitrato Mercuroso


Dissolver 1g de nitrato mercuroso em uma mistura de 50 mL de gua destilada e 5mL de acido ntrico.
Avolumar para 100 mL. Guarde em frasco de vidro mbar, protegido da luz.
Manchas cinza escuro, que clareiam rapidamente so obtidas na reao com barbitricos (amidas).

Soluo de Iodo Platinado acidificado


Dissolva 0,25g de cloreto platnico e 5 g de iodeto de potssio em 100 mL de gua deionizada.
Adicione 5 mL de HCl.

Reagente FPN
Misture 5 ml de soluo de cloreto frrico (a 5%), com 45 mL de soluo de cido perclrico a 20%
w/w. A seguir, adicione 50 mL de soluo de cido ntrico a 50% v/v.
Manchas rosas, vermelhas ou arroxeadas so produzidas com fenotiaznicos. Manchas azuladas so
produzidas por reao com as dibenzazepinas.

Reagente de Dragendorff
Soluo A: misture 2g de subnitrato de bismuto, com 25 mL de cido actico e 100 mL de gua.
Soluo B: misture 40g de iodeto de potssio em 100 mL de gua
Misture 10mL da soluo A com 10 mL da soluo B, e acrescente 20 mL de cido actico e 100mL de
gua destilada. A mistura estvel por 2 dias.

Cloreto de paldio
Dissolver com ajuda de calor, 0,1g de cloreto de paldio em 5 Ml de HCl 2M. Diluir a soluo para 100
mL com gua destilada. Misturar volumes iguais desta soluo com hidrxido de sdio 2M. O reagente
assim misturado estvel por vrias semanas. Cores do amarelo, laranja ao marrom so obtidas para
compostos com enxofre na cadeia (exceto se o enxofre estiver ligando dois anis ou se for apenas
uma cadeia S-alquil, sem halognios na extremidade).
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Curso: Ano/Semestre:
NOTA:
Disciplina/Turma:

NOMES:

Relatrio de Aula Prtica

Ttulo da Aula:

Objetivo da Anlise:

Princpio Analtico:

Relatrio de Atividades:
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Relatrio de Atividades (Continuao):

Clculos:

Interpretao dos resultados:


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Anexo (Fotos, Figuras, Esquemas, Grficos, Outros):