COLORACIONES

I. INTRODUCCION:

El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el
microscopio ptico; la principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que
la rodea y el modo ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de
colorantes.(Atas,1998)

La envoltura celular bacteriana tiene como funcin principal evitar que la bacteria, pierda iones
y otras molculas a favor de gradiente de concentracin con el exterior, menos concentrado. (
Corts/www.joseacortes.com/bacterias/microscopio.htm)

La pared bacteriana se sita a continuacin de la membrana celular. El componente principal

y diferenciador de la pared bacteriana es el peptidoglucano, un heteropolmero de N-
acetilglucosamina y cido N-acetilmurmico (ambos son monosacridos).( Gaitn, 1997)

En bacterias encontramos dos tipos de paredes o envolturas celulares, que dividen a las
bacterias en dos grupos dependiendo, de si la tincin de GRAM es positiva o negativa, s entra
o no dentro de las clulas. (Koneman, 1994)

La tincin de Gram fue creada por Hans Christian Gram a fines del siglo XIX y puede utilizarse
para separar la mayora de especies bacterianas en dos grandes grupos: GRAM POSITIVAS Y
GRAM NEGATIVAS. (Martnez, l993)

Las paredes celulares, de ambas poseen una capa basal de peptidoglicano responsable de la
rigidez caracterstica de la pared (Gaitn, 1997) Sin embargo, existen diferencias estructurales
en lo que respecta a las capas ms externas.( Pelczar,1995) As en las Gram Negativas, existe
una membrana externa cuya constitucin qumica es similar a la de cualquier otra membrana
biolgica (fosfolpidos y protenas) pero que posee adems un alto contenido de
lipopolisacridos (endotoxina).( Corts, http://www.joseacortes.com/practicas/)

Durante el proceso de tincin, tanto las bacterias Gram positivas como las Gram negativas,
toman el colorante primario; sin embargo al aplicar el agente decolorante, la pared de las
bacterias Gram positivas sufren una deshidratacin que impide la salida del colorante. (Torres,
2001)
En el caso de las bacterias Gram negativas, el agente decolorante destruye la membrana
externa, incrementando as su permeabilidad, lo cual permite la salida del colorante primario. (
Quero,http://www.uniovi.es/bos/Asignaturas/Parasit/)

Al aplicar el colorante de contraste, este no puede penetrar fcilmente en las bacterias Gram
positivas debido a la deshidratacin de su pared; adems de que estas bacterias quedaron
previamente teidas con el colorante primario
(Corts/www.joseacortes.com/bacterias/microscopio.htm). Por el contrario las bacterias GRAM
(-) se tien fcilmente con el colorante de contraste.( Torres, 2001)

El resultado final es que las bacterias Gram (+) se tien de color violeta y las Gram (-) de rojo.
(Pelczar,1995)

Muchas bacterias estn rodeadas por compuestos qumicos superficiales que se ties con
mucha dificultad y que ha sido denominada cpsula. (Ros,2000)

La cpsula bacteriana o glucoclix es una capa que se forma en la parte externa de la pared
de la mayora de las bacterias, protege de la desecacin, del ataque de los anticuerpos del
hospedador y de la fagocitosis por los glbulos blancos, lo que aumenta la virulencia de las
bacterias encapsuladas. (Ros, 2000).

La cpsula desempea un papel importante en la virulencia de algunas bacterias patgenas,

ya que les confiere propiedades antifagocticas que interfieren con los mecanismos de defensa
del organismo. (Torres, 2001)

El grosor de la cpsula vara no solo de una especie de microorganismos a otra, sino que
tambin entre las diferentes cepas de la misma especie y dependiendo de la fase de la curva
de crecimiento en que se encuentra el cultivo. (Ros, 2000)

El dimetro de la cpsula puede ser varias veces mayor al dimetro del cuerpo celular, como
en el caso de Streptococcus pneumoniae y Klebsiella pneumoniae; por el contrario, en otras
bacterias su dimetro puede ser mucho menor, ponindose de manifiesto solamente mediante
procesos bioqumicos y serolgicos como en el caso de algunas cepas de Pasteurella spp.
(Pelczar,1995)

Las bacterias con cpsula, en los medios de cultivo, forman colonias lisas y mucoides mientras
que las bacterias no capsuladas producen colonias rugosas. (Torres,2001)
Las cpsulas bacterianas no pueden observarse en frotis teidos con las tcnicas usuales
porque son incapaces de retener el colorante y porque los procesos de fijacin al calor y lavado
las disuelven. Por lo tanto el mejor mtodo para observarlas es el mtodo de Maneval. (Ros,
2000)

Un tipo de tincin puede ser rodamina-auramina en donde los cidos miclicos de las paredes
celulares de las micobacterias poseen afinidad para los fluorocromos auramina y rodamina.
(Atas,1998) Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen de color amarillo o naranja
brillante contra un fondo verdoso. (Quero,http://www.uniovi.es/bos/Asignaturas/Parasit/)

Un aspecto importante de la coloracin rodamina-auramiria es que luego los frotis pueden ser
reteidos con la coloracin de ziehl-neelsen o kinyoun directamente sobre la tincin con el
fluorocromo, si se elimina antes el aceite de inmersin. (Atas,1998)

En la tincin de naranja de acridina, el fluorocromo naranja de acridina se une al cido nucleico

ya sea en su forma nativa o desnaturalizada. (Atas,1998) En algunas preparaciones de naranja
de acridina, el color de la fluorescencia puede variar, dependiendo del ph y de la concentracin.
(Pelczar,1995)

El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital, que da una fluorescencia verde
si el microorganismo est vivo y roja si est muerto. (Torres,2001)

Al aplicar la tincion ziehl-neelsen (baar) las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias
contienen cidos grasos (cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que
les confieren la propiedad de resistir la decoloracn con alcohol-cido, despus de la tincin
con colorantes bsicos.( Pelczar,1995)

En la tincin blanca de calcoflor las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco
de calcoflor aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras.
(Ros, 2000)

La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica
por los materiales celulares; muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas
cargadas positivamente (cationes) .Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno,
el cristal violeta y la safranina.( Torres,2001)
Otros colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los
constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas; esos colorantes
incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. (Pelczar, 1995)

Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se combinan
con los materiales lipdicos de la clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de las
gotculas o depsitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudn.
(Quero,http://www.uniovi.es/bos/Asignaturas/Parasit/)

II. MATERIALES Y METODOS

Materiales Equipos
Laminillas cubreobjetos Microscopios
Laminas portaobjetos
Mechero de Bunsen
Aceite de inmersin
Colorantes para la tincin de Maneval
Mondadientes
Colorantes para la tincin de Gram.
Estudiantes (muestra)
Rejilla de soporte o de tincin
Goteros

Coloracin de Gram : Realizar un frotis de sarro dentario en una lmina portaobjetos. Permita
que los frotis se sequen al aire y luego fjelos con calor. Teir con cristal violeta agregando
suficiente colorante e inundar suavemente con el mordiente, yodo de Gram, y dejar actuar
durante dos minutos. Lavar suavemente con agua. Decolorar con alcohol etlico al 95%. Nota:
No sobredecolorar, agregue el alcohol gota a gota hasta que este salga casi claro, solo
ligeramente azul. Lavar suavemente con agua. Agregar la safranina para la tincin de contraste,
y dejar actuar durante dos minutos. Lavar suavemente con agua. Secar la preparacin. Por
ltimo, examinar al microscopio con el objetivo 100X de inmersin con aceite de cedro.

Coloracin de Maneval: Colocar una gota de Maneval A (Rojo Congo) en una laminilla sobre
el frotis ya fijado, haciendo movimientos giratorios con el asa. Extender la suspensin de
manera que quede una pelcula delgada. Dejar secar la preparacin a temperatura ambiente.
NO FIJAR EL FROTIS AL CALOR. Cubrir la preparacin con Maneval B (Fucsina cida) y dejar
que acte durante dos minutos. Lavar suavemente con agua corriente de la llave y seca el frotis
mediante un ligero contacto con una toalla de papel. Observar al microscopio Con el objetivo
de inmersin. Las cpsulas se observan como halos incoloros. El espacio intercelular se observa
de un color oscuro y las clulas bacterianas de color rojo.

III. RESULTADOS

MUESTRA :

OBSERVACION :

PREPARACION :

COLORACION :

AUMENTO :

MUESTRA :

OBSERVACION :

PREPARACION :

COLORACION :

AUMENTO :

IV. COMENTARIOS
 Desarrollamos el fundamento y realizacin de la coloracin de Gram y la
observacin de capsula bacteriana coloreada por el mtodo Maneval.
La coloracin gram permite diferenciar dos tipos de bacterias.
La coloracin Maneval es importante ya que permite conocer si una bacteria
posee cpsula, que la hace resistente.

V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Atas, A. Parasitologa Clnica. 4 Edicin. Editorial El Mediterrneo. Santiago Chile. 1998

Corts, J. Manual de prcticas de Microbiologa. Cualquiera de estas prcticas se puede
hacer perfectamente en un laboratorio de instituto.
URL: http://www.joseacortes.com/practicas/
Corts .El Microscopio ptico compuesto. Prctica de laboratorio: Manejo
y uso del microscopio ptico compuesto. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si
se derrama sobre ella www.joseacortes.com/bacterias/microscopio.htm
Gaitn, MA, Manual de prcticas de Bacteriologa General, Facultad
de Ciencias Qumicas, Universidad de Colima. 1997
Koneman EW, et.al. Diagnstico Microbiolgico, Panamericana, quinta edicin, Mxico.
1994
Mandell/ Douglas/ Bennet. "Enfermedades Infecciosas, principios y prctica " 4 Edicin.,
Editorial Panamericana 1995.
Martnez, R. Manual de Prcticas de Microbiologa General, Centro de Graduados
e investigacin, Instituto Tecnolgico de Veracruz, l993.
Pelczar, M, et.al, Elementos de Microbiologa, McGraw-Hill, Mxico. 1995.
Quero, A. Parasitologa. Departamento de Biologa de Organismos y Sistemas (BOS).
http://www.uniovi.es/bos/Asignaturas/Parasit/
Ros, A. Parasitologa. Tabasco Mxico. 2000. URL:
http://www.monografias.com/trabajos12/paras/paras.shtml
Torres, M. Parasitologa para Enfermera. Pontificia Universidad Catlica de Chile. 2001.
http://escuela.med.puc.cl/paginas/udas/Parasitologia/Parasitol_03.html
Zinsser, Microbiologa, Editorial Mdica Panamericana, 18 edicin, Mxico. 1990
VI. ANEXOS
ANEXO 01 : Preparacion del colorante maneval

ANEXO 02: Preparacon de la coloracin GRAM