Universidad Nacional Jos Faustino Snchez Carrin

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA

ESCUELA ACADMICO PROFESIONAL DE MEDICINA HUMANA

Docentes: Dra. ZOILA F. HONORIO DURAND

Dra. SOLEDAD D. LLAEZ BUSTAMANTE

Alumno (a):.

HUACHO

2016
 PRESENTACIN

El presente manual de prcticas ha sido elaborado por las docentes, en base al material y equipos con
los que actualmente cuenta los laboratorios de Bioqumica de la facultad de Bromatologa y
Nutricin y el apoyo del laboratorio Multifuncional y de Microscopia de la facultad de Medicina de
nuestra universidad, se desarrollaran sesiones experimentales que van a reforzar el contenido terico
del curso.

El trabajo de laboratorio bioqumico requiere de concentracin y cuidados para la manipulacin

tanto de material biolgico como reactivos qumicos. El uso de equipos no sofisticados como es el
potencimetro; apoyara el entendimiento de los conceptos e interpretacin del comportamiento de
los iones que junto con los componentes de la orina dan lugar a su densidad, que son reflejo de la
funcin renal e influyen en el mantenimiento del equilibrio cido base del organismo. Asimismo
practicaremos la medicin del pH; as como, la composicin y actividad de los amortiguadores del
pH biolgico.

Se har nfasis en el comportamiento general de las enzimas, la concentracin de Hemoglobina en

sangre, del mtodo Espectrofotomtrico, para valorar biomolculas, se interpretar los mecanismos y
comportamientos de Amilasa salival y Lipasa pancretica frente a sustratos especficos.

Cuantificaremos la glucosa y otros metabolitos en sangre y orina con el objetivo de que a travs
de pruebas experimentales adquirieran la destreza en el uso de mtodos y tcnicas, as como la
interpretacin clnica de los valores resultantes de los anlisis que se efectuaran.

Se recomienda leer la gua de prctica con anticipacin para minimizar los errores que se puedan
cometer por la falta del dominio en la tcnica a aplicar y en los resultados de las posteriores
evaluaciones.

Dra. Zoila F Honorio Durand

Dra. Soledad D. LLaez Bustamante

 NORMAS DEL LABORATORIO DE BIOQUMICA

Para el desarrollo de la parte prctica de la asignatura de Bioqumica se exige: respeto, limpieza,

cuidado en el uso de materiales, equipos y muchos deseos de trabajar, por lo que se debe cumplir las
siguientes indicaciones:

1. Ingresa al laboratorio a la hora exacta

2. Previamente debes saber lo que vas a hacer en el Laboratorio.

3. Ten puesto tu mandil, de preferencia de color blanco y de algodn.

4. Ten el cabello recogido (gancho, cinta, etc). Las uas sin esmalte y recortadas.

5. Ten en cuenta la limpieza del lugar donde vas a trabajar.

6. Lleva a la mesa tu Gua de laboratorio y una libreta de notas de ser necesario.

7. Antes de usar cualquier material o reactivo observa qu caractersticas tiene, no te precipites

en oler o pipetear cualquier sustancia o reactivo qumico, consulta si tienes duda.

8. Debes tener mesura y concentracin para el uso del material de vidrio y de los reactivos,
revisa siempre el etiquetado de la solucin o reactivo; si es necesario prepararlos estos
deben ser inmediatamente trasvasados a frascos con caractersticas especiales (segn el
reactivo) tpalos y etiquetalos.

9. Dispn de marcadores indelebles o permanentes para el etiquetado del material de trabajo e

insumos para el lavado antes y/o despus de su uso. Es indispensable el uso de jabn
lquido y una toalla especial para el secado de las manos. El ambiente del laboratorio debe de
quedar limpio para que tus compaeros puedan seguir trabajando.

10. Coordina con tus compaeros para asegurar la disponibilidad de los materiales reactivos,
muestras y el agua destilada para el desarrollo de la prctica.

11. Est prohibido ingerir alimentos, usar celulares o algn dispositivo que los entretengan en
el momento del trabajo prctico.

NOTA: No se permite el cambio de grupo de estudiantes.

La Jefatura del Laboratorio.

 INTRODUCCIN

Las prcticas que se desarrollaran en el presente semestre se harn en sangre, plasma, orina, saliva y
en alimentos.

La sangre ser extrada de la puncin venosa y puncin cutnea.

Como conocimiento previo debemos de saber la conservacin de las muestras, segn el anlisis que
se quiera realizar ya que los metabolitos pueden sufrir alteraciones estructurales por factores
externos que van a dificultar su reconocimiento.

Aun sabiendo mantener las muestras en forma adecuada, el anlisis bioqumico slo se completa con
el conocimiento del manejo instrumental y de materiales de laboratorio en forma adecuada.

Las sesiones de laboratorio van a estar alternadas con el desarrollo de prcticas instrumentales, con
el objetivo de que antes de realizar el anlisis en los especmenes biolgicos debemos de saber el
fundamento y el uso adecuado de los equipos del laboratorio.

PROGRAMACIN
1. Determinacin de la densidad y el pH urinario.
2. Mecanismo de accin de los buffers biolgicos.
3. Espectrofotometra.
4. Determinacin de Hemoglobina.
5. Factores que alteran la actividad cataltica de los enzimas.
6. Determinacin de Amilasa en plasma y orina .
7. Determinacin de glucosa en sangre.
8. Accin de la lipasa pancretica.
9. Determinacin de triglicridos.
10. Determinacin de colesterol en sangre.
11. Protenas Totales y Albumina plasmticos.
12. Propiedades de protenas y aminocidos.
 PRCTICA 1
DETERMINACIN DE L DENSIDAD Y EL pH URINARIO

I.- GENERALIDADES.-

La orina es un lquido transparente y amarillento, excretado por los riones; est formado por
agua y compuestos slidos, cerca de la mitad de estos slidos son de urea, principal producto de
degradacin del metabolismo de las protenas, el resto, aminocidos, creatinina, enzimas,
cloruros cetosteroides, la mayor parte de hormonas, cido oxlico, cido rico, amonio, Na, K,
Cl, Ca, P etc. Los elementos que constituyen la orina son dinmicos y pueden variar con la
dieta, actividad, consumo de medicamentos y otras variables.

El anlisis de orina proporciona informacin valiosa para la deteccin, diagnstico diferencial y

valoracin de alteraciones nefro-urolgicas y ocasionalmente puede revelar elementos de
enfermedades sistmicas que transcurren de manera silenciosa o asintomtica. Su utilizacin en
el diagnstico de enfermedades data desde los albores de la medicina. En la actualidad gracias al
desarrollo de tcnicas bioqumicas aplicadas a la orina, la informacin que aporta as como su
exactitud son cada vez ms decisivas. Las caractersticas y bondades del anlisis de orina estn
basadas en lo fcil y rpidamente disponible de la muestra a analizar, la posibilidad de obtener
informacin sobre muchas funciones importantes de nuestra fisiologa y por ser a la vez un
mtodo de laboratorio simple y rpido.

Para los exmenes de rutina se emplean procedimientos que involucran el uso de los sentidos,
para hacer medidas y establecer comparaciones con constantes ya establecidas previamente, se
evala caractersticas como: Cantidad, color, olor, espuma, aspecto, sedimento, reaccin,
densidad y slidos totales.

Cantidad.- La cantidad de orina eliminada por da, oscila entre 1000 a 1500 ml;
aproximadamente 18,5ml/kilogramo de peso corporal, en los nios la diuresis es mayor que en
el adulto aproximadamente 40 ml por kilogramo de peso. La diuresis es mayor en el da que en
la noche; la proporcin es de 4 a 1.

Con respecto al volumen de la orina pueden ocurrir algunas variaciones ya sea por causas
fisiolgicas o patolgicas y se presentan situaciones como:
a) Poliuria.- Aumento del volumen de orina por causas fisiolgicas o patolgicas
como excesiva ingestin de lquidos, alimentos acuosos, el fro que disminuye la
evaporacin cutnea, vasoconstriccin perifrica, trastornos psquicos, alcoholismo
(cerveza o vino), diabetes mellitus inspida, hipertiroidismo resorcin de edemas y
al final de algunas enfermedades febriles etc. En caso de poliuria es muy importante
medir la densidad de la orina de 24 horas para definir el tipo; si la poliuria es
hiperdensa que se presenta en caso de diabetes sacarina, o hipodensa en caso de
diabetes inspida primaria, acidosis tubular renal, isodensa, que corresponde a una
nefropata adquirida, nefritis crnica.
b) Oliguria.- Disminucin de la diuresis < de 400 ml/24 horas, y puede ocurrir por baja
ingestin de lquidos, despus de ejercicios violentos con abundante transpiracin,
fases terminales de la uremia producto de una enfermedad renal crnica , perodo
agudo de una glomrulo nefritis, intoxicaciones, afecciones hepticas, insuficiencia
cardiaca incipiente, coma diabtico, ascitis, hidrotrax hemorragias, diarreas,
vmitos.
 En condiciones fisiolgicas la concentracin de hidrgenos que se eliminan por la orina son
responsables de la acidez urinaria, estos provienen de la dieta. La mayora de los fosfatos y de
la transformacin de urea en amoniaco, por la ingesta de alimentos alcalinizantes o
acidificantes.

CARGA CIDA URINARIA DIARIA:

Acidez titulable (H2PO4-) = 25-30 mEq

Acidez no titulable (NH4+) = 30-35 mEq
H+ libres = pH 5,0 = 0,01 mEq
En el caso de expresarlo en ml de NaOH 0,1N gastados el valor normal es de 250 a 400
ml/litro de orina.

II.- OBJETIVOS:

- Hallar la densidad de muestras de orina

- Medir el pH de las muestras de orina.

III.- MATERIALES Y REACTIVOS:

1. Vasos de 50 o 100 ml
2. Vaguetas
3. Fiolas de 25 y 50 ml.
4. Erlemeyer de 125 y 250ml
5. Bureta de 25 o 50ml
6. Solucin alcohlica de fenolftaleina al 1%
7. Hidrxido de sodio 0,1N
8. Balanza analtica
9. Potencimetro
10. Papel de Tornasol
11. Panpeha

IV.-PROCEDIMIENTO:

Unos tres da previo a la prctica 5 estudiantes, de cada uno de los grupos anotaran la cantidad
de agua que consumen y los alimentos que ingieren desde el desayuno, por la maana (da de la
prctica) al levantarse recolectaran luego de eliminar un primer chorro el total de orina eliminada y
medirn el volumen, luego traer al laboratorio aproximadamente unos 150 ml. Si el grupo de
prcticas es por la tarde refrigerar la muestra, ella no debe permanecer ms de media hora sin
refrigeracin. (Debe embalar adecuadamente la muestra en un vaso o botella limpia o seca preferible
de primer uso)
En el laboratorio:
A) Densidad de la orina
1.- Pesar en balanza analtica una fiola de 25 o de 50 ml (Anotar el peso)
2.- Agregar la orina a la fiola, completando el volumen correspondiente hasta el aforo
3.- Pesar la fiola que contiene la orina (paso 2)
4.- Hallar la densidad de la orina utilizando la formula siguiente:
Masa (g)
D = .
Volumen (cm3 )
B) Colocar en un tubo de prueba 5 ml. de orina y colocar una pequea porcin de papel de tornasol
rojo, retirarlo con una vagueta y realizar la misma operacin con el papel azul y retirarlo; colocar
ambas porciones de papel utilizadas sobre una placa Petri. Observar los resultados.
C) Colocar 20 ml de orina en un vaso de precipitado de 50 ml, medir el pH con una tira de papel
PANPEHA y luego con el potencimetro. Comparar los resultados.
D) Medir unos 25 ml de orina y colocarlo en el erlemeyer de 100ml de capacidad, aadir 3 gotas de
fenolftalena, mezclar y titular el contenido del matraz con una solucin de Na OH 0,1N hasta
cambio de color ligeramente rosado persistente.
Anotar el volumen gastado.

La cantidad de lcali aadido, equivale a la acidez titulable urinaria, que se expresa como una
cantidad determinada de mili equivalentes de hidrgeno excretado en el mismo tiempo.

V.- RESULTADOS:

Clculo:
Gasto de NaOH 0,1N 20ml.
X 1000 ml

X = ml. de NaOH 0,1N/L de orina

VI.- INTERPRETACIN
VII.-CONCLUSINES
VIII.- CUESTIONARIO:

1.- En un pequeo esquema represente el mecanismo de los iones consumidos en las dietas hasta la
excrecin renal.
2.- Averiguar sobre mtodos que se usan para medir la densidad y el pH de la orina y sangre.
3.- Cuando se forma orina hipotnica y cuando orina hipertnica
4.- Qu es la Diabetes inspida?

IX.- BIBLIOGRAFA

MATERIALES ENCARGADOS PARA LA PRACTICA N 1

Muestras Orina preparadas segn encargo de las docentes (detalles en la parte de procedimental)
- 1 litro de agua destilada pH 7 mnimo cada 5 estudiantes.
- 3 goteros por cada mesa.
- Material para limpieza de su mesa de trabajo, jabn lquido, toalla para manos o papel
toalla, escobilla de lava pomo (2 por mesa) detergente, un ayudn en pote (por
grupo)
- Un potencimetro manual, un frasquito de papel de tornasol rojo y otro azul (para
compartir con todo el grupo de prctica y ser usado durante todo el ciclo)
 PRCTICA 2

MECANISMO DE ACCIN DE LOS BUFFERS BIOLGICOS

I.- GENERALIDADES.-

Muchas de las reacciones que se producen en los tejidos implican la liberacin de cidos o
lcalis y una de las caractersticas que hay que tener en cuenta son los valores de pH en los
cuales se llevan a cabo estos procesos.

La sangre humana cuyo pH suele ser de 7,35 para sangre venosa y de 7,40 para sangre arterial
(los valores entre 7,0 y 7,6 suelen ser extremadamente peligrosos), constituye un sistema no
slo para el transporte de cidos y bases, productos de la digestin y metabolismo de los
alimentos ( cido carbnico y lctico por ejemplo), sino tambin para controlar que se
modifique el pH en grado notable, ello debido a sustancias amortiguadoras o buffer que tienen
la particularidad de resistirse a los cambios bruscos.

Entre los principales pares amortiguadores plasmticos con sus concentraciones milimolares
totales correctas tenemos a:
NaHCO3/H2CO3 = 27 mM, . pK 6,1
Na2HPO4/NaH2PO4 = 2 mM, . pK7,21
Na,protena/H,protena = 16 mM.

Donde el cociente de cada par y el pH de la solucin se relacionan con la frmula de

Henderson-Hasselbalch. El pK funcional del sistema de bicarbonato es 6,1 y el del sistema
fosfato 7,21 en los lquidos corporales.

Las diversas protenas tienen cada una distinto valor de pK, por ello, no es prctico mencionar
un pK para las protenas combinadas del plasma. De acuerdo a ello, es obvio notar, que los
valores de pK son ms cidos que el de la sangre, esto significa que la eficacia de los
amortiguadores de los lquidos corporales ante los cidos aumenta conforme disminuye el pH.

La relacin H2CO3:NaHCO3 en sangre a pH 7,40 es 1:20 y NaH2PO4: Na2HPO4 es 1:3,55. Se

deduce entonces que si hay ms de un sistema amortiguador, cuando el pH cambie, tambin lo
har el cociente de todos los sistemas.
Se elige el sistema bicarbonato para utilizarlo en el diagnstico y tratamiento de los estados
patolgicos porque ste se encuentra a la mxima concentracin molar en el plasma y lquido
extracelular, por lo tanto es el amortiguador ms efectivo. As tambin la concentracin de cido
carbnico no es fija.
El organismo puede reducirla por medio de la reaccin: H2CO3 CO2 + H2O.
El CO2 es expulsado por los pulmones y de ser necesario el organismo puede incrementar la
concentracin de cido carbnico reduciendo la ventilacin, reteniendo CO2 y de este modo
invierte el sentido de la reaccin, para mantener el pH entre sanguneo entre 7,31-7,40.
Tambin en la sangre participa un sistema amortiguador formado por hemoglobina. En la orina
el rango de pH puede estar entre 4,6 a 7,9 siendo el principal sistema amortiguador el fosfato
aunque tambin se forma el sistema amoniaco/amonio, producido a partir del amoniaco
liberado en el rin a partir de la Glutamina. En la saliva la regulacin del pH responde a
muchas variantes (sexo, edad, patologa bucal estimulacin de saliva etc.) .
 El pH de la saliva no estimulada se encuentra en el rango de 5,5 a 6,4 mientras que cuando es
estimulada aumenta de 7,1 a 7, 4; no existiendo amortiguadores fuertes Esta regulacin del
pH puede deberse principalmente por la presencia de iones sodio y bicarbonato .

II.- OBJETIVO
1. Demostrar in vitro la accin amortiguadora de los iones de Hidrgeno por accin del
buffer fosfato.

III.- ACTIVIDAD EXPERIMENTAL

Materiales y Reactivos.-
Materiales
1.- Potencimetro digital (~ 0,001 sensibilidad)
2.- Fiola de 100 ml (03)
3.- Vasos de precipitacin (04)
4.- Matraz erlenmeyer de 50 ml (06)
5.- Bureta de 50 ml (02)
6.- Pipeta volumtrica de 5 ml (05)

Reactivos:
a.- NaH2PO4.2HOH - (M.= 156,01 g/mol)
b.- Na2HPO4.7HOH - (M.= 268,07 g/mol)
c.- Indicador: Fenolftalena al 1,0%
d.- Indicador: Anaranjado de metilo al 0,1%
e.- Solucin de HCl 0,1 M

A. PREPARAR UNA SOLUCIN AMORTIGUADORA DE BUFFER FOSFATO

Lea con atencin el enunciado y su solucin:

* Preparar 100 ml de una solucin buffer fosfato 0.1 M de pH 7,0,usando las

sales de fosfato monobsico y dibsico.
Clculos:

Datos.-
A.- NaH2PO4.2HOH - M = 156,01 g/mol
B.- Na2HPO4.7HOH - M = 268,07 g/mol

Molaridad del Buffer = 0,1 M aportado por NaH2PO4.2HOH (sal monobsica)

y Na2HPO4.7HOH (sal bibsica).

Donde: A + B = 0,1
A = 0,1 - B
B = 0,1 - A

Por lo que, Cul ser el valor de A B? - Se recurre a la relacin B/A.

pH = pKa + log B/A
7,00 = 7,21 + log B/A
7,0 - 7,21 = log B/A
-0,21 = log B/A
 Aplicando antilog, se tiene:

0,62 = B/A
Por lo tanto: B = 0,62
Reemplazando en: B = 0,1 - A

0,62 A = 0,1 - A
0,62 A + A = 0,1
1,62 A = 0,1

A = 0,062 M

B = 0,1 - 0,062

B = 0,038 M

Cunto de acido debemos de pesar y Cunto de base, si queremos preparar 100 ml de cada una de
estas soluciones?
S:
156,01 g ------- 1000 ml ------- 1,000 M
X g ------- 1000 ml ------- 0,062 M

X = 9,67 g/1000 ml

9,67 g ------- 1000 ml ------- 0,062 M

X g ------- 100 ml ------- 0,062 M

X = 0,967 g NaH2PO4.2HOH

268,07 g ------- 1000 ml ------- 1,000 M

X g ------- 1000 ml ------- 0,038 M

X = 10.19 g/1000 ml

10,19 g -------- 1000 ml ------- 0,038 M

X g -------- 100 ml ------- 0,038 M

X = 1,019 g Na2HPO4.7.HOH

Pesar ambas sustancias por separado y disolver con agua bidestilada, llevando a enrase en una fiola
de 100 ml.

* Proceder igual para la preparacin del buffer fosfato 0,2 M.

 B. Comprobar el efecto regulador de los cambios de pH, por las soluciones Buffer elaboradas
a la experiencia a :

Erlenmeyer/Reactivo 1 2 3 4 5 6

Agua Destilada (ml) 5.0 ---- ---- 5.0 ---- -----

Buffer Fosfato 0.1 M (ml) ---- 5.0 ---- ---- 5.0 ----
Buffer Fosfato 0.2 M (ml) ---- ---- 5.0 ---- ---- 5.0
Anaranjado de Metilo 1% 3 gts 3 gts 3gts ---- ---- ----
Fenolftalena 1% ---- ---- ---- 3 gts 3 gts 3 gts

Titular con: HCl M/10 Erln.1 Erln.2 Erln 3 ---- ---- -----
Titular con Na OH M/10 ---- ----- ----- Erln 4 Erln.5 Erln 6

Anotar el gasto (ml) :

* Repita la Experiencia con el Buffer Fosfato 0,2 M

IV.- RESULTADOS
V.- INTERPRETACION
VII.- CONCLUSIONES
VIII.- CUESTIONARIO

1.- La tcnica potencio mtrica fundamentos, caractersticas (Esquema)

2.- Cul es el potencimetro ms comn utilizado en los laboratorios bioqumicos? (Esquema)
3.- Cul es el significado del pH y el pK ? 5 ejemplos. Cul es la funcin de cada uno de
ellos en el sistema amortiguador?
3. Detalle la importancia y esquematice el mecanismo utilizado para la accin a nivel del
organismo de cada uno de los buffer biolgicos
4.- Alteraciones que se suceden por los cambios de pH a nivel celular.
5.- Detalle la accin integrada de los tampones biolgicos en la manutencin del pH
sanguneo.

IX.- BIBLIOGRAFIA
 PRCTICA 3
ESPECTROFOTOMETRA

I.- GENERALIDADES:

Son mtodos de anlisis cualitativos y cuantitativos, basados en la interaccin de la luz con los
tomos y las molculas de las sustancias problemas que se quieren analizar, pudindose identificar
compuestos desconocidos por su espectro de absorcin caracterstico en el UV, VIS o IR. As como
tambin se pueden determinar las concentraciones de compuestos conocidos midiendo la absorcin
de luz a una o ms longitudes de onda, generalmente a la longitud de onda de mxima absorcin.
A fin de que la presente prctica facilite el entender, aplicar y explicar el mtodo en la determinacin
de los metabolitos bioqumicos indicadores del estado de salud del hombre se explica algunas de las
propiedades de la luz
La luz se manifiesta mediante radiaciones electromagnticas la cual puede considerase como
corpuscular o en la forma de onda.
Algunas propiedades fsicas de la luz se entienden mejor mediante sus caractersticas de onda. Otras
propiedades pueden explicarse a travs de su naturaleza corpuscular o de partculas.
Las caractersticas de una onda son:

: longitud de onda: distancia a la que se mueve la

onda durante un ciclo. Unidades:

A (armstrongs) = 10-10 m
cm (centmetro) = 10 7 nm
nm (nanmetro) = 10-9 m = 10 -6 mm = 10-7 cm
m (milimicras ) = 10 -6 mm
: perodo: tiempo que se requiere para que un ciclo
completo pase por un punto.
Unidad: seg/ciclo o s/ciclo
: frecuencia de oscilacin: nmero de ciclos que se
presenta en cada segundo.
Unidad ciclos/seg Hz.

La relacin entre la longitud de onda () y la frecuencia () para una onda de luz es:
 = C

C es la velocidad de luz (3,0 x 108 m/s 3,0 x 1010 cm/s)

La relacin entre la frecuencia y el perodo es inverso: v = 1/T
La luz por su naturaleza corpuscular o de partculas puede considerarse como una corriente de
paquetes de energa que se desplazan a gran velocidad (3,0 x 10 10 cm/s).
Estos paquetes de energa se denominan fotones.
La frecuencia ( ) de la teora ondulante puede relacionarse con la energa de los fotones (E) de la
teora de las partculas mediante la Ecuacin de Planck.

E = h

h es la constante de Planck cuyo valor es de 6,63 x 10 -34 joule . s

El nmero de onda es una caracterstica de onda que es proporcional a la energa y se define

como el nmero de ondas por centmetro:

= 1/

Unidad: cm -1

La radiacin electromagntica se divide en regiones denominadas:

Ondas de radio, Microondas, Infrarrojo, Visible, Ultravioleta y Rayos X, las que se encuentran
asociadas con las longitudes de onda, nmero de ondas, frecuencias y energa, se presentan en el
siguiente grfico. El espectro ptico o electromagntico es detectado por equipos especiales como:

FOTOCOLORIMETRO: Cuya zona de observacin es en la Zona visible: (400 700 nm).

ESPECTROFOTOMETRO: Estas pueden ser de dos clases:

1. Espectrofotmetro UV que comprende de 10 a 400 nm.

* UV cercano 200 a 400 nm
* UV lejano 10 a 200 nm

2. Espectrofotmetro IR que comprende de 760 a 10 000 nm

* IR cercano 0,75 a 2,50 m
* IR medio 2,50 a 5,00 m
* IR lejano 5,00 a 10 m

Las molculas biolgicas absorben las radiaciones de la regin UV cercana (200 a 400 nm). Las
protenas lo hacen en el UV lejano debido a los enlaces peptdico, mientras que la Fenilalanina,
Tirosina y Triptfano absorben a 280 nm lo cual constituye el fundamento de una tcnica muy
sensible para determinar protenas sin que se destruya la muestra.

Los esteroides, las bases pricas y pirimidnicas, nuclesidos y nucletidos lo hacen tambin en la
regin UV.
Los enlaces o grupos funcionales como: amino, carboxilo, metilo, amida absorben las radiaciones de
la regin IR.
La molcula o parte de ella que se excita por la luz como consecuencia de la absorcin de sta se
denomina CROMOFORO.
Cuando la luz continua se hace pasar a travs de un prisma, la luz sufre una dispersin de sus
longitudes de onda componentes. Cuando estas longitudes de onda dispersas se les hacen pasar a
travs de una celda que contiene la muestra problema (tomos o molculas), la luz emergente deja
de ser continua ya que parte de las ondas de luz han interaccionado con los tomos o molculas y han
sido absorbidos por stos.

Las longitudes de ondas faltantes se detectan cuando la luz emergente de la celda que contiene la
muestra problema incide sobre una placa fotogrfica o sobre algn dispositivo o detector. A este
procedimiento se le denomina ESPECTROSCOPIA DE ABSORCION.

La longitud de onda en la que las molculas o tomos de la muestra absorben con mayor intensidad
la luz, se denomina LONGITUD DE MAXIMA ABSORCION.

Los procesos de absorcin de las radiaciones electromagnticas son explicados por la Ley de
Lambert-Beer que relaciona la intensidad de la luz incidente (Io) y la transmitida (It) en funcin de
la concentracin de las molculas y tomos que absorben la luz.
Su expresin es:

A = log Io/It = e. l. C

A = - log It/Io = e. l. C

Donde:
A: Absorbancia o Extincin
e : Coeficiente de extincin molar. Valor constante que depende de la naturaleza de la sustancia
y de la longitud de onda.
l: ancho del recipiente de la muestra = 1 cm
C: Concentracin de la muestra problema

II.- OBJETIVOS:

1. Aplicar los conceptos de la espectrofotometra UV - VIS,

2. Representar los resultados de las curvas espectral y estndar del KMn O4
3. Hallar la concentracin de una muestra desconocida de KMn O4 usando la curva estndar o de
trabajo.

III.- MATERIALES Y REACTIVOS:

Equipos: Balanza analtica

Espectrofotmetro
Muestra: solucin de Permanganato de Potasio (KMnO4) 4 %, solucin de anaranjado de metilo 4%,
solucin de azul de metileno 4%.
Tubos de Vidrio, gradillas, fiolas, vasos, pipetas, Picetas.
IV.- PROCEDIMIENTO:

PARTE 1.- Longitud de onda ptima (Curva Espectral) para la solucin muestral.

Encender el espectrofotmetro 30 min antes de empezar a trabajar.

Seleccionar la regin visible (VIS) del espectro, e Iniciar las lecturas desde 400 nm.
Colocar en la cubeta agua destilada y llevar a CERO de Absorbancia y 100% de
Transmitancia.
Colocar en otra cubeta la solucin muestral.
Realizar la lectura en Absorbancia y anotar el valor obtenido.
Aumentar la a 420 nm . Recuerde que cada vez que se cambie de longitud de onda es
necesario graduar el instrumento en CERO con agua destilada en la cubeta. Luego: LEER
la absorbancia.
Repetir la misma operacin DE 20 nm cada vez hasta llegar a 700 nm
En el papel milimetrado dibuje la Curva Espectral A vs

DATOS:

Lectura (A) Lectura (A)

PARTE 2.-Curva de trabajo y cuantificacin de solucin problema.

Clculo de la concentracin de una solucin problema

Existen dos mtodos:

2.1 Mtodo de la curva estndar: Consiste en utilizar varios estndares de concentraciones

conocidas y progresivas para construir un grfico de un sistema de coordenadas, colocndose las
lecturas de concentracin en las abscisas y las lecturas de absorbancia (medidas a la longitud de
onda optima seleccionada) en el eje de la ordenada. En la recta obtenida (funcin lineal) se pueden
extrapolar la absorbancias o densidad ptica de la muestra problema hallando la concentracin de
la misma en el eje de las abscisas

2.2 Factor de Calibracin : El FC relaciona la concentracin de una sustancia estndar con su

absorbancia.
Si la muestra problema y el estndar son procesados de una misma manera la concentracin de la
muestra problema se hallar con la formula siguiente:

Concentracin del estndar

FC = -----------------------------------
Lectura del estndar

MP = Amp x FC
Amp = Absorbancia de la muestra problema
FC = Factor de calibracin

Si la muestra sufre diluciones previas se usar el factor de dilucin ( Fd) que es matemticamente la
inversa de la dilucin
Volumen total
Fd = ---------------------
Volumen medido

MP = Amp x FCx Fd

Fd = Factor de dilucin

Proceder de acuerdo a:
TUBOS 1 2 3 4
KMno4 ml 1 2 3 4
Agua ml. 9 8 7 6
KMno4 mg%

Leer cada uno de los tubos a la longitud de onda elegida o hallada en el primer experimento. Hallar
la concentracin de la muestra problema con los mtodos de la curva estndar y el factor de
calibracin. Proceder de igual modo para las otras soluciones muestras
Comparar ambas medidas y analizar los resultados.

V.- RESULTADOS:
Elaborar las grficas en papel milimetrado con los datos obtenidos en cada uno de los experimentos.

VI.- INTERPRETACIN

VII.- CONCLUSIONES.

VIII.- CUESTIONARIO:

1.- Dibuje las partes bsicas de un espectrofotmetro tpico.

2.- Cules son los cromforos de las protenas que absorben la luz de 280nm?
3.- Cules son los rangos de energa de la regin Ultravioleta UV, Infraroja IR y que aplicacin
medica considera Ud. que estas tendran?
4.- Porque es importante la ley de Lamber y Beer?

MATERIALES ENCARGADOS PARA LA PRCTICA N 3

- 1 litro de agua pH 7(destilada) cada 5 estudiantes en total 1 litro por mesa (son 3)
- 5 goteros por cada mesa, 10 vasitos descartables de 100 ml. por cada mesa.
- Papel Oscuro delgado o preparar un sistema casero cmara o caja pequea con
tapa que pueda mantener oscuridad en los sistemas de tubos hasta el momento de su
lectura.
- Papel secante o papel higinico blanco.
- Papel milimetrado 2 hojas por alumno, Lpiz, regla.
 PRCTICA 4
DETERMINACION DE LA HEMOGLOBINA EN SANGRE

I.- GENERALIDADES:

La hemoglobina es una protena conjugada o heteroprotena de la sangre, de masa

molecular 64.000 g/mol (64 kDa), de color rojo caracterstico, que transporta el oxgeno desde
los rganos respiratorios hasta los tejidos, el dixido de carbono desde los tejidos hasta los
pulmones que lo eliminan y tambin participa en la regulacin de pH de la sangre, en
vertebrados y algunos invertebrados. La hemoglobina es una protena de estructura cuaternaria,
que consta de tres subunidades. Esta protena hace parte de la familia de las hemoprotenas, ya
que posee un grupo hemo que sirve para el transporte de oxgeno y dixido de carbono. La masa
total de eritrocitos de un adulto contiene unos 600gr. de hemoglobina capaces de transportar
800ml de oxgeno.

Una molcula de hemoglobina consta de 2 pares de cadenas polipepticas (unin de

aminocidos) (globina) y 4 grupos proteicos HEM que contienen cada uno un tomo de hierro
en estado ferroso. Cada punto HEM se localiza en una zona determinada de una de las cadenas
de polipeptidos. Localizando cerca la superficie de la molcula, el HEM se combina de forma
reversible con una molcula de oxigeno y dixido de carbono. Este grupo HEM es el
responsable del color rojo de la hemoglobina (Hb).

La parte proteica o globina tiene 4 cadenas polipeptidicas que se denominansegun su

maduracin con las letras , , , . Existe una cadena ms la que est presente durante los 3
primeros meses de vida se diferencian unas de las otras en el numero o posicin (de los
aminocidos de los que estn compuestas). Por lo tanto existen varios tipos de Hb. en el ser
humano se pueden encontrar las siguientes hemoglobinas normales:

Hemoglobina A: consta de 2 cadenas y 2 cadenas en un adulto normal corresponde a ms

del 95% del total.

Hemoglobina A: consta de 2 cadenas y 2 cadenas en un adulto sano esta en porcin menor

de 3%.

Hemoglobina F (fetal): consta de 2 cadenas y 2 cadenas . Es la hemoglobina principal en el

feto desde el 4 mes del embarazo hasta aproximadamente los 6 meses de edad. La Hb F tiene
mayor afinidad por el oxgeno.

Hemoglobina Gower: consta de 2 cadenas y 2 cadenas . Desaparece casi por completo en el

tercer mes de embarazo y empieza a aparecer la Hb fetal.

Algunos datos se obtiene examinando a simple vista una muestra de sangre. Un aspecto normal
del suero o del plasma revela que el pigmento esta en los glbulos rojos. Si se agita en una
sangre total normal en el aire durante 15 min. Adquiere un color rojo claro por convertir la Hb
en oxihemoglobina.

La sangre tiene un color rojo cereza brillante cuando el pigmento es carboxi-hemoglobina en la

intoxicacin por CO. El color es chocolate en la metahemoglobulemia y el color verdoso en la
sulfohemoglobulemia.
 Las distintas Hb tienen espectros de absorcin caractersticas a las que determina en un
espectrofotmetro. La identificacin de diferentes formas de la Hb con la determinacin de sus
espectros de absorcin puede hacerse de una manera sencilla En esta oportunidad se
determinara la concentracin de Hb, por el mtodo de Drabkin .El principio del mtodo se basa
en que el hexacianoferrato (III) de potasio, oxida el hierro (II) del grupo hemo de la Hb a hierro
(III), con lo que se forma la metahemoglobina, la cual se combina con el cianuro de potasio a
pH 7,2 para producir la cianometahemoglobina, complejo de color rojo cuya intensidad de
absorcin se mide por espectrofotometra a una longitud de onda de 540 nm y es proporcional a
la concentracin de hemoglobina en la muestra de sangre.

II.- OBJETIVOS:

- Determinar la cantidad de la hemoglobina en sangre, a travs de una muestra de esta, ya sea

venosa o capilar por el mtodo Drabkin.
-Discutir entre otros las caractersticas y aplicacin de la determinacin de Hemoglobina en
Sangre.

III.- MATERIALES Y EQUIPOS:

Los materiales necesarios para la elaboracin de esta prctica son los siguientes:
1. Espectrofotmetro o fotocolormetro VIS para lecturas a 540nm.
2. Cubetas de una medida de 1,0 cm de paso de luz.
3. Pipetas, puntas de pipetas, Micropipetas,
4. Tubos de ensayo,
5. Gradillas,
6. Probetas de 50 ml
7. Vasos de precipitados de 50 y 100ml
8. EPI (equipo de proteccin individual): Mandil, Guantes de ltex, mascarilla.
9. Parafilm ( Tapar los tubos o y vasos segn sea conveniente )
10. Muestra: en este caso de sangre capilar o venosa.
11. Solucin Drabkin:
12. Patrn de hemoglobina: hemoglobina 15 g/ litro .
13. Material de limpieza y desinfeccin (alcohol, esponjas, escobillas, jabn lquido)

IV.- PROCEDIMIENTO:
La sangre venosa ser recogida en un tubo con anticoagulante (EDTA).
La solucin Drabkin ser preparada con anterioridad, se debe de tener mucho cuidado
(proteccin) para su uso debido a que sus componentes producen dao .
Mezclar perfectamente la sangre problema, por inversin por lo menos 20 veces antes
de tomar la muestra.
Proseguir de acuerdo al siguiente diseo:

Soluciones/ Tubos 1 2 3
Drabkin (ml) 5 5 5
Muestra (ul) - 20 -
Patron (ul ) - - 20
 Mezcle la solucin de Drabkin con la sangre por inversin y con mucha precaucin
(utiliza parafilm para tapar los tubos)
Dejar en reposo por espacio de 3 a 5 minutos. Para que se efecte la reaccin.
Despus de ese tiempo se observara una coloracin roja transparente, se llena
Llevar a lectura en el espectrofotmetro de 540nm.

V.- RESULTADOS:

CLCULOS:
Para calcular la cantidad en sangre de hemoglobina, se usar la siguiente frmula:
ABS. DE LA MUESTRA
Cantidad de hemoglobina = --------------------------------------- x [CONCENTRACIN DEL PATRN]
ABS. DEL PATRN

Valores de referencia:

Nios al nacer.. 13,6 - 19,6 g/dL

Nios de 1 ao..... 11,3 - 13,0 g/dL

Nios de 10 -12 aos... 11,5 - 14,8 g/dL

Mujeres.11,5 - 16,5 g/dL

Hombres 14,0 - 18,0 g/dL

VI.- INTERPRETACIN
VII.- CONCLUSIONES.

VIII.- CUESTIONARIO:

1.- Cual es la razn para el requerimiento de pruebas bioqumicas en humanos

2.- Investigue sobre un caso clnico de aplicacin de determinacin de Hemoglobina
3.- Explique porque hay diferencias de niveles de hemoglobina entre el hombre del ande y
hombre de la costa.

MATERIALES ENCARGADOS PARA LA PRCTICA N 4

- 1 litro de agua pH 7(destilada) cada 5 estudiantes en total 1 litro por mesa (son 3)
- 5 goteros por cada mesa, 10 vasitos descartables de 100 ml. por cada mesa.
- Leer la parte de Materiales y Equipos para complementar este requerimiento.
- Equipo para extraccin de sangre.
 PRCTICA N5

FACTORES QUE ALTERAN LA ACTIVIDAD CATALTICA DE LOS ENZIMAS

I.- GENERALIDADES:

Las enzimas son protenas biocatalizadores, sensibles de modificar su actividad por la alteracin
de las condiciones de su medio de accin ya que actan solo bajo condiciones definidas de pH,
temperatura, concentracin de sustratos, cofactores, etc. Sobre los cofactores hay que recordar
que los enzimas para su actividad requieren de sustancias no proteicas que pueden ser de
naturaleza orgnica (coenzimas) o inorgnicas (minerales) los que cumplen funciones especficas
como la de coordinar entre el centro activo del enzima con el sustrato antes de la transformacin
de ste a producto. Hay medicamentos que actan como competidores de las vitaminas las que
son coenzimas y por lo tanto bloquean la accin de los enzimas o lo que es ms inhiben la
sntesis de los enzimas especficos, por ejemplo el metrotexato (MTX), empleado para el
tratamiento de la leucemia y artritis reumatoide que libera al folato de la enzima hidrofolato
reductasa.
Los enzimas se clasifican por su accin en seis clases; tambin toman el nombre genrico segn
el sustrato por ejemplo los enzimas proteo lticos como la pepsina, quimotripsina, tripsina, etc.

II. OBJETIVO:

Demostrar el efecto de los factores: Concentracin de Sustrato, Concentracin de Enzima, pH,

cofactor y temperatura sobre la actividad enzimtica de la Amilasa salival sobre el almidn.

III.- MATERIALES Y REACTIVOS:

1. Solucin de almidn al 1%
2. Enzima: Solucin de alfa amilasa salival dializada 1%
3. Sol. Buffer fosfato 0,1M a pH 4,6; 6,8 y 9,0
4. Sol. Yodo iodurada (Lugol)
5. Sol Cloruro de sodio 0,2%

IV.- PROCEDIMIENTO:

Coleccin de la saliva: El alumno donante no debe haber ingerido alimento unas 2 horas antes

Preparacin de la solucin de amilasa salival al 1%: Previamente la saliva recolectada se

debe de filtrar a travs de gasa y luego medir 1ml y diluir con agua destilada, llevar a volumen
de 100 ml. en una fiola.

Seguir las indicaciones de las siguientes tablas:

A.- BATERA N1

Reac.\tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Sol. Almidn 1% 1 1 1 1 1 1,5 1 1 1
Buffer pH4,6 - - - 5 - - - - -
Buffer pH 6,8 5 5 - - 5 5 5 5 5
Buffer pH 9,0 - - 5 - - - - - -
 Sol. Na Cl 0,2% 1,4 1,4 1,4 1,4 1,4 1,4 - 1,4 1,4

Agua 2,6 2,0 2,0 2,0 2,4 1,5 3,4 2,0 2,0

HOMOGENIZAR CADA TUBO

Colocar en bao mara a 37C los tubos del 1 al 7 por 5 minutos.

El tubo 8 llevar a 0C por 5 minutos y el tubo 9 a bao mara de 100C por 5 minutos.

Cumplido los 5 minutos, agregar la solucin enzimtica, como se indica en el siguiente Cuadro:

Sol. enzimtica 0,0 0,6 0,6 0,6 0,2 0,6 0,6 0,6 0,6

MEZCLAR BIEN CADA TUBO SIN RETIRARLO DEL MEDIO EN QUE SE ENCUENTRAN

Continuar la incubacin, considerando un control de 20 minutos, desde el momento que el preparado

enzimtico fue agregado a cada tubo.

Cumplido el tiempo exacto de 20 minutos, (incubado) medir 0,5 ml de cada tubo y aadir a la
batera N02 tal como se indica en la siguiente Tabla

B.- BATERA N2.

Reactivo \tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Incubado (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Lugol (gotas) III III III III III III III III III

MEZCLAR. Observar

Reconocimiento de los productos por reaccin con el Benedict:

Reactivo \tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Sol HCl0.05N (ml)

0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Incubado (ml) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Mezclar cada tubo y llevar a Bao Mara hirviente por 5 minutos. Dejar reposar y
comparar los precipitados.
V.- RESULTADOS:

Exprese los resultados en tablas o grficos segn corresponda al efecto hallado en el esquema
general de reaccin.
Verifique y compare la cantidad de precipitado formado en cada uno de los tubos

VI.- INTERPRETACIN
VII.- CONCLUSIONES
VIII.- BIBLIOGRAFIA
IX.- CUESTIONARIO:

1.- Cules son los factores que modifican la actividad de las enzimas? Explique la razn de la
accin de cada uno segn sus resultados.

2.- Describa algn caso clnico que evidencie la participacin de una enzima en particular afectada
por algn factor que ha modificado su actividad o expresin.

3.-Con grficos explique experiencias de diversos tipos de inhibicin enzimtica que se evidencian
en la clnica mdica.

MATERIALES ENCARGADOS PARA LA PRCTICA N5

- 1 litro de agua destilad pH 7, cada 5 estudiantes en total 1 litro por mesa (son 3)
- 5 goteros por cada mesa, 10 vasitos descartables de 100 ml. por cada mesa.
- 10 g. de almidn soluble por cada mesa
- Amilasa salival dializada 1 ml.
- Gasa 1 bolsita pequea.
 PRCTICA N 6

DETERMINACIN DE AMILASA EN SUERO Y ORINA

I.- GENERALIDADES
Las amilasas son enzimas que catalizan la hidrlisis de los enlaces glucosdicos de
molculas hidrocarbonadas complejas. Se secretan por el pncreas exocrinos y las glndulas
salivales para hidrolizar el almidn. Tambin se pueden encontrar en el hgado y en el
revestimieto de las trompas de Falopio.
La amilasa humana se le conoce como alfa-amilasa porque separa los enlaces alfa 1-4 de los
polisacridos dando como productos dextranos, maltosas y algunas unidades de glucosa.
Para el desarrollo de la prctica se ha optado por el mtodo de Caraway, el cual es el ms
accesible al laboratorio de bioqumica. La unidad de actividad enzimtica de amilasa se
define como la cantidad de enzima que en las condiciones establecidas hidroliza 10mg de
almidn en 30 minutos hasta no producirse color con el Iodo.

II.- OBJETIVO
Determinar los valores de amilasa en el suero y orina, mediante mtodo de Caraway

III.- MATERIALES Y REACTIVOS

Sustrato de almidn (500 mg/dl) con buffer (Fosfato 0,1M pH 7,0 )
Solucin de Iodo 0,1 mol/litro (Sol. De reserva)
Solucin Iodo 0,01 mol/litro (Solucin de . de trabajo), diluido en HCl 0,05N
Espectrofotmetro VIS
Bao mara
Erlemeyer (matraz graduado)
Probetas
Pipetas graduadas

IV.- PROCEDIMIENTO
La muestra de sangre debe de ser heparinizada
Medir con la pipeta 5 ml del almidn, amortiguado a pH 7,0, en dos erlemeyer de 50 ml de
volumen rotulados como testigo y problema.
Slo al erlemeyer problema llevar a BM a 37C por 5 minutos.
Con una micropipeta aadir 0,1 ml (100 l) de suero. Mezclar por agitacin horizontal e
incubar a BM por 7 minutos.
Retirar el erlemeyer problema del BM y aadir inmediatamente 5ml de iodo 0,01 mol/litro a
ambos erlemeyers se agita brevemente, se afora con agua destilada, se mezcla.
Leer la absorbancia a 590 nm utilizando agua como blanco.
Llevar a cabo el mismo procedimiento con la muestra de orina

V.- CALCULOS

Amilasa (U/L) = Lectura de testigo Lectura de problema X 7500*

Lectura de testigo
*7500 U/l: Por definicin la unidad Caraway para actividad de amilasa es la cantidad de
enzima que digerir 10 mg de almidn en 30 min. a 37 C. De la condicin de reaccin
anterior, la digestin de almidn completa requiere:

500 mg (almidn/dl) 0.5 ml 30 min

(se digiere 10 mg de almidon) 100 ml/dl
---------------- x -------------- x -------------- x ----------------- = 750 U/dl o 7500 U/l
1000 ml 10 mg/U 5 min(incubacin) 0.02 ml(de muestra)

VALORES REFERENCIALES:
En suero 600 1800 U/l
En orina Menor a 5000 U/l

VI.- INTERPRETACIN
VII.- CONCLUSIONES
IX.- CUESTIONARIO:
1.- Cuales son las caractersticas diferenciales entre las diversas amilasas que ejercen
actividad enzimtica en el organismo humano.
2.- En qu casos patolgicos se encuentran altas concentraciones de amilasa y en qu casos
bajas concentraciones?

VIII.- BIBLIOGRAFIA

MATERIALES ENCARGADAS PARA LA PRCTICA N 6

- Muestra de Sangre para extraer suero o plasma

- Tubo con anticoagulante heparina
- Almidn soluble 10 gramos
- Agua destilada
 PRCTICA N 7

DETERMINACIN DE GLUCOSA EN PLASMA

I. GENERALIDADES:

Los carbohidratos de la dieta estn constituidos por azcares simples (Glucosa, fructosa y galactosa),
disacridos (sacarosa, lactosa y manosa) y complejos (almidn).

Las enzimas, como la amilasa y dems enzimas glucolticas presentes en el intestino convierten a los
disacridos y al almidn en hexosas, siendo la glucosa la principal.

La funcin principal de la glucosa es como fuente de energa para el trabajo de las clulas. Rol que
cumple cuando ingresa a las clulas donde se activa por accin de la Hexocinasa, la cual presenta 4
isoenzimas (I, II, III y Glucocinasa). El transporte de la glucosa a travs de la membrana celular,
mayormente se encuentra relacionado con la Insulina quien junto con el hgado regula los niveles de
glucosa srica.

Los niveles altos de glucosa en suero caracteriza a la enfermedad conocida como Diabetes I y II.
Qumicamente la glucosa puede estar bajo la forma de una estructura aldehdica (estructura abierta) y
que por el pH fisiolgico se encuentra bajo la forma enodilica (Cclica). El equilibrio entre la forma
aldehdo/enodiol permite que la glucosa pueda ser reducida y oxidada con facilidad.

La determinacin de la glucosa se basa en la capacidad reductora de este azcar sobre el ion cprico
(Cu++) a quien transforma en ion cuproso (Cu+). Este ion monovalente en un medio alcalino y en
calor se transforma en xido cuproso (Cu2O). Este compuesto puede ser detectado por diferentes
mtodos como: Folin-Wu, Somogyi-Nelson y las modificaciones de estos conocidos como Benedict.
Sin embargo, slo son indicadores cualitativos o semicuantitativo.

Actualmente la determinacin de glucosa en suero se realiza por mtodos enzimtico como el

conocido:

MTODO ENZIMATICO (TRINDER)GLUCOSA-OXIDASA (GOD), cuyo fundamento es: la

glucosa es oxidada por la Glucosa oxidasa a cido glucnico ms perxido de hidrgeno, el agua
oxigenada en presencia de una peroxidasa produce la copulacin oxidativa del fenol con la 4-
aminofenazona (4AF), dando lugar a la formacin de un cromgeno rojo-cerezo con absorbancia
mxima a 505 nm.
GOD
GLUCOSA+ O2 + HOH Ac.Glucnico + H2O2

H2O2+ 4AF + fenol POD CROMOGENO + 4 HOH

II. OBJETIVO:

Determinar y cuantificar a travs de mtodo enzimtico los valores de glucosa en el plasma por
espectrofotometra.

III. MATERIALES Y REACTIVOS:

Muestra: plasma
 - Tubos de ensayo 13 x 100 mm-Bao Mara
- Espectrofotmetro a 505 nm -Kit trtabajo.

IV.- PROCEDIMIENTO:

DETERMINACIN DE LA GLUCOSA EN SOLUCION PREPARADA:

Proceder segn las indicaciones del Cuadro siguiente:

Tubos Blanco Estndard Desconocido

(b) (s) (D)
Estndard (ul) - 20 -
Muestra (ul) - - 20
Rvo.trabajo (ml) 2.0 2.0 2.0

Incubar a 37c por 10 minutos.

Retirar de B.M y enfriar a chorro de agua fra por 1-3 min.

Llevar a lectura espectrofotomtrica a 505 nm., llevando el aparato a cero con el blanco.

CLCULOS:

GLUCOSA (g/L) = D x F

DETERMINACIN DEL FACTOR (F):

F = 1.0 g/lt
Lec.Est

V.- RESULTADOS VI.- INTERPRETACIN, VII.- CONCLUSIN

VIII.- CUESTIONARIO:

1.- Mencionar los niveles de glucosa en el lquido cefalorraqudeo en estado de ayuno, en diabticos
2.- Mencione casos clnicos para hiperglucemia e hipoglucemia

IX.- BIBLIOGRAFIA

MATERIALES ENCARGADOS PARA LA PRCTICA N 7

- 1 litro de agua destilad cada 5 estudiantes en total 1 litro por mesa 5 goteros por cada mesa,
- 10 vasitos descartables de 100 ml. Por cada mesa
- Kit de reactivos para glucosa
- Plasma fresco 5 ml. Normal y de hiperglicemico
 PRCTICA N 8

ACCIN DE LA LIPASA PANCRETICA

I.- GENERALIDADES:

La lipasa, al igual que la amilasa; tripsina y pepsina, pertenecen a las hidrolasas, diferencindose de
otros estearasas por actuar especficamente en la interfase steragua y ser inactiva frente a sustratos
hidrosolubles.

Es secretado por las clulas acinosas del pncreas y acta a pH alcalino. Su accin hidroltica la
ejerce a nivel de yeyuno, favorecido por la propiedad emulsificante de las sales biliares (glicocolato
y transcocolato) posicin; rompen los enlaces steres de la glicerina (triglicridos en
liberando monoglicridos los que sern atacados posteriormente por lipasas especficas para
posicin o por las isomerasas quienes cambian la posicin por pero debido a que la accin de las
isomerasas es lenta; los productos de la digestin de triglicridos son: abundantes
monoglicridos, pequea cantidad de di y triglicridos, glicerol y cidos grasos libres.
La lipasa pancretica, de gran inters clnico, se presenta en la sangre en escasas concentraciones (0 a
1.5 unidades de Cherry Grandall), niveles altos son indicadores de pancreatitis aguda, carcinoma de
pncreas, peritonitis aguda y obstruccin intestinal.

II.- OBJETIVO:

Demostrar experimentalmente la hidrlisis enzimtica de los triglicridos.

III.- MATERIALES Y REACTIVOS:

1.1. MATERIALES
Pipetas simples de 5 y 10 ml
Bao Mara 37C
Bureta de 50 ml
Matraces 125 ml
Aceite comercial

1.2. REACTIVOS
Buffer fosfato pH 8.0
Hidrxido de sodio 0.1 N
Hidrxido de sodio 0.01 N
Solucin alcohlica fenolftalena
Solucin de pancreatina y sales biliares.

IV.- PROCEDIMIENTO:

Muestra con que se trabajar la Experiencia: Aceite Neutralizado.

1. Neutralizacin del aceite . Colocar 50 ml del aceite en un matraz, aadir 2 gotas de

solucin alcohlica de fenolftalena.
 Mezclar y agregar poco a poco Hidrxido de Sodio 0.01 N hasta una coloracin ligeramente
rosada.

2. Solucin de pancreatina y sales biliares.- Para su preparacin se har uso de frmacos

comerciales como el Helopanzyn que contiene 200 mg. de pancreatina y 50 mg. de sales
biliares.
Disolver 5 pastillas en 100 ml. de buffer fosfato pH 8.0.

3. Hidrlisis del aceite (Triglicrido).- Seguir las indicaciones del siguiente cuadro.

SOLUCIONES TUBOS 1 2 3 4

g aceite neutralizado 2 2 2 2
ml buffer fosfato pH 8.0 4 4 - 4
ml. agua destilada 10 - 4 -

Agitar bien. Si el color ligeramente rosado no persiste aadir Hidrxido de Sodio 0.1 N poco a
poco agitando continuamente hasta obtener el color.

ml. de solucin pancreatina - 10 10 10

Previo hervor

Llevar a B.M. de 37C por una hora.

Titular el contenido de cada tubo con Hidrxido de sodio 0.01 N hasta color rosado usando solucin
alcohlica de fenolftalena como indicador.

CALCULOS:

A.G.L% = Gasto NaOH N/100 x Fact.conversin Ac.Olico x N x 100

g de muestra

V.- RESULTADOS

VI.- CONCLUSION

VII.- INTERPRETACION

VIII.- CUESTIONARIO

1.- Qu lipasas conoces y donde actan?

2.- Qu funciones cumplen la colipasa y las sales biliares?
3.- Cmo estn compuestas las sales biliares?

IX.- BIBLIOGRAFIA
 MATERIALES ENCARGADOS PARA LA PRCTICA N 8

- 1 litro de agua destilad (pH 7) cada 5 estudiantes en total 1 litro por mesa (son 3)
- 5 goteros por cada mesa, limpios y secos 10 vasitos descartables de 100 ml. por cada mesa.
- 50ml. de aceite por cada mesa de trabajo.
- 5 Pastillas que contengan pancreatina o lipasa pancretica con c. Biliares, por cada mesa
(Pankreoflat , helopanzyn , Pankreon etc).
 PRCTICA N 9

DETERMINACIN DE TRIGLICRIDOS

I.- GENERALIDADES:

Forman parte de las lipoprotenas. Pueden ser exgenos o endgenos.

Se encuentran en mayor porcentaje en los quilomicrones y en la VLDL.
Es la forma como se encuentran almacenados los lpidos en los tejidos adiposos.

La determinacin de TG totales se fundamenta en las siguientes reacciones:

Trigliceridos + H20 Glicerol + Acidos grasos

LPL
Glicerol + ATP Glicerol 3 fosfato + ADP
GK
Glicerol 3 fosfato + O2 Dihidroxicetona fosfato + H2O2
GPO
POD
2H2O2 + 4-amino antipirina + 4-clorofenol Rojo de Quinona + 4H2O

El rojo quinona es ledo a 510 nm a una temperatura de 37 C.

II.- OBJETIVO:

Determinar la concentracin de triglicridos en sangre.

III.- MATERIALES Y REACTIVOS

Muestra: Suero o plasma

REACTIVOS:

Buffer pH 6,9 40 mmol/L

4-Clorofenol 5.0 mmol/L
Lipoprotein Lipasa 1,4 U/ml
Glicerol Kinasa 1,0 U/ml
Glicerol 3 fosfato oxidasa 1,5 U/ml
Peroxidasa 0,5 U/ml
4 Amino antipirina 0,4 mmol/L
ATP 1,0 mmol/L
Magnesio 5,0 mmol/L
Detergentes

ESTANDAR:
 Triglicridos 2,2 mmol/L 200 mg/dl

IV.- PROCEDIMIENTO:

Segn las indicaciones

Blanco Estndar Muestra

Reactivo de trabajo 1 ml 1ml 1ml
Estndar - 10 ul -
Muestra - - 10 ul

Mezclar e incubar a 37C por 5 minutos. Leer a 510 nm.

CALCULOS:

mg/dl = Conc estandar X Lectura de Muestra

Lectura de estndar

VALORES DE REFERENCIA:

Varones: 0,68 1,88 mmol/L 60,2 166,4 mg/dl

Mujeres: 0,63 1,60 mmol/L 56,6 141,6 mg/dl

V.- RESULTADOS
VI.- INTERPRETACION
VII.- CONCLUSION
VIII.- CUESTIONARIO.

1.- Mencione los tipos de hipertrigliceridemias

2.- Qu son los cidos grasos omegas? Cul es el papel en el metabolismo?

IX.- BIBLIOGRAFIA

MATERIALES ENCARGADOS PARA LA PRCTICA N 9

- 1/2 litro de agua destilad pH7 cada 5 estudiantes en total 1/2 litro por mesa (son 3)
- Kit de reactivos para determinacin de triglicridos
- Plasma fresco 5 ml. Normal y de hipertrigliceridemico
- Kits de reactivos para determinacin de Triglicridos
 PRCTICA N 10

DETERMINACIN DE COLESTEROL EN SANGRE

I.- GENERALIDADES:

El colesterol presente en el organismo humano, procede de la dieta el que es absorbido a nivel del
tracto intestinal junto con los cidos grasos.
Tambin se obtiene por sntesis (en el hgado) a partir del acetato por va del escualeno.
El colesterol est integrado por las lipoprotenas VLDL (13%) + LDL (70%) + HDL (17%).

Quiz es el lquido de mayor inters particular, se encuentra en los ms variados tejidos (nervioso,
graso, bilis donde puede formar gran parte de los clculos biliares, sangre, entre otros), es excretado
normalmente por las heces, donde tambin se encuentran algunos de sus derivados (coprosterol).

El colesterol es uno de los principales componentes de la fraccin insaponificable de la sangre,

donde 2/3 se encuentran sobre la forma estrica y 1/3 libre. Esa proporcin es normalmente
constante y las dos porciones se hallan dbilmente ligadas a las protenas plasmticas (+/- 75% en
las beta-lipoprotenas).

II.- OBJETIVO:

Determinar y cuantificar a travs de mtodo enzimtico los valores de Colesterol sanguneo.

III.-MATERIALES Y REACTIVOS:

Mtodo: ENZIMATICO COLESTEROL-OXIDASA (CHOD) - TRINDER

Fundamento:
El Colesterol es oxidado enzimticamente por el colesterol-oxidasa (CHOD) previa hidrlisis
enzimtica de los steres mediante una Lipasa de origen fungal.
El agua oxigenada generada en la oxidacin, produce la copulacin oxidativa del fenol con la 4-
aminofenazona (4AF), mediante una reaccin catalizada por la peroxidasa.
El producto es una quinona roja con absorbancia mxima 505 nm.

LIPASA
ESTERES DE COLESTEROL COLESTEROL + ACID GRASOS
CHOD
COLESTEROL + 02 Colesten-3-ona + H2O2
POD
H2O2 + 4AF + FENOL 4 (P-benzoquinona-mono-imino)-
fenazona + 4H20

REACTIVOS:
 Solucin Stndard de Colesterol: 2 g/litro
Solucin de Enzimas: .
Lipasa Fungal (300 U/ml)
Colesterol-oxidasa (34 U/ml)
Peroxidasa (20 U/ml)
Solucin 4-aminofenazona: 25 mmol/litro
Solucin de Fenol: 55 mmol/litro.

IV.- PROCEDIMIENTO:

Toma de muestra: Paciente en Ayuno por 12 16 Horas

- Se debe proceder a la extraccin de 5 cc. de sangre, tomada en un tubo de 13 x 100 mm.
- Cada muestra ser centrifugada a 2500 rpm x 5 min. y se separar el suero, en otro tubo.

NOTA: Si se trabaja con plasma, la muestra de sangre debe haber sido tratada solamente con
Heparina como anticoagulante.

Seguir las indicaciones de la tabla:

Tubos Blanco (B) Estandar (S) Muestra

Estandard (ul) ---- 20 ---

Muestra (ul) ---- ---- 20

Rvo.Trabajo (ml) 2.0 2.0 2,0

- Incubar a 37C por 15 minutos o 30 min. a temperatura ambiente.

- Retirar de B.M. y enfriar a chorro de agua fra por 1-3 min.
- Llevar a lectura espectrofotomtrica a 505 nm., llevando el aparato a CERO con el
BLANCO.

CLCULOS:

COLESTEROL (g/L) = M x F

DETERMINACION DEL FACTOR (F):

F = 2.0 g/lt
S

VALORES DE REFERENCIA:

SUERO o PLASMA: HOMBRES: 1,72 a 2,48 g/L.

MUJERES: 1,75 a 2,40 g/L.
V. RESULTADOS
VI.-INTERPRETACIN
VII.-CONCLUSIN

VIII. CUESTIONARIO:
1.- Cules son las funciones del colesterol en el organismo?
2.- Bajo que formas y a travs de que vas el colesterol se absorbe en el intestino?
3.- Cules son los tipos y funciones de las protenas?
4.- Cules son los tipos de hiperlipoproteinemias?
5.- Qu factores determinan la formacin de la placa ateromatosa en la arterioesclerosis?

MATERIALES ENCARGADOS PARA LA PRCTICA N 10

- Kit de reactivos para determinacin de colesterol

- Plasma fresco 5 ml. Normal y de hipercolesterolemico
- Agua destilada
- Equipo para extraccin de sangre y separacin de plasma
 PRCTICA N 11

DETERMINACIN DE PROTENAS PLASMTICAS

I.- GENERALIDADES:

Las protenas son compuestos macromoleculares, ampliamente distribuidos en el organismo:

Actan como elementos estructurales y de transporte y aparecen bajo la forma de enzimas,
hormonas anticuerpos, factores de coagulacin etc. Esta multiplicidad de funciones hace que
las protenas resulten esenciales para la vida.
En el plasma las protenas contribuyen a mantener el volumen del fluido circulante, actan en
la inactivacin de compuestos txicos y en la defensa contra agentes invasores.
La protena ms abundante es la albmina, que permite el transporte de los cidos grasos,
hormonas esteroides, bilirrubina, catecolaminas que en forma libre son solubles en el medio
acuoso, mantiene la presin coleidoosmtica, lo que estara relacionado con su carga neta y su
peso molecular.
La concentracin de protena total es muy til en el monitoreo de cambios que se producen
en ella, as como consecuencia de diversas patologas. Niveles elevados se encuentran en
procesos de deshidratacin mieloma mltiple, nefropatas crnicas y niveles bajos en algunas
patologas renales.

II.-. OBJETIVO:

Determinar protenas totales por el mtodo de Biuret y Albmina mediante el mtodo

enzimtico

III.- MATERIALES Y METODOS:

Sulfato de Cobre 15 mM Tubos de prueba

Tartrato de sodio y potasio 70mM Vasos de precipitado
Ioduro de potasio 10 mM Matraces, Gradillas, Fiolas
Hidrxido de potasio 200 mM Vaguetas, Balanzas y otros
Kit de reactivos para determinacin de albminas
Verde de Bromocresol 0,20 mM
Buffer Succinato pH 3.8 100 mM
Estndar: Solucin de albuminas y globulinas en estado nativo con ttulo conocido de
protenas y albumina

OBTENCIN Y PREPARACIN DE LAS MUESTRAS:

A) Para protenas: Se debe obtener suero libre de hemolisis. Posteriormente se realiza una dilu
cin del suero 1/10 tomndose 0,2 ml. de suero y se completa con 1,8ml. de agua destilada
(Volumen final 2,0ml) Tomar
B) Para la Albumina Se debe obtener suero libre de hemlisis. Tomar 0,2 ml. de suero y
completar con 1,8 ml. de buffer succinato pH 3,8 (Volumen final 2,0ml).
IV.- PROCEDIMIENTO:
DETEMINACIN DE PROTEINAS TOTALES
En tres tubos de pruebas marcados (B S MP) y proceder de acuerdo al siguiente cuadro

Soluciones Blanco Estndar Muestra

St. Protenas g/dl. ml. - 0,4 -

Suero diluido - - 0.4
Reactivo de Biuret 4,0 4.0 4.0
Agua destilada 1,0 0,6 0.6

Mezclar e incubar durante 10 minutos a 37C.

Leer las absorbancias a 540 nm cerrando con el blanco, teniendo en cuenta que la estabilida
d del color resultante es 30 minutos.

CALCULOS:
G/dl de protena = Lectura de la MP x FC x FD FC = estndar

Valores Normales 6.0 - 8.0 g/dl

FC = Cc estndar / Absorbancia del estndar.

Determinacin de albuminas

Soluciones/Tubos B S D

Estndar ul - 20 -
Suero o Plasma ul - - 20
Reactivo de trabajo ml. 2 2 2

Llevar a B M por 5 minutos a temperatura ambiente Leer la absorbancia a 625nm

G/dl= DO. Muestra problema x Fc x Fd x Fc

Valores normales 3,5 a5,0 g/dl

F c = Estndar protenas g/dl/DOAlbumina

Relacin albumina /globulina ( A/G ) :
A/G= Albumina g/dl / (Protena total g/dl- Albumina g/dl )

Valores de referencia
Se determin el contenido de PT y A en suero de personas sanas, de ambos sexos, con a
limentacin mixta normal y edades entre 17 y 40 aos . Se obtuvieron los siguientes r
angos:

Protenas Totales 6,0 a 8 g/dl

Albumina 3,5 a 5,0 d/dl
Relacin A/G 1,2 a 2,2
 V. RESULTADOS
VI.- INTERPRETACIN
VII.- CONCLUSIONES

VIII.- CUESTIONARIO:

1.- Defina que son las hipoproteinemias e hiperproteinemias.

2.- Con respecto a la pregunta anterior. Cules son las posibles causas del origen?
3.- Fundamente las reacciones para la determinacin de albuminas y protenas totales s
egn el mtodo utilizado en la prctica.
4.- Cul es la concentracin de albminas y globulinas presentes en el plasma? y Cul es su
Aplicacin clnica?

IX. BIBLIOGRAFIA:

MATERIALES ENCARGADOS PARA LA PRCTICA N 11

- Agua destilada, Kit de reactivos

- Plasma fresco 5 ml. Normal
 PRACTICA N 12
DETERMINACIN DE CREATININA EN SUERO Y EN ORINA

I. GENERALIDADES:

La creatina es una sustancia presente en los tejidos musculares, se encuentra bajo la forma
de creatina-Fosfato, complejo productor de ATP energa necesaria para las contracciones
musculares por accin de la actina y miosina.
Aproximadamente un 2% de creatina se transforma en creatinina como producto de su
catabolismo. La creatinina es transportado por los vasos sanguneos hacia los riones y
eliminado por la orina y en pequeas cantidades con las heces. La creatinina normalmente
en orina de adulto es de 1 a 1,5 g/100ml de orina en 24 horas.
En sangre la cifra normal esta entre 1 a 2 mg/100ml y es proporcional a la masa muscular,
por lo que en mujeres son ms bajos (0,4 a 1,1 mg/100ml).
Hay variaciones entre los individuos: *Diferencia en la masa muscular y por tanto de
produccin de creatinina en distintos individuos. * Diferencia en la ingesta de carne. Un Kg
de carne contiene de 2 a 5 g de creatina que se convierte en creatinina en el proceso de
coccin. *Del 15 al 30% de la creatinina excretada diariamente es de origen alimentario.
Los niveles se incrementan en estados de hipertiroidismo, sndrome febril, inanicin,
miopatas, diabetes sacarina, tratamiento con ACTH o corticoides.
La determinacin de creatinina en plasma es til para el diagnstico y pronstico de las
nefropatas, obstrucciones urinarias por afeccin de prstata, vejiga y urteres.
El ndice de creatinina/talla es un mtodo para medir la protena muscular.
% ndice creatinina/talla = mg de creatinina orina en 24 horas x 100
mg creatinina ideal/talla/24 horas
La medida de creatinina en el lquido amnitico es importante para valorar la madurez fetal.
Representa la masa muscular del feto. La cifra de 2mg/dl indica seguridad de madurez fetal
en el 94% de los casos.
Las cifras inferiores a 1.10mg/dl, corresponde a feto de 6 meses y cifras de 2 y 4 mg/dl,
indican que el feto pasa de las 36 semanas.
II. OBJETIVO
Demostrar los niveles de creatinina en orina de estudiantes que practican su deporte y en
estudiantes sedentarios
III. MATERIALES Y REACTIVOS
Pipeta automtica
Pipeta de 1 ml
Tubos de ensayo
Gradilla
Espectrofotmetro
Reactivos:
Muestra orina despus de practicar deporte y orina en estado de ayuno
a. Solucin de cido pcrico 46,2 mmol/l
b. Solucin de NaOH 300 mmol/l adicionado con 1% de tensioactivo no inico
c. Solucin estndar de creatinina: 2mg/dl

IV. PROCEDIMIENTO
1. Preparar el reactivo de trabajo, con la mezcla de las soluciones a y b en un frasco oscuro.
2. Centrifugar la muestra de sangre a 3000 rpm por 5 minutos. En caso de orina diluir 1:50
4. En tres cubetas de 1cc marcadas B (Blanco), S (Estndar) y D (Desconocido), colocar:

B S D
R. Trabajo 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
Estndar - 100 ul -
Muestra - - 100 ul
5. Leer la densidad ptica en espectrofotmetro a 492 nm.
6. Leer la absorbancia despus de 30 s de haber puesto la cubeta. Anotar lectura ASt1. Dejar pasar
90 segundos despus de la primera y anotar lectura ASt2.
7. Proceder igual con la muestra: AM1 y AM2
8. Calcular el resultado: Antes calcular ASt = ASt2 Ast1 y AM = AM2 AM1
mg % = AM x Conc, Estndar
St

V. RESULTADOS

Valores normales de Creatinina:

0,7 1,4 mg/dl Varones
0,6 1,1 mg/dl Mujeres

VI.- INTERPRETACIN
VII.-CONCLUSIN

VIII.- CUESTIONARIO:
1.- Escriba la explicacin bioqumica de los niveles de creatinina en estado de
hipertiroidismo y tratamientos con corticoides.
2.- Escriba la sntesis de la creatina

VIII.- BIBLIOGRAFA:

MATERIALES ENCARGADOS PARA LA PRCTICA N12

- Sangre y orina de estudiantes deportistas y de no deportistas

- Material para extraccin de sangre.