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Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Diagnstico laboratorial
MINISTRIO DA SADE
Secretaria de Vigilncia em Sade
Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais
SAF Sul Trecho 2, Bloco F, Torre 1, Edifcio Premium
CEP: 70070-600, Braslia - DF de doenas sexualmente
transmissveis, incluindo o vrus
E-mail: aids@aids.gov.br
Home page: www.aids.gov.br

Para mais informaes, por favor, contatar:


Departamento de Sade Reprodutiva e Pesquisa da imunodeficincia humana
Organizao Mundial da Sade
Avenue Appia, 20, CH-1211, Genebra 27, Sua
Fax: +41 22 791 4171
E-mail: reproductivehealth@who.int
Home page: www.who.int/reproductivehealth
Diagnstico
laboratorial de doenas
sexualmente transmissveis,
incluindo o vrus da
imunodeficincia humana
Publicado pela Organizao Mundial da Sade em 2013 sob o ttulo Laboratory diagnosis of sexually transmitted
infections, including human immunodeficiency virus

Organizao Mundial da Sade 2013

A Organizao Mundial da Sade concedeu os direitos de traduo e publicao da presente edio em portugus
Coordenao de Laboratrio do Departamento de DST, AIDS e Hepatites Virais, que a nica responsvel pela
qualidade e fidelidade da traduo em portugus. Em caso de qualquer inconsistncia entre as edies em ingls e
portugus, a edio original em ingls dever ser considerada a edio juridicamente vinculativa e autntica.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana /


Coordenao de Laboratrio do Departamento de DST, AIDS e Hepatites Virais 2014.

1.Doenas sexualmente transmissveis diagnstico. 2.Infeces por HIV - diagnstico. 3.Tcnicas e procedimentos de
diagnstico. 4.Laboratrios.
Diagnstico laboratorial do diagnstico de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia
humana

2013 2015

Responsveis pela publicao em ingls: Responsveis pela publicao em portugus:

Editor-chefe Departamento de DST, AIDS e Hepatites Virais

Magnus Unemo Fabio Mesquita


Centro de Colaborao da OMS para Gonorreia e outras Diretor do Departamento de DST, AIDS e Hepatites Virais
DST
Adele Schwartz Benzaken
Hospital Universitrio de rebro, rebro, Sucia
Diretora-Adjunta do Departamento de DST, AIDS e
Editores Hepatites Virais

Ronald Ballard Miriam Frachini


Centros de Controle e Preveno de Doenas Coordenadora de Laboratrio do Departamento de DST,
Atlanta, Georgia, Estados Unidos da Amrica AIDS e Hepatites Virais

Catherine Ison Traduo:

Sade Pblica da Inglaterra (anteriormente Agncia de Nazle Mendona Collao Vras


Proteo Sade)
Londres, Reino Unido Reviso tcnica:
David Lewis Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho
Instituto Nacional de Doenas Transmissveis Roberta Barbosa Lopes Francisco
Joanesburgo, frica do Sul Jos Boullosa
Francis Ndowa Bruna Lovizutto Protti
Organizao Mundial da Sade Ana Flvia Pires
Genebra, Sua Mariana Villares

Rosanna Peeling Regina Comparini

Escola de Higiene e Medicina Tropical de Londres Pmela Cristina Gaspar

Reviso ortogrfica:

Angela Gasperin Martinazzo

Projeto grfico e diagramao:

Ademildo Coelho Mendes


Fernanda Dias Almeida Mizael
Marcos Cleuton de Oliveira
Sumrio

Siglas e abreviaturas vii


Prefcio xi
Agradecimentos xiii
1 Escolha de testes para doenas sexualmente transmissveis
Edward W. Hook III, Francis Ndowa, David Mabey, Manju Bala e Ye Tun 1
2 Gesto da qualidade no laboratrio
Catherine Ison e Ronald Ballard 11
3 Micoplasmas genitais
Jrgen Skov Jensen e Magnus Unemo 17
4 Gonorreia
Magnus Unemo e Catherine Ison 23
5 Infeces por clamdia
Barbara Van Der Pol e Magnus Unemo 61
6 Tricomonase
Yaw Adu-Sarkodie, Magnus Unemo, and Barbara Van Der Pol 83
7 Vaginose bacteriana
Yaw Adu-Sarkodie e Catherine Ison 95
8 Candidase
Yaw Adu-Sarkodie e Catherine Ison 101
9 Infeces pelo vrus da herpes simples (HSV)
Laurent Blec 105
10 Sfilis
Ronald Ballard e Edward W. Hook III 121
11 Linfogranuloma venreo (LGV)
Ronald Ballard 147
12 Cancro mole
David Lewis 149
13 Donovanose (granuloma inguinal)
David Lewis 157
14 Infeces pelo papilomavrus humano (HPV)
Suzanne Garland 161
15 Infeces pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV)
Bharat S. Parekh, Dennis Ellenberger, Larry Westerman, Chunfu Yang
e John N. Nkengasong 175

Sumrio v
Anexos
Anexo 1. Microscopia e princpios de colorao
Catherine Ison 189
Anexo 2. Princpios dos testes point-of-care rpidos
Rosanna Peeling 197
Anexo 3. Princpios dos testes moleculares para o diagnstico de doenas sexualmente
tranmissveis
Cheng Y. Chen e Magnus Unemo 205
Anexo 4. Meios, reagentes, testes de diagnstico e corantes (protocolos)
Stefania Starnino e Jo-Anne R. Dillon 223
Anexo 5. Materiais de laboratrio
Stefania Starnino e Jo-Anne R. Dillon 245

vi Diagnstico laboratorial do diagnstico de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Siglas e abreviaturas

ACT gar cistena tripticase DNA cido desoxirribonucleico; do ingls


AEQ Avaliao externa da qualidade deoxyribonucleic acid
AIDS Sndrome da imunodeficincia DP Desvio padro
adquirida; do ingls acquired dsDNA DNA de fita dupla; do ingls double-
immunodeficiency syndrome stranded DNA
AIQ Avaliao interna da qualidade DST Doenas sexualmente transmissveis
ARV Antirretroviral EA ster de acridnio
AVAI Anos de vida ajustados por ECD Ensaio cintico duplo
incapacidade EDL Ensaios desenvolvidos por laboratrios
BD Becton, Dickinson and Company EIA Imunoensaio enzimtico; do ingls
bDNA DNA em cadeia ramificada; do ingls enzyme immunoassay
branched chain DNA EID Ensaio de imunofluorescncia direta
C2CA Amplificao crculo a crculo; do ingls ELISA Ensaio imunossorvente ligado enzima;
circle-to-circle amplification do ingls enzyme-linked immunosorbent
CCUG Coleo de Culturas da Universidade de assay
Gotemburgo (Gotemburgo, Sucia) EM Espectrometria de massa
CDC Centros de Controle e Preveno de EQI Ensaio de quimioluminescncia
Doenas; do ingls Centers for Disease EUCAST Comit Europeu para o Teste a
Control and Prevention (Atlanta, Susceptibilidade Antimicrobiana;
Gergia, Estados Unidos da Amrica); do ingls European Committee on
CH/CH2 Captura hbrida/captura hbrida II Antimicrobial Susceptibility Testing
CIM Concentrao inibitria mnima FCE Fluido cerebroespinal
CIQ Controle interno da qualidade FDA Administrao de Alimentos e Drogas
CLSI Instituto de Padres Clnicos e dos Estados Unidos da Amrica; do
Laboratoriais; do ingls Clinical and ingls United States of America Food
Laboratory Standards Institute and Drug Administration
CO2 Dixido de carbono FITC Isotiocianato de fluorescena; do ingls
CQ Controle de qualidade fluorescein isothiocyanate
CSPS Controle de substncias prejudiciais FO Fuido oral
sade FRET Transferncia de energia de
Ct Ciclo limiar ressonncia por fluorescncia; do ingls
CV Carga viral fluorescence resonance energy transfer
CV Coeficiente de variao FTA-Abs Absoro do anticorpo treponmico
CVA Cofatores vitaminas aminocidos fluorescente; do ingls fluorescent
CVV Candidase vulvovaginal treponemal antibody absorption
DBS Mancha de sangue seco; do ingls dried g Acelerao da gravidade
blood spot GASP Programa de Vigilncia da
DIP Diagnstico infantil precoce Susceptibilidade Antimicrobiana;
DMC DNA metiltransferase do ingls Gonococcal Antimicrobial
citosina-especfica Susceptibility Surveillance Programme
GC Meio gar base GC

Siglas vii
gG Glicoprotena G LR Tipos de baixo risco; do ingls low-risk
GKNP Soluo glicose-potssio-sdio-fosfato types
GQ Garantia de qualidade LSIL Leso intraepitelial de baixo grau; do
HBV Vrus da hepatite B; do ingls hepatitis ingls low-grade intraepithelial lesion
B virus MALDI-TOF Ionizao e dessoro a laser assistida
HCV Vrus da hepatite C; do ingls hepatitis por matriz tempo de vo; do ingls
C virus matrix-assisted laser desorption
HIV Vrus da imunodeficincia humana; do ionizationtime of flight
ingls human immunodeficiency virus MH Mueller-Hinton
HIVDR Resistncia do HIV s drogas da terapia MIF Microimunofluorescncia
antirretroviral; do ingls HIV drug MOMP Protena principal da membrana
resistance externa; do ingls major outer
HPA Ensaio de proteo da hibridizao; do membrane protein
ingls hybridization protection assay MTM Meio de Thayer-Martin modificado
HPV Papilomavrus humano; do ingls NAAT Teste de amplificao de cido nucleico;
human papillomavirus do ingls nucleic acid amplification test
HR Tipos de alto risco; do ingls high-risk NAH Ensaios de hibridizao de cidos
types nucleicos no amplificados; do ingls
HSH Homens que fazem sexo com homens non-amplified nucleic acid hybridization
HSIL Leso intraepitelial de alto grau; do assays
ingls high-grade intraepithelial lesion NASBA Amplificao baseada na sequncia de
HSV Vrus da herpes simples; do ingls cido nucleico; do ingls nucleic acid
herpes simplex virus sequence-based amplification
ICT Teste imunocromatogrfico; do ingls NCTC Coleo Nacional de Cultura Tipo;
immunochromatographic test do ingls National Collection of Type
IF Imunofluorescncia Cultures
IFA Ensaio de imunofluorescncia; do ingls NIBSC Instituto Nacional de Padres e Controle
immunofluorescence assay Biolgicos; do ingls National Institute
IgA/IgG/IgM Imunoglobulinas A, G, M for Biological Standards and Control
IGD Infeco gonoccica disseminada NIC Neoplasia intraepitelial cervical
IMDM-VGA Meio de Dulbecco modificado por nvCT Nova variante de Chlamydia trachomatis
Iscove; do ingls Iscoves modified NYC gar New York City
Dulbecco medium OMS Organizao Mundial da Sade
IP Imunoperoxidase Pap Papanicolau
ISO Organizao Internacional de PBS Soluo salina tamponada com fosfato;
Padronizao; do ingls International do ingls phosphate-buffered saline
Organization for Standardization solution
KOH Hidrxido de potssio PCR Reao em cadeia da polimerase; do
LGV Linfogranuloma venreo ingls polymerase chain reaction
LIA Imunoensaio em linha; do ingls line PET Teste de enzima pr-formada; do ingls
immunoassay preformed enzyme test
LJ Grfico de Levey-Jennings PID Doena inflamatria plvica; do ingls
LPMN Leuccitos polimorfonucleares pelvic inflammatory disease
LPS Lipopolissacardeo

viii Diagnstico laboratorial do diagnstico de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
PIP Prolilaminopeptidase; do ingls TPHA Ensaio de hemaglutinao para
prolyliminopeptidase Treponema pallidum; do ingls
POC Teste point-of-care Treponema pallidum haemagglutination
POP Procedimento operacional padro assay
PR Regies da protease; do ingls protease TPPA Ensaio de aglutinao passiva de
regions partculas para Treponema pallidum;
PRR Papilomatose respiratria recorrente do ingls Treponema pallidum passive
RCA Amplificao por crculo rolante; do particle agglutination assay
ingls rolling circle amplification TRUST Teste da toluidina vermelha com soro
RCUT Teste de utilizao rpida de no aquecido; do ingls toluidine red
carboidrato; do ingls Rapid unheated serum test
carbohydrate utilization test TSB Caldo triptona de soja; do ingls
RHR Departamento de Sade Reprodutiva trypticase soy broth
e Pesquisa; do ingls Department of UE Unio Europeia
Reproductive Health and Research UFC Unidades formadoras de colnia
RNA cido ribonucleico; do ingls ribonucleic UG lcera genital de etiologia sexualmente
acid transmissvel
RPR Reagina plasmtica rpida UK NEQAS Servio Nacional de Avaliao Externa
RT Transcriptase reversa; do ingls reverse da Qualidade do Reino Unido; do ingls
transcriptase United Kingdom National External
SARA Artrite reativa adquirida sexualmente; Quality Assessment Service
do ingls sexually acquired reactive UNAIDS Programa Conjunto das Naes Unidas
arthritis sobre HIV/AIDS; do ingls Joint United
SDA Amplificao por deslocamento de Nations Programme on HIV/AIDS
cadeia; do ingls strand displacement UNG Uretrite no gonoccica
amplification UNGNC UNG no clamidial
SDC Sensibilidade dicotmica calibrada VB Vaginose bacteriana
SGQ Sistema de gesto de qualidade VDRL Laboratrio de Pesquisa de Doenas
SNP Polimorfismo de nucleotdeo simples; do Venreas; do ingls Venereal Disease
ingls single nucleotide polymorphism Research Laboratory
SPG Sacarose-fosfato-glutamato VPN Valor preditivo negativo
spp. Espcies VPP Valor preditivo positivo
TARV Terapia antirretroviral WB Western blot
TC Captura de alvo; do ingls target capture WR Reao de Wasseman; do ingls
TDR/OMS Programa Especial para Pesquisa e Wasserman reaction
Treinamento em Doenas Tropicais
da OMS; do ingls WHO Special
Programme for Research and Training in
Tropical Diseases
TMA Amplificao mediada por transcrio;
do ingls transcription-mediated
amplification
TOC Teste de cura; do ingls test-of-cure

Siglas ix
Prefcio

As doenas sexualmente transmissveis (DST), incluindo aquelas causadas pelos vrus da imunodeficincia humana
tipos 1 e 2, permanecem como uma rea de importante foco para a sade pblica. Isso se deve alta morbidade
associada s DST, tais como as sequelas de infeces no trato reprodutivo, cncer cervical, sfilis congnita,
gravidez ectpica e infertilidade, assim como a morbidade de doenas relacionadas ao HIV e morte pela sndrome da
imunodeficincia adquirida (AIDS). As estratgias de sade pblica para o controle das DST incluem a promoo de um
comportamento sexual mais seguro e oferta de preservativos (preveno primria), assim como o gerenciamento eficaz
e precoce de pacientes com DST, usando tanto abordagens de gesto sindrmica quanto etiolgicas.

Na abordagem de gesto sindrmica, o gerenciamento fsica e economicamente acessvel e eficiente de indivduos


portadores de DST baseia-se na utilizao de fluxogramas (algoritmos) para cada DST. Os fluxogramas permitem o
diagnstico de DST comuns, a oferta de tratamentos atuais e apropriados para cada pas, o aconselhamento na gesto
de parceiros sexuais e a nfase na importncia dos testes para HIV no mesmo dia da visita ao profissional de sade.
Os fluxogramas devem ser baseados na etiologia local e os dados de susceptibilidade antimicrobiana obtidos por
meio de pesquisas laboratoriais peridicas. Em geral, os testes de laboratrio no so realizados para a maioria dos
pacientes com DST que recebem gesto sindrmica. No entanto, pode ser apropriado coletar espcimes para exames
laboratoriais dos pacientes que no responderam s terapias de primeira gerao, para definir o diagnstico e/ou
determinar se a falha do tratamento se deve a resistncia antimicrobiana. Nos pases que podem custear a abordagem
do diagnstico etiolgico, os exames laboratoriais desenvolvem um papel muito maior em termos de diagnstico
de patgenos de DST especficos e determinao de susceptibilidade antimicrobiana. Os laboratrios tambm
desempenham um papel-chave na vigilncia das DST e nos programas de pesquisa tanto em naes com menos
recursos quanto naquelas mais ricas.

A Organizao Mundial da Sade publicou uma verso anterior deste manual, intitulada Diagnstico laboratorial de
doenas sexualmente transmissveis, em 1999, com o objetivo de oferecer um guia completo de procedimentos-padro
para isolar, detectar e diagnosticar as DST por microbiologistas e tecnlogos mdicos. O guia foi concebido como um
manual de bancada, sintonizado com as necessidades e capacidades dos laboratrios nos diferentes nveis do sistema
de sade. O manual, subsequentemente, mostrou-se muito popular tanto em laboratrios nacionais como particulares.

Desde a publicao do manual de 1999, houve uma srie de avanos fundamentais nos procedimentos de diagnstico,
em especial no que se refere amplificao de cido nucleico e testes rpidos, assim como as metodologias e
recomendaes dos testes de susceptibilidade antimicrobiana. Um conjunto de especialistas internacionais atualizaram
extensivamente os captulos do manual de 1999. Alm disso, a verso revisada inclui novos captulos abordando
uma srie de tpicos, a exemplo das tcnicas de diagnstico de Mycoplasma genitalium, os testes rpidos para
DST e gesto da qualidade de laboratrios. Embora este manual atualizado aborde os mais importantes patgenos
causadores de DST, ele no deve ser visto como completo, cabendo ao leitor consultar outras fontes de referncia
para maiores informaes, por exemplo, no que diz respeito s polticas nacionais dirigidas s DST, guias para teste de
susceptibilidade microbiana, questes mdico-legais e testes de DST em menores.

Este novo manual, Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da
imunodeficincia humana, fornece o conhecimento bsico sobre os princpios dos testes laboratoriais no contexto das
abordagens de triagem e diagnstico, assim como o teste de susceptibilidade antimicrobiana, como componentes do
controle das DST. Assim como na publicao de 1999, este manual trata de cada doena em um captulo separado,
fornecendo informao detalhada quanto coleta, transporte e testagem laboratorial de espcimes. Dois anexos teis,
abordando equipamentos, testes, meios, reagentes e corantes, encontram-se no final do manual.

Prefcio xi
Prev-se que o manual atualizado ser informativo para administradores, gerentes de programas, equipes de mdicos
e enfermeiros, assim como para o pblico-alvo primrio, que continua sendo formado pelos microbiologistas e
tecnlogos mdicos. O manual deve constituir uma ferramenta til para auxiliar na escolha dos testes diagnsticos
mais apropriados no cenrio individual, idealmente por meio de comits nacionais e/ou locais de especialistas
em aconselhamento. O manual tambm uma fonte valiosa de informaes para estudantes e estagirios, tanto
dentro quanto fora do ambiente de laboratrio. Finalmente, prev-se que a ampliao de produtos e metodologias
de diagnstico continuar nos prximos anos e, dessa forma, ser importante para todos os leitores manterem-se
atualizados quanto aos progressos mais recentes no campo.

xii Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Agradecimentos

O Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana, foi
revisado utilizando a estrutura testada e comprovada do manual de 1999, criada por Eddy Van Dyck, do Instituto de
Medicina Tropical, Anturpia, Blgica; Andr Z. Meheus, da Universidade de Anturpia, Blgica; e Peter Piot, Diretor-
Executivo do Programa Conjunto das Naes Unidas sobre HIV/AIDS (UNAIDS). O Departamento de Sade Reprodutiva e
Pesquisa (RHR), da Organizao Mundial da Sade (OMS) em Genebra, Sua, reconhece e expressa sua gratido para
com a viso desses autores e agradece-lhes a permisso para atualizar o manual, a fim de garantir que este mantenha
sua relevncia global, incorporando a ele novas tecnologias e mtodos de diagnstico.

Especialistas experientes e qualificados em diferentes reas da medicina diagnstica atualizaram o documento


para garantir que a diversidade de mtodos disponveis para o diagnstico das doenas sexualmente transmissveis
(DST) estivesse nele representada, tornando-o o mais atual possvel nessa rea da medicina, que est em constante
mutao. A OMS/RHR gostaria de agradecer a diversos especialistas e suas instituies pela dedicao e entusiasmo,
que garantiram a alta qualidade e a perspectiva global deste documento no que diz respeito ao diagnstico das DST.

Agradecimentos sinceros so dirigidos a Yaw Adu-Sarkodie, Manju Bala, Ronald Ballard, Alan Herring, Edward W. Hook
III, Catherine Ison, David Mabey, Rosanna Peeling e Magnus Unemo, que revisaram o manual de 1999 e determinaram
as sees que necessitavam de mudanas e atualizaes, alm de identificar os novos captulos a ser adicionados. O
grupo tambm props uma lista de possveis autores para a reviso dos captulos existentes e a elaborao dos novos
captulos, e indicaram alguns dos possveis revisores desses contedos.

A OMS/RHR gostaria de agradecer aos seguintes autores, que revisaram a primeira verso dos captulos e continuaram
o trabalho para sua finalizao: Manju Bala, Ronald Ballard, Laurent Blec, Fatim Cham, Jo-Anne Dillon, Suzanne
Garland, Edward W. Hook III, Catherine Ison, David Lewis, Bharat Parekh, Rosanna Peeling, Ye Tun, Magnus Unemo e
Barbara Van Der Pol. Os seguintes funcionrios do Departamento da OMS forneceram informaes e orientaes para
a finalizao do manual: Nathalie Broutet, Lori Newman e Igor Toskin. Francis Ndowa liderou o processo de reviso do
manual.

A OMS/RHR tambm reconhece e agradece aos autores remanescentes: Cheng Y. Chen, Dennis Ellenberger, Jrgen
Skov Jensen, John Nkengasong, Stefania Starnino, Larry Westerman e Chunfu Yang pelo grande esforo e tempo
empregados para garantir que a qualidade dos captulos fosse a mais alta possvel.

A OMS/RHR grata s seguintes pessoas por concordarem em revisar os captulos relacionados aos seus respectivos
campos de especializao: Rajesh Bhatia, Xiang-Sheng Chen, Charlotte Gaydos, Monica Lahra, Jrme Le Goff, Jeanne
Marrazzo, Allan Ronald e Patricia Totten.

A OMS/RHR tambm reconhece a dedicao de Fatim Cham, que conferiu os comentrios dos revisores, compilou os
captulos e garantiu a harmonizao entre os diferentes captulos e anexos.

A OMS/RHR agradece a assistncia fornecida pelos Centros de Controle e Preveno de Doenas (CDC), em Atlanta,
Gergia, pela edio das cpias da verso final do manual e o auxlio da equipe da Green Ink, Reino Unido, pelo design,
layout e reviso.

Agradecimentos xiii
Captulo 1

Escolha de testes para doenas sexualmente transmissveis

1.1 Introduo antimicrobiana. Alguns elementos-chave para esses


termos esto descritos a seguir:
Mais de 30 bactrias, vrus e patgenos parasitas
so transmitidos sexualmente e constituem um grupo Vigilncia. Vigilncia a coleta sistemtica,
de infeces denominadas doenas sexualmente agrupamento e anlise de dados que determinam a
transmissveis (DST). Embora alguns patgenos possam frequncia de uma infeco em uma comunidade ou
ser adquiridos por meio de outras rotas de transmisso populao. um elemento essencial de planejamento
que no a sexual, epidemiologicamente o contato sexual para o controle das DST. Investimentos em vigilncia
mais importante para a sua transmisso de uma para infeces com baixo impacto direto na sade
pessoa para a outra (Tabela 1.1). pblica no devem ser altamente priorizados se os
recursos so limitados, se a infeco for incomum
Os testes laboratoriais e os testes rpidos (TR) ou
(por exemplo, cancro mole, especialmente em
point-of-care (POC) so instrumentos potencialmente
naes desenvolvidas) ou se estiver associada a uma
poderosos para a gesto e controle das DST, por
baixa morbidade (por exemplo, piolhos pubianos).
facilitarem a preveno da transmisso das DST e
Geralmente, o tempo necessrio para a obteno do
suas sequelas. O alto nmero de DST, assim como a
resultado de um teste com propsito de vigilncia
variedade dos possveis testes para cada DST tornam
no um fator crtico. Em alguns casos, o espcime
difcil a escolha do teste de diagnstico apropriado. No
coletado para vigilncia tambm pode ser utilizado
momento, uma ampla variedade de testes disponveis
para o monitoramento de outros fatores clinicamente
para as DST apresentam atributos e possveis limitaes
importantes, como a resistncia antimicrobiana (por
que podem influenciar sua aplicao, a fim de aumentar
exemplo, na Neisseria gonorrhoeae).
o controle das DST. Alm disso, em uma era de recursos
limitados, a deciso sobre em quais e em quantas DST Validao da gesto sindrmica. O diagnstico
se deve investir para a realizao de testes, quem deve sindrmico um elemento til para o controle de
ser testado e quais dos mltiplos testes disponveis DST, oferecendo uma avaliao rpida quanto ao
devem ser utilizados para um determinado propsito diagnstico, a qual pode ser utilizada para guiar a
pode ser difcil. A seleo do teste deve refletir um terapia oportuna de pessoas com sinais ou sintomas
processo de priorizao que considera a prevalncia de uma infeco. Em lugares em que o diagnstico
da infeco, o impacto e complicao das infeces sindrmico representa um elemento importante para
nos indivduos e populaes, as caractersticas de a gesto das DST, o teste laboratorial peridico de
desempenho do teste, os custos do teste e a razo pelo pacientes diagnosticados e tratados utilizando os
qual o teste est sendo realizado. algoritmos de gesto sindrmica para DST deve ser
realizado para garantir que o diagnstico sindrmico
Os testes para DST podem ser utilizados para uma
esteja conseguindo identificar as infeces que
variedade de diferentes propsitos que, por sua vez,
so alvos de interveno. Em situaes em que o
podem afetar a escolha do teste. Essas diferentes
diagnstico sindrmico no esteja resultando no
razes para testagem incluem fins de vigilncia,
tratamento de sua DST-alvo, necessrio haver
validao de algoritmos de gesto sindrmica, garantia
empenho para avaliar as razes do fracasso. As
de qualidade (GQ), diagnstico de pessoas com sinais
informaes adquiridas por meio do uso peridico de
ou sintomas de possveis DST, triagem de pessoas
testes para avaliar a qualidade dos servios clnicos
de risco assintomticas, e testes de susceptibilidade

Escolha de testes para doenas sexualmente transmissveis 1


podem ser usadas como uma forma de melhorar o teste, uma vez que as pessoas infectadas podem
tratamento do paciente. transmitir a doena para outros, sofrer complicaes
na infeco ou abandonar o acompanhamento
Garantia/melhoria da qualidade. A grande rea
no intervalo entre a testagem e a notificao
da GQ inclui tanto o controle de qualidade, para
do resultado do teste (1, 2). Quando o teste de
assegurar que os testes estejam sendo realizados
diagnstico realizado como parte dos servios
conforme o esperado, quanto a avaliao da
clnicos, pode ser til monitorar o intervalo entre a
qualidade, para garantir que os testes sejam
testagem e o tratamento das pessoas com testes
utilizados adequadamente e que todas as etapas
positivos, como uma medida de qualidade de
necessrias gesto dos pacientes sejam seguidas
atendimento.
de forma correta. A preciso dos testes de DST pode
ser impactada por muitos fatores, incluindo a variao Triagem. A triagem um elemento essencial para
nos reagentes, o funcionamento dos equipamentos e uma gesto tima das DST e para a elaborao de
a proficincia tcnica. Como resultado, recomenda-se estratgias de controle baseadas nas contribuies
a realizao de testes peridicos de espcimes- da gesto sindrmica e dos testes de diagnstico.
padro para avaliar a proficincia laboratorial e Todas as DST podem ocorrer de forma assintomtica
garantir a preciso esperada do teste. Espcimes- ou no ser reconhecidas pela pessoa infectada.
padro podem ser obtidos a partir de organizaes Apesar da ausncia de sintomas identificados, as
certificadas, ou ento ser gerados no prprio pessoas com infeces assintomticas podem
laboratrio. A avaliao de espcimes-padro pode estar em risco de transmisso para outros e de
identificar a necessidade de novo treinamento ou complicaes da infeco. Como resultado, a triagem
de uma avaliao da qualidade dos componentes (isto , o teste de pessoas em alto risco sem sinais
individuais do teste laboratorial. ou sintomas reconhecidos) ir identificar as pessoas
infectadas, reduzindo, desse modo, o risco de
Diagnstico. Os sintomas das DST comuns tendem
complicaes ou de transmisso de infeces. Assim
a ser no especficos e, tipicamente, apresentam
como no teste de diagnstico, o intervalo de tempo
uma variedade de possveis agentes causadores
entre o teste e o incio do tratamento, bem como a
que podem requerer diferentes tratamentos. Como
proporo de pessoas recebendo o tratamento, caso
resultado, os testes de diagnstico so teis tanto
alguns indivduos abandonem o acompanhamento,
para a obteno de um diagnstico preciso quanto
so medidas teis de qualidade. A triagem por DST
para guiar a gesto de parceiros sexuais, assim
pode ser mais eficiente em termos de custo quando
como a GQ de algoritmos de gesto sindrmica,
puder ser direcionada a subgrupos de populaes
como notado acima. Quando os testes so usados
de alto risco; normalmente, esse direcionamento
para diagnstico, o tempo necessrio para a
melhor realizado utilizando-se dados de vigilncia.
disponibilizao dos resultados a fim de guiar a
gesto deve ser considerado para a escolha do

2 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


Tabela 1.1: Principais patgenos transmitidos sexualmente e doenas por eles causadas

Patgeno Manifestaes clnicas e outras doenas associadas

Infeces bacterianas
Neisseria gonorrhoeae GONORREIA
Homens: corrimento uretral (uretrite), epididimite, orquite, infertilidade
Mulheres: cervicite, endometrite, salpingite, doena inflamatria plvica,
infertilidade, ruptura prematura de membranas, perihepatite; comumente
assintomtica
Chlamydia trachomatis INFECO CLAMIDIAL
Homens: corrimento uretral (uretrite), epididimite, orquite, infertilidade
Mulheres: cervicite, endometrite, salpingite, doena inflamatria plvica,
infertilidade, ruptura prematura de membranas, perihepatite; comumente
assintomtica
Ambos os sexos: proctite, faringite, sndrome de Reiter
Recm-nascidos: conjuntivite, pneumonia

Chlamydia trachomatis LINFOGRANULOMA VENREO


(sorotipos L1L3) Ambos os sexos: lcera, inchao inguinal (bubo), proctite

SFILIS
Ambos os sexos: lcera primria (cancro) com adenopatia local, erupes na
pele, condiloma lata; danos sseos, cardiovasculares e neurolgicos
Treponema pallidum
Mulheres: perda da gravidez (aborto, natimorto), parto prematuro
Recm-nascidos: natimorto, sfilis congnita

CANCRO MOLE
Ambos os sexos: lceras genitais doloridas; podem ser acompanhadas por
Haemophilus ducreyi
bubo

DONOVANOSE (GRANULOMA INGUINAL)


Ambos os sexos: inchaos nodulares e leses ulcerativas das reas inguinal
Klebsiella (Calymmatobacterium) e anogenital
granulomatis Homens: corrimento uretral (uretrite no gonoccica)
Mulheres: cervicite, endometrite, provvel doena inflamatria plvica

Homens: corrimento uretral (uretrite no gonoccica)


Mycoplasma genitalium Mulheres: cervicite, endometrite, provvel doena inflamatria plvica

Escolha de testes para doenas sexualmente transmissveis 3


Tabela 1.1: Principais patgenos transmitidos sexualmente e doenas por eles causadas (continuao)

Patgeno Manifestaes clnicas e outras doenas associadas


Infeces virais
SNDROME DA IMUNODEFICINCIA ADQUIRIDA (AIDS)
Vrus da imunodeficincia humana
Ambos os sexos: doenas relacionadas ao HIV, AIDS
(HIV)

Vrus da herpes simples tipo 2 HERPES GENITAL


Vrus da herpes simples tipo 1 (menos Ambos os sexos: leses vesiculares anogenitais e ulceraes
comum) Recm-nascidos: herpes neonatal (frequentemente fatal)

VERRUGAS GENITAIS
Homens: verrugas penianas e anais; carcinoma no pnis
Mulheres: verrugas vulval, anal e cervical; carcinoma cervical, carcinoma
Papilomavrus humano
vulval, carcinoma anal
Recm-nascidos: papiloma de laringe

HEPATITE VIRAL
Vrus da hepatite B Ambos os sexos: hepatite aguda, cirrose heptica, cncer de fgado

INFECO POR CITOMEGALOVRUS


Ambos os sexos: febre subclnica ou no especfica, inchao difuso no
Citomegalovrus
linfonodo, doenas hepticas, etc.

MOLUSCO CONTAGIOSO
Ambos os sexos: ndulos firmes e umbilicados na pele, genitais ou
Vrus do molusco
generalizados

SARCOMA DE KAPOSI
Herpesvrus associado ao sarcoma de
Ambos os sexos: tipo de cncer agressivo em pessoas imunossuprimidas
Kaposi (herpesvrus humano tipo 8)

Infeces por protozorios


TRICOMONASE
Homens: Corrimento uretral (uretrite no gonoccica); frequentemente
assintomtico
Trichomonas vaginalis Mulheres: vaginose com corrimento vaginal abundante e espumoso,
nascimento prematuro, bebs de baixo peso ao nascer
Recm-nascidos: baixo peso ao nascer

4 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


Tabela 1.1: Principais patgenos transmitidos sexualmente e doenas por eles causadas (continuao)

Patgeno Manifestaes clnicas e outras doenas associadas


Infeces por fungos
CANDIDASE
Homens: infeco superficial na glande do pnis
Candida albicans
Mulheres: vulvo-vaginite com secreo vaginal espessa e aspecto de
coalhada, prurido ou queimao vulvar
Infeces parasitrias
Phthirus pubis INFESTAES POR PIOLHOS PUBIANOS
Sarcoptes scabiei SARNA

Determinao de susceptibilidade cada tipo de teste de diagnstico tem suas vantagens e


antimicrobiana. Para algumas DST (vale desvantagens. Como resultado, em alguns contextos, o
ressaltar como exemplo a N. gonorrhoeae), teste mais preciso pode no ser o mais adequado, caso
o desenvolvimento continuado de resistncia seja to oneroso que no possa ser realizado em um
tem levado, periodicamente, a mudanas na grande nmero de pessoas em risco, ou to complexo
terapia recomendada. A vigilncia sistemtica que os resultados no estaro disponveis a tempo para
da susceptibilidade antimicrobiana e/ou o teste guiar a gesto de pacientes. Finalmente, em alguns
de isolados especficos para a susceptibilidade a casos, os testes laboratoriais para DST esto disponveis
agentes antimicrobianos utilizados em terapias em uma variedade de formas e plataformas, o que
fornecem informaes que podem ser usadas para influencia o nmero de testes que podem ser realizados
ajustar as recomendaes de tratamento de forma em um determinado intervalo de tempo. Desse modo, o
antecipada, preferencialmente antes que a falha rendimento do teste (o nmero de testes completados
teraputica se torne um problema. A determinao em um determinado intervalo de tempo) tambm
da susceptibilidade antimicrobiana melhor realizada considerado na seleo de testes. Em alguns contextos,
em isolados clnicos vivos de culturas de organismos volumes maiores ou menores de testagem tornam alguns
e tipicamente melhor utilizada para guiar terapias testes ou plataformas preferveis.
recomendadas populao do que para a gesto
Em geral, os testes de diagnstico podem ser separados
individual de pacientes. Na maioria das vezes, a
em pelo menos trs tipos. Primeiro, a deteco direta
vigilncia da resistncia antimicrobiana melhor
de microrganismos a finalidade mais bvia para o
conduzida por laboratrios de referncia, utilizando
diagnstico das DST. Pode ser realizada por meio de
espcimes coletados a partir de um espectro de
microscopia e colorao apropriada ou preparao a
localidades geograficamente representativo e de
fresco para a visualizao de patgenos. A cultura, a
populaes de interesse.
deteco de antgeno ou a deteco de cido nucleico,
1.2 Tipos de testes de diagnstico por meio da amplificao ou no, so frequentemente
mais sensveis que a microscopia. No entanto, podem
O progresso cientfico tem fornecido uma ampla
implicar necessidades tcnicas mais complexas para um
gama de testes para a identificao das DST. Esses
timo desempenho do teste, o que aumenta o intervalo
testes apresentam grande variedade no seu nvel de
entre a coleta do material e a disponibilidade dos
complexidade (isto , os requisitos tcnicos para um
resultados do teste (o teste rpido ajuda a superar essa
timo desempenho do teste), nos custos necessrios
ltima possvel limitao). Cada uma dessas abordagens
para realiz-los (tanto materiais como em relao a mo
apresenta suas prprias vantagens e desvantagens.
de obra) e em termos de desempenho. Dessa forma,
A microscopia, principalmente quando realizada

Escolha de testes para doenas sexualmente transmissveis 5


na presena do paciente, pode fornecer resultados do teste de pH ou sopro/amina para o diagnstico de
imediatos para auxiliar nas decises de gesto, vaginose bacteriana.
mas, como outros testes, necessita equipamentos
especializados (como microscpios), eletricidade ou 1.3 Desempenho do teste
procedimentos especiais de colorao, alm de depender Em ltima anlise, o valor dos testes para a deteco
do treinamento e experincia do microscopista. das DST tambm depende muito do seu desempenho
(Tabela 1.2). Como medidas do desempenho, os
Em contraste, outros testes laboratoriais, como a cultura
clculos da sensibilidade e da especificidade (3) desde
ou a amplificao de cido nucleico, podem necessitar
que realizados com base em um tamanho amostral
mtodos especiais para o transporte do espcime e
suficientemente grande representam estimativas
equipamentos e procedimentos especializados para
confiveis do desempenho geral dos testes. No entanto,
um timo desempenho, atrasando, dessa forma,
os valores preditivos (tanto positivo como negativo)
a disponibilidade dos resultados para a tomada de
desses testes podem variar substancialmente de
decises imediatas.
populao para populao, dependendo da prevalncia
Em segundo lugar, para muitas DST importantes (a sfilis da infeco na comunidade.
e o HIV representam exemplos comuns), a deteco
Assim, os testes que apresentam taxas substanciais de
da resposta do hospedeiro para a infeco (anticorpos)
falso-positivos e os testes para infeces relativamente
representa um teste de diagnstico mais favorvel. A
incomuns (isto , de baixa prevalncia) podem
vantagem dos testes sorolgicos que eles podem
apresentar um valor preditivo positivo baixo, mesmo
ser teis no s para o propsito de diagnstico, mas
havendo alta sensibilidade para a deteco da infeco.
tambm para a vigilncia. Todos os testes sorolgicos
Em geral, a literatura cientfica revisada por especialistas
apresentam resultados falso-positivos ocasionais. O
fornece estimativas confiveis de testes de sensibilidade
problema dos testes sorolgicos falso-positivos pode
e especificidade. No entanto, para qualquer situao
frequentemente ser reduzido por meio de um segundo
especfica, a prevalncia local da doena ir determinar
teste sorolgico confirmatrio, o qual tem como alvo um
parcialmente o valor preditivo dos testes laboratoriais.
antgeno diferente do teste sorolgico inicial de triagem
Assim, a vigilncia para determinar a prevalncia local
(o uso de teste confirmatrio discutido em maiores
da doena fornece dados importantes para a escolha do
detalhes na seo de testes sorolgicos para sfilis e
teste para DST.
HIV). Alguns testes sorolgicos podem ser capazes de
diferenciar infeces adquiridas recentemente daquelas
1.4 Tipos de laboratrios e funes
mais antigas ou previamente tratadas por meio da
deteco da imunoglobulina M (IgM) para infeces Embora o mtodo tradicional para o diagnstico de DST
recentes. Uma deficincia do diagnstico sorolgico se constitua em anlises laboratoriais para determinar
que os anticorpos para um patgeno causador os agentes etiolgicos, nem todos os testes precisam
de DST podem persistir por um longo perodo aps ser realizados em todos os laboratrios, para todos os
um tratamento bem-sucedido. Dessa forma, o teste propsitos. O diagnstico laboratorial de DST tende a
sorolgico de populaes pode ser uma indicao do ser dispendioso em termos de equipamento, reagentes,
total cumulativo de infeces, em vez do nmero de infraestrutura e manuteno. Ainda mais importante,
infeces adquiridas mais recentemente. especialmente em lugares com recursos limitados,
as amostras da maioria dos pacientes com DST so
Em terceiro lugar, existem os testes que detectam processadas em locais sem instalaes laboratoriais
metablitos microbianos, como materiais que alteram (2). Para adequao s situaes em que no se dispe
o pH das secrees genitais e aminas biognicas. Em de instalaes laboratoriais, a Organizao Mundial da
certos contextos, esses testes so teis para o propsito Sade desenvolveu guias sobre o uso da abordagem
de diagnstico. Um exemplo disso a importncia sindrmica para a gesto de algumas DST e defende seu
uso desde meados da dcada de 80, aps avaliaes de

6 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


campo sobre o seu desempenho (3). Subsequentemente, Inevitavelmente, porm, a abordagem sindrmica tem
uma srie de estudos de campo mostraram que a o potencial de superdiagnosticar e tratar pacientes que
abordagem sindrmica funciona bem no tratamento de possam no estar infectados com qualquer ou algum dos
homens com corrimento uretral sintomtico e na gesto organismos presumidos como causadores da sndrome
de homens e mulheres com lcera genital bacteriana (4, em questo (8).
5). No entanto, esse no o caso para o diagnstico e
Dessa forma, para apoiar a abordagem sindrmica
gesto de infeces cervicais por N. gonorrhoeae ou C.
voltada ao diagnstico, os laboratrios clnicos locais
trachomatis, exceto nos casos em que o exame mostra
devem ser incentivados a realizar os testes necessrios
mucopus, eroses e friabilidade cervicais, ou quando h
para facilitar a gesto clnica de pessoas com DST ou em
um histrico de sangramento entre as menstruaes e
risco para esses agravos. Em alguns lugares em que o
durante a relao sexual (6). No entanto, o diagnstico
transporte de espcime no representa um problema, a
sindrmico acompanhado de tratamento tem a vantagem
economia de escala torna o processamento do espcime
de proporcionar cuidados imediatos ao paciente na sua
em laboratrios centrais to rpido quanto e mais
primeira procura por avaliao, alm de ser de baixo
eficiente do que quando realizado em stios locais. Nem
custo no h incidncia de custos laboratoriais diretos
todos os laboratrios precisam realizar as atividades
sobre o paciente, o prestador de servio ou o Estado.
do laboratrio central, como o teste de susceptibilidade
O uso da abordagem sindrmica tambm permite a
antimicrobiana.
padronizao do diagnstico e tratamento e a elaborao
de relatrios em um ambiente ou situao em particular. Os sistemas de laboratrio podem ser arbitrariamente
Os pacientes com suspeita de DST podem ser categorizados em trs nveis, com base nos nveis
direcionados a instituies de ateno primria sade, dos servios de cuidado e tratamento inerentes a
clnicas de planejamento familiar, mdicos particulares cada categoria. Entretanto, deve-se ter em mente
e s prprias clnicas especializadas em DST (7 ). que a infraestrutura laboratorial e as capacidades de

Tabela 1.2: Efeito da sensibilidade, especificidade e prevalncia no valor preditivo positivo, usando somente o
teste primrio ou, adicionalmente, o teste suplementar

Prevalncia na populao = 1%
A B C D E
Sensibilidade/especificidade do
99%/99% 99%/99,9% 99%/99% 99,5%/99,5% 99,5%/99,5%
teste primrio
Sensibilidade/especificidade do
ND ND 99%/99% ND 99,5%/99,5%
teste suplementar/confirmatrio
Nmero testado 1000 1000 11 1000 15
Negativos
Nmero total 980 989 1 985 5
Negativos verdadeiros 980 989 1 985 5
Falso-negativos 0 0 0 0 0
Positivos
Total 20 11 10 15 10
Positivos verdadeiros 10 10 10 10 10
Falso-positivos 10 1 0 5 0
Valor preditivo positivo (VPP) 50% 91% 100% 67% 100%
ND: no determinado.

Escolha de testes para doenas sexualmente transmissveis 7


diagnstico podem variar imensamente entre os pases As decises quanto escolha de testes devem ser
com recursos limitados e aqueles industrializados. conduzidas no contexto da prevalncia da infeco
Considere as seguintes categorias como um guia geral: em questo, do impacto da infeco na comunidade,
dos recursos disponveis para apoiar a testagem e
1. Laboratrios perifricos que apoiam o nvel
tratamento e da priorizao da infeco em relao a
de servio de sade primrio, apresentando
outras DST. Alm disso, fatores como a complexidade,
equipamentos laboratoriais limitados e equipe
o tempo para obter o resultado do teste e os custos so
de laboratrio minimamente treinada. Esses
consideraes essenciais para a escolha dos testes
laboratrios so projetados para fornecer
de diagnstico. Modelos matemticos demonstraram
diagnstico rpido de DST no prprio local.
claramente que em situaes e ambientes nos quais
2. Laboratrios de nvel intermedirio, que do suporte os resultados so disponibilizados no momento
aos laboratrios do servio de sade primria e da avaliao inicial do paciente e onde h atraso
clnicas e hospitais de nvel intermedirio. no tratamento, quando o mesmo no iniciado
no momento da avaliao, testes menos sensveis
3. Laboratrios centrais que apoiam as clnicas de oferecidos nas unidades de sade podem de fato
sade tercirias, incluindo as clnicas de referncia aumentar o nmero de pessoas tratadas e reduzir as
especializadas em DST, assim como clnicas e complicaes das infeces quando comparados a
laboratrios de cuidado sade de menor nvel. testes mais sensveis, que necessitam de mais tempo
Embora os testes rpidos possam carecer de para gerarem o resultado (2).
sensibilidade, normalmente apresentam boa
Tabela 1.3: Possveis fatores que influenciam a
especificidade e podem oferecer uma economia na
escolha dos testes para DST
gesto de algumas condies, como corrimento vaginal,
no nvel de cuidados de sade perifricos. 1. Finalidade do teste

Este manual descreve testes abrangendo desde a Vigilncia


abordagem bsica econmica at os procedimentos mais Garantia de qualidade
sofisticados e de alto custo. Os gestores de programas Avaliao do diagnstico sindrmico
e os especialistas de laboratrios, em colaborao com Diagnstico
os agentes polticos, devem determinar a viabilidade e Triagem
utilidade da incorporao dos testes em diferentes nveis Teste de susceptibilidade antimicrobiana
de centros de sade. A escolha tambm depender das 2. Consideraes especficas em relao ao teste
abordagens usadas pelos diferentes nveis de centros de
Desempenho (sensibilidade, especificidade, valor
sade: a abordagem sindrmica (bsica ou modificada),
preditivo)
a abordagem etiolgica, ou ambas.
Coleta de espcime e necessidades de transporte
Prevalncia
1.5 Sintetizando
Morbidade associada
No existe um nico teste ideal para a deteco de Recursos
agentes causadores de DST. Para uma tomada de Finanas
deciso programtica, as vrias DST e as populaes Pessoal
impactadas devem ser consideradas como uma matriz Infraestrutura (servios, etc.)
para definir no somente qual teste laboratorial o mais Importncia relativa em relao a outras prioridades
apropriado para a comunidade em questo, mas tambm
qual a proporo do total de recursos disponveis
(oramento, pessoal, etc.) deve ser alocada para cada
DST a ser testada (Tabela 1.3).

8 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


1.6 Referncias
1. Geisler WM et al. The natural history of
untreated Chlamydia trachomatis infection in
the interval between screening and returning for
treatment. Sexually Transmitted Diseases, 2008,
35(2):119123.

2. Gift TL et al. The rapid test paradox: when fewer


cases detected lead to more cases treated:
a decision analysis of tests for Chlamydia
trachomatis. Sexually Transmitted Diseases, 1999,
26(4):232240.

3. Kuypers J, Gaydos CA, Peeling RW. Principles of


laboratory diagnosis of STIs. In: Holmes KK et al.,
eds. Sexually transmitted diseases, 4th ed. Nova
York, McGraw-Hill Medical, 2008:937958.

4. Adler MW et al. Sexual health and care: sexually


transmitted infections: guidelines for prevention and
treatment. [Occasional paper]. Londres, ODA, 1996

5. Management of patients with sexually transmitted


diseases. Genebra, Organizao Mundial da Sade,
1991 (WHO Technical Report Series No. 810).

6. Alary M et al. Evaluation of clinical algorithms


for the diagnosis of gonococcal and chlamydial
infections among men with urethral discharge or
dysuria and women with vaginal discharge in Benin.
Sexually Transmitted Infections, 1998, 74(Suppl.
1):S4449.

7. Moherdaui F et al. Validation of national algorithms


for the diagnosis of sexually transmitted diseases
in Brazil: results from a multicentre study. Sexually
Transmitted Infections, 1998, 74(Suppl. 1):S3843.

8. Vuylsteke B. Current status of syndromic


management of sexually transmitted infections
in developing countries. Sexually Transmitted
Infections, 2004, 80(5):333334.

Escolha de testes para doenas sexualmente transmissveis 9


10 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Captulo 10

Sfilis

10.1 Introduo

A sfilis uma doena sexualmente transmissvel A Figura 10.1 mostra o curso de uma sfilis no tratada.
crnica, caracterizada por manifestaes pontuais e A primeira manifestao da doena em adultos
longos perodos de quiescncia. Ela causada pelo uma pequena mcula, a qual se transforma em
Treponema pallidum subsp. pallidum, um organismo uma ppula que, por sua vez, se torna uma lcera.
espiralado e delicado, intimamente relacionado com A lcera tpica (cancro primrio) classicamente
os organismos causadores das treponematoses no uma leso nica e indolor, que apresenta uma base
venreas, denominados T. pallidum subsp. pertenue limpa e relativamente avascular. Em homens, a
(bouba), T. pallidum subsp. endemicum (sfilis endmica) leso comumente encontrada no sulco coronal, na
e T. carateum (pinta). Esses quatro patgenos so glande e na haste peniana e, nas mulheres, na vulva,
morfolgica e antigenicamente idnticos. Eles s podem nas paredes vaginais ou no colo do tero. Leses
ser diferenciados entre si pelo modo de transmisso, extragenitais so raras, mas o cancro oral pode
epidemiologia, manifestaes clnicas e, mais ocorrer como resultado de sexo oral, e leses perianais
recentemente, por sequenciamento gentico (1). ou no reto so frequentemente vistas em homens
que fazem sexo com homens ou em mulheres que
A sfilis venrea normalmente transmitida como praticaram relao sexual anal receptiva. Por serem
resultado do contato sexual com uma leso infecciosa frequentemente indolores, as leses primrias podem
da membrana mucosa ou pele desgastada ou por meio no ser percebidas. Se no forem tratadas, a lcera
da placenta de uma gestante para o feto. A multiplicao ir curar-se espontaneamente em 3-8 semanas sem
bacteriana ocorre preferencialmente no momento da deixar cicatriz. Os cancros primrios genitais so
inoculao, resultando na formao da ulcerao genital normalmente associados linfadenopatia inguinal
primria, seguida de um perodo de incubao de 9-90 bilateral, a qual classicamente discreta e suave.
dias. Entretanto, a sfilis deve ser considerada uma
doena sistmica, uma vez que a bactria causadora
entra na corrente sangunea logo aps a infeco.
6 semanas a Muitos anos at
6 meses por toda a vida
Infeco

Primria Secundria Sfilis latente


Terciria
(cancro) (erupes) (sem sinal da doena)

(Sfilis meningovascular) Doena gomosa benigna


Perodo de incubao Sfilis cardiovascular
9-90 dias Neurossfilis tardia

Muitos anos at
1 ano por toda a vida
Sfilis precoce Sfilis tardia

Figura 10.1
Representao esquemtica do curso da sfilis no tratada
Sfilis 121
Em pacientes no tratados, o surgimento do segundo coexistir. As gomas so leses destrutivas da sfilis
estgio da doena costuma ocorrer entre seis semanas terciria que podem ocorrer em qualquer rgo do
e seis meses aps a infeco inicial. O cancro primrio corpo, porm mais frequentemente na pele, cartilagem
pode ainda estar presente quando as leses secundrias e ossos (doena gomosa benigna); nas paredes da
clinicamente aparentes ocorrerem. A principal aorta (sfilis cardiovascular); nos vasos cerebrais (sfilis
caracterstica da sfilis secundria uma erupo meningovascular); ou no crebro e na medula espinhal
na pele, no irritvel e distribuda uniformemente, (neurossfilis).
que pode ser macular, papular ou papulo-escamosa.
Essas manifestaes tardias so frequentemente
frequentemente observada na palma das mos e
diagnosticadas em centros clnicos combinadas com
na sola dos ps. A erupo pode ser acompanhada
os resultados de raio-x do trax ou outra imagem (para
de linfadenopatia, febre, dor de cabea e mal-estar
sfilis cardiovascular); avaliao de raio-x dos ossos
generalizado. Em reas quentes e midas, como a
afetados para detectar gomas nos ossos; e testes
vulva ou regio perianal, a erupo muitas vezes se
sorolgicos, incluindo o exame do lquido cefalorraquidiano
torna maior e forma uma estrutura elevada semelhante
para neurossfilis. Uma descrio mais completa das
a uma verruga, conhecida como condiloma lata, e, em
manifestaes da doena pode ser encontrada em textos
regies mucosas, forma leses superficiais brancas
oficiais (2).
acinzentadas serpiginosas, conhecidas como lceras em
rastro de caracol.
10.2 Mtodos de deteco direta para o
Se a sfilis secundria permanecer sem diagnstico diagnstico de sfilis
e, portanto, sem tratamento, todas as manifestaes
Uma vez que o T. pallidum no pode ser cultivado em
visveis da doena iro sarar espontaneamente e o
meio artificial, os mtodos de deteco direta, tais como
paciente passar por um perodo de latncia que pode
a microscopia de campo escuro, imunofluorescncia
durar muitos anos. A sfilis latente convenientemente
direta (IF) e testes para detectar sequncias de DNA
dividida em infeco latente precoce e tardia, com a
especficas de T. pallidum em espcimes obtidos
linha de diviso ocorrendo um ano aps a aquisio da
de leses na pele ou tecidos so os mtodos de
doena (Figura 10.1). Entretanto, deve-se ter em mente
escolha para diagnosticar a sfilis precoce. O teste de
que muitas vezes impossvel determinar a durao
infectividade em coelhos (RIT, do ingls rabbit infectivity
exata da infeco no tratada e, por padronizao,
test) vem sendo considerado, h muito tempo, o padro-
esses casos devem ser classificados como doena
ouro para a deteco direta de T. pallidum em espcimes
tardia latente. Durante os estgios latentes da doena,
clnicos (3). Esse mtodo tem uma sensibilidade de
no h leses na pele ou membrana mucosa para
aproximadamente um nico organismo, quando so
serem coletadas; dessa forma, um diagnstico deve
utilizadas passagens repetidas em coelhos. Entretanto,
ser baseado no resultado de testes sorolgicos e na
esses testes raramente so realizados, exceto em
ausncia de sinais e sintomas de sfilis terciria.
laboratrios de pesquisa, uma vez que so demorados
A sfilis terciria , normalmente, considerada o estgio (necessitam de aproximadamente 1-2 meses para
destrutivo da doena. Em geral, os sinais e sintomas serem completados) e requerem o acesso a biotrios
dessas manifestaes tardias ocorrem, frequentemente, adequados.
muitos anos aps a infeco inicial, embora o
processo da doena possa cursar significantemente 10.2.1 Microscopia de campo escuro
mais rpido em pacientes coinfectados com o vrus A microscopia de campo escuro o nico teste point-of-
da imunodeficincia humana (HIV, do ingls human care (POC) capaz de determinar um diagnstico direto
immunodeficiency virus). As vrias manifestaes de sfilis, em casos de doena primria ou secundria,
da sfilis terciria foram classificadas em doena em adultos, ou doena congnita precoce. Seu uso ,
gomosa benigna, sfilis cardiovascular e neurossfilis. portanto, recomendado para clnicas especializadas em
No entanto, essas manifestaes clnicas podem DST e laboratrios hospitalares prximos a clnicas. Uma

122 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
vez que necessria uma microscopia especializada ser colocadas no condensador de um microscpio
adaptada com um condensador de campo escuro, previamente alinhado. O condensador deve ser, ento,
somada adeso a condies tcnicas estritas para ligeiramente rebaixado, de modo que o leo fique abaixo
que se produzam resultados confiveis, o teste deve ser do nvel da platina. O espcime a ser examinado ento
limitado a laboratrios especializados. colocado na platina e o condensador elevado at que
haja um bom contato entre o leo e a parte de baixo
Na microscopia de campo escuro, apenas os raios de da lmina. importante evitar a formao de bolhas
luz que atravessam os organismos ou partculas em no leo. O espcime deve ser examinado inicialmente
um ngulo oblquo entram na objetiva do microscpio, utilizando uma objetiva de baixo poder de aumento (10x).
dando origem a corpos brilhantes, brancos e
luminescentes contra um fundo preto. A microscopia Aps focar a objetiva, a luz deve ser centralizada no
de campo escuro deve ser realizada por profissionais meio do campo mediante o ajuste dos parafusos de
bem treinados e experientes, capazes de ajustar o centralizao localizados no condensador, e esse ltimo
microscpio corretamente e de diferenciar o T. pallidum deve ser focalizado com movimentos de subida e descida
de treponemas no patognicos e outros organismos at que seja obtido o menor dimetro de luz possvel. A
espiralados comumente encontrados nas membranas luz deve ser, ento, novamente centralizada, caso seja
genitais ou mucosa anal. Uma vez que a cavidade oral necessrio. O espcime focalizado utilizando uma
frequentemente colonizada por outras espiroquetas, objetiva seca de aumento de 40x, e a lmina examinada
diferentes dos treponemas, no se recomenda o exame cuidadosamente. A microscopia de campo escuro
em campo escuro de material de leses orais. melhor conduzida em uma cmara escura.

Tanto as leses primrias como secundrias de sfilis Os T. pallidum aparecem como corpos espiralados
podem ser examinadas por microscopia de campo brilhantes e brancos, iluminados contra um fundo
escuro. O espcime ideal um exsudato seroso de preto. O organismo identificado por sua morfologia,
leses ativas, livre de clulas sanguneas vermelhas. tamanho e movimento tpicos. Ele um organismo fino
A leso ativa deve ser cuidadosamente lavada com (0,10-0,18m de largura), com 6-20m de comprimento
gaze e soluo salina estreis. Deve ser, ento, e 8-14 espirais profundas e regulares (Figura 10.2).
raspada gentilmente, com uma haste estril e seca, Exibe movimentos rpidos e bastante abruptos, girando
e espremida para produzir um exsudato seroso. Se relativamente devagar ao redor do seu eixo longitudinal.
ocorrer sangramento, as gotas de sangue devem ser Essa rotao acompanhada por flexes sincopadas
removidas e o lquido seroso transferido para uma e tores no meio do organismo. Podem-se notar
lmina de vidro, utilizando uma esptula fina de ao inox movimentos de alongamento e encurtamento (como
ou platina ou uma ala bacteriolgica, ou pressionando uma mola em expanso). Distores podem ocorrer
a lmina diretamente no fluido. O material deve ser em circunvolues tortuosas. Outras espiroquetas,
misturado com uma gota de soluo salina para formar normalmente saprfitas, podem ser observadas.
uma suspenso homognea que pode ser, ento, No entanto, elas so frequentemente enroladas de
coberta por uma lamnula. A lmina deve ser examinada forma mais frouxa, ou ento aparecem mais espessas
imediatamente, uma vez que a mobilidade caracterstica e grossas, com diferentes movimentos, incluindo
do organismo um fator importante para a identificao. contores com flexo e relaxamento acentuados dos
Qualquer atraso no exame diminui rapidamente essa espirais.
mobilidade. A chance de visualizar treponemas tambm
diminui se a leso estiver seca ou em processo de A demonstrao de treponemas com morfologia e
regenerao. mobilidade caractersticas de T. pallidum constitui um
diagnstico positivo para sfilis primria e secundria
O alinhamento ptico correto do microscpio de campo (4). Os pacientes com cancro primrio positivos para
escuro essencial para o sucesso da microscopia de a microscopia de campo escuro podem apresentar
campo escuro. Algumas gotas de leo de imerso devem sorologia negativa, mas normalmente espera-se que

Sfilis 123
a soroconverso ocorra em poucos dias. Entretanto, 10.2.2 Teste de anticorpo de fluorescncia
a no visualizao do organismo no exame de campo direta (EID)
escuro no exclui um diagnstico de sfilis. Os resultados O mtodo utilizado para coletar material de leso para
negativos podem significar que: o EID idntico ao usado para a microscopia de campo
escuro. Os espcimes devem ser passados em uma
O nmero de organismos presentes no espcime no
rea de 1cm2 da lmina do microscpio, secos ao ar livre
suficiente (um nico exame de campo escuro tem
e fixados com acetona ou metanol, podendo, depois,
uma sensibilidade menor que 50%);
ser acondicionados para o transporte ao laboratrio.
O paciente j recebeu tratamento ou uma preparao Aps adicionar globulina anti-T. pallidum marcada com
tpica antibacteriana foi aplicada na leso; fluorescena, obtida comercialmente, incubar e lavar, as
lminas devem ser examinadas com um microscpio
A leso est prxima de uma cura natural;
de fluorescncia. Qualquer espiroqueta T. pallidum no
A leso no sfilis. espcime aparece como um organismo colorido verde-
ma, com a morfologia tpica de T. pallidum contra
um fundo preto (Figura 10.3). Tanto a sensibilidade
quanto a especificidade do teste EID so superiores s
da microscopia de campo escuro, principalmente se
forem utilizados anticorpos monoclonais para realizar o
conjugado com a fluorescena, uma vez que a tcnica
de EID elimina a confuso com outros organismos
espiralados; alm disso, um pequeno nmero de
treponemas marcados com fluorescena podem ser mais
facilmente detectados no esfregao corado do que na
preparao no colorida (5). Infelizmente, o conjugado

Figura 10.2
Treponema pallidum, microscopia de campo escuro.
Fonte: cortesia de David Cox, Centros de Controle e
Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.

Independentemente do resultado do exame de campo


escuro, deve-se sempre coletar sangue para a realizao
do teste sorolgico.

NOTA: pode-se praticar a tcnica de campo escuro


e otimizar a ptica do microscpio por meio do
Figura 10.3
uso de espcimes obtidos ao longo da margem da
Teste de imunofluorescncia direta positivo para T.
gengiva dentria. As clulas epiteliais da gengiva e
pallidum.
bactrias orais, incluindo organismos espiralados,
Fonte: cortesia de David Cox, Centros de Controle e
podem ser visualizados como corpos brilhantes e
Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.
brancos contra um fundo escuro.

124 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
especfico de fluorescena no comercializado em neurossfilis, nos quais mais provvel que o nmero
muitos pases. de organismos seja baixo. Entretanto, os testes no
podem ser recomendados para a deteco de rotina
NOTA: o conjugado de fluorescena de T. pallidum no sangue, mesmo no caso de doenas
convenientemente titulado por meio da aplicao primrias e secundrias, devido presena de inibidores
de diluies em duas vezes do conjugado em de PCR. Todavia, um ensaio de PCR em tempo real
lminas comerciais que podem ser compradas para semiquantitativo foi utilizado para indicar que o nmero
a realizao do teste de absoro do anticorpo de espiroquetas no sangue de pacientes muda de acordo
treponmico fluorescente (FTA-Abs, do ingls com o estgio de sfilis, variando de 200 a 105 organismos
fluorescent treponemal antibody absorption), por mL de sangue (9).
incubando, lavando e examinando o espcime como
no procedimento do teste de imunofluorescncia Ensaios de PCR mltipla foram desenvolvidos para
direta anteriormente descrito. A diluio a ser detectar simultaneamente as causas mais comuns de
utilizada no teste de imunofluorescncia direta a lcera genital de etiologia sexualmente transmissvel
maior diluio possvel do conjugado, que mostra (UG), T. pallidum, Haemophilus ducreyi e o vrus do
uma fluorescncia clara e especfica na ausncia herpes simples (10). O alvo de T. pallidum na PCR
de colorao no fundo. mltipla o gene 47-kDa, e um ensaio imunossorvente
ligado enzima (ELISA, do ingls enzyme-linked
immunosorbent assay) de captura utilizado para
10.2.3 Teste de amplificao de cidos detectar as sequncias amplificadas especficas. Esse
nucleicos para T. pallidum ensaio foi adaptado para um formato mltiplo em tempo
real que vem sendo utilizado para determinar as causas
O teste da reao em cadeia da polimerase (PCR, do
de ulceraes genitais em diferentes lugares no mundo
ingls polymerase chain reaction) pode detectar o
e, subsequentemente, para determinar algoritmos
DNA equivalente a <10 organismos em um espcime,
sindrmicos adequados gesto de UG.
por meio da amplificao de segmentos de genes
especficos de DNA genmico de T. pallidum. Esse
10.3 Testes sorolgicos para sfilis
teste pode ser utilizado para examinar espcimes de
qualquer exsudato de leso, tecido ou fluido corpreo, Os testes sorolgicos para sfilis podem ser,
podendo o espcime ser fresco, congelado ou fixado convenientemente, divididos em dois tipos: os testes
e embebido em parafina. Uma vez que no h testes no treponmicos ou reaginas, tais como a reao de
disponveis de PCR comerciais para T. pallidum liberados Wasserman (WR, do ingls Wasserman reaction), a
pela Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados reagina plasmtica rpida (RPR), o teste do Laboratrio
Unidos da Amrica, alguns laboratrios implementaram de Pesquisa de Doenas Venreas (VDRL, do ingls
testes de PCR desenvolvidos internamente. Venereal Disease Research Laboratory) e o teste da
toluidina vermelha com soro no aquecido (TRUST,
Vrios ensaios de PCR foram desenvolvidos e vm sendo do ingls toluidine red unheated serum test); e os
usados com sucesso para detectar sequncias-alvo de testes treponmicos, tais como o FTA-Abs, o ensaio
DNA especficas para T. pallidum em leses primrias de hemaglutinao para Treponema pallidum (TPHA,
e secundrias (6-8). A sensibilidade analtica desses do ingls Treponema pallidum haemagglutination
ensaios equivalente a aproximadamente 10 organismos. assay), o ensaio de aglutinao passiva de partculas
O uso de iniciadores marcados com fluorescena e uma para Treponema pallidum (TPPA, do ingls Treponema
analisador gentico ABI 310 para detectar sequncias pallidum passive particle agglutination assay), o ELISA,
amplificadas melhorou a sensibilidade analtica da PCR a quimioluminescncia e a grande maioria dos testes
para polA para aproximadamente um organismo por rpidos ou POC atualmente disponveis comercialmente.
reao de PCR. Esses mtodos, teoricamente, podem
ser aplicados no diagnstico de sfilis congnita e

Sfilis 125
10.3.1 Testes sorolgicos no treponmicos treponmicos falso-positivos, todos os soros reativos nos
testes no treponmicos devem ser confirmados por um
Atualmente, todos os testes sorolgicos no
teste treponmico.
treponmicos para sfilis detectam a reagina, uma
mistura de anticorpos IgG e IgM no soro de pacientes Entretanto, ttulos baixos no excluem a possibilidade de
com sfilis que capaz de reagir com um antgeno infeco por sfilis e so frequentemente encontrados na
complexo (uma mistura de cardiolipina, lecitina e doena latente tardia ou terciria.
colesterol) nos testes. O primeiro teste sorolgico
no treponmico a usar esse antgeno foi o teste A determinao dos ttulos de soros no treponmicos
WR, baseado no princpio da reao de fixao do utilizando um procedimento quantitativo pode ser til
complemento. No entanto, os testes utilizados mais para uma interpretao mais correta dos resultados e
frequentemente baseiam-se nas reaes de floculao, para avaliar os pacientes aps o tratamento.
que podem ou no incluir partculas indicadoras.
Quando utilizados como testes de triagem inicial, os
Acredita-se que anticorpos IgG e IgM antilipdeos
testes no treponmicos tornam-se positivos por volta
so formados como parte da resposta do hospedeiro
de seis semanas aps a infeco. Dessa forma, at 40%
ao material liberado por suas clulas danificadas no
das leses primrias positivas na microscopia de campo
incio da infeco como, tambm, para os lipdeos da
escuro ou na PCR podem ser inicialmente soronegativas.
superfcie celular do organismo causador (11, 12).
Em seguida soroconverso, os ttulos de anticorpos
Embora sejam muito sensveis e possam ser no treponmicos aumentam at atingirem o pico entre
quantificados, os testes no treponmicos no 1-2 anos aps a infeco, se no for administrado
apresentam especificidade adequada para sfilis, nenhum tratamento efetivo. Aps isso, durante os
tendo-se estimado que reaes falso-positivas podem estgios latentes tardios e tercirios da doena, os ttulos
ocorrer em 0,2-0,8% dos testes. Essas reaes esto diminuiro lentamente, tornando-se frequentemente
associadas a vrias condies mdicas no relacionadas soronegativos na doena j bastante tardia. A grande
com sfilis (11, 12). As reaes falso-positivas agudas vantagem dos testes no treponmicos que estes
(que persistem por perodos inferiores a seis meses) podem ser utilizados para verificar a eficcia da terapia.
geralmente esto associadas a outras doenas Assim, aps o tratamento efetivo da sfilis precoce (isto
infecciosas como a malria, hepatite, catapora ou , primria, secundria ou doena latente primria), os
sarampo, ou com vacinao recente. Em contrapartida, ttulos de anticorpos diminuiro significativamente (ou
reaes falso-positivas crnicas (que persistem por mais seja, uma reduo de pelo menos quatro vezes no ttulo),
de seis meses) esto associadas a distrbios no tecido tornando-se finalmente negativos. Entretanto, a oferta
conjuntivo, neoplasias e infeces crnicas, como lepra, de tratamento eficiente durante os estgios tardios da
abuso de drogas intravenosas e envelhecimento. Dessa doena pode resultar em soropositividade persistente,
forma, teoricamente, os soros reativos nos testes no embora em ttulos baixos (Figura 10.4). importante
treponmicos devem ser confirmados com um teste ressaltar que qualquer aumento subsequente (de quatro
treponmico mais especfico. vezes ou mais) na titulao pode indicar tanto recada
como reinfeco.
importante ressaltar que, embora a gravidez tenha
sido por muito tempo considerada uma condio
10.3.1.1 Teste do Laboratrio de Pesquisa de Doenas
possivelmente associada a testes no treponmicos
Venreas (VDRL)
falso-positivos, a taxa de testes positivos em mulheres
gestantes no maior do que nas no gestantes e pode No teste VDRL, o antgeno no estabilizado e uma
estar associado apenas ao grande nmero de mulheres suspenso fresca deve ser preparada no dia em que for
grvidas testadas para a doena, principalmente em usada. O teste realizado em um soro aquecido (56C)
lugares com baixa prevalncia (13). Via de regra, a e os resultados devem ser lidos com um microscpio
grande maioria dos soros falso-positivos apresentam utilizando um aumento de 100x. O VDRL continua
ttulos de anticorpos 1:4. Para excluir os resultados no sendo o teste escolhido para a deteco de reagina nos

126 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
espcimes no lquido cefalorraquidiano (LCR) obtidos de para VDRL pode ser comprada ou preparada no
pacientes com neurossfilis. Uma descrio detalhada laboratrio.
do teste VDRL fornecida a seguir. O teste de reagina
A soluo salina tamponada para VDRL inclui:
com soro no aquecido um aperfeioamento na verso
do teste do VDRL, utilizando o soro no aquecido e um Formaldedo, neutro (ACS) 0,5mL
antgeno estabilizado.
Na2HPO4, andrico 0,037g
Procedimento do teste VDRL (adaptado de Larsen et
KH2PO4 0,170g
al., 1998; 3).
NaCl 10,00g
Reagentes e equipamentos necessrios:
1. Antgeno VDRL. Uma soluo sem cor, alcolica, gua destilada 1000,0mL
contendo 0,03% de cardiolipina, 0,9% de colesterol e
O pH da soluo deve ser mensurado e a soluo
0,21%+0,01% de lecitina. O antgeno armazenado
armazenada em garrafas com tampa de rosca.
no escuro a temperatura ambiente (23-29C) ou
refrigerado a 2-8C, mas no deve ser congelado. Nota: quando uma mudana inexplicvel ocorre na
Nessas temperaturas, os componentes do antgeno reatividade dos controles, o pH da soluo salina deve
continuam em soluo. Garrafas ou frascos que ser mensurado para determinar se esta seria a causa da
contm o precipitado devem ser descartados. alterao. A soluo salina tamponada que estiver fora
do intervalo de 6,00,1 deve ser descartada.
2. Soluo salina tamponada para VDRL, pH 6,00,1
(NaCl a 1,0%). A soluo salina tamponada

Sfilis precoce Sfilis tardia


Primria Secundria Latente precoce Latente tardia Terciria

Normalmente
Negativo
No tratado Normalmente Normalmente positivo mas
tornando-se Sempre positivo
positivo positivo tornando-se
positivo
negativo

Tratado com Tornando-se Tornando-se Tornando-se Permanece Resultado sem


sucesso negativo negativo negativo positivo alterao

Teste de anticorpo no treponmico positivo Teste de anticorpo no treponmico negativo

Figura 10.4
Reatividade dos testes sorolgicos no treponmicos durante o curso da sfilis no tratada (quadrados) e resposta
dos testes acompanhando uma terapia bem sucedida (crculos), por estgio da doena.

Sfilis 127
3. Amostras de soro-controle. Soros reativos (R), 9. Microscpio binocular com oculares de 10x,
fracamente reativos (F) ou no reativos (N) nas objetiva de 10x.
formas liofilizadas ou lquidas so usados como
10. Recipientes para descarte; desinfetantes.
controle no teste. Se testes quantitativos forem
realizados, um soro-controle, que pode ser titulado 11. Luvas de ltex descartveis, culos de segurana e
a uma diluio de pelo menos 1:4, deve ser roupa de proteo.
utilizado.
12. Proteo para lminas enquanto estiverem no rotor
4. Acetona. para manter umidade e evitar o ressecamento.

5. lcool, etanol a 95%. 13. Seringas, 2mL ou 5mL.

6. Parafina. Procedimentos do teste para espcimes de soro

7. Soluo salina a 0,9%. Adicione 0,9g de cloreto de Preparao da suspenso do antgeno:


sdio seco para cada 100mL de gua destilada. 1. Prepare uma suspenso de antgeno VDRL fresca
para cada dia. Enquanto a suspenso est sendo
8. Soluo salina a 10,0%. Adicione 10g de cloreto de
preparada, mantenha a temperatura da soluo
sdio seco para cada 100mL de gua destilada.
salina tamponada, do antgeno e dos equipamentos
Equipamentos: entre 23-29C.

2. Dispense 0,4mL de soluo salina tamponada para


1. Agulhas calibradas no descartveis sem bisel
VDRL no fundo de uma garrafa com rolha redonda,
a. Para teste sorolgico: calibre 18 de 30mL, com o fundo de superfcie interna plana,
ou em um frasco com rolha de 25mL.
b. Para teste do LCR: calibre 21 ou 22
3. Adicione 0,5mL da suspenso de antgeno VRDL
2. Garrafas, 30mL com fundo de superfcie interna diretamente na soluo salina, enquanto gira a
plana. garrafa de forma contnua, mas gentil, em uma
superfcie plana. O antgeno deve ser adicionado
3. Dispositivo para pipetagem de segurana com gota a gota, num ritmo de aproximadamente seis
pontas descartveis que liberem 50mL. segundos para cada 0,5mL de antgeno.

4. Pipetas de 1,0mL, 5,0mL e 10,0mL. 4. A ltima gota do antgeno deve ser expulsa da
pipeta sem encost-la na soluo salina e a rotao
5. Lminas para microscpio, medindo 5x7,5cm,
da garrafa deve continuar por 10 segundos.
com 12 anis de parafina ou cermica de
aproximadamente 14mm de dimetro. Nota: os 5. Adicione 4,1mL de soluo salina tamponada.
anis devem ser altos o suficiente para prevenir o
6. Tampe a garrafa e agite-a aproximadamente 30
derramamento durante a rotao.
vezes em 10 segundos. A suspenso de antgeno
6. Suporte para lmina, para lminas de 5x7,5cm. est, ento, pronta para o uso e pode ser utilizada
durante o dia de trabalho.
7. Montador de anis, para fazer anis de parafina de
aproximadamente 14mm de dimetro (Cat.# 2600, 7. Misture a suspenso de antgeno VDRL,
Eberback Corp., Ann Arbor, MI, EUA). agitando-a gentilmente cada vez que for utiliz-la.
(A suspenso no deve ser misturada com
8. Agitador mecnico ajustvel para 1802rpm, movimentos de trs para frente por meio de uma
circunscrevendo um crculo de 19mm de dimetro seringa ou agulha, uma vez que isso pode causar a
em um plano horizontal. quebra de partculas e perda da reatividade.)

128 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Teste qualitativo (soro): Teste quantitativo (soro):
1. Os testes de floculao em lmina para sfilis 1. Prepare uma diluio dupla do soro a ser titulado.
so afetados pela temperatura ambiente. Para Testes quantitativos para trs espcimes de soro
resultados de teste confiveis e reprodutveis, com diluies de at 1:8 podem ser realizados em
a suspenso de antgeno VDRL, controles e os uma lmina.
espcimes a serem testados devem ser mantidos a
temperatura ambiente, 23-29C, quando os testes 2. Realize o teste na diluio de duas vezes do soro
forem realizados. exatamente da mesma forma que para o teste
qualitativo.
2. Adicione 50L de soro a ser testado em cada anel
da lmina com anel de parafina ou cermica. 3. Analise os resultados microscopicamente, utilizando
oculares de 10x e uma objetiva de 10x, assim como
3. Segurando a agulha ou seringa de distribuio de no teste qualitativo.
suspenso na posio vertical, dispense vrias
gotas do antgeno para descartar bolhas de ar 4. Registre os ttulos da maior diluio que apresenta
na agulha. Adicione, ento, uma gota (17L) da resultado reativo (no fracamente reativo).
suspenso de antgeno para cada anel contendo o
5. Aps completar os testes do dia, descarte a
soro.
suspenso de antgeno e limpe a agulha e a seringa
lavando-as com gua, lcool e acetona, nessa
4. Posicione a lmina no rotor mecnico e gire-a
ordem. Remova a agulha da seringa aps limp-la.
por quatro minutos a 1802rpm, debaixo de uma
proteo para manter a umidade atmosfrica e
evitar a evaporao em excesso. Nota: o teste VDRL o preferido para realizao
em LCR no diagnstico de neurossfilis. O teste
5. Imediatamente aps girar, analise a lmina e anote realizado de forma idntica quela utilizada para
os resultados do teste. soro. Entretanto, o espcime de LCR no deve ser
aquecido a 56C antes da realizao do teste.
6. Todos os espcimes de soro que produzirem
resultados reativos, fracamente reativos, ou no
10.3.1.2 Teste de reagina plasmtica rpida (RPR)
reativos irregulares no teste de lmina qualitativo
VDRL devem ser testados quantitativamente e a As principais vantagens do RPR em relao ao VDRL
titulao do ponto final deve ser registrada. que o primeiro inclui o uso de um antgeno estabilizado,
o emprego de cartes no lugar de lminas e a adio
de partculas de carvo no antgeno como um indicador
Leitura e registro dos resultados:
de floculao. O antgeno no coberto por essas
1. Analise as lminas microscopicamente, utilizando partculas, mas o carvo preso na estrutura formada
oculares de 10x e objetivas de 10x. pelo complexo antgeno-anticorpo nas amostras reativas,
tornando a reao visvel a olho nu. O teste pode ser
2. Registre os resultados como segue:
realizado em soro ou plasma no aquecido e conduzido
Leitura Registro em crculos de 18mm em cartes plastificados. O
Aglomerados mdios Reativo (R) RPR constitui o teste no treponmico macroscpico
ou grandes mais amplamente disponvel, sendo utilizado em todo
Aglomerados Fracamente reativo (F) o mundo. A Figura 10.5 mostra o procedimento para
pequenos realizar o teste RPR.
Sem aglomerados No reativo (N) Como uma modificao do RPR, o TRUST usa toluidina
ou rugosidade muito vermelha no lugar de carvo para visualizar a reao
discreta de floculao. Os reagentes do TRUST no precisam de

Sfilis 129
armazenamento refrigerado, ao contrrio dos utilizados Dessa forma, no h motivos para realizar ensaios
no teste RPR. treponmicos quantitativos como parte dos
algoritmos de diagnstico. Uma vez que alguns testes
10.3.2 Testes sorolgicos treponmicos treponmicos podem se tornar reativos antes dos no
Ao contrrio dos testes no treponmicos, os testes treponmicos (o teste FTA-Abs pode tornar-se reativo
treponmicos so considerados mais especficos. em aproximadamente trs semanas aps a infeco),
Entretanto, foram relatados raros resultados alguns pacientes com infeco primria muito recente
falso-positivos, que podem ser transitrios e de podem resultar soronegativos para o teste no
causa desconhecida ou associados a distrbios treponmico e soropositivos para o teste treponmico.
no tecido conjuntivo (11). de pouca importncia Entretanto, deve-se tomar muito cuidado quanto
o monitoramento de respostas terapia utilizando interpretao dos resultados desses testes sorolgicos,
testes treponmicos, uma vez que estes normalmente uma vez que a identificao de um teste no treponmico
permanecero positivos por toda a vida mesmo negativo e um treponmico positivo frequentemente
aps a oferta de terapia eficaz (ver Figura 10.6). uma indicao de doena recente previamente tratada,

(A)

1. Use luvas, jaleco e culos de 2. Coloque o kit e todos os reagentes 3. Prepare o equipamento. Umedea
proteo quando estiver necessrios em temperatura uma esponja e coloque-a na tampa
manipulando espcimes e reagentes. ambiente. do agitador

4. Prepare a folha de trabalho e 5. Aspire 50L de amostra de soro para 6. Dispense 50L (1 gota) do soro a ser
etiquete o carto de teste com a o interior de uma ponteira de pipeta testado e controles em cada crculo
identificao (ID) da amostra. de preciso ou dispensador. rotulado no carto de teste.

7. Espalhe as amostras e os controles 8. Fixe a agulha do conta-gotas garrafa de 9. Coloque o carto no agitador a
gentilmente dentro dos crculos, antgeno para RPR. Assegure-se de que o 100rpm por oito minutos.
utilizando a extremidade plana do antgeno esteja bem misturado. Adicione
dispensador. uma gota do antgeno a cada crculo.

10. Manualmente, agite algumas vezes o 11. Use uma boa luz para interpretar os 12. Registre os resultados em formulrios
carto, gentilmente. resultados. apropriados.

Figura 10.5
Procedimentos para a realizao (A) e interpretao (B) do teste de reagina plasmtica rpida (RPR)
Fonte: Centros de Controle e Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.

130 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
a menos que existam sinais bvios de infeco primria usando eritrcitos sensibilizados ou partculas de gelatina;
atual (ver e comparar Figura 10.4 e 10.6). os ELISA, inclusive as variantes que utilizam a tecnologia
de quimioluminescncia e imunocromatografia (fluxo
Todos os testes treponmicos atuais usam os lisados
lateral) ou testes POC. Entretanto, esses testes passveis
completos de clulas de T. pallidum ou antgenos
de automatizao, ou seja, alguns ELISA e ensaios de
recombinantes treponmicos, isolados ou misturados,
quimioluminescncia, foram licenciados em alguns pases
para detectar anticorpos contra componentes celulares
para utilizao como testes de triagem iniciais e os testes
treponmicos especficos. Existem vrias plataformas
POC treponmicos so frequentemente utilizados como
diferentes de testes utilizadas para a testagem sorolgica
o nico indicador de infeco, principalmente em lugares
treponmica, incluindo a IF indireta; o teste de aglutinao
com limitao de recursos.

(B) Resultados qualitativos: Reativo


(Aglomerao/
Minimamente reativo
(Leve aglomerao/
No reativo
(Padro cinza suave)
surgimento de aglutinao)
aglutinao).

As amostras apresentando um grau de Todas as amostras Todas as amostras Relate como no reativo
reatividade igual ou maior em relao ao reativas devem ser reativas devem ser
controle minimamente reativo (Rm) so reativas testadas por RPR testadas por RPR
(R). Os trs crculos inferiores do lado direito do quantitativa para obter quantitativa para obter
carto so os controles: reativo R, um nvel de titulao. um nvel de titulao.
minimamente reativo Rm e no reativo N.

Procedimentos do teste RPR quantitativo:

1. 2. 3.
1. Rotule um carto de teste com a 2. Adicione 50L de soluo salina a 0,9% 3. Adicione 50L de amostra no primeiro
identificao (ID) das amostras e as em cada crculo que conter a amostra (1:1) e segundo (1:2) crculos.
diluies em duas vezes seriadas. Cada diluda ou o controle. NO adicione
amostra ser testada sem estar diluda soluo salina no primeiro crculo para
(1:1) e diluda (1:2, 1:4, etc.). cada amostra (poo 1:1).

4. Utilizando uma pipeta, misture os 5. Transfira 50L dessa mistura (crculo 2) 6. Siga os passos 7-12 na pgina 1 (RPR
espcimes com a gota de soluo para o prximo crculo (3) e repita o qualitativo) e anote os resultados de
salina, movimentando o lquido para passo da mistura at que a ltima modo que os nveis de diluio sejam
cima e para baixo na ponteira da pipeta diluio seja realizada. Descarte os registrados; isto , a maior diluio
5-6 vezes. ltimos 50L. reativa a 1:4 ser registrada como R4.

Resultados quantitativos:

Registre a diluio mais alta reativa. No caso acima, o No caso acima, o espcime reativo at a diluio 1:64 e ser
espcime 7 (primeira fileira) mostra a reatividade para a registrado como R64. Se a diluio mais alta ainda for reativa,
diluio 1:1 e registrada como R1. O espcime 8 (segunda deve-se continuar com a diluio do espcime: prepare um
fileira) um R4. Os trs crculos de baixo do lado direito do novo carto de teste e estenda as diluies at que a mistura
carto so os controles: reativo R, minimamente reativo em um crculo no seja reativa.
Rm e no reativo N.

Figura 10.5 (continuao)


Procedimentos para a realizao (A) e interpretao (B) do teste de reagina plasmtica rpida (RPR)
Fonte: Centros de Controle e Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.

Sfilis 131
Sfilis precoce Sfilis tardia
Primria Secundria Latente precoce Latente tardia Terciria
Normalmente
Negativo positivo,
Sempre Sempre Sempre
No tratado tornando-se tornando-se
positivo positivo positivo
positivo eventualmente
negativo

Permanece
Tratado com positivo (se Permanece Permanece Permanece Resultado sem
sucesso inicialmente positivo positivo positivo alterao
positivo)

Teste treponmico positivo Teste treponmico negativo

Figura 10.6
Reatividade dos testes sorolgicos treponmicos durante o curso da sfilis no tratada (quadrados) e resposta dos
testes acompanhando uma terapia bem-sucedida (crculos), por estgio da doena.

10.3.2.1 Teste de absoro do anticorpo


treponmico fluorescente (FTA-Abs)
O teste FTA-Abs foi considerado por muito tempo o
teste treponmico padro ouro, tendo sido, entretanto,
recentemente substitudo por testes mais sensveis,
com menos demandas tcnicas e subjetividade bem
menor. Tanto o desempenho do teste como a leitura
dos resultados devem ser verificados cuidadosamente.
Um microscpio de fluorescncia de boa qualidade,
experincia na leitura de resultados por parte do
executante, reagentes de qualidade e uma diluio
apropriada do conjugado so todos fatores crticos para Figura 10.7
a confiabilidade do teste (Figura 10.7). Infelizmente, Teste FTA-Abs positivo mostrando espiroquetas T.
resultados de FTA-Abs tanto falso-positivos como falso- pallidum fluorescentes.
negativos so comuns devido a erros laboratoriais e Fonte: adaptado de Larsen et al., 1998 (3)
leitura subjetiva do teste (14, 15). Veja a seguir o mtodo
detalhado.

132 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Reagentes: Reagentes a serem preparados:

1. As lminas de antgeno do T. pallidum podem 1. Soluo salina tamponada com fosfato (PBS, do
ser obtidas comercialmente. Alternativamente, o ingls phosphate-buffered saline solution). Deve
antgeno pode ser adquirido como uma suspenso ser preparada utilizando a seguinte formulao em
ou preparado a partir de T. pallidum (cepa Nichols) gua destilada e armazenada em grandes volumes:
extrado do tecido testicular de coelho e lavado
NaCl 7,65g
com soluo salina tamponada com fosfato (PBS,
Na2HPO4 0,724
do ingls phosphate-buffered saline solution) para
KH2PO4 0,21g
remover a globulina de rato. Guarde os frascos
H2O destilada 1000mL
fechados a 2-8C.

2. Imunoglobulina anti-humana marcada com O pH deve ser determinado e ajustado para pH 7,20,1
isotiocianato de fluorescena (FITC, do ingls com NaOH 1N.
fluorescein isothiocyanate). 2. Tween 80 a 2,0% em PBS.

3. Prepare o reagente absorvente a partir de Aquea os reagentes a 56C em banho-maria.


culturas de treponemas Reiter no patognicos, Para 49mL de PBS estril, adicione 1mL de Tween
normalmente sem a adio de conservante. O 80. Ajuste o pH para 7,2 com NAOH 1N. Descarte
reagente geralmente distribudo em volumes de o reagente caso se forme um precipitado ou se
5mL e liofilizado ou mantido como suspenso. houver mudana no pH.

4. Soro controle reativo. Obtenha uma mistura 3. Meio de montagem. Adicione uma parte de PBS, pH
de soros humanos de doadores soropositivos 7,2, para nove partes de glicerina (grau reagente).
com reatividade 4+. Distribua a mistura de
soros em alquotas e armazene-os congelados, Equipamentos:
preferencialmente a -70C ou menos. O soro 1. Estufa, 35-37C.
altamente reativo pode ser diludo apropriadamente
com soro no reativo para produzir um controle 2. Banho-maria, ajustvel para 56C.
minimamente reativo 1+. O controle 1+ exibe o
3. Centrfuga.
menor grau de fluorescncia relatado como reativo
e usado como um padro para leitura. 4. Dispositivos para pipetagem de segurana.

5. Soro controle inespecfico. O soro controle 5. Micropipetas de 10L e 200L.


inespecfico uma mistura de soro obtida de
indivduos sem sfilis. Nenhum conservante 6. Ala bacteriolgica de platina padro com 2mm de
adicionado. Esse controle mostra uma reatividade dimetro, calibre 26.
no especfica >2+ a uma diluio em PBS de 1:5 7. Papel absorvente.
e, praticamente, nenhuma colorao quando diludo
no reagente absorvente em 1:5. 8. Placa de lminas com cmera mida e papel toalha.

6. leo de imerso no secante e de baixa 9. Cubas de colorao de vidro ou plstico, com


fluorescncia. porta-lminas removvel.

7. Acetona. 10. Lminas para microscpio, 1x3 polegadas, com


extremidade fosca, espessura de 1mm, com dois
crculos, dimetro interno de 1cm.

11. Lamnulas, no 1, 22mm2.

Sfilis 133
12. Tubos de teste (12x75mm) e suporte. Imunoglobulina anti-humana marcada com
fluorescena (conjugado):
13. Recipientes para descarte e desinfetantes.
1. Reidrate o conjugado marcado com FITC de acordo
14. Luvas de ltex descartveis, culos de segurana e
com as instrues do fabricante. Se for observada
roupa de proteo.
turvao, centrifugue a 500g por 10 minutos. Faa
15. Microscpio de fluorescncia com ocular de 10x e alquotas de volumes pequenos e armazene-os a
objetivas de 10x e 40x. -20C. O conjugado descongelado no deve ser
congelado novamente, mas armazenado a 2-8C.
16. Agitador (vrtice).
2. Prepare diluies seriadas em duplicata do novo
Se as lminas de antgeno no forem adquiridas conjugado em PBS pH 7,2, contendo Tween 80 a
comercialmente, elas podem ser preparadas a partir 2%, de modo que as diluies incluam a titulao
de suspenses treponmicas, como descrito a seguir: sugerida pelo fabricante.
1. Higienize as lminas com gaze limpa e armazene-as 3. Teste cada diluio do conjugado com o soro
em lcool. controle reativo 4+ diludo em PBS em 1:5 e com a
2. Se necessrio, reidrate o antgeno de acordo com diluio do controle reativo mnimo 1+ apropriado,
as instrues do fabricante. Armazene os frascos utilizando o procedimento de FTA-Abs descrito
abertos a 2-8C. Estes devem permanecer estveis adiante.
por uma semana. 4. Inclua um controle de colorao inespecfico em
3. Misture vigorosamente as suspenses de antgeno cada diluio do conjugado.
em um agitador (vrtice) por 10 segundos e 5. Prepare um conjugado testado previamente em sua
examine as amostras com um microscpio de diluio de trabalho e realize testes com um soro-
campo escuro para garantir que os treponemas controle reativo 4+, um soro controle minimamente
estejam distribudos adequadamente ( melhor reativo 1+ e um controle de colorao inespecfico
obter organismos nicos que amontoados) antes da com PBS para atuarem como controles ao testar
preparao das lminas para o teste FTA-Abs. pela primeira vez um lote novo do conjugado.
4. Prepare esfregaos bem finos do antgeno de T. 6. Leia as lminas de acordo com a seguinte ordem:
pallidum dentro de cada crculo, utilizando uma ala
de arame de 2mm. Coloque uma ala completa de a. Examine as trs lminas controle (descritas
antgeno dentro dos dois crculos de 1cm e deixe acima no item 5) para garantir que os
secar ao ar livre por, pelo menos, 15 minutos. reagentes e as condies de teste sejam
satisfatrias.
5. Fixe as lminas em acetona por 10 minutos e
deixe-as secar ao ar livre. Armazene os esfregaos b. Examine as lminas de conjugados novos,
fixados com acetona a -20C. Os esfregaos no comeando pela de menor diluio do
devem ser descongelados e congelados novamente. conjugado, e registre as leituras como 1+, 2+,
3+ ou 4+.
Soluo absorvente
c. A maior diluio o ponto final da titulao,
Reidrate a soluo absorvente com gua destilada estril resultando em uma fluorescncia mxima 4+
ou de acordo com as instrues do fabricante. Armazene com o soro controle reativo e uma leitura 1+
a soluo absorvente reidratada a 2-8C ou a -20C. com a diluio 1+. A titulao de trabalho do
Ela pode ser utilizada enquanto apresentar reatividade novo conjugado uma diluio de duas vezes
aceitvel e o produto no estiver contaminado. abaixo do ponto final e deve ser o ponto final
do controle minimamente reativo.

134 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
d. O novo conjugado no pode colorir lminas na cuba de colorao contendo PBS por
inespecificamente trs diluies de duas vezes cinco minutos e agite as lminas, colocando-as
abaixo da titulao de trabalho do conjugado. dentro e fora do PBS, pelo menos 20 vezes.
Utilizando PBS fresco, repita o procedimento de
e. Armazene o conjugado de acordo com o
enxgue mais uma vez. Finalmente, enxague as
fabricante e distribua-o em alquotas no
lminas por cinco segundos em gua destilada
inferiores a 0,3mL a menos de -20C. Um
corrente e passe levemente o papel absorvente.
conjugado com uma diluio de trabalho de
1:1000 ou maior deve ser diludo em 1:10 com 11. Dilua a IgG anti-humana marcado com FITC sua
PBS estril contendo 0,5 de albumina de soro titulao de trabalho em PBS contendo Tween 80 a
bovino e 0,1% de azida de sdio antes de ser 2% e verta aproximadamente 30L do conjugado
congelado. diludo em cada esfregao.

f. Verifique a titulao do conjugado aps o 12. Repita os passos 9 e 10.


armazenamento por vrios dias no congelador.
13. Monte as lminas imediatamente, colocando uma
Procedimento do teste pequena gota de meio de montagem em cada
esfregao e sobrepondo uma lamnula.
1. Identifique as lminas de antgenos preparadas
previamente por meio da numerao da parte 14. Coloque as lminas em uma cmara escura e
fosca. prossiga com a leitura em at quatro horas.

2. Enumere cada tubo e lmina para corresponderem 15. Verifique os esfregaos por microscopia de campo
ao soro teste e ao soro controle. escuro, utilizando primeiro uma lmpada de
tungstnio para verificar a presena de treponemas
3. Prepare as diluies dos soros controle reativo (4+),
no esfregao e, ento, analise-os em um
minimamente reativo (1+) e inespecfico na soluo
microscpio de fluorescncia, utilizando os filtros
absorvente ou em PBS, de acordo com o fabricante.
apropriados para FITC.
4. Pipete 200L de soluo absorvente em um tubo
10.3.2.2 Ensaios de aglutinao treponmicos
de teste para cada soro-teste.
Os testes TPHA e TPPA so mais fceis de ser realizados
5. Adicione 50L de soro-teste aquecido ao tubo que o FTA-Abs e apresentam sensibilidade similar do
apropriado e misture. FTA-Abs. Esses ensaios de aglutinao so tambm
mais prticos que o teste FTA-Abs para o processamento
6. Cubra os esfregaos de antgeno adequados com de lotes com grande nmero de espcimes. O TPHA
30L das diluies dos soros-controle reativo (4+), e, mais recentemente, o TPPA, surgiram como testes
minimamente reativo (1+) e inespecfico. confirmatrios treponmicos escolhidos por muitos
7. Cubra os esfregaos de antgeno adequados com laboratrios. A Figura 10.8 mostra o procedimento de
30L de PBS e 30L de soluo absorvente para os execuo do teste TPPA. O mtodo para realizar o TPHA
controles de colorao inespecficos. semelhante.

10.3.2.3 Imunoensaios enzimticos (EIA) e ensaios de


8. Cubra os esfregaos de antgeno adequados com
quimioluminescncia (EQI) treponmicos
30L das diluies do soro teste.
Os EIA e EQI para a deteco do anticorpo para T.
9. Coloque as lminas em uma cmara mida e pallidum foram desenvolvidos ainda mais recentemente.
incube-as a 35-37C por 30 minutos, para evitar a Suas sensibilidades e especificidades so comparveis
evaporao. s do FTA-Abs e ensaios de aglutinao.

10. Coloque as lminas no suporte e enxague por cinco A maioria dos EIA treponmicos empregam tanto
segundos em PBS corrente. Ento, coloque as antgenos de T. pallidum sonicados, um antgeno

Sfilis 135
recombinante treponmico, ou uma mistura de revestidas por antgeno e subsequente deteco das
recombinantes revestidos nos poos de placas de prolas que foram marcadas com ficoeritrina conjugada
microtitulao. Uma diluio do soro dos pacientes a IgG de cabra anti-humana, ora detectam os anticorpos
adicionada a cada poo. Se anticorpos especficos para utilizando um conjugado de isoluminol-antgeno para
T. pallidum estiverem presentes no soro, eles se ligaro gerar emisso de quimioluminescncia, que detectada
aos antgenos treponmicos. Aps lavar o excesso de por um sistema fotomultiplicador sofisticado (16).
anticorpos, um conjugado composto por IgG de cabra
Devido ao grande nmero de EIA e EQI disponveis
biotinilada anti-humana marcado com estreptavidina-
comercialmente no mundo, uma descrio detalhada do
peroxidase adicionado para detectar anticorpos
procedimento do teste para cada fabricante est alm
de ligao especfica. Aps um passo seguinte de
do escopo deste captulo. Dessa forma, solicita-se que
lavagem para remover qualquer excesso de conjugado,
o leitor siga as instrues includas no manual fornecido
um substrato de enzima adicionado para detectar o
pelo fabricante em cada kit.
complexo antgeno-anticorpo-conjugado. Uma reao
de colorao ocorre caso o paciente tenha anticorpos 10.3.2.4 Ensaios de western blot treponmicos
para o(s) antgeno(s) de T. pallidum. A intensidade do
aparecimento da cor diretamente proporcional O teste WB treponmico tem sido utilizado como um
concentrao de anticorpos presente. A mudana de cor teste confirmatrio para anticorpos treponmicos no
lida utilizando um leitor de placas. soro de pacientes com sfilis. Antgenos individuais
de T. pallidum so fracionados por eletroforese de
Em alguns EIA, utiliza-se uma abordagem diferente para poliacrilamida de lisados celulares totais. As bandas de
a deteco de anticorpos especficos. Os antgenos polipeptdeos resolvidas de vrias massas moleculares
recombinantes treponmicos especficos com 15kD, so, ento, transferidas para folhas de membrana
17kD, 44,5kD e 47kD so imobilizados nos poos de de nitrocelulose. Essas folhas so secas e cortadas
microplacas. O soro do paciente ento adicionado em tiras para ser utilizadas em amostras de soro
aos poos e, se houver presena de anticorpos individuais. O soro de um paciente diludo e incubado
antitreponmicos, eles se ligaro especificamente aos com cada tira. Se houver presena de anticorpos IgM
antgenos imobilizados. Todas as protenas no ligadas especficos para T. pallidum na amostra, eles se ligaro
so ento removidas durante a fase de lavagem. Os a um ou mais antgenos de peso molecular 15kD, 17kD,
mesmos antgenos recombinantes que foram conjugados 44,5kD e 47kD na tira. Qualquer anticorpo no ligado
peroxidase de rbano so adicionados aos poos removido por lavagem.
da placa. Aps um passo seguinte de lavagem para
Os anticorpos ligados so detectados com fosfatase
remover os conjugados no ligados, adiciona-se um
alcalina conjugada IgG ou IgM anti-humana. A tira ,
substrato cromognico peroxidase. A mudana de cor
ento, lavada para remover o excesso de conjugados e,
resultante medida espectrofotometricamente aps se
finalmente, reage com um precipitado desenvolvendo
adicionar uma soluo de parada. A intensidade da cor
uma soluo que forma bandas de antgeno roxas. A
proporcional quantidade de anticorpos presentes
reatividade nas bandas especficas dos antgenos de
no soro do paciente. Como um resultado dessa
15kD, 17kD e 47kD considerada significativa (Figura
configurao, a especificidade e a sensibilidade do teste
10.9). Em contraste, a reatividade em outras posies
so superiores s dos ELISA treponmicos de primeira
da tira no considerada significativa. Os WB foram
gerao.
utilizados no passado para estudar a resposta imune
Os EQI para detectar os anticorpos treponmicos sfilis (17, 18) e, subsequentemente, para selecionar os
so quase que exclusivamente utilizados em grandes antgenos adequados a ser includos nos imunoensaios
laboratrios clnicos em pases industrializados, onde em linha.
o custo de mo de obra alto e se prev uma grande
demanda de espcimes. Esses ensaios ora usam o
princpio de ligao de um anticorpo especfico a prolas

136 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
(A) Verifique o kit antes de utiliz-lo. Coloque todos os espcimes e reagentes em temperatura ambiente. Anote o nmero do
lote e a data de validade.
Sempre use as medidas universais de segurana quando estiver manipulando espcimes.
Tempo de execuo: aproximadamente uma hora. O nmero mximo de espcime/placa de 21.

Este guia no tem a inteno de substituir o manual do produto ou seu procedimento operacional padro (POP).

Use luvas, jaleco e culos de Prepare os materiais necessrios Coloque o kit e todos os reagentes
proteo quando estiver (kit, agitador de placa, pipetas, placa necessrios em temperatura
manipulando espcimes e reagentes. de microtitulao em formato de U). ambiente antes de utiliz-los.

Identifique a folha de trabalho e as Adicione 100L de diluente de amostra Inverta a amostra de soro para
placas de microtitulao com a para TPPA no primeiro poo de cada mistur-la. Adicione 25L de amostra
identidade das amostras (ID). Divida cada conjunto de espcime e controle. no primeiro poo de cada conjunto
placa de modo que cada espcime Adicione 25L de diluentes de amostra de espcime. Misture pipetando para
ocupe um conjunto de quatro poos para TPPA nos poos restantes da cima e para baixo 5-6 vezes.
consecutivos. O controle positivo placa. Transfira 25L para o segundo poo
ocupar toda a primeira fileira (oito e misture 5-6 vezes. Repita para o
poos). O controle negativo ocupar poo 4, descartando 25L do poo 4
quatro poos. de cada espcime.

Reconstitua os reagentes contendo Adicione uma gota (25L) de partculas Adicione uma gota (25L) de partculas
partculas sensibilizadas e no no sensibilizadas (tampa cinza) ao sensibilizadas (tampa vermelha) ao
sensibilizadas. Misture gentilmente para terceiro poo de cada amostra e quarto poo de cada amostra e aos
garantir a ressuspenso completa. controle. poos 5-8 do controle positivo.

Cubra a placa com um protetor e Incube por duas horas em Leia, interprete e registre os
misture por 30 segundos. temperatura ambiente. resultados nos formulrios
apropriados.

Figura 10.8
Procedimentos de execuo (A) e interpretao dos resultados (B) do ensaio de aglutinao passiva de partculas
para Treponema pallidum (TPPA).
Fonte: Centros de Controle e Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.

10.3.2.5 Imunoensaios em linha tiras de membrana de nitrocelulose com um suporte de


plstico rgido. O soro do paciente adicionado s tiras
Os imunoensaios em linha para sfilis so designados
dos testes. Se anticorpos especficos para T. pallidum
como testes confirmatrios treponmicos. Eles so
estiverem presentes nas amostras, eles se ligaro s
planejados para uso como testes suplementares quando
linhas de antgenos individuais (19). Aps lavar qualquer
os resultados dos testes treponmicos de rotina so
excesso de soro, adiciona-se uma IgG ou IgM de cabra
ambguos. Quatro protenas recombinantes, TpN47,
anti-humana, marcada com fosfatase alcalina, a qual
TpN17, TpN15 e TmpA, so revestidas como linhas em

Sfilis 137
(B)
O controle positivo
ocupa toda a
primeira fileira.
O controle
negativo ocupa
quatro poos
consecutivos.
Cada espcime
ocupa quatro
poos
consecutivos.

Adicione
partculas
sensibilizadas.

Adicione
partculas no
sensibilizadas.

Interpretao dos resultados de TPPA


Diluio do
controle
positivo

Interpretao Clulas-teste Clulas-controle Padro de organizao


Anel grande definido com uma margem externa
irregular multiforme e aglutinao perifrica, ou
partculas aglutinadas espalhadas, cobrindo
uniformemente o fundo do poo.
Positivo

As partculas se concentram no formato de um


boto no centro do poo, com uma margem
externa suave e arredondada.
Negativo
As partculas se concentram no formato de um
anel compacto, com uma margem externa suave
e arredondada.
Inespecfico
O uso de nome e recursos comerciais apenas para a identificao e no implica apoio pela OMS.

Figura 10.8 (continuao)


Procedimentos de execuo (A) e interpretao dos resultados (B) do ensaio de aglutinao passiva de partculas
para Treponema pallidum (TPPA).
Fonte: Centros de Controle e Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.

se ligar a qualquer complexo antgeno-anticorpo de especficos presentes na amostra. Quando no h


sfilis formado. A adio subsequente de um substrato anticorpos para T. pallidum presentes, pode aparecer
para a enzima produz linhas de cor marrom-escura, cuja apenas uma cor de fundo padro.
densidade proporcional concentrao de anticorpos

138 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
10.3.2.6 Testes POC para sfilis da Organizao Mundial da Sade para a Eliminao
Global da Sfilis Congnita (24). O uso desses testes
Mundialmente, existem vrios fabricantes para testes de
simples permite a triagem e o tratamento no mesmo
diagnstico POC para sfilis. Esses testes so geralmente
dia em clnicas perifricas distantes dos laboratrios.
formatados seja como testes de fita com fluxo lateral,
Esses testes podem ser realizados utilizando o sangue
seja como dispositivos de escoamento. No formato
completo (obtido por uma picada no dedo), plasma ou
de fluxo lateral, um ou mais antgenos recombinantes
soro e no necessitam de equipamentos especiais (a
so distribudos em uma tira imunocromatogrfica de
exemplo de refrigerador ou centrfuga). Embora sejam
nitrocelulose para capturar anticorpos treponmicos
de fcil execuo, necessria a adeso rigorosa s
especficos e uma linha colorida produzida ao associar
instrues do fabricante para garantir sua preciso. A
imunoglobulina anti-humana ligada a uma enzina, ouro
adoo de testes POC em clnicas requer a superviso
coloidal ou partculas de ltex coloridas.
contnua por um laboratrio de referncia, incluindo o
Uma linha de controle separada incorporada ao teste, estabelecimento de um programa de avaliao externa
atuando tanto como um controle de procedimento da qualidade.
(em alguns testes) ou indicando a adequao do
Alm das aplicaes de triagem, esses testes podem ser
espcime (por meio da indicao da presena de
utilizados para confirmar a especificidade dos testes no
imunoglobulina humana inespecfica no espcime
treponmicos reativos no lugar de ensaios treponmicos
do paciente) (20-22). Em formato de escoamento,
laboratoriais mais complexos. importante notar que o
pontos de antgenos substituem as linhas, e a ligao
uso desses testes treponmicos rpidos sozinhos (isto
do anticorpo especfico ao antgeno ocorre durante a
, sem a subsequente confirmao no treponmica dos
passagem pela membrana ao invs da passagem lateral
testes rpidos reativos), inevitavelmente, resultar em
ao longo da tira de membrana. Todos esses testes
tratamento excessivo, uma vez que, assim como todos
fornecem uma identificao rpida de exposio prvia
os testes treponmicos, eles provavelmente continuaro
infeco por treponema e vm sendo convenientemente
reativos por toda a vida, mesmo aps a realizao
utilizados na triagem de mulheres grvidas em pases
de tratamento bem-sucedido. Idealmente, um teste
em desenvolvimento para prevenir a sfilis congnita.
quantitativo no treponmico deve ser realizado visando
O uso desses testes para a triagem de sfilis durante
aumentar a especificidade do diagnstico da infeco
a gravidez mostrou-se extremamente econmico (23)
ativa e servir de base para monitorar o tratamento. Pela
e surgiu como um componente-chave da Estratgia
mesma razo, esses testes rpidos treponmicos no

Cont + + + + + + _ _ _ Cont

Figura 10.9
Deteco de anticorpos para Treponema pallidum por western blot (WB).
Fonte: Centros de Controle e Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.

Sfilis 139
podem ser utilizados sozinhos para a sorovigilncia O desenvolvimento recente de ELISA e EQI treponmicos
de sfilis, a menos que um teste no treponmico seja com possibilidade de automao resultou em uma
realizado em todos os casos reativos na triagem por mudana nessa abordagem, particularmente em
teste rpido; somente aqueles duplamente reativos sero muitos laboratrios com grandes demandas em
considerados casos de infeco. pases industrializados, nos quais o custo de mo de
obra alto e a soroprevalncia baixa, tais como em
A Figura 10.10 mostra um exemplo de procedimento a bancos de sangue. Assim, a triagem de lotes de soros
ser seguido e os resultados que podem ser obtidos em realizada por meio de um desses testes ELISA ou
um teste rpido treponmico de fluxo lateral. Para outros EQI mais recentes e, somente se um soro for reativo,
tipos de dispositivo, devem-se seguir precisamente realiza-se um teste no treponmico. Se tanto os testes
as instrues do fabricante. Ambos os formatos de treponmicos como no treponmicos forem reativos, tal
escoamento ou de fluxo lateral permitem a realizao como anteriormente descrito, deve-se realizar um teste
de ensaios multiplex. Como resultado, testes POC no treponmico quantitativo.
imunocromatogrfico duplo treponmico/HIV esto
atualmente em desenvolvimento. Essas duas abordagens devem, teoricamente, produzir
o mesmo resultado. Entretanto, a segunda abordagem
importante ressaltar que, atualmente, existe resulta na deteco de testes treponmicos positivos
pelo menos um teste POC duplo no treponmico/ e testes no treponmicos negativos, que no foram
treponmico disponvel comercialmente em algumas detectados pela abordagem convencional (27 ). Uma
regies do mundo (25, 26). Ao detectar tanto anticorpos vez que esse padro de reatividade sorolgica pode
treponmicos como no treponmicos (Figura 10.11), ser encontrado na sfilis primria recente, na doena
prev-se que esses testes reduziro fortemente as taxas primria previamente tratada e raramente na infeco
de tratamento excessivo inerentes ao teste rpido atual e terciria tardia, deve-se dar considervel ateno aos
permitiro que um nico dispositivo POC seja usado para resultados do exame fsico de pacientes, histria prvia
a sorovigilncia de sfilis. da doena e ao risco sexual recente, antes de qualquer
tratamento e notificao do parceiro.

10.3.3 Uso apropriado de testes sorolgicos Os laboratrios devem considerar os seguintes fatores
para sfilis antes de escolher a abordagem mais apropriada
(frequentemente em termos de custo-benefcio) para
A Tabela 10.1 mostra a sensibilidade e a especificidade
fornecer servios sorolgicos de sfilis a uma populao
de testes para sfilis no treponmicos e treponmicos,
em particular, a saber: o nmero de soros triados para
para as diferentes fases da doena.
sfilis em um determinado lugar; a soroprevalncia de
A abordagem convencional para o teste sorolgico de sfilis (tanto treponmica quanto no treponmica);
sfilis envolve a triagem do soros com um teste no o custo da aquisio de equipamentos para ELISA e
treponmico de baixo custo, sensvel, mas relativamente EQI; o custo dos kits para testes no treponmicos e
menos especfico e trabalhoso e, se este gerar treponmicos; e o custo da mo de obra.
resultado reativo, realiza-se a confirmao por meio Nos casos em que se detectarem reaes
de um teste treponmico mais especfico, porm mais indeterminadas em qualquer dos testes, estes devem
caro. Ao longo dos anos, essa abordagem mostrou-se ser repetidos, se possvel, no espcime de um soro
eficiente, principalmente em lugares nos quais a novo. Se os ensaios iniciais no resultarem reativos e
doena frequentemente encontrada. A subsequente caso se suspeite de sfilis primria, os testes devem
titulao do soro reativo confirmado, utilizando um teste ser repetidos aps 2-3 semanas em uma nova amostra
no treponmico quantitativo, tambm fornece uma de soro. Finalmente, alguns pacientes que receberam
interpretao mais precisa desses resultados, com uma o devido tratamento logo no incio da infeco primria
mensurao da linha de base (ttulo) em relao qual permanecero negativos para o teste de anticorpo.
se pode avaliar a eficcia da terapia.

140 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
(A) Verifique o kit antes de utiliz-lo. Use apenas os itens no expirados e no danificados.
Sempre use as medidas universais de segurana quando estiver manipulando espcimes. Mantenha a rea de trabalho limpa e organizada.

Este guia no tem a inteno de substituir o manual do produto ou seu procedimento operacional padro (POP).

Separe os itens do teste e todos os Abra um envelope laminado do teste. Identifique a tira do teste com o
outros materiais de laboratrio nmero de identificao do paciente.
necessrios.

Realize a puno digital ou venosa. Colete 20L de sangue total. Para a Aplique o espcime na almofada
puno digital, use duas gotas de sangue absorvente da tira.
da ponta do dedo. Para a puno venosa,
abra um tubo para a coleta de sangue a
vcuo (Vacutainer) e utilize uma pipeta de
preciso.

Adicione 3 gotas do diluente do Espere 10 minutos e leia, Leia e registre os resultados e outras
ensaio no espcime sobre a imediatamente, os resultados. informaes pertinentes no
almofada. questionrio do estudo.

Figura 10.10
Procedimentos de execuo (A) e interpretao dos resultados (B) de um teste rpido treponmico de fluxo lateral.
Fonte: Centros de Controle e Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.

A sororreverso dos testes no treponmicos em 10.4 Diagnstico laboratorial de sfilis congnita


pacientes devidamente tratados ocorre normalmente
Qualquer leso na pele ou membrana mucosa presente
dentro de um perodo de seis meses a alguns anos
em um recm-nascido de me soropositiva deve ser
e est associada durao da infeco e titulao
examinada por microscopia de campo escuro, IF direta
de anticorpos no soro no momento da terapia (28).
ou PCR para obter evidncias diretas de infeco por
Entretanto, em alguns indivduos, principalmente
T. pallidum. Treponemas saprfitos no aparecem na
naqueles que receberam tratamento 1-2 anos aps
boca do neonato at, aproximadamente, seis semanas
o incio da infeco, os anticorpos no treponmicos
aps o nascimento. Assim, existe pouca chance de obter
podem persistir por longos perodos, mesmo aps o uso
resultados falso-positivos a partir de espcimes orais.
de terapia adequada. Esses indivduos so conhecidos
como soro-rpidos. A sororreverso de testes A deteco de um teste sorolgico reativo em um
treponmicos pode ocorrer tambm em uma minoria dos neonato pode ser resultado de transferncia passiva
pacientes em poucos anos. de anticorpos maternais atravs da placenta durante

Sfilis 141
(B) Positivo
Aparecem duas linhas de qualquer intensidade em ambas as reas de controle e do paciente.

Negativo
Aparece uma linha na rea do controle e nenhuma linha na rea do paciente.

Invlido
No aparece linha na rea do controle.
No registre resultados invlidos. Repita o teste com um novo dispositivo de teste.

Invlido
Nenhuma linha aparece na rea de controle e aparece uma linha na rea do paciente.
No registre resultados invlidos. Repita o teste com um novo dispositivo de teste.

Figura 10.10 (continuao)


Procedimentos de execuo (A) e interpretao dos resultados (B) de um teste rpido treponmico de fluxo lateral.
Fonte: Centros de Controle e Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.

Tabela 10.1 Caractersticas de desempenho de testes sorolgicos para sfilis selecionados, por estgio da
doena
Sensibilidade (%)
Estgio da infeco por sfilis
Teste Primria Secundria Latente Terciria Especificidade (%)
FTA-Abs 98 (93-100) 100 100 96 99
TPHA/PA 82 (69-90) 100 100 94 99
RPR 86 (81-100) 100 80 (53-100) 73 (36-96) 98
VDRL 80 (74-87) 100 80 (71-100) 71 (37-94) 98
FTA-Abs: absoro do anticorpo treponmico fluorescente; TPHA: ensaio de hemaglutinao para Treponema pallidum; TPPA: ensaio de
aglutinao passiva de partculas para Treponema pallidum; RPR: reagina plasmtica rpida; VDRL: Laboratrio de Pesquisa de Doenas Venreas.

a gravidez, o que no pode ser considerado um um perodo de trs meses, foram previamente
diagnstico. Entretanto, a identificao de ttulos por considerados indicadores de infeco congnita.
RPR/VDRL significativamente superiores (isto , 4
As verses modificadas dos testes FTA-Abs (FTA-IgM),
vezes maior) no soro de um neonato comparados
EIA especficos e imunoensaios em linha que detectam
titulao materna, ou a deteco de um aumento
somente IgM podem ser utilizadas para detectar IgM
significativo dos ttulos por RPR/VDRL durante
antitreponmico especfico, o qual no capaz de

142 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
atravessar a barreira placentria. A identificao desses Em EIA para IgM especfico, o anticorpo IgM de coelho
anticorpos IgM na circulao do beb uma indicao de anti-humano (cadeia especfica) colocado nos poos
infeco congnita, mas o IgM especfico no pode ser de placas de microtitulao. Uma diluio mensurada
detectado em todos os casos da doena congnita (29). do soro do paciente adicionada aos poos da placa. A
IgM de coelho anti-humana captura qualquer anticorpo
Testes de IF indireta para IgM especficos apresentam
IgM disponvel no soro do paciente. O antgeno de T.
especificidade notoriamente baixa e o teste FTA-IgM,
pallidum purificado adicionado aos poos da placa,
assim como o teste FTA-Abs, inerentemente subjetivo.
e seu excesso lavado. Uma mistura de antissoro
Alm disso, as colunas usadas para separar as fraes
anti-T. pallidum biotinilado humano ou de coelho e
de imunoglobulinas na utilizao do teste 19S-FTA-IgM,
estreptavidina conjugada peroxidase de rbano
o qual substituiu em grande parte o teste FTA-IgM, no
adicionada aos poos da placa. Aps lavar os complexos
esto mais disponveis em muitos pases.

No reativo Reativo confirmado


Somente a linha do 3 linhas
controle

Reativo (2 linhas) Reativo (2 linhas)


Treponmico e controle No treponmico e controle
(caso antigo ou tratado) (falso-positivo)

Figura 10.11
Teste point-of-care (POC) duplo, no treponmico/treponmico, indicando os padres de reatividade e as
possveis interpretaes.

no ligados, adiciona-se o substrato enzimtico e os casos possuem treponemas no sistema nervoso central,
indicadores cromognicos. Se o soro contm anticorpos eles no precisam do tratamento reforado necessrio
IgM especficos para T. pallidum, ocorrer uma reao para a neurossfilis (30). Consequentemente, a puno
colorida, com a intensidade de cor proporcional lombar de rotina no realizada rotineiramente para
concentrao de anticorpos presentes. sfilis precoce, a menos que indicado clinicamente.
Entretanto, quando indicado, os espcimes de LCR
10.5 Neurossfilis devem ser examinados para protena total e contagem
Anormalidades no LCR so comuns em pacientes de leuccitos, realizando-se tambm o teste VDRL-LCR.
com sfilis precoce que no apresentam sintomas Esse ltimo apresenta alta especificidade (99-100%),
neurolgicos. Enquanto uma grande proporo desses mas baixa sensibilidade para neurossfilis (31, 32).

Sfilis 143
Assim, enquanto o teste VDRL-LCR reativo um PCR testing. Journal of Clinical Microbiology, 2006,
indicador de neurossfilis, um teste no reativo no pode 44(9):34523456.
ser utilizado como um meio de excluir a possibilidade de 7. GayetAgeron A et al. Assessment of a realtime
neurossfilis. Por outro lado, o teste FTA-Abs para LCR PCR test to diagnose syphilis from diverse biological
apresenta alta sensibilidade, mas baixa especificidade samples. Sexually Transmitted Infections, 2009,
para neurossfilis, devido transferncia passiva de 85(4):264269.
anticorpos IgG especficos atravs da barreira hemato- 8. Liu H et al. New tests for syphilis: rational design
enceflica. Assim, quando se obtm um resultado of a PCR method for detection of Treponema
negativo no teste FTA-Abs para LCR, existe uma alta pallidum in clinical specimens using unique regions
probabilidade de excluso de neurossfilis (33). of the DNA polymerase I gene. Journal of Clinical
Microbiology, 2001, 39(5):19411946.
10.6 Deteco de IgM anti-treponmico no soro 9. Marfin AA et al. Amplification of the DNA
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Como em outras infeces bacterianas e virais, na sfilis, whole blood of persons with syphilis. Diagnostic
Microbiology and Infectious Diseases, 2001,
a sntese de anticorpos IgM especficos a primeira
40(4):163166.
resposta imune humoral ps-infeco. Entretanto, o
anticorpo treponmico IgM no est apenas presente em 10. Orle KA et al. Simultaneous PCR detection of
pacientes com sfilis precoce, mas tambm encontrado Haemophilus ducreyi, Treponema pallidum, and
herpes simplex virus types 1 and 2 from genital
durante o perodo latente e em pacientes com doena
ulcers. Journal of Clinical Microbiology, 1996,
tardia. Esse fenmeno limita o valor dos ensaios para
34(1):4954.
IgM especfico no diagnstico da doena em adultos.
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testing algorithms using treponemal tests for
initial screeningfour laboratories, New York City,

Sfilis 145
Captulo 11 ou femurais resulta frequentemente na formao
de nguas supurantes em um ou ambos os lados do
ligamento inguinal (o indcio de sulco, que pode ser
Linfogranuloma venreo (LGV) observado em uma minoria dos casos de pacientes
com cancro) (1). Em mulheres, a glndula plvica
profunda e a perirretal podem ser comprometidas se as
11.1 Introduo
leses primrias forem encontradas no colo do tero,
O linfogranuloma venreo (LGV) uma das trs doenas e a paciente pode apresentar sintomas relacionados
sexualmente transmissveis tropicais clssicas. Ele doena inflamatria plvica (PID, do ingls pelvic
causado pela biovariante tpica L de Chlamydia inflammatory disease).
trachomatis, a qual apresenta as sorovariantes (L1, L2,
L2a, L2b e L3), mais invasivas do que as responsveis Os HSH podem apresentar uma proctite ou proctocolite
pela infeco clssica nos olhos por tracoma ulcerativa severa com dor no reto, corrimento
(sorovariantes A-C) e por uretrite no gonoccica, e sanguinolento, anuscopia nitidamente anormal, febre e
por infeces associadas ao trato genital (sorotipos linfadenopatia (6,7 ). Tal como em mulheres, que tambm
D-K). O LGV apresenta uma distribuio mundial, podem apresentar essas leses, a falha no tratamento
sendo, porm, mais prevalente em pases tropicais e da doena nesse estgio pode resultar na formao
subtropicais; por exemplo, endmico em partes do de abcessos perirretais, estenoses retais, fstulas e
Leste e do Oeste da frica, ndia, Sudeste da sia, cicatrizes crnicas. Alm dessas complicaes, que
Amrica do Sul e Caribe. Na maioria dos casos, essas surgem como resultado de mudanas inflamatrias
observaes epidemiolgicas so relacionadas agudas, as manifestaes crnicas da doena podem
apresentao clnica clssica de LGV, que se caracteriza causar o bloqueio da drenagem linftica da genitlia
por uma linfadenopatia inguinal, com ou sem leso ou reto, causando edema. O edema linftico severo
primria associada (1). Esses sintomas so mais denominado de elefantase.
comumente referidos em homens que em mulheres.
Em 2003, foram relatadas infeces retais por LGV, 11.2 Testes laboratoriais
com comprometimento caracterstico do linfonodo e/ou At o incio da dcada de 80, o isolamento de C.
proctite ou proctocolite, em homens que fazem sexo com trachomatis na cultura de clulas era o principal mtodo
homens (HSH) na Holanda (2). Relatos subsequentes para o diagnstico de infeces clamidiais (ver Captulo
foram realizados em muitos outros pases europeus, 5). Os isolados de LGV foram identificados por crescerem
alm da Amrica do Norte, Austrlia e outros, nos quais mais rapidamente em clulas de cultura de tecidos
anteriormente se registraram apenas casos espordicos que os isolados clamidiais no LGV. A partir de meados
e importados de LGV (3-5). O nmero de C. trachomatis da dcada de 90, os testes de amplificao de cidos
no reto pertencentes ou no s biovariantes do LGV nucleicos (NAAT, do ingls nucleic acid amplification test)
continua desconhecido, devido carncia de triagem e tornaram-se os testes de escolha para o diagnstico
ao uso disseminado de um teste discriminatrio. de infeces clamidiais. Esses NAAT, disponveis
comercialmente, so significativamente mais sensveis
Classicamente, o LGV apresenta uma leso primria
que os mtodos de diagnstico anteriores (ver Anexo
transitria herpetiforme na genitlia externa; porm,
3). Entretanto, eles no so capazes de discriminar
em muitos casos, a leso pode passar despercebida,
as cepas de LGV ou no-LGV. Subsequentemente,
manifestar-se como uma uretrite no gonoccica aguda
foram desenvolvidos ensaios moleculares que podem
em homens ou ser completamente assintomtica em
diferenciar as cepas com base em uma deleo que
mulheres, como resultado da infeco primria do colo
ocorre no gene pmpH somente em isolados de LGV
do tero. Muitos casos necessitam de ateno mdica
(8-10). A coleta, o transporte e o armazenamento
quando ocorre infeco dos gnglios linfticos regionais,
apropriados dos espcimes so fundamentais para a
como resultado da disperso linftica do organismo
causador. Em homens, o inchao das glndulas inguinais

Linfogranuloma venreo (LGV) 147


alta sensibilidade e especificidade de todos os mtodos 3. Rnn MM, Ward H. The association between
diagnsticos. lymphogranuloma venereum and HIV among men
who have sex with men: systematic review and
Os espcimes escolhidos para cultura e NAAT de LGV
meta-analysis. BMC Infectious Diseases, 2011,
incluem amostras coletadas com hastes diretamente
11:7078.
das leses primrias (quando presentes); amostras da
uretra colhidas com hastes ou o primeiro jato de urina, 4. Martin-Iguacel R et al. Lymphogranuloma venereum
em homens; amostras endocervicais em mulheres e proctocolitis: a silent endemic disease in men who
amostras do reto em HSH, tambm coletadas com have sex with men in industrialised countries.
hastes. Aspirados obtidos a partir de linfonodos regionais European Journal of Clinical Microbiology and
flutuantes raramente apresentam resultados positivos. Infectious Diseases, 2010, 29(8):917925.
Ao contrrio de outras infeces clamidiais no
5. White J, Ison C. Lymphogranuloma venereum: what
invasivas do trato genital, as infeces por LGV tendem
does the clinician need to know? Clinical Medicine,
a provocar uma resposta de anticorpos significativa. No
2008, 8(3):327330.
passado, o teste clamidial de fixao de complemento
foi amplamente usado para o diagnstico da infeco 6. Levine JS, Smith PD, Brugge WR. Chronic proctitis
tropical clssica, sendo detectadas titulaes 1:64. in male homosexuals due to lymphogranuloma
Subsequentemente, o teste de microimunofluorescncia venereum. Gastroenterology, 1980, 79(3):563565.
foi utilizado, sendo detectados ttulos de anticorpos
1:256, com reao cruzada ampla. Deve-se ressaltar 7. Quinn TC et al. The polymicrobial origin of intestinal
que mulheres com PID e indivduos com infeco infections in homosexual men. New England Journal
por cepas de LGV no complicada podem apresentar of Medicine, 1983, 309(1):576582.
respostas de anticorpos semelhantes. A importncia da 8. Morr SA et al. Real-time polymerase chain reaction
sorologia no diagnstico de proctite e proctocolite por to diagnose lymphogranuloma venereum. Emerging
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11.3 Referncias 9. Chen CY et al. The molecular diagnosis of


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148 Diagnstico laboratorial do diagnstico de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Captulo 12 lceras genitais podem estar infectadas por mais de
um patgeno causador de UG, mas, atualmente, isso
menos comum devido reduo da prevalncia relativa
Cancro mole de bactrias causadoras de UG.

O patgeno H. ducreyi um bacilo Gram-negativo,


12.1 Introduo pequeno e imvel. Trata-se de um organismo delicado
O cancro mole causado pela bactria Haemophilus e, devido s suas necessidades nutricionais complexas,
ducreyi, sendo transmitido exclusivamente por contato necessrio utilizar meio de cultura enriquecido para
sexual, com a invaso direta do organismo pela pele o seu isolamento. O crescimento dos isolados de H.
saudvel ou desgastada. A doena , aproximadamente, ducreyi pode ser tanto aerbico quanto anaerbico,
sete vezes mais comum em homens que em mulheres sendo considerado timo a 32-33C, em uma atmosfera
e sua transmisso est associada ao nmero elevado saturada de vapor de gua. A maioria das cepas,
de parceiros sexuais. O cancro mole produz lceras principalmente no isolamento primrio, dependente
na genitlia, tipicamente no sulco coronal peniano, de dixido de carbono. O H. ducreyi apresenta poucas
em homens, e na vulva, em mulheres. O cancro mole caractersticas bioqumicas distintivas: todas as cepas
perianal pode ocorrer em homens que fazem sexo com reduzem o nitrato a nitrito, so positivas tanto para
homens com comportamento receptivo e, tambm, em oxidase quanto para fosfatase alcalina e necessitam de
mulheres que tiveram relaes sexuais com penetrao hemina (fator X) para seu crescimento.
anal. O cancro mole pode estar associado linfadenite
Embora o cancro mole tenha sido considerado muito
inguinal supurativa, principalmente se houve um atraso
comum em algumas partes do mundo, a prevalncia
na procura pelo servio de sade ou na realizao de
dessa doena diminuiu drasticamente desde a dcada de
um diagnstico correto. Raramente, o cancro mole pode
90, devido, em parte, ampliao do acesso a agentes
ser adquirido no laboratrio por meio de uma inoculao
antimicrobianos, implantao da gesto sindrmica,
acidental de H. ducreyi por via digital.
melhoria dos cuidados mdicos para os profissionais do
O tempo de inoculao , normalmente, de 4-10 dias. sexo e mudana no comportamento sexual na era da
A lcera genital comea como uma ppula tenra, que infeo por HIV.
se torna pustulosa e ulcera em dois dias. A lcera
dolorida, irregular, com extremidades no definidas 12.2 Reviso dos procedimentos de
e, normalmente, no endurecida. Essas so as diagnstico
caractersticas clssicas que diferenciam o cancro O diagnstico laboratorial de cancro mole baseia-se
mole das lceras sifilticas. Entretanto, importante tradicionalmente na recuperao de H. ducreyi a
destacar que a sensibilidade do diagnstico baseado partir da cultura, o que representa um procedimento
simplesmente no surgimento clnico de ulceraes tecnicamente exigente, com baixo rendimento fora dos
baixa. A base da lcera encontra-se frequentemente laboratrios altamente especializados e acostumados a
coberta por uma secreo purulenta e necrtica, trabalhar com o patgeno (1). Embora no exista nenhum
sangrando facilmente quando raspada ou limpada. teste de amplificao de cidos nucleicos (NAAT,
comum haver mltiplas leses, que podem se fundir do ingls nucleic acid amplification test) disponvel
e formar lceras grandes. Tambm costuma ocorrer comercialmente para o diagnstico de cancro mole,
adenite inguinal dolorosa unilateral; caso esta no vrios NAAT desenvolvidos in-house foram utilizados
seja pronta e adequadamente tratada, pode levar para aumentar a sensibilidade do diagnstico (1). Alm
ruptura espontnea dos linfonodos supurados (nguas). disso, descreveram-se diversas tcnicas fundamentadas
Apresentaes atpicas de cancro mole so comuns em pesquisa, incluindo o uso da deteco de antgenos
e a doena pode ser facilmente confundida com com base em anticorpo monoclonal e sondas de DNA
outras lceras genitais (UG) de etiologia sexualmente (1). A microscopia direta apresenta sensibilidade e
transmissvel, principalmente o herpes genital. Algumas especificidade muito baixas, no sendo, portanto, muito

Cancro mole 149


utilizada como ferramenta de diagnstico para cancro foi subsequentemente contornado pela adio de
mole. Os ensaios sorolgicos baseados em pesquisa, vancomicina ao gar de chocolate semislido
atualmente disponveis, so teis somente para concentrao de 3g/mL (4). Utilizando tal meio seletivo,
propsitos soroepidemiolgicos. Hammond et al. registraram o crescimento de H. ducreyi
em sete (44%) de 16 pacientes com o diagnstico clnico
12.3 Coleta e transporte de espcimes de cancro mole (4). Deve-se ressaltar que o crescimento
Os espcimes para a cultura de H. ducreyi devem ser de algumas cepas de H. ducreyi pode ser inibido quando
obtidos a partir da base da lcera. Limpe a lcera com estas so expostas a essa concentrao de vancomicina,
uma gaze seca, ou com uma haste, para remover crostas e que tais cepas necessitariam ser isoladas em um meio
e detritos superficiais. No necessrio realizar uma de cultura isento de antibitico.
limpeza excessiva, o que pode causar sangramento e
Vrios meios seletivos artificiais foram desenvolvidos e
ser doloroso para o paciente. Colete o exsudato da base
revisados com detalhes em outro documento (5). Nsanze
com uma haste. O tipo de fibra utilizada na haste no
et al. demonstraram que o rendimento das culturas
parece afetar a sensibilidade da cultura. O isolamento
positivas pode ser aumentado utilizando mais de um
de H. ducreyi a partir do pus da ngua inguinal bem
tipo de meio de cultura para isolar H. ducreyi, a partir
menos eficiente que a partir do material da lcera genital
de material de lcera genital (6). As diferenas nas
e, dessa forma, raramente realizado. Para resultados
necessidades nutricionais entre as cepas de H. ducreyi
ideais, inocule os espcimes imediatamente no meio
podem contribuir parcialmente para essas observaes.
para isolamento e os mantenha em um recipiente com
Um meio contendo gar base GC, 1-2% de hemoglobina,
vela, ou em uma estufa com atmosfera mida, a uma
5% de soro fetal bovino com enriquecimento de 10% de
temperatura no superior a 35C, at sua incubao
cofatoresvitaminasaminocidos (CVA) e vancomicina
final. Quando o meio de cultura no estiver disponvel na
(3g/mL) parece apresentar a maior sensibilidade para
clnica mdica, os espcimes podem ser transportados
o isolamento de H. ducreyi de espcimes clnicos, com
a 4C em um meio para transporte. Um meio baseado
registro de culturas positivas em at aproximadamente
em tioglicolato com hemina, contendo L-glutamina e
80% dos casos de cancro mole definidos clinicamente
albumina bovina, parece manter a viabilidade de H.
(Figura 12.1) (5). Entretanto, notou-se que alguns
ducreyi por vrios dias a 4C (2).
isolados de H. ducreyi no crescem nesse meio, mas
podem ser isolados a partir de um meio diferente
12.4 Isolamento e identificao de H. ducreyi
contendo gar Mueller-Hinton (MH), 5% de sangue de
A cultura bacteriolgica de H. ducreyi continua sendo cavalo achocolatado com enriquecimento de 1% de CVA
a principal ferramenta para o diagnstico de cancro e vancomicina (3g/mL) (5). Para auxiliar na otimizao
mole em clnicas e, por muitos anos, foi o padro ouro da cultura de H. ducreyi em clnicas, dois meios podem
para a avaliao de outros mtodos diagnsticos. Uma ser incorporados simultaneamente em uma nica placa.
cultura bem-sucedida depende crucialmente do uso Mais recentemente, foi desenvolvido um meio baseado
de meio fresco (idealmente, com menos de sete dias) em carvo que evita a necessidade de adicionar o
e da ateno s condies de incubao. Entretanto, oneroso soro fetal bovino, o qual pode representar uma
com o surgimento de NAAT mais sensveis, baseados ferramenta de diagnstico com melhor custo-benefcio
em pesquisa, sabido que a cultura pode detectar, no para lugares com limitaes de recursos (Figura
mximo, apenas 75% das infeces por H. ducreyi (3). 12.2) (7 ). O Anexo 4 lista os protocolos para os meios
As tentativas iniciais de cultura de H. ducreyi utilizaram apropriados. Para o estabelecimento de lugares para
sangue de coelho fresco coagulado e aquecido a a cultura de H. ducreyi, recomenda-se o uso de, pelo
55C, sangue humano fresco coagulado e soro menos, dois dos meios mencionados acima e a definio
humano inativado por calor; mas esses mtodos de suas sensibilidades durante estudos-piloto.
foram alvo frequente de contaminaes recorrentes Aps a inoculao, incube as placas de cultura a
por microrganismos (1). O problema da contaminao 32-34C em uma atmosfera saturada de vapor

150 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Figura 12.1
Crescimento de H. ducreyi em placa de gar chocolate GC enriquecido.

Figura 12.2
Aglomerados de H. ducreyi em um meio baseado em carvo.

de gua, contendo 5% de dixido de carbono, ou, coletadas intactas em aglomerados na superfcie de gar
preferencialmente, em condies microaeroflicas. com uma ala bacteriolgica. As colnias podem ser
Incube as culturas por 48 horas antes da anlise inicial tanto translcidas quanto opacas e essa variabilidade
e as mantenha por cinco dias antes de defini-las como muitas vezes d a impresso de uma cultura misturada,
negativas. As colnias de H. ducreyi podem variar de impura. A colorao de Gram de esfregaos de colnias
tamanho, dependendo do tempo e da temperatura de mostra cocobacilos em cadeias curtas, aglomerados
incubao, da atmosfera e do meio de crescimento. ou espirais. Os organismos so pleomrficos em,
As colnias so no mucoides, elevadas, granulares, aproximadamente, 50% das culturas. As bactrias
apresentam uma cor amarela acinzentada e so individuais parecem apresentar colorao bipolar. Em

Cancro mole 151


vrios lugares do mundo, quase todos os isolados de luz de Wood (comprimento de onda de 360nm), em uma
H. ducreyi produzem -lactamase. Essa caracterstica cmara escura. Uma fluorescncia vermelha indica a
pode contribuir para uma identificao presuntiva. Para presena de porfirinas, isto , no h necessidade de
o trabalho de diagnstico de rotina em reas endmicas, hemina. Assim, o H. ducreyi deve fornecer um resultado
no existe a necessidade de identificao posterior. negativo e no exibir fluorescncia vermelha.
Entretanto, a identificao confirmatria pode ser
Deteco de fosfatase alcalina
necessria para os isolados suspeitos provenientes de
reas no endmicas. Uma combinao de alguns dos Faa uma suspenso densa de bactrias (padro de
mtodos a seguir pode ser realizada para viabilizar esse McFarland 3, 109 UFC/mL) em um tubo contendo 0,5mL
processo: teste de oxidase, reduo de nitrato, teste de de fosfato dissdico livre de fenol a 0,3g/L em tampo
porfirina e deteco de fosfatase alcalina. de Srensen citrato-hidrxido de sdio a 0,01mol/L, pH
5,6, e incube o tubo em banho-maria a 37C, por quatro
Teste de oxidase
horas. Adicione quatro gotas de 2,6-dibromoquinona-
A produo de citocromo oxidase pode ser demonstrada 4-clorimida a 5g/L em metanol, agite e deixe o tubo
colocando algumas gotas de hidrocloreto de tetrametil- repousar a temperatura ambiente por 15 minutos.
p-fenilenodiamina em uma tira de papel filtro e Adicione 0,3mL de n-butanol, agite e deixe repousar por
friccionando, com o auxlio de uma ala bacteriolgica, cinco minutos. Uma cor de azul a roxo nas camadas de
as vrias colnias crescidas em uma rea impregnada. butanol indica um resultado positivo.
Uma mudana de cor do azul para o roxo em um minuto
Outras caractersticas de H. ducreyi
indica um resultado positivo.
Os testes de catalase, indol e urease so negativos. O
Reduo de nitrato
H. ducreyi no considerado sacaroltico. Entretanto,
Prepare uma suspenso bacteriana densa (padro de foram registradas reaes positivas para diferentes
McFarland 3, 109 UFC/mL) e transfira 0,04mL para carboidratos. O H. ducreyi apresenta uma grande gama
um tubo pequeno. Adicione 0,04mL de soluo de de atividades de aminopeptidases e todos os isolados
nitrato de sdio a 0,5g/L e 0,04mL de tampo fosfato a testados mostraram atividade com -naftilamida
0,025mol/L, pH 6,8, e incube em banho-maria a 37C, derivada de L-lisina, L-arginina, L-alanina, L-glicina,
por uma hora. Em seguida, adicione 0,06mL de cido glicilglicina, glicil-L-alanina e L-leucina.
sulfanlico a 8g/L em cido actico a 5mol/L e 0,06mL
de -naftilamina a 5g/L em cido actico a 5mol/L. O 12.5 Deteco de H. ducreyi baseada em
tubo deve ser agitado e, se a cor rosa for observada, o cido nucleico
teste positivo. At o momento da escrita deste documento (junho
de 2012), no existe NAAT para a deteco de H.
Necessidade de hemina (Fator X) o teste de
ducreyi disponvel comercialmente e aprovado pela
porfirina
Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados
O teste clssico de crescimento com discos ou tiras Unidos da Amrica. Vrios NAAT baseados em
impregnadas por hemina no pode ser utilizado para pesquisas foram descritos na literatura e utilizam uma
detectar H. ducreyi. O teste de porfirina o nico modo gama de alvos moleculares diferentes, incluindo o
vivel para demonstrar a necessidade de hemina. gene do RNAr 16S de H. ducreyi, a regio ribossmica
Faa uma suspenso densa de bactrias (padro de espaadora intergnica rrs (16S)-rrl (23S) e o gene
McFarland 3, 109 UFC/mL) em 0,5mL de uma soluo de groEL (1). Foi tambm desenvolvida uma reao em
hidrocloreto de cido -aminolevulnico a 2mmol/L em cadeia da polimerase multiplex robusta para a deteco
tampo fosfato a 0,1mil/L, pH 6,9, contendo soluo de de patgenos de UG, incluindo o H. ducreyi, que est
sulfato de magnsio a 0,08mmol/L. Incube em banho- sendo utilizada em uma srie de centros de referncia
maria a 37C, por quatro horas. Exponha o substrato internacionais (8).

152 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
12.6 Tecnologias de sonda de cido nucleico aglutinao e o ensaio dot immunobiding (1). Durante
o estgio ulcerativo do cancro mole, desenvolve-se
Foram investigados ensaios de hibridizao DNA-DNA e
uma resposta humoral infeco por H. ducreyi;
DNA-RNA como possveis meios de detectar H. ducreyi
porm, segundo experincias clnicas e estudos de
no laboratrio, provando-se que estes apresentam
inoculao experimental em humanos, provavelmente
100% de sensibilidade e 100% de especificidade, mas
no h imunidade adquirida para H. ducreyi. Os testes
sua adequao como ferramenta de diagnstico para
sorolgicos oferecem muito pouco em termos de
detectar cancro mole ainda deve ser estabelecida (1).
assistncia a diagnstico, mas seriam uma ferramenta
12.7 Microscopia til para os profissionais que realizam pesquisas
soroepidemiolgicas para infeces de cancro mole
O exame direto de material clnico em esfregaos com
presentes nas diversas comunidades.
colorao de Gram pode, ocasionalmente, ser til
para o diagnstico de cancro mole, caso se visualizem 12.10 Teste de susceptibilidade
bacilos Gram-negativos pequenos tpicos, agrupados em
antimicrobiana
correntes dos tipos cardume de peixes, vias frreas
ou impresses digitais. Entretanto, essas aparncias Foi observada e descrita em isolados de H. ducreyi uma
morfolgicas clssicas so raramente visualizadas alta resistncia mediada por plasmdio a sulfonamidas,
na prtica clnica. Alm disso, a maioria das lceras penicilinas, canamicina, estreptomicina, tetraciclina,
genitais abriga uma microbiota polimicrobiana devido cloranfenicol e trimetoprina. Os padres da resistncia
contaminao secundria. A presena de bacilos Gram- cromossmica mediada por plasmdeo pode variar
negativos em um esfregao, dessa forma, pode ser muito entre as diversas reas geogrficas. Um grande
mal interpretada e contribuir para o fraco desempenho nmero de isolados de H. ducreyi exibe resistncia a
da microscopia como uma ferramenta de diagnstico. vrios agentes antimicrobianos. O crescimento contnuo
Consequentemente, devido sua baixa sensibilidade e da resistncia a drogas entre os patgenos de doenas
especificidade, os esfregaos com colorao de Gram sexualmente transmissveis (DST) torna necessria a
no so recomendados para o diagnstico de cancro vigilncia adequada da susceptibilidade de isolados
mole. clnicos de H. ducreyi em reas nas quais o cancro
mole continua representando um problema clnico
12.8 Deteco de antgeno de H. ducreyi significativo. Entretanto, ainda no h um procedimento
padro para o teste de susceptibilidade antimicrobiana a
Vrios anticorpos monoclonais contra os antgenos
esse organismo.
proeminentes de H. ducreyi, incluindo a protena da
membrana externa de 29kDa e o lipo-oligosacardeo, A maioria dos estudos publicados utilizou a tcnica
foram utilizados para detectar a infeco por H. de diluio em gar para determinar a concentrao
ducreyi em diversos formatos de diagnstico, incluindo inibitria mnima (CIM). Um dos meios mais adequados
imunofluorescncia e ensaios imunolgicos Limulus (1). o gar MH enriquecido com hemoglobina a 1%, soro fetal
Esses ensaios baseiam-se em pesquisas, no tendo bovino a 5% e o suplemento IsoVitaleX TM a 1% (Anexo 4).
sido utilizados como uma ferramenta de diagnstico na Alternativamente, o meio MH pode ser substitudo por
prtica clnica. gar base GC. A determinao da CIM antimicrobiana
para os isolados de H. ducreyi um procedimento
12.9 Sorologia tecnicamente complicado e delicado, sendo realizado
Atualmente, os testes sorolgicos para a deteco com sucesso somente em laboratrios de referncia
de anticorpos contra H. ducreyi no esto disponveis especializados.
comercialmente. As respostas sorolgicas de humanos
A lista de antibiticos a ser testados deve incluir as
e coelhos para infeces por H. ducreyi foram
drogas localmente recomendadas para o tratamento
detectadas mediante uma srie de tecnologias, a
de cancro mole, assim como os agentes teraputicos
exemplo de imunoensaios enzimticos, precipitao,
alternativos, os antibiticos teis para estudos

Cancro mole 153


epidemiolgicos de H. ducreyi e, finalmente, novas de ser menos destrutivo para o bacilo. A centrifugao
drogas desenvolvidas que necessitam de avaliao a baixa velocidade (500g) pode ajudar a sedimentar os
microbiolgica. Os antibiticos comumente testados aglomerados grandes. A densidade do sobrenadante
incluem sulfametoxazol e trimetoprina (usados ento comparada a 0,5 no padro de McFarland
isoladamente ou combinados), tetraciclina, cloranfenicol, (108UFC/mL). Dilua a suspenso em TSB (1:10) para
eritromicina, canamicina (ou estreptomicina), obter 107UFC/mL e coloque 0,5mL dessa diluio
ciprofloxacina (ou fleroxacina) e ceftriaxona (ou no poo correspondente em um bloco repicador de
cefotaxima). sementes.

A preparao de solues-estoque antimicrobianas e as Aquea as placas do teste de CIM para a temperatura


diluies para seu uso no teste da CIM esto descritas ambiente e, se necessrio, seque-as em uma estufa, na
com detalhes no Captulo 4, seo 4.8.4.2. posio invertida, com a tampa semiaberta. Transfira
o inculo bacteriano preparado para as placas-
Para preparar o meio, dissolva o gar MH desidratado
teste, utilizando um repicador de mltiplos pontos,
e a hemoglobina, separadamente, em gua destilada.
a fim de gerar pontos contendo aproximadamente
O volume de gua utilizado deve ser 16% ou inferior
104UFC. Inocule, primeiro, uma placa-controle sem
ao da frmula do meio normal (para permitir o volume
antibiticos e, em seguida, as placas contendo os
de suplementos e solues antimicrobianas a ser
agentes antimicrobianos, comeando pela de menor
adicionados posteriormente). Ferva e dispense o MH
concentrao para cada agente. Finalmente, inocule uma
e a hemoglobina, separadamente, em recipientes
segunda placa-controle. Deixe secar o inculo, inverta as
com volumes apropriados ao nmero de placas a ser
placas e incube a 33C, em uma atmosfera saturada em
preparadas para cada diluio antimicrobiana, o qual
vapor de gua, contendo dixido de carbono a 5%, por
depender do nmero de cepas a serem testadas.
24 horas.
Autoclave em recipientes bem fechados, deixe esfriar
a uma temperatura de 50-55C em banho-maria e, A CIM a concentrao mais baixa do antibitico, a qual
ento, misture os dois em um recipiente e adicione soro no permite o crescimento ou o crescimento de apenas
fetal bovino a 5%, suplemento para H. ducreyi a 1% e poucas colnias, bem finas e praticamente no visveis.
soluo antimicrobiana a 10%. Misture gentilmente o O crescimento em ambas as placas-controle deve ser
meio e verta uma quantidade de aproximadamente 20mL aderente e livre de contaminao. A determinao da
nas placas, com um dimetro interno de 9cm. Uma CIM para sulfonamidas um pouco difcil, uma vez
vez que o gar esteja solidificado, as placas devem ser que os seus limites so menos precisos do que para
armazenadas a 4C, por at uma semana, em sacolas os outros antibiticos. Uma leitura padro e resultados
plsticas fechadas. reprodutveis so obtidos se a segunda diluio, na
qual se d uma grande reduo no crescimento, for
Para preparar o inculo, ressuspenda em caldo de
considerada como a CIM. Pode ser til comparar esse
triptona de soja (TSB, do ingls trypic soy broth) a cultura
crescimento com o das placas controle.
crescida a partir de uma subcultura de 24 horas em gar
MH ou GC enriquecidos (similar ao meio de isolamento, 12.11 Conservao dos isolados
mas sem a vancomicina), para uma densidade de 108
Para manter a viabilidade dos isolados de H. ducreyi
unidades formadoras de colnias (UFC) por mL. As
no laboratrio, estes devem ser subcultivados a cada
colnias de H. ducreyi so normalmente to viscosas
quatro dias. As cepas tambm podem ser preservadas
que no possvel obter uma suspenso homognea,
por at quatro semanas, por meio da inoculao em
mesmo aps agitar vigorosamente ou mistur-la com
gar chocolate enriquecido. Para a manuteno durante
o auxlio de um vrtice. O uso de seringa e uma agulha
perodos de muitos meses, suspenses em leite
25G laranja para quebrar os aglomerados, por meio da
desnatado so armazenadas mediante congelamento
aspirao e liberao da suspenso, pode auxiliar na
a -70C. Para preservao em longo prazo, os isolados
obteno de uma suspenso mais homognea, alm
podem ser suspensos em um meio crioprotetor, tais

154 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
como soro fetal bovino + dimetilsulfoxida a 10% ou
leite desnatado + glicerol a 20%, e armazenados em
nitrognio lquido.

12.12 Questes mdico-legais


O cancro mole sempre deve ser visto como uma DST,
com exceo de episdio raro de infeco adquirida em
laboratrio.

12.13 Referncias
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Transmitted Infections, 2000, 76(2):137141.

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34(1):4954.

Cancro mole 155


156 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Captulo 13 de tecidos de bipsia. O organismo somente pode ser
cultivado, com dificuldade, em centros especializados,
utilizando cultura de clula de moncito/Hep2. Ainda no
Donovanose (granuloma possvel cultivar o organismo em meio artificial. Foram

inguinal) descritos na literatura ensaios de amplificao de cido


nucleico in-house, mas, na maioria dos pases, esses
ensaios no esto disponveis para fins de diagnstico
13.1 Introduo de rotina.
A donovanose, tambm conhecida como granuloma
inguinal, uma infeco crnica envolvendo a pele, as 13.3 Coleta de espcime
membranas mucosas e o sistema linftico da genitlia Antes de preparar o esfregao do material da lcera,
e rea perianal (1). A ocorrncia de donovanose gire gentilmente, por sobre a leso, uma haste com
geograficamente limitada, por exemplo, ao Brasil, ponta de algodo, para remover o exsudato resultante
Caribe, ndia, Papua-Nova Guin e ao sul da frica. de infeces secundrias e/ou resduos, de forma a
Essa doena, que apresenta baixa infecciosidade, minimizar o sangramento. Uma segunda haste deve
transmitida entre humanos principalmente por contato ser utilizada para coletar material da base da lcera,
sexual. O tempo de incubao pode ser prolongado, assegurando uma boa amostragem das bordas da leso,
variando entre 1-12 semanas. A doena comea onde mais provvel que os corpos de Donovan sejam
como um ndulo subcutneo endurecido, que corri encontrados. A seguir, role essa haste uniformemente
a pele para formar uma lcera vermelha, hipertrfica sobre uma lmina e deixe-a secar ao ar livre antes de
e granulomatosa, com a borda bem definida. A leso transport-la ao laboratrio. importante ressaltar que
sangra facilmente com o contato. A lcera progride alguns mdicos preferem utilizar uma pina perfuradora
devagar e pode se tornar dolorosa caso se desenvolva para bipsia e remover um pequeno pedao de tecido, o
uma infeco bacteriana secundria. Tal infeco com qual , ento, esmagado, espalhado em uma lmina e,
outros organismos pode contribuir para a formao de em seguida, seco ao ar livre. A preparao de lminas
detritos necrticos na lcera. Novas leses costumam a partir de material esmagado facilita a interpretao
formar-se por autoinoculao e os linfonodos inguinais microscpica e aumenta o valor de diagnstico.
aumentam de tamanho, como resultado de infeco
secundria (pseudonguas). A donovanose pode se 13.4 Microscopia
espalhar hematogenicamente para os ossos, juntas e Foi descrito um mtodo simples e rpido (1 minuto)
fgado. Por vezes a disseminao tambm resulta em de microscopia usando colorao de Giemsa (4). Com
leses cutneas em locais extragenitais. Leses genitais esse mtodo de colorao, a lmina mergulhada
e perianais em vrios estgios podem lembrar leses cinco vezes em um fixador, seis vezes em uma soluo
formadas por outras condies, como sfilis, cancro de eosina, seis vezes em uma mistura de corante
mole, carcinoma e amebase. tiazdico e, ento, lavada com tampo fosfato, pH 6,8.
Os corantes de Giemsa a 10% ou de Leishman, diludo
A donovanose causada pelas Klebsiella (anteriormente
de forma semelhante, tambm podem ser empregados
chamada Calymmatobacterium) granulomatis, bactrias
como alternativa, seguidos da fixao do material na
Gram-negativas (1,5 x 0,7m) que podem ser observadas
lmina com metanol por 2-3 minutos. Cubra a lmina
no interior de vacolos em grandes clulas histiocticas,
com o corante diludo por 10 minutos (corante de
onde so denominadas corpos de Donovan (1,2).
Leishman) ou por at 30 minutos (corante de Giemsa)
13.2 Reviso do diagnstico laboratorial e, ento, lave a lmina em um fluxo de gua tamponada
corrente ou de soluo salina de tampo fosfato (pH
O diagnstico laboratorial depende da visualizao dos
7,0-7,2). Em seguida, deixe a lmina secar ao ar livre e,
corpos de Donovan em esfregaos coloridos obtidos a
ento, examine-a em um microscpio de luz, utilizando
partir de leses clnicas ou cortes histolgicos coloridos
leo de imerso (aumento de 1000x). Os corpos de

Donovanose (granuloma inguinal) 157


Donovan aparecem como coco-bacilos dentro de isoladas, no existem outras tcnicas de cultura in
grandes vacolos (25-90m de dimetro) no citoplasma vitro para o isolamento de K. granulomatis. Entretanto,
de histicitos grandes e, ocasionalmente, em clulas o organismo pode ser cultivado por inoculao dos
plasmticas e leuccitos polinucleares. Os organismos espcimes clnicos no saco vitelino de ovos de galinha
apresentam cores de azul a roxo e, frequentemente, embrionados de cinco dias (10). O organismo
encontram-se circundados por uma cpsula proeminente detectvel aps 72 horas de incubao.
rosa claro a acidfila (Figura 13.1). A bactria tpica
lembra alfinetes de segurana fechados. A contaminao
com outras bactrias frequentemente observada.
Embora a microscopia de esfregaos de lcera seja a
forma convencional de diagnosticar a donovanose, os
corpos de Donovan tambm j foram identificados em
esfregaos de Papanicolau (Pap) utilizados na citologia
cervical de rotina (5).

13.5 Histopatologia Figura 13.1


O exame histopatolgico de uma bipsia pode ser til Esfregao com colorao de Giemsa de material de
no diagnstico diferencial entre donovanose e outras lcera, contendo moncitos de corpos de Donovan
(1000x).
condies. Uma lcera com um infiltrado inflamatrio
mesclado de clulas plasmticas, neutrfilos e
histicitos, com ausncia notvel de linfcitos,
13.7 Amplificao de cido nucleico
sugestiva de donovanose. Retire um pedao de tecido
Foi desenvolvida uma reao em cadeia da polimerase
(3-5mm de espessura) da borda da leso com uma pina
(PCR, do ingls polymerase chain reaction) para
perfuradora para bipsia e coloque-o em um recipiente
diagnstico, baseada em pesquisas, a qual tem como
com soluo salina-formaldedo fixadora. O diagnstico
alvo o gene phoE e incorpora, aps a amplificao, a
pode ser realizado por meio da identificao de corpos
digesto de amplicons com base na enzima de restrio
de Donovan, utilizando o reagente de impregnao de
HaeIII (3). Esse mtodo foi refinado, em seguida, em um
prata de Warthin-Starry (6). As bipsias parafinadas
teste de PCR colorimtrico.
devem ser cortadas em seces de 6m. Aps a
desparafinizao e hidratao com gua destilada, fixe
13.8 Testes sorolgicos
as seces em uma lmina de vidro com glicerol, seque
e trate com soluo cida de nitrato de prata a 43C, Atualmente, no existem testes sorolgicos disponveis
por 30 minutos. Lave com gua quente, enxague em para auxiliar no diagnstico.
gua destilada, desidrate em etanol 95% e clarifique em
xileno.
13.9 Referncias
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13.6 Cultura Infections, 2002, 78(6):452457.
Aps um relatrio descrevendo a cultura de K.
2. Carter JS et al. Phylogenetic evidence for
granulomatis a partir de fezes, em 1962, mostrou-se,
reclassification of Calymmatobacterium
subsequentemente, ser muito difcil a cultura do
granulomatis as Klebsiella granulomatis comb nov.
organismo com base em espcimes clnicos (1, 7 ).
International Journal of Systematic Bacteriology,
Em 1997, dois grupos reportaram a multiplicao
1999, 49(Pt4):16951700.
bem-sucedida de K. granulomatis utilizando diferentes
sistemas de cultura, isto , um sistema de cocultura 3. Carter JS et al. Diagnostic polymerase chain
de moncitos e uma tcnica modificada de cultura reaction for donovanosis. Clinical Infectious
de clamdia (8, 9). Com exceo dessas publicaes Diseases, 1999, 28(5):11681169.

158 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
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granulomatisthe aetiological agent of granuloma
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donovanosis (Calymmatobacterium granulomatis) in
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10. Anderson K, Demonbreun WA, Goodpasture EW. An


etiologic consideration of Donovania granulomatis
cultivated from granuloma inguinale (three cases) in
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Sexually Transmitted Infections, 2000,
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Donovanose (granuloma inguinal) 159


160 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Captulo 14 O termo gnero utilizado para os clados de maior
ordem, denominados por meio do alfabeto grego e,
dentro de cada gnero, pequenos clados so designados
Infeces pelo papilomavrus como espcies e recebem um nmero. Por exemplo, o

humano (HPV) gnero papilomavrus contm as espcies -9 e -7,


as quais representam, respectivamente, as duas causas
mais comuns de cncer cervical, ou seja, os gentipos
14.1 Papilomavrus humano (HPV) 16 e 18 do HPV (2). Existem mais de 200 tipos diferentes
Os HPV so vrus pequenos (~55nm de dimetro), do vrus, dos quais, aproximadamente, 100 j tiveram
icosadricos, no envelopados, com um genoma de DNA o genoma completo sequenciado e 40 so conhecidos
de fita dupla circular e enrolado de, aproximadamente, por infectar, especificamente, a mucosa anogenital de
8kb (Figura 14.1). Esses vrus infectam, tipicamente, humanos (HPV mucosotrfico).
a pele e superfcies mucosas de humanos (1). Ao
Os tipos de HPV detectados, frequentemente, no trato
contrrio da maioria dos vrus que infectam pessoas,
anogenital so subdivididos em tipos de baixo risco (LR,
os papilomavrus no podem se propagar por meio
do ingls low-risk) e de alto risco (HR, do ingls high-
de cultura in vitro convencional. Dessa forma, no se
risk), com base no risco relativo para a complicao rara
pode utilizar uma classificao clssica antignica
de neoplasia (3). Os tipos LR de HPV so encontrados,
e de sorotipo para a determinao do tipo viral. Em
tipicamente, em leses intraepiteliais de baixo grau
vez disso, utiliza-se uma abordagem de genotipagem
(leses no pr-cancerosas), assim como em verrugas
para a identificao e classificao desses vrus. Os
anogenitais. Os tipos 6 e 11 do HPV contribuem para,
HPV individuais so identificados quanto ao tipo e ao
aproximadamente, 90% das verrugas genitais (4, 5). Os
gentipo, distinguidos de acordo com sua sequncia
HPV HR so encontrados em leses de baixo e alto graus,
genmica e enumerados na ordem em que so
assim como em cncer de colo do tero e outros locais
descobertos. O gene L1, que codifica o principal
anogenitais (vulva, vagina e nus) (6). Coletivamente, os
componente do capsdeo viral (Figura 14.2), a regio
HPV 16 e 18 so responsveis por, aproximadamente,
mais conservada entre os tipos individuais, sendo
70% de todos os cnceres de colo do tero no mundo
utilizada pela taxonomia para a construo de rvores
(7-11). Com exceo dos cnceres anogenitais, o tipo
filogenticas (Figura 14.3) (2). Os HPV com divergncia
16, principalmente, apresenta um papel causal em
de 2-10% na sequncia de L1 so conhecidos como
alguns cnceres de orofaringe, particularmente aqueles
subtipos, e aqueles com menos de 2%, como variantes.
localizados nas tonsilas (12, 13).
P97

URR
E6
E7

MY11 MY09

E1
L1
HPV

L2 E2
E4
E5

Figura 14.1
Microscopia eletrnica de HPV mostrando as Figura 14.2
partculas virais nas clulas selecionadas de um Organizao gentica dos HPVs(48).
esfregao de Papanicolau (Pap). URR: regio reguladora proximal (do ingls upstream
Fonte: cortesia de Colin Laverty, Sydney, NSM, regulatory region)
Australia, 1978. Fonte: reproduzido com permisso da Organizao
Mundial da Sade (OMS).
Infeces pelo papilomavrus humano (HPV) 161
Figura 14.3
rvore filogentica contendo as sequncias de L1 de 118 tipos de papilomavrus (2).
Fonte: reproduzido com permisso da Virology.

14.2 Histria natural das infeces genitais por de aquisio de HPV ao longo da vida de at 60-80%
HPV (19, 20). A idade mdia da primeira relao sexual em
A maioria das infeces genitais por HPV so adquiridas muitos pases ocidentais, tais como Austrlia, Reino
sexualmente, transitrias e lentamente curadas pelo Unido e Estados Unidos da Amrica, de 16 anos (19,
sistema imune do hospedeiro (14). Raramente, em cerca 21). Dessa forma, segue-se que as taxas mais elevadas
de 5-10% dos casos, as infeces por HPV podem se de novas infeces por HPV adquiridas so observadas
tornar persistentes. O HPV HR persistente um forte em mulheres jovens, com o pico etrio logo aps o
indicador de risco para o desenvolvimento de pr-cncer, incio da atividade sexual e com estimativas de at
o qual, por sua vez, apresenta o risco de progredir para 75% das infeces por HPV ocorrendo em mulheres
cncer ao longo dos anos, caso no seja tratado (15, 16). de 15 a 24 anos. Dados recentes sugerem que muitas
Os cofatores determinados para o desenvolvimento de novas infeces em mulheres jovens, no infectadas
infeco persistente e cncer cervical so o tabagismo, previamente por HPV, so infeces mltiplas (mltiplos
uso prolongado de contraceptivo oral, alta paridade, idade tipos de HPV detectados) (22).
precoce no primeiro parto e estado imunossupressivo,
como na coinfeco por HIV (17 ). Ainda no se tem H menos conhecimento sobre a histria natural da
conhecimento sobre se h fatores especficos do infeco por HPV em homens. Novamente, as infeces
hospedeiro e/ou outros fatores ambientais que determinam (peniana, na pele genital e/ou anal) so muito comuns,
os indivduos destinados a pr-cncer ou neoplasia (18). ocorrendo logo aps o incio da atividade sexual, com
taxas rpidas de aquisio e cura (23, 24). Alm disso, o
A transmisso de HPV genital normalmente ocorre via comportamento sexual envolvendo nmeros elevados de
contato sexual direto (pele genital com pele genital) com parceiros sexuais aumenta o risco de infeco, enquanto
um indivduo infectado, resultando em taxas estimadas a circunciso mostra um efeito protetor (24).

162 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
14.3 Imunologia do HPV tendncia a recuar aps o tratamento. Os HPV 6 e 11
causam a maiorias das verrugas anogenitais (85-90%) (5).
A resposta imune do hospedeiro ao HPV envolve tanto os
compartimentos humorais como aqueles mediados por Papilomatose respiratria recorrente (PRR)
clulas. Em seguida infeco natural, a resposta humoral A PRR uma condio muito rara, caracterizada pelo
de anticorpos especfica, sendo detectada, primeiramente, crescimento recorrente de estruturas semelhantes a
em 6-18 meses aps a infeco (14). A resposta fraca e, verrugas (papilomas) no trato respiratrio superior, embora
aproximadamente, apenas 50-60% dos indivduos positivos tambm possa envolver o trato respiratrio inferior,
para o teste de DNA do HPV desenvolvem uma resposta de resultando em morbidade e mortalidade significativas. Os
anticorpos mensurvel (14). Aps a infeco natural, um tipos 6 e 11 do HPV so responsveis, em grande parte,
indivduo pode permanecer positivo para o teste de DNA do por essas leses. A laringe a regio mais comumente
HPV, apesar do desenvolvimento de anticorpos especficos. afetada, resultando em alteraes na voz. Em crianas
Tais indivduos no esto isentos de desenvolver uma doena pequenas, pode ocorrer a obstruo de ar. O diagnstico
subsequente a partir desse tipo de HPV. A eliminao da feito clinicamente por meio da observao de leses
infeco por HPV e a resoluo das leses clnicas, como caractersticas semelhantes a verrugas em laringoscopia/
as verrugas genitais, so caracterizadas por uma resposta broncoscopia. As leses so benignas, mas podem recorrer
imune celular efetiva (25). frequentemente aps o tratamento. O surgimento dos
sintomas segue dois padres: a forma juvenil (idade mdia
A sorologia do HPV no utilizada para o diagnstico.
de dois anos) e a forma tardia, observada em adultos (28).
A sorovigilncia til para estimar, em uma base
populacional, a idade e prevalncia da exposio em locais Leses pr-cancerosas e cnceres
pr-vacina. A sorologia ps-vacinao utilizada como
A infeco persistente com HPV oncognicos ou de
uma mensurao da efetividade da vacina. A proteo
gentipos HR est intimamente relacionada a um aumento
corresponde deteco de anticorpos neutralizantes,
de risco de cncer anogenital. Essa tendncia foi melhor
embora o mecanismo de proteo em si no seja
estudada no colo do tero, onde foram primeiramente
completamente compreendido. Estudos em animais com
definidos os critrios para a identificao citolgica e
papilomavrus especficos para o hospedeiro descrevem
histolgica de leses pr-cancerosas de progresso
anticorpos neutralizantes, a partir da infeco primria,
lenta. A nomenclatura dos tipos mudou ao longo dos anos
que se mostram protetores, embora sejam, em seguida,
e continua a evoluir. Os precursores do cncer foram
desafiados pelo vrus respectivo. importante ressaltar
denominados de displasias (suave, moderada e severa)
que, apesar de a durabilidade dos anticorpos induzidos
ou neoplasia intraepitelial cervical (NIC 1, 2, 3) e, mais
por vacinao em triagens humanas ser atualmente
recentemente, de leses NIC 1-3 de alto grau (HSIL,
documentada como sendo superior a oito anos, ainda no
do ingls high-grade intraepitelial lesion) ou baixo grau
se definiu uma correlao imune de proteo (27).
(LSIL, do ingls low-grade intraepithelial lesion) (29).
14.4 Manifestaes de doenas A terminologia em outras regies anatmicas segue o
mesmo padro: anal (AIN, do ingls anal intraepithelial
Verrugas anogenitais
lesion), vulvar (VIN, do ingls vulvar intraepithelial lesion),
As verrugas anogenitais, tambm conhecidas como vaginal (VaIN, do ingls vaginal intraepithelial lesion) e
condiloma acuminado, so uma massa exoftica benigna, peniana (PIN, do ingls penile intraepithelial lesion). Em
de crescimento papular ou plano, que podem ocorrer em cada caso, as leses precursoras (de alto grau ou grau 3)
qualquer regio da rea anogenital. Elas so extremamente so assintomticas, de progresso lenta e diagnosticadas
comuns, principalmente em jovens que iniciam a atividade com histologia. A triagem recomendada apenas para as
sexual, sendo amplamente diagnosticadas nas clnicas. leses cervicais, embora a abordagem para a triagem anal
Raramente, as leses podem causar problemas devido esteja sendo avaliada (30). Atualmente, o tratamento s
ao seu tamanho e s obstrues que provocam, mas recomendado para as leses precursoras (de alto grau).
acarretam, sobretudo, dificuldades psicossociais ou
relacionadas aparncia. As leses apresentam uma

Infeces pelo papilomavrus humano (HPV) 163


Fortes evidncias laboratoriais e epidemiolgicas tambm pode auxiliar na triagem de cncer cervical.
associam o HPV ao cncer cervical, sendo a infeco Atualmente, as vacinas para HPV tm como alvo os
por HPV HR persistente considerada um fator causal tipos 16 e 18 do HPV HR, que contribuem para 70% dos
necessrio, mas no suficiente, para o cncer cervical. casos de cncer cervical no mundo (7-11). As evidncias
Na ausncia de infeco por HPV, muito improvvel epidemiolgicas so menos estabelecidas para os outros
que o cncer cervical se desenvolva, e essa ntima cnceres associados ao HPV, mas estes envolvem
relao a razo pela qual as vacinas visam a preveno infeces em outras regies anogenitais, assim como
das infeces por HPV oncognicos mais frequentes a orofarngeas (base da lngua e tonsila), resultando em
fim de prevenir o cncer, motivo pelo qual o teste de HPV um nus significativo da doena (Tabela 14.1).

Tabela 14.1: Cnceres atribuveis ao HPV em 2002


Destes, so Ambos os sexos
positivos % de Atribuveis % de
Atribuveis para o HPV 16 Total de Atribuveis todos os ao HPV todos os
Local ao HPV (%) e/ou 18 (%) cnceres ao HPV cnceres 16/18 cnceres
Colo do tero 100 70 492.800 492.800 4,54 344.900 3,18
Pnis 40 63 26.300 10.500 0,10 6.600 0,06
Vulva, vagina 40 80 40.000 16.000 0,15 12.800 0,12
nus 90 92 30.400 27.300 0,25 25.100 0,23
Boca 3 95 274.300 8.200 0,08 7.800 0,07
Orofaringe 12 89 52.100 6.200 0,06 5.500 0,05
Todos os locais 10.862.500 561.100 5,17 402.900 3,71
Fonte: adaptado de Parkin DM. The global burden of infection-associated cancers in the year 2002. International Journal of Cancer, 2006, 118: 3030-3044.

A proporo de cnceres relacionados ao HPV difere clnicas necessita que os laboratrios utilizem ensaios
para cada local anatmico e o HPV-16 , principalmente, validados por agncias reguladoras para obter indicaes
proeminente em cnceres no cervicais. clnicas especficas ou que os laboratrios procedam
validao do desempenho clnico do ensaio. Uma vez
14.5 Procedimentos laboratoriais para a que os precursores de cncer esto apenas associados
deteco do HPV aos HPV HR, no h indicaes clnicas para o teste de
O teste para HPV baseia-se em mtodos moleculares. HPV LR. Existem algumas variaes nas quais os tipos
Isso ocorre, como mencionado anteriormente, devido de HPV HR so clinicamente relevantes, e a maioria dos
a que os mtodos de cultura convencionais no so ensaios incluem (ou realizam a reao cruzada com) os
capazes de cultivar o HPV e a sorologia relativamente 14 tipos de HPV HR seguintes: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45,
insensvel. Os mtodos de teste para a vigilncia 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68.
epidemiolgica diferem daqueles aplicados em clnicas.
Os mtodos epidemiolgicos requerem ensaios 14.6 Aplicaes clnicas dos ensaios de
especficos, com alta sensibilidade analtica. Uma deteco do HPV
vez que os ensaios clnicos utilizam o HPV como um
As aplicaes clnicas para os ensaios de deteco do
marcador da doena subjacente, eles so comparveis
HPV incluem:
aos desfechos da patologia. No h tratamentos para
o HPV em si; os tratamentos so direcionados aos Triagem primria, tanto isolada quanto em
precursores do cncer associado ao HPV ou outras combinao com a citologia cervical (Figura 14.4), em
leses relacionadas ao vrus. Uma ampla variedade de mulheres 30 anos de idade. Estudos longitudinais
ensaios para HPV esto disponveis comercialmente e mostram que o teste de DNA para HPV apresenta
tambm so desenvolvidos por laboratrios. O uso em maior sensibilidade para predizer a prevalncia ou o

164 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Normal ASCUS/limtrofe LSIL

HSIL Coilcito

Figura 14.4
Citologia de Papanicolau (Pap) de clulas esfoliadas normais, coilocitose tpica, mas no patognica, da
infeco por HPV, clulas escamosas atpicas de significncia indeterminada, mudanas celulares LSIL e HSIL.

desenvolvimento tardio de displasia; alm disso, o WNL, 200x NIC1, 200x


seu valor preditivo negativo (VPN) extremamente
alto e superior ao da citologia. Dessa forma,
prope-se que os pacientes com resultado negativo
no exame de DNA para HPV em duas ocasies
possam apresentar um intervalo maior de triagem.
Isso torna a combinao de Papanicolau (Pap) e teste
de DNA para HPV custo-efetiva (31-36).
NIC2, 200x NIC3, 200x
A triagem de mulheres com anormalidades citolgicas
mnimas (inconclusiva, equivocada ou limiar), para
discrimin-las daquelas de fato relacionadas ao HPV
e que requerem acompanhamento (37 ).

Terapia ps-ablao para displasia de alto grau e


monitoramento de mulheres com evidncias de
doena persistente/recorrente, e como um teste de
cura (32, 38). Figura 14.5
p16 no expressa em tecidos normais (WNL) e
O uso do HPV como uma triagem primria para cncer
progressivamente expressa com anormalidades
cervical est sendo avaliado (39). Atualmente, enquanto crescentes (NIC1 a NIC3).
o teste para HPV um excelente preditor negativo da Fonte: reproduzido com permisso de Magnus von
doena, ele no apresenta a especificidade necessria Knebel Doeberitz, Departamento de Biologia aplicada a
para a indicao direta de tratamento. A citologia tumor, Instituto de Patologia, Universidade de Heidelberg,
cervical uma opo de segundo teste. Outros testes Heidelberg, Alemanha.
moleculares esto sendo avaliados, tais como o fator
do hospedeiro p16INK4a (p16), um inibidor quinase representando a expresso ativa de oncogenes do
dependente de ciclina. ndices elevados de p16 indicam HPV (40) (Figura 14.5). Alm disso, em combinao
a remoo do controle de realimentao negativa com a expresso aumentada de outros fatores do
fornecido pelo gene do retinoblastoma, pRB. Quando hospedeiro, tais como o Ki67, a expresso em excesso
protenas as oncognicas E7 do HPV se ligam ao pRB, o de p16 est altamente relacionada com infeces virais
p16 expresso em demasia e seus ndices so elevados, transformadoras (Figura 14.6) (41).

Infeces pelo papilomavrus humano (HPV) 165


14.7 Mtodos de deteco do DNA do HPV excelentes comparaes interlaboratoriais e alto VPN
para leses NIC2/3 (42). Alm disso, foi desenvolvida
Historicamente, os mtodos utilizados para detectar o
uma verso de baixo custo para realizao em locais
DNA do HPV constituam ensaios de hibridizao direta
com poucos recursos, necessitando apenas um
de sonda, tais como o dot blot e o southern blot. Esses
mnimo de equipamentos e treinamento, e de execuo
mtodos eram trabalhosos, demorados e apresentavam
semelhante de um teste rpido (43).
baixa sensibilidade, sendo necessria uma grande
quantidade de DNA em amostras clnicas. Atualmente, Embora o teste careHPV tenha sido, por longo tempo,
as aplicaes clnicas se baseiam em ensaios altamente utilizado apenas em pesquisa, atualmente ele est
padronizados, que simplificam o manuseio da amostra disponvel para uso clnico. Sua sensibilidade para
e envolvem alguma forma de amplificao para a NIC2+ em uma ampla triagem na China foi de 90%,
realizao do teste. A Tabela 14.2 mostra os testes no sendo significativamente diferente do CH2, com o
atualmente aprovados pela Administrao de Alimentos qual foi comparado. Dessa forma, o teste considerado
e Drogas dos Estados Unidos da Amrica (FDA, do ingls promissor como um mtodo de triagem primria para a
United States of America Food and Drug Administration). preveno de cncer cervical em regies com recursos
limitados (43). Os resultados no diferenciam os tipos de
O teste de captura hbrida (CH2), desenvolvido pela
HR presentes, mas so indicativos da presena de um ou
Digene (Qiagen), foi amplamente utilizado em estudos
mais tipos includos no ensaio.
anteriores, tendo sido o primeiro ensaio aprovado
pela FDA. O CH2 um ensaio semiquantitativo com

HSIL persistente HSIL regressivo

Progresso do HSIL

Regresso
% de ncleos positivos para p53 na

Persistncia
metade profunda do epitlio

% de ncleos positivos para protenas


do retinoblastoma na metade profunda
do epitlio

Figura 14.6
Vrios marcadores de fatores de risco viral e do hospedeiro com HSIL. Centro: Grfico de disperso da
deteco da protena do retinoblastoma (pRb) e p53 na metade inferior do epitlio de leses HSIL que
persistem (tringulos vermelhos) ou regridem (crculos azuis abertos) durante o acompanhamento. Esquerda:
HSIL persistente. Direita: HSIL com regresso (41).
Fonte: reproduzido com permisso da American Journal of Surgical Pathology.

166 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Tabela 14.2: Testes de HPV aprovados pela FDA
Testes Fabricante Mtodo Tipos (alvo)
Captura hbrida (CH2) Quiagen (Valencia, CA, EUA) Amplificao de sinal HR 13 (DNA genmico)
Amplificao de sonda (Inva-
Cervista HPV HR Hologic (Bedford, MA, EUA) HR 14 (DNA proprietrio)
der Technology)
Cervista HPV 16/18 HPV16/18
Amplificao do alvo (ampli-
APTIMA HPV GenProbe (So Diego, CA, EUA) ficao mediada por trans- HR 14 (RNA de E6/E7)
crio)
Cobas HPV Roche (Pleasanton, CA, EUA) Amplificao do alvo (PCR) HR 14 (DNA de L1)
FDA: Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados Unidos da Amrica; HPV: papilomavrus humano; HR: tipos de alto risco; PCR: reao em
cadeia da polimerase.

Recentemente, em uma avaliao de vrios ensaios principalmente aqueles arquivados, prefervel o uso
de reao em cadeia da polimerase (PCR, do ingls dos ensaios que detectam amplicons pequenos, tais
polymerase chain reaction) para a triagem primria e como os iniciadores SPF, uma vez que o DNA dever
deteco precoce de leses de alto grau, a sensibilidade estar degradado.
dos ensaios de amplificao do alvo para o diagnstico
Para os passos seguintes em cada um desses
de NIC2+ foi registrada como alta, de aproximadamente
ensaios, o leitor deve se reportar ao manual de HPV da
96% (34, 44). Por exemplo, o teste para HPV COBAS
Organizao Mundial da Sade (OMS), o qual detalha
4800, aprovado recentemente pela FDA, que utiliza uma
cada etapa, incluindo a descrio dos iniciadores,
preparao automatizada de amostra combinada com a
controles apropriados, preveno de contaminao,
tecnologia de PCR em tempo real para detectar o HPV
interpretao de dados, etc. (48).
HR 14 em um nico tubo, foi comparado favoravelmente
CH2, com sensibilidade e especificidade clnicas no
Ensaios de mRNA de HPV
inferiores s desta (44). De forma similar, nos resultados
finais, recentemente publicados, da triagem POpulation- Alm dos ensaios de DNA, outros testes detectam a
Based SCreening study Amsterdam (POBASCAM) uma expresso do mRNA dos oncogenes E6/E7 (49, 50).
triagem controlada, randomizada, de base populacional Os princpios desses ensaios moleculares esto descritos
um ensaio de PCR para L1 (GP5+/6+) levou a uma nos seguintes tpicos (51):
deteco mais precoce de NIC2 clinicamente relevantes
ou piores, corroborando o uso do teste de DNA em Pr-anlise
todas as mulheres de 29 anos de idade ou mais (34).
So essenciais a utilizao dos espcimes adequados
Os ensaios baseados em PCR que apresentam a regio
e o manuseio apropriado de amostras clnicas para
L1 como alvo so conhecidos como ensaios de PCR
a obteno de resultados precisos. Para a deteco
consensos para L1. Os diferentes ensaios utilizam
de HPV, as amostras adequadas incluem aquelas
iniciadores distintos: o MY09/MY11, substitudo
coletadas por hastes, raspagem e bipsia de tecidos.
posteriormente pelos iniciadores PGMY09/11, resulta
O manuseio apropriado das hastes inclui o transporte
em um amplicon de 450pb (45). Outros conjuntos de
seco ou em um meio de transporte para vrus, enquanto
iniciadores descritos incluem o GP5+/6+, produzindo um
que as raspagens e bipsias so coletadas em meio
amplicon de, aproximadamente, 160pb (46), enquanto
de transporte viral. O transporte deve ser realizado
o SPF10 produz um amplicon pequeno, de 65pb (47 ).
em temperatura ambiente em 24 horas ou em at
O sistema PGMY09/11 est disponvel comercialmente
quatro dias a 4C. Os ensaios com a aprovao da FDA
como o teste Linear Array HPV Genotyping Test (Qiagen)
especificam os mtodos de coleta e armazenamento, e
ou o Multiplex HPV Genotyping Kit (Multimetrix,
os resultados no devem ser considerados vlidos caso
Heidelberg). Para os tecidos embebidos em parafina,
haja irregularidades na coleta e armazenamento.

Infeces pelo papilomavrus humano (HPV) 167


Anlise ensaios atualmente disponveis comercialmente que
Aps a coleta do espcime, deve-se proceder extrao apresentam o DNA ou mRNA como alvo. Os laboratrios
ou liberao do cido nucleico das amostras. Os que buscam providenciar dados para o monitoramento
ensaios aprovados pela FDA especificam os mtodos da resposta vacinao devem ser incentivados a seguir
de processamento ou extrao para cada ensaio. Os as diretrizes que constam no Manual de Laboratrio de
resultados no so considerados vlidos se houver HPV da OMS (ver adiante a seo 14.8 sobre a LabNet
modificaes na realizao do processamento ou de HPV).
extrao. O uso de ensaios comerciais no isenta os
Tabela 14.3 Vrios ensaios para HPV disponveis
laboratrios da necessidade de manter mtodos de
atualmente, com nome, alvo e iniciado
garantia de qualidade (GQ) e controle de qualidade (CQ)
Tipo de ensaio para HPV Regio do HPV alvo
vigentes. A incluso de cepas celulares como controles
(iniciador)
negativos e positivos pode ser til para o monitoramento
Todos os ensaios L1/E1/E6/E7
dos resultados. O processamento de gua em todos
Linear Array (Roche) L1 (PGMY)
os passos do ensaio particularmente crucial para o
monitoramento de resultados falso-positivos, que podem PGMY-RBH L1 (PGMY)
ocorrer por meio da contaminao cruzada de amostras. InnoLiPA (Innogenetics) L1 (SPF10)
CLART (Genomica) L1 (PGMY)
Alguns ensaios incluem um alvo endgeno da clula DNA chip (Biocore) L1
hospedeira, tal como a -globulina, para monitorar a
Microarray (Genetel) L1
presena de DNA passvel de amplificao. Amostras
Ensaios DEIA LiPA L1 (SPF10)
negativas para o alvo endgeno e para o HPV no podem
Microarray (Papillocheck) E1
ser interpretadas. Os ensaios aprovados clinicamente
PCR tipo especfica (GenolD) L1
incluem as diretrizes para o monitoramento e relato
PCR in-house Luminex L1 (PGMY-GP)
de ensaios. Os ensaios desenvolvidos em laboratrios,
in-house, otimamente verificados, podem tambm ser PCR Luminex (Multimetrix) L1 (GP)
utilizados no diagnstico de rotina. Sempre que um ensaio PCR EIA (GenoID) L1
comercialmente aprovado estiver disponvel, as autoridades RealTime para HPV de alto L1
de credenciamento devem recomendar sua utilizao. risco da Abbott
Uma das vantagens desse procedimento que os ensaios Teste para HPV Amplicor L1
comerciais normalmente incluem reagentes com qualidade APTIMA Gen-Probe (TMA) E6/E7
controlada, assim como controles apropriados. NucliSENS EasyQ HPV E6/E7

Garantia da qualidade laboratorial 14.8 Desenvolvimento de uma rede de


Devem ser seguidas as boas prticas microbiolgicas, laboratrios de HPV da OMS, LabNet
incluindo os controles positivo e negativo apropriados. Um grupo de especialistas conveniados OMS se
A participao em painis de proficincia e programas encontrou em Genebra em 2005 e recomendou o
de GC essencial para determinar o desempenho do estabelecimento de uma rede global de laboratrios de
ensaio, devendo-se envidar o mximo esforo para a HPV, a LabNet, visando contribuir com a melhoria da
realizao de tais programas para cada analito. qualidade dos servios laboratoriais para a vigilncia
eficiente e com o monitoramento do impacto da
Epidemiologia/teste em pesquisa vacinao para HPV, alm de realizar treinamentos
Vrios ensaios comerciais e in-house so usados (53-55). Previu-se que a LabNet de HPV aceleraria
na epidemiologia e pesquisa. Eles variam quanto s a introduo das vacinas para HPV, pelo auxlio
caractersticas de desempenho, como ressaltado por implementao de procedimentos laboratoriais validados
estudos de proficincia global para a determinao do e padres, pelo desenvolvimento de um sistema de
tipo de HPV (52). A Tabela 14.3 mostra exemplos de GQ e de teste de proficincia, pelo treinamento de

168 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
funcionrios e pela disponibilizao de uma rede de conjunto no sentido de manter uma rede de especialistas
vigilncia. A LabNet de HPV da OMS foi criada mediante em testagem otimizada para HPV, e se renem
um financiamento da Fundao Gates e permaneceu em anualmente durante a Conferncia Internacional de
operao sob a gide da OMS de 2006 a 2010. Durante Papilomavrus.
esses quatro anos de operao, a LabNet priorizou as
atividades centrais de desenvolvimento dos padres Marcadores de progresso
internacionais para os ensaios de DNA e sorologia para Nem todas as mulheres com infeco persistente por
HPV, padronizao dos ensaios e desenvolvimento de HPV HR, ou com NIC 3, progridem para cncer cervical,
um manual laboratorial e um programa de treinamento caso no sejam tratadas. Dessa forma, esto sendo
enfatizando a GQ e o CQ. A LabNet auxiliou o Instituto investigados outros marcadores para atuar como
Nacional de Padres e Controle Biolgicos (NIBSC, do preditores de progresso, tais como o p16. Esses
ingls National Institute for Biological Standards and marcadores de progresso, juntamente com a deteco
Control) a desenvolver os padres internacionais do DNA de HPV HR, prometem oferecer um diagnstico mais
dos tipos 16 e 18 do HPV e anticorpos do tipo 16, os preciso de displasias de alto grau (40, 41).
quais esto disponveis no catlogo do NIBSC. O Manual
de Laboratrio de HPV da OMS foi publicado em 2009 14.9 Concluses
com base no conhecimento e experincia adquiridos Uma enorme quantidade de informaes sobre HPV e
por meio dos estudos de colaborao internacional, doenas relacionadas tem sido disponibilizada, incluindo
e est disponvel por meio da OMS (55). O manual muitas tecnologias novas para a deteco do HPV.
visa auxiliar o estabelecimento do apoio laboratorial importante que se utilizem testes apropriados, seja para
necessrio implementao e monitoramento dos aplicaes clnicas ou para propsitos epidemiolgicos.
programas de vacinao para HPV, e tem por foco os Alm disso, para garantir uma melhor qualidade dos
ensaios epidemiolgicos, no os clnicos. Os laboratrios resultados, os laboratrios que realizam esses ensaios
membros da LabNet de HPV continuam a trabalhar em devem aderir s prticas de GQ e CQ.

Infeces pelo papilomavrus humano (HPV) 169


Pontos principais:
Os HPV oncognicos so causas necessrias da maioria dos cnceres cervicais e de uma alta proporo de
outros cnceres anogenitais, incluindo alguns da orofaringe. Os HPV genitais so extremamente comuns;
aproximadamente 80% das pessoas sexualmente ativa so infectadas em algum momento de suas vidas.

A infeco persistente por HPV oncognico um pr-requisito para o desenvolvimento de leses precursoras e
neoplasia subsequente.

O cncer um desfecho raro dessa infeco genital, embora esta seja muito comum.

Os tipos 16 e 18 do HPV causam regularmente 70% dos cnceres cervicais em todo mundo.

A leso precursora para o cncer cervical a neoplasia intraepitelial cervical de grau 3 (NIC 3); os tipos 16 e
18 causam 50% desses casos.

A deteco do HPV baseia-se em tecnologia molecular, uma vez que o vrus no pode ser prontamente
cultivado pelos mtodos de diagnstico virais tradicionais, e a sorologia no sensvel. A triagem primria
de HPV est sendo incorporada triagem de cncer cervical em vrias combinaes com a citologia cervical
tradicional (teste de esfregao Pap).

Os ensaios utilizados clinicamente para a triagem de NIC3 ou cncer so diferentes daqueles utilizados em
estudos epidemiolgicos, tais como a vigilncia antes e aps a implementao de programas de vacinao.
Atualmente, no h indicaes clnicas para a testagem de HPV LR. Testes clnicos exigem uma padronizao
cuidadosa para a coleta, processamento e teste de amostras, com correlao aos desfechos clnicos (e no
analticos).

importante haver alta GC e CQ para a deteco de HPV. A LabNet de HPV da OMS, em colaborao com a
NIBSC, desenvolveu padres internacionais para o DNA de ambos os HPV 16 e 18 e de anticorpos para o HPV
16.

Para os ensaios de deteco de HPV, o cuidado na coleta de amostras clnicas e no transporte para o
laboratrio, assim como para o subsequente manuseio, imprescindvel para a preveno de contaminao e
ensaios falso-positivos.

A deteco de DNA do HPV um excelente preditor negativo (se o HPV HR no for detectado, improvvel
que a doena se manifeste), mas h muitos resultados falso-positivos na predio de doenas. Uma pesquisa
em andamento est investigando a utilidade de certos marcadores de progresso a fim de melhorar a
especificidade para desfechos clnicos importantes.

Com programas de sade adequados para a vacinao contra o HPV, o valor preditivo positivo da citologia
para detectar displasias em alto grau ir diminuir e, no futuro, ser provvel a utilizao de vrios mtodos
moleculares para a deteco do HPV.

170 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
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Infeces pelo papilomavrus humano (HPV) 173


Captulo 15

Infeces pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV)


15.1 Introduo
Os primeiros casos da sndrome da imunodeficincia cnico que contm duas cpias de RNA genmico (Figura
adquirida (AIDS, do ingls acquired immunodeficiency 15.1). A protena do capsdeo, p24, o principal componente
syndrome) foram descritos em 1981 e o vrus causador do vrus, sendo coberta por um envelope lipdico contendo
da doena, o HIV, foi isolado pela primeira vez em 1983. duas glicoprotenas, gp41 e gp120. Essas glicoprotenas de
Desde ento, o vrus se espalhou pelo mundo, com uma superfcie so importantes para a ligao s clulas T-CD4,
estimativa de 34 milhes de pessoas vivendo com HIV e o primeiro passo para o processo de infeco, assim como
2,7 milhes de novas infeces s em 2010 (1). A frica para a gerao de resposta imune do hospedeiro contra
subsaariana foi a regio mais impactada, com 23,1 o vrus. O HIV altamente divergente e existem vrios
milhes de pessoas vivendo com HIV e uma estimativa de subtipos ou clados diferentes no mundo. Subtipos distintos
1,9 milhes de novas infeces em 2010. A prevalncia so mais prevalentes nas diferentes regies do planeta.
do HIV alcanou >30% entre adultos em alguns pases. Alm disso, existem dois tipos principais de HIV, o HIV-1 e
Apesar do desenvolvimento da terapia antirretroviral e da o HIV-2. O HIV-1 subdividido em trs grupos: M (subtipos
expanso da cobertura do tratamento para muitos pases A-K), N e O. O HIV-1 o vrus mais comum, dominando a
com recursos limitados, estima-se que para cada pessoa epidemia, com diversos subtipos e vrus recombinantes.
que inicia o tratamento haja 2-3 novas infeces por O HIV-2 ocorre principalmente no Oeste da frica, com
HIV-1. Dessa forma, na ausncia de uma vacina efetiva, o registro de casos isolados em vrios pases no mundo.
diagnstico de HIV acessvel, com aconselhamento para Existem algumas diferenas entre os subtipos do HIV-1,
preveno, e o encaminhamento de pessoas infectadas mas, para fins de diagnstico, eles apresentam uma forte
por HIV para receber cuidados apropriados so estratgias reao cruzada. Assim, os antgenos/protenas derivados
importantes para desacelerar a propagao da epidemia. de um nico subtipo so adequados para o diagnstico da
infeco, independentemente dos subtipos prevalentes. Em
O HIV transmitido principalmente por meio de trocas de
virtude da reao cruzada entre HIV-1 e HIV-2, antgenos
fluidos corporais, que podem ocorrer por via sexual e por
especficos adicionais so necessrios para diagnosticar de
sangue ou produtos sanguneos contaminados. Gestantes
forma precisa a infeco por HIV-2.
infectadas por HIV tambm podem transmitir o vrus para
a criana durante a gravidez, parto (transmisso perinatal) 15.2 Testes de diagnstico
ou por meio da amamentao (transmisso ps-natal). A
transmisso do HIV tambm reportada em seguida ao 15.2.1 Diagnstico sorolgico da infeco por HIV
transplante de rgos, quando se descobre posteriormente O diagnstico sorolgico da infeco por HIV
que o doador era HIV positivo. Atualmente, para garantir obtido, rotineiramente, por meio da deteco de
a segurana, o sangue, os produtos sanguneos e os anticorpos para HIV no sangue ou em outros fluidos
doadores de rgos so testados rotineiramente para a corporais. Os anticorpos so induzidos, em mdia, em,
presena de HIV ou anticorpos para HIV, a fim de eliminar a aproximadamente, 4-6 semanas aps a infeco, embora,
possibilidade de transmisso do vrus. em alguns casos, o desenvolvimento de anticorpos
detectveis pode levar at 3-6 meses aps a infeco.
O HIV pertence famlia Retroviridae, subfamlia dos
Dessa forma, a infeco por HIV no pode ser excluda
lentivirus, da qual fazem parte vrus similares tais
com base em um teste negativo realizado 4-6 semanas
como o vrus Maedi-Visna, o vrus da artrite encefalite
aps a exposio documentada. Durante o perodo inicial
caprina, o vrus da anemia infecciosa equina e o vrus
da replicao viral, os anticorpos esto ausentes e o
da imunodeficincia em smios. O vrion apresenta,
diagnstico do HIV pode no ser feito de forma precisa,
aproximadamente, 100nm em dimetro, com um capsdeo

Infeces pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV) 175


utilizando testes que se baseiam apenas em anticorpos. a infeco aguda por HIV antes do desenvolvimento de
O perodo de janela agudo pode ser reduzido por meio do anticorpos e, atualmente, so utilizados rotineiramente
uso de mtodos que detectam diretamente um ou mais para a triagem de sangue e produtos sanguneos em
componentes (antgeno p24 ou RNA) do HIV. A replicao muitos pases. Embora os ensaios moleculares possam
viral no corpo induz tanto a resposta imune humoral como a detectar o cido nucleico viral alguns dias antes que o
mediada por clulas, que reduz o nvel de vrus a um ponto antgeno p24 possa ser detectado pelos EIA de quarta
definido. A presena de vrus detectveis na maioria dos gerao, o custo e a complexidade da deteco de cido
indivduos no tratados continua a estimular a resposta de nucleico pode exceder os benefcios, exceto em bancos de
clulas B e o nvel de anticorpos permanece alto ao longo sangue sofisticados.
do perodo subsequente, a menos que o paciente esteja
Embora os EIA sejam ensaios qualitativos, uma reviso
altamente imunocomprometido, como nos estgios tardios
aprofundada dos valores de densidade ptica pode ser de
da doena. Assim, a deteco de anticorpos especficos
utilidade. Os ensaios com taxa de sinais/cut-off alta tm
para HIV um marcador bastante confivel para o
mais probabilidade de resultado positivo para o HIV do que
diagnstico da infeco pelo vrus (Figura 15.2).
aqueles com taxa de sinais/cut-off baixa.
Existem trs usos principais para o teste de HIV: garantir
a segurana de sangue, de produtos sanguneos ou de gp120
Glicoprotena
rgos transplantados; realizar vigilncia; e efetuar o de ancoragem
Membrana
diagnstico de indivduos/pacientes. O exame realizado gp41
lipdica
Glicoprotena
para a segurana de sangue, normalmente, usa os transmembrana Capsdeo
Matriz

procedimentos de teste mais sensveis e sofisticados para


detectar tanto o anticorpo para HIV quanto o antgeno ou o
RNA do HIV-1, a fim de reduzir o perodo de janela.
Transcriptase
reversa
15.2.1.1 Imunoensaios enzimticos (EIA)
Logo aps a descoberta do HIV, os EIA foram
Figura 15.1
desenvolvidos para o diagnstico da infeco por HIV.
Estrutura e organizao da partcula viral do HIV
Esses EIA detectavam anticorpos especficos para HIV,
um indicador de infeco por HIV, e utilizavam lisados
virais como antgenos. Os ensaios de primeira gerao
foram, mais tarde, substitudos pelos de segunda gerao, Anticorpo
para HIV
que empregam antgenos mais especficos na forma
de peptdeos sintticos ou protenas recombinantes.
Esses ensaios eram mais sensveis e especficos para
1 gerao
detectar anticorpos para HIV. Entretanto, eles ainda 3 gerao 2 gerao
4 gerao
no identificavam respostas precoces de anticorpos na
forma de IgM (imunoglobulina M), devido ao seu formato Infeco Infeco Dias desde a infeco
e desenho. A terceira gerao de EIA utiliza um formato indetectvel Aguda

sanduche, que inclui antgenos marcados com enzima


e so capazes de detectar respostas de IgM precoce, Figura 15.2
reduzindo, assim, o perodo de janela. Nos ltimos anos, Dinmica precoce da replicao viral e
desenvolvimento de anticorpos com marcadores da
novos EIA de quarta gerao foram desenvolvidos para
infeco por HIV. Mostra-se o tempo aproximado
reduzir ainda mais o perodo de janela, por meio da da deteco dos anticorpos pelos imunoensaios
combinao da deteco do antgeno viral (p24), alm dos enzimticos de primeira, segunda, terceira e quarta
anticorpos para HIV (Figura 15.2). Os EIA de combinao geraes.
antgeno-anticorpo so muito sensveis para detectar

176 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Dessa forma, o valor preditivo positivo (VPP) de um treinamento que aborda vrios assuntos, incluindo a
ou dois resultados de EIA reativos ser muito maior qualidade, preciso e segurana (2). Com a ampliao
se os resultados forem interpretados no contexto do da oferta de cuidado e tratamento, observa-se um
sinal. Os ensaios com sinal baixo, mesmo com dois aumento nos esforos para fornecer aconselhamento
EIA reativos, devem ser testados em seguida com um e testagem a milhes de pessoas no mundo, como um
teste mais especfico ou por meio de uma amostra de componente importante de preveno.
acompanhamento para a confirmao da infeco.
Devido alta demanda e a um mercado ampliado,
existem mais de 50 tipos kits de testes disponveis em
15.2.1.2 Testes rpidos
todo o mundo, nem todos, porm, com caractersticas
Nos ltimos anos, houve uma migrao progressiva
de desempenho desejadas. importante garantir que
do diagnstico do HIV dos laboratrios para locais no
os testes rpidos sejam fabricados com o maior nvel
laboratoriais, como um resultado da disponibilidade
de qualidade possvel, de acordo com as boas prticas
de vrios testes rpidos para HIV. No mundo, mais
de fabricao, e que apresentem caractersticas de
de 100 milhes de pessoas foram testadas com
desempenho equivalentes aos mtodos de diagnstico. A
testes rpidos para HIV, apenas em 2011. Os testes
OMS e os CDC possuem programas de qualificao para
rpidos para HIV apresentam, principalmente, dois
avaliar a qualidade dos novos kits de teste rpido (3, 4).
formatos diferentes, os quais incluem dispositivos
para imunoconcentrao e cassetes ou tiras de fluido Recentemente, foram desenvolvidos os testes rpidos
lateral (Figura 15.3). Uma vez que os testes rpidos de quarta gerao, capazes de diagnosticar a infeco
foram desenvolvidos para detectar anticorpos para HIV aguda por HIV mediante a deteco do antgeno p24,
em poucos minutos (1-15 min), quando comparados alm dos anticorpos para HIV. A deteco do antgeno
aos EIA, que podem levar 2-4 horas, os dispositivos p24 pode reduzir o perodo de janela para poucos dias
so otimizados para acelerar a interao antgeno- e identificar pessoas que se encontram na fase aguda
anticorpo. Isso requer o uso de altas concentraes de da infeco. Entretanto, uma vez que a deteco da
antgeno e a deteco de complexos antgeno-anticorpo infeco aguda um evento raro mesmo em locais com
com reagentes coloridos sensveis, tais como o ouro alta prevalncia/incidncia, um teste de antgeno positivo
coloidal. Os testes rpidos so ideais para fornecer deve ser acompanhado pela realizao de exame em
resultados no mesmo dia em diversas situaes, tais quatro semanas ou mais para garantir a soroconverso.
como a realizao de testes em populaes de difcil Uma avaliao de campo recente desses testes rpidos
acesso, testagem e aconselhamento em domiclio, demonstrou que a sensibilidade e especificidade da
testagem por iniciativa do servio, teste em gestantes deteco do Ag ainda no aceitvel (5). Alm disso, uma
e realizao de testagem mvel. Os testes rpidos vez que essa tecnologia nova e as infeces agudas
para HIV so, frequentemente, utilizados em locais so raras, seria importante a realizao de avaliaes de
com baixa demanda de espcimes, para oferecer uma campo adicionais que incluam a confirmao de todas
alternativa de bom custo-efetividade. Eles podem ser as potenciais infeces agudas por meio de teste de
realizados utilizando soro, plasma ou sangue total, com cido nucleico. Assim como em qualquer outro teste, as
a vantagem do uso de amostras coletadas por meio medidas da garantia de qualidade (GQ) so essenciais
da puno digital. Os testes rpidos so de realizao para assegurar a preciso dos testes rpidos.
simples e podem ser utilizados em ambientes externos
ao laboratrio por trabalhadores ou consultores leigos
treinados, expandindo assim o acesso testagem
para HIV. A Organizao Mundial da Sade (OMS) e
os Centros de Controle e Preveno de Doenas dos
Estados Unidos da Amrica (CDC, do ingls United
States of America Centers for Disease Control and
Prevention) desenvolveram um amplo mdulo de

Infeces pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV) 177


por HIV. Os anticorpos para HIV, se presentes, so

negativo
positivo
detectados por anticorpos secundrios marcados
com fluorescena e observados em microscpio de
fluorescncia. O IFA no mais usado rotineiramente
e foi substitudo por outros mtodos tais como o
WB ou LIA. Os WB e LIA envolvem o uso de tiras
de membrana com protenas especficas para HIV
ou protenas/peptdeos recombinante separados.
Essas tiras so analisadas por espcimes de soro.
negativo positivo
Os anticorpos especficos para HIV so detectados
(A) (B) por anticorpos secundrios que so conjugados com
uma enzima, seguidos por um substrato que gera um
Figura 15.3 produto colorido. A Figura 15.4 mostra o padro tpico
Exemplos de teste rpido para HIV, mostrando (A)
de bandas no WB, indicando a presena de anticorpos
dispositivo de imunoconcentrao por fluxo e (B)
dispositivo de fluxo lateral. So mostrados testes para protenas virais especficas e incluindo um
rpidos com resultados positivo e negativo. controle positivo que mostra todos os anticorpos
especficos para protenas virais passveis de
Foram desenvolvidos vrios testes rpidos que utilizam deteco com seu padro caracterstico (Linha P). Os
espcimes de fluido oral (FO) coletados por meio de indivduos com infeces novas/recentes apresentam
uma haste. O FO contm 1/500-1/1.000 vezes menos anticorpos mais fracos e para menos protenas,
IgG que os espcimes sanguneos, mas o suficiente tipicamente a p24 e gp120/160. Conforme a infeco
para diagnosticar a infeco por HIV. A maioria dos progride, desenvolvem-se anticorpos para protenas
anticorpos no FO transferida passivamente a partir virais adicionais e estes se tornam mais fortes ao
do sangue e no produzida localmente, e contm um longo do tempo, como observado nos indivduos
complemento total de IgG do soro, embora com uma com infeces crnicas. Os LIA so similares ao
concentrao mais baixa. Os testes de FO podem ensaio de WB, mas utilizam protenas ou peptdeos
simplificar ainda mais o teste para HIV, tornando-os recombinantes purificados, imunologicamente
mais acessveis, enquanto reduzem os riscos biolgicos importantes para o diagnstico. Os WB e LIA so
associados aos testes que utilizam amostras de caros e requerem interpretao para estabelecer um
sangue. Atualmente, pelo menos trs kits de testes diagnstico baseado na combinao de anticorpos
rpidos orais esto disponveis comercialmente. para antgenos especficos (para p24 e uma ou mais
protenas do envelope) presentes no sangue. Esses
15.2.1.3 Ensaios confirmatrios ensaios detectam somente IgG especfica para HIV.
Dessa forma, eles no podem ser utilizados para
Embora os ensaios individuais listados acima sejam
confirmar a presena de IgM especfica para HIV ou
muito sensveis e especficos, resultados falso-positivos
vrus, que so detectados por EIA mais sensveis de
ou falso-negativos podem ocorrer. Os resultados falso-
terceira ou quarta gerao, respectivamente. Um
positivos podem ter consequncias maiores em nvel
algoritmo de teste que envolve o uso de dois ou mais
individual. Dessa forma, ensaios confirmatrios foram
EIA ou testes rpidos em um algoritmo seriado ou
desenvolvidos para corroborar os resultados positivos
paralelo pode fornecer resultados praticamente to
iniciais. Esses ensaios confirmatrios, baseados em
confiveis quanto os ensaios confirmatrios WB ou
diferentes formatos e princpios, incluem os ensaios de
LIA, mas a um custo bem menor.
imunofluorescncia (IFA, do ingls immunofluorescence
assay), western blot (WB) ou imunoensaios em linha
(LIA, do ingls line immunoassay). Os IFA envolvem
o uso de lminas com fixao de clulas infectadas

178 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Recente Crnica qualitativos so suficientes e apresentam aplicaes
para a deteco precoce de infeces por HIV em
adultos e crianas. A deteco da infeco aguda por
testes de amplificao de cido nucleico (NAAT, do
ingls nucleic acid amplification tests) tem aplicao
para o aumento da segurana de sangue ou produtos
sanguneos doados e, possivelmente, para populaes
de alto risco. Muitos bancos de sangue em pases
desenvolvidos ou em desenvolvimento utilizam NAAT
rotineiramente como parte de seus algoritmos de
testagem. Os indivduos com infeco aguda apresentam
carga viral elevada e tm alto risco de transmitir
a infeco a seus parceiros. Assim, a deteco de
indivduos com infeco aguda foi promovida como
Figura 15.4 parte da estratgia de preveno do HIV. Entretanto,
Ensaio de western blot confirmatrio e padro de
a deteco de casos agudos na maioria dos lugares
bandas de anticorpos que podem ser observados
de baixo rendimento e alto custo, considerando o curto
durante infeces recentes (tiras 3-7) e infeces
crnicas (tiras 8-13). P, controle positivo; N, controle perodo de janela (aproximadamente duas semanas).
negativo. Vrias protenas virais especficas so
Outra aplicao importante para os testes moleculares
mostradas prximas ao controle positivo.
o diagnstico precoce da infeco por HIV em
crianas com exposio perinatal. Uma vez que todas
as crianas nascidas de mes soropositivas adquiriram
15.2.2 Deteco do RNA, DNA ou p24 do HIV
passivamente anticorpos para HIV, os ensaios de rotina
O HIV tambm pode ser diagnosticado por meio da baseados em anticorpos no podem ser utilizados para
deteco direta do vrus ou componentes virais (antgeno confirmar ou excluir a possibilidade de infeco por
p24, RNA ou DNA pr-viral). A deteco do vrus por HIV. Anticorpos residuais em crianas no infectadas
meio da cultura ou outros mtodos no realizada persistem e podem ser detectados at os 18 meses de
rotineiramente, devido baixa sensibilidade quando idade. Assim, a deteco da presena ou ausncia de
comparada aos mtodos imunolgicos e moleculares RNA ou DNA para HIV em crianas com seis meses ou
padro e complexidade das tcnicas de cultura de mais o meio definitivo para diagnosticar a infeco
vrus. A deteco do antgeno p24 ou do RNA ou DNA por HIV em crianas. Para o diagnstico infantil precoce
do HIV desempenha um papel importante quando no (DIP) em locais com limitaes de recursos, o sangue
possvel realizar o diagnstico com base em anticorpos, pingado em papis-filtro e seco (mancha de sangue
tais como em crianas expostas no momento perinatal seco; DBS, do ingls dried blood spot) como um modo
ou a deteco de infeco aguda em adultos antes de facilitar a coleta, processamento, transporte e
do desenvolvimento de anticorpos para HIV (6-10). A armazenamento de espcimes de sangue. Com o
deteco molecular de cidos nucleicos alvo mais foco principal na preveno da transmisso vertical,
sensvel que a deteco de p24. os ensaios moleculares para o diagnstico infantil
Dependendo do estgio da infeco, o HIV pode precoce foram implementados em um grande nmero
ser encontrado principalmente como DNA pr-viral de laboratrios. Existem vrios ensaios comerciais
em clulas infectadas ou como RNA no sangue utilizados para o diagnstico de HIV em crianas.
(como um componente de partculas virais livres e Esses ensaios incluem a extrao manual de cidos
RNA intracelular). Kits comerciais esto disponveis nucleicos ou as mais recentes plataformas moleculares
para detectar o DNA e/ou RNA qualitativamente ou que oferecem a automao para a extrao de cidos
quantitativamente. Para fins de diagnstico, os ensaios nucleicos e a deteco qualitativa do RNA e DNA do

Infeces pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV) 179


HIV-1. A extrao manual de cidos nucleicos requer um um resultado positivo confirmado em seguida por um
nmero significativo de passos, havendo um potencial de segundo teste diferente. Baseando-se na especificidade
ocorrncia de erro humano ou contaminao na reao dos testes, e se a prevalncia do HIV for relativamente
em cadeia da polimerase (PCR, do ingls polymerase alta (>5%) na populao, dois resultados positivos
chain reaction). Com a necessidade de alcanar so utilizados para diagnosticar a infeco. Em uma
maior qualidade, as plataformas foram desenhadas populao de baixa prevalncia, um terceiro teste
para minimizar a interveno do usurio e melhorar o recomendado antes que um diagnstico positivo para
processamento de amostras. A deteco qualitativa HIV seja confirmado. O algoritmo em srie lgico e
da infeco pelo HIV-1 em crianas foi apontada como custo-efetivo e inclui um teste mais sensvel como o
sensvel o suficiente para detectar 500 cpias de DNA/ primeiro teste, seguido por um teste mais especfico,
mL, dependendo da fonte do espcime (plasma, sangue para eliminar resultados falso-positivos. No entanto,
total ou DBS). O agrupamento de espcimes, o qual em algumas situaes, so utilizados algoritmos
frequentemente realizado para detectar infeces paralelos, que incluem o uso simultneo de dois testes,
agudas em adultos, a fim de aumentar a eficincia registrando-se o resultado como negativo ou positivo de
e reduzir os custos, no recomendado para DIP. acordo com a concordncia dos resultados. No caso de
Infelizmente, os ensaios quantitativos para HIV no resultados discrepantes, ou um terceiro teste realizado
so licenciados em muitos pases para o diagnstico, ou o paciente testado posteriormente para confirmar
mas apenas para o monitoramento da infeco por ou excluir a ocorrncia de soroconverso recente. Os
HIV. Entretanto, o uso de um ensaio quantitativo de algoritmos em paralelo podem ser mais custo-efetivos
RNA de HIV em espcimes de plasma antes do incio em uma situao de alta prevalncia, grande volume de
do tratamento antirretroviral (ARV) o segundo teste pacientes ou na testagem de gestantes em trabalho de
confirmatrio preferido. parto. importante selecionar a combinao correta de
testes para assegurar um diagnstico preciso (11).
Enquanto a realizao de testes sorolgicos rpidos
de qualidade para HIV se tornaram rotina em locais
15.2.4 Espcimes em mancha de sangue seco
perifricos, os testes point-of-care (POC) de PCR,
(DBS)
utilizando DNA, para os quais necessrio apenas
Embora a maioria dos ensaios de diagnstico seja
uma infraestrutura laboratorial mnima, est evoluindo
desenvolvida para utilizar sangue processado (espcimes
lentamente. Novas modalidades de testes POC, que
de soro ou plasma), a coleta de espcimes necessita
podem ser realizadas em locais com recursos limitados,
de um flebotomista experiente e equipamentos. Alm
baseiam-se na amplificao isotrmica, com a deteco
disso, o transporte de espcimes lquidos depende de
rpida de sequncias-alvo. Alguns ensaios POC utilizam
refrigerao, a qual relativamente onerosa. O DBS
instrumentos portteis pequenos e, geralmente, realizam
oferece uma alternativa simples e fcil de amostra para a
a extrao e amplificao do cido nucleico, amplificao
sorologia e teste molecular para HIV. Os EIA e WB foram
do sinal e deteco. Um estudo de campo desses testes
otimizados para trabalhar com espcimes DBS (12). Os
ser fundamental para validar a sua solidez e habilidade
espcimes DBS podem ser coletados, armazenados e
de fornecer resultados acurados.
transportados em temperatura ambiente. Normalmente,
realiza-se uma puno de 6mm para diluir os anticorpos
15.2.3 Algoritmos para testagem
a fim de realizar o teste. Dependendo do ensaio utilizado,
Para o diagnstico de HIV, dois ou mais testes so
geralmente, necessrio realizar algumas otimizaes
combinados em um algoritmo para aumentar o VPP
no ensaio para garantir a sensibilidade e especificidade
de um teste inicialmente positivo. Na maioria das
ideais (13). Com o sistema de ensaios otimizado, o DBS
situaes, o algoritmo normalmente mais utilizado inclui
o espcime ideal para a vigilncia do HIV.
o uso de testes em srie ou sequenciais (algoritmo em
srie). Embora um resultado negativo seja geralmente Como descrito anteriormente, o DBS um espcime
comunicado ao paciente com base em um nico teste, conveniente, utilizado rotineiramente para o DIP em

180 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
muitos pases. Recentemente, os ensaios foram da terapia de primeira linha para a de segunda linha,
otimizados e validados para o monitoramento de carga principalmente em pases nos quais o teste de carga
viral com espcimes DBS. Aps o tratamento eficiente, viral no est disponvel. A deciso de quando comear
a carga viral plasmtica diminui rapidamente para nveis a TARV crtica em pases com menos recursos, em um
abaixo do detectvel, em poucas semanas. Entretanto, contexto de maiores taxas de mortalidade e incidncia
o RNA e o DNA intracelular persistiro e podero ser de infeces oportunistas (15, 16). Quando a contagem
detectados em espcimes DBS. Assim, o uso de DBS de CD4 diminui, os indivduos HIV-positivos apresentam
para o monitoramento longitudinal de pacientes em maior probabilidade de se infectarem por patgenos
tratamento requer cautela. oportunistas. A TARV utilizada quando a contagem
de clulas CD4 atinge um certo limiar para evitar o
15.3 Monitoramento laboratorial clnico da desenvolvimento dessas infeces. A contagem de CD4
infeco por HIV normal em crianas menores de cinco anos de idade
maior que em adultos e declina ao longo do tempo.
15.3.1 Funo do teste de CD4 no monitoramento
Isso torna difcil o acesso elegibilidade para TARV em
clnico do HIV
crianas com base na contagem absoluta de CD4. As
A infeco por HIV leva ao desenvolvimento de AIDS, porcentagens de CD4 tm sido utilizadas para determinar
a qual se caracteriza pela perda de clulas T-CD4, quando iniciar a TARV em crianas infectadas por HIV.
necessrias ao funcionamento adequado do sistema
imune do indivduo. O teste de CD4 utilizado no 15.3.1.1 Princpios do ensaio de CD4
monitoramento clnico de pessoas infectadas por HIV
Em geral, a contagem de CD4 se refere determinao
para determinar, adequadamente, quando iniciar a terapia
do nmero de clulas T-CD4, tambm chamadas de
antirretroviral (TARV), para monitorar a eficincia do
linfcitos CD4 ou clulas T auxiliares. Os ensaios de CD4
tratamento com medicamentos antirretrovirais (ARV)
so utilizados para determinar a concentrao absoluta
e para determinar quando se deve fornecer profilaxia
de clulas CD4 no sangue total e/ou a porcentagem de
para infeces oportunistas. A OMS recomenda a TARV
clulas CD4 na populao de linfcitos. A contagem de
para adultos e adolescentes infectados por HIV com a
CD4 normal situa-se entre 400-1.600 clulas/dL e a
contagem de CD4 <350 clulas/L, independentemente
porcentagem normal de CD4, entre 35-55% (17 ).
dos sintomas clnicos (14). Em regies com recursos
limitados, a taxa para o incio da terapia difere de pas Os mtodos-padro para a contagem de CD4 utilizam
para pas, mas normalmente, varia de 200 para 350 anticorpos monoclonais marcados para identificar as
clulas/L. A contagem de CD4 tambm utilizada, molculas de superfcie de clulas sanguneas, tais
normalmente, como uma ferramenta para monitorar a como CD4, CD3, CD8 e CD45. As principais clulas
progresso da doena e a efetividade da TARV. Quando brancas com anticorpos anti-CD4 e CD3 marcados esto
um paciente no responde ao tratamento, os dados representadas na Figura 15.5.
de CD4 so utilizados para determinar a mudana

Anti-CD4 Anti-CD3
com com
marcao em marcao em
ouro vermelho
Moncito Clula B

Figura 15.5
Clulas sanguneas brancas com anticorpos anti-CD4 e anti-CD3 marcados.

Infeces pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV) 181


As clulas sanguneas que expressam as molculas de clulas sanguneas brancas ou linfcitos. Atualmente,
superfcie de interesse so identificadas por citmetros os mtodos de plataforma simples so os preferidos,
de fluxo, os quais detectam a marcao especfica de tendo-se mostrado que estes melhoram a preciso
cada anticorpo monoclonal. Os citmetros de fluxo dos ensaios de CD4 (15). O mtodo de plataforma
tambm diferenciam as clulas sanguneas por meio simples determina a contagem de CD4 em citmetros
da propriedade de difuso da luz pelas clulas. Como de fluxo a partir de amostras de sangue total, com o
um exemplo de teste de CD4, a Figura 15.6 mostra volume determinado precisamente. Os mtodos de
uma anlise citomtrica de fluxo com grficos de plataforma simples baseiam-se tanto em um princpio
disperso de dois parmetros. O primeiro grfico de volumtrico pela contagem de clulas CD4 em uma
disperso identifica a populao de clulas brancas unidade de volume das amostras processadas quanto na
por meio da propriedade de disperso da luz e das comparao da contagem de um nmero conhecido de
molculas de superfcie CD45. O quadro representado microesferas adicionadas amostra processada com a
por R1 identifica a populao de linfcitos, e o R2, a contagem de clulas CD4.
populao de moncitos. O segundo grfico de disperso
A estratgia recomendada para a marcao da rea a ser
verifica apenas as clulas dentro das caixas R1 e R2
estudada para a contagem de CD4 identifica a populao
do primeiro grfico de disperso. As clulas CD4 so
de linfcitos por meio de marcadores CD45 e propriedades
o grupo de clulas na direita superior, verificando-se
de disperso lateral. Tambm existem vrios ensaios
tanto a expresso de CD4 quanto de CD3. As clulas T
de CD4 que utilizam estratgias de marcao de uma
CD8 esto logo abaixo do grupo de CD4, expressando
rea fixa e especfica a ser estudada, que so exclusivas
CD3, mas no CD4. As clulas B so o grupo no canto
desses ensaios. Exemplos destes ensaios incluem o
esquerdo inferior, no expressando CD4 ou CD3. Os
FACSCount CD4 e o Guava Auto CD4/CD4%.
moncitos so o grupo verde de clulas acima das
clulas B, com baixa expresso de CD4 e ausncia
15.3.1.3 Ensaios de CD4
de CD3. O citmetro de fluxo pode contar o nmero
de clulas em cada grupo para ajudar a determinar a A Tabela 15.1 mostra a variedade de tecnologias
contagem de CD4. comercialmente disponveis para o teste de CD4. A
tabela inclui os mtodos manuais para a contagem de
10 4

clulas CD4, que se baseiam na contagem direta por


1000

microscpio, assim como o novo ensaio de CD4 POC, o


Disperso lateral

10 3
800

Pima CD4. Antes da implementao dos ensaios de CD4,


CD4 Cy5

Moncito
10 2

devem-se considerar as polticas internas de cada pas e


600

Clulas T CD4
R2
da OMS quanto ao uso desses testes, no que diz respeito
400

R1
101

infraestrutura e aos profissionais necessrios para sua


200

Clula B
Clulas T CD8
implementao apropriada, assim como ao fornecimento
10 0
0

10 0 101 10 2 10 3 10 4 10 0 101 10 2 10 3 10 4
CD45 PerCP CD3 FITC
de servios de logstica e avaliao e monitoramento
Figura 15.6 da qualidade dos testes (16).
Exemplo de grficos de disperso de citmetro de
fluxo de um ensaio de CD4. 15.3.2 Garantia da qualidade para os testes de CD4
O desenvolvimento de diretrizes para a GQ do teste de
15.3.1.2 Plataformas de CD4 e estratgias CD4 orientou-se pelo avano e experincia tanto nos
A contagem de CD4 era tradicionalmente determinada locais desenvolvidos quanto naqueles com escassez de
utilizando uma tcnica de plataforma dupla com recursos (17-19). importante que os espcimes para
um citmetro de fluxo, fornecendo a porcentagem a contagem de CD4 sejam devidamente identificados;
de clulas CD4 em uma populao de clulas coletados em tubos adequados para sangue; mantidos
sanguneas brancas ou de linfcitos, e um analisador em temperatura ambiente, mas no expostos ao calor
de hematologia, fornecendo a contagem absoluta de extremo; e analisados no perodo de tempo recomendado

182 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
para o ensaio. Estabilizadores de sangue, tais como o inventrio de reagentes e uma cadeia de suprimento
Cyto-chex e o Transfix, foram utilizados para estender o confivel para garantir que no haja atrasos no teste
perodo durante o qual um espcime pode ser analisado, como resultado da falta de reagentes.
principalmente quando necessrio um espcime de
O controle de qualidade (CQ) deve ser realizado
referncia. O espcime deve ser processado seguindo
diariamente, sempre que o teste de CD4 for realizado.
um procedimento-padro escrito. Pipetas calibradas e
Suprimentos de sangue estabilizado podem ser
reagentes devidamente estocados e dentro do prazo de
utilizados como material para o CQ e esto disponveis
validade so importantes para a obteno de resultados
comercialmente (19). Dois nveis de materiais de CQ,
confiveis. Os ensaios de CD4 devem ser realizados por
normal e baixo, devem ser testados como um espcime de
profissionais de laboratrio treinados e qualificados.
paciente. Os resultados de CQ necessitam ser revisados
Todos os resultados obtidos, incluindo os grficos de
diariamente. Alternativamente, controles de esferas
disperso, devem ser revisados quanto preciso,
podem ser utilizados para garantir a preciso da funo de
completude e identificadores corretos. necessrio
contagem dos instrumentos de CD4. Os laboratrios que
que realizar a manuteno diria de equipamentos
realizam o teste CD4 tambm devem ser registrados em
e instrumentos, de acordo com um cronograma. O
um programa de avaliao/GQ externa.
contrato de servios em citmetros de fluxo pode
estender a vida til do instrumento e ajuda a garantir
seu funcionamento apropriado. So necessrios um

Tabela 15.1: Instrumentos e ensaios para CD4


Tipo Instrumentos/ Ensaio Princpios do ensaio
companhias
Sistemas de Epic XL-MCL & PLG CD4 Citometria de fluxo, baseada em
rendimento alto FC500/ Beckman esfera
Coulter Brea, CA, EUA

FACSCalibur & Canto/ Tritest & MultiTest Citometria de fluxo, baseada em


BD Bioscience San esfera
Jose, CA, EUA
Sistemas de FACSCount/BD Reagentes para FACSCount Citometria de fluxo, baseada em
rendimento mdio Bioscience & reagentes para CD4 esfera
a baixo

Guava PCA/ Easy CD4, Citometria de fluxo, volumtrica


Millipore Easy CD4%
Billerica, MA, EUA Auto CD4/CD4%

CyFlow SL_3 & Partec Easy CD4 & CD4% Citometria de fluxo, volumtrica
Counter/ Partec
Gorlitz, Alemanha
Sistemas manuais Beckman Coulter Cyto-Spheres Observao direta de clulas com
Invitrogen esfera
Oslo, Noruega Kit T4 Quant Observao direta de clulas
imunocapturadas
POC Pima Analyzer/ Pima CD4 Imagem digital de clulas duplamente
Alere Technologies marcadas, volumtrica
Jena, Alemanha

POC: teste point-of-care.

Infeces pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV) 183


15.3.3 Teste de carga viral ARV, as quais, por fim, podem levar a mudanas nas
Embora o CD4 seja um parmetro importante para a protenas enzimticas essenciais para a replicao viral
compreenso do estado clnico do paciente e para iniciar e permitir que o HIV se replique na presena de ARV
a TARV, a carga viral uma medida quantitativa de HIV importantes. Em locais com poucos recursos, os ARV
no sangue, sendo tambm um parmetro importante prescritos mais comumente agem contra as regies
utilizado para monitorar a eficcia do tratamento ao da RT e protease (PR). A evoluo de subpopulaes
longo do tempo. Existem muitos ensaios de carga de HIV resistentes a drogas pode comprometer
viral (CV) comercialmente disponveis e utilizados, significativamente a habilidade dos ARV de suprimirem a
principalmente, para o manejo da infeco pelo HIV, replicao viral. Uma vez que as cepas virais resistentes
em conjunto com a apresentao clnica e outros surgem, elas podem persistir indefinidamente, tanto
testes laboratoriais. A tecnologia de amplificao de como vrus circulantes ou integradas ao genoma de
cido nucleico in vitro usada para quantificar as linfcitos T de memria como DNA pr-viral. Essas
partculas de HIV no plasma. Os mtodos de PCR linhagens virais resistentes podem no s causar HIVDR
para a transcriptase reversa (RT, do ingls reverse em pacientes que as adquirem, como tambm podem
transcriptase), amplificao baseada nas sequncias de ser transmitidas a novos indivduos infectados por HIV,
cido nucleico (NASBA, do ingls nucleic acid sequence- levando ao comprometimento da eficcia da TARV
based amplification) e DNA em cadeia ramificada (bDNA, nesses pacientes. Dois mtodos estabelecidos para o
do ingls branched DNA) so utilizados para quantificar teste de HIVDR esto disponveis: os testes genotpico
o RNA do HIV por PCR, amplificao isotrmica de cido e fenotpico. Ambos so complexos e onerosos. Em
nucleico e amplificao de sinal, respectivamente. As pases ricos, o monitoramento de pacientes em TARV
tecnologias no fundamentadas em cido nucleico para a aquisio de HIVDR e deteco da transmisso
baseiam-se na deteco de enzimas virais (RT) e de HIVDR em indivduos infectados recentemente por
protenas (antgeno p24) como uma medida substituta de HIV tornou-se o cuidado padro (17 ). Demonstrou-se
carga viral para HIV. Os ensaios de CV diferem quanto que o teste de HIVDR melhora a sobrevivncia e a resposta
sensibilidade, amplitude dinmica e capacidade de imune, quando utilizado para orientar a tomada de deciso
detectar e quantificar os diferentes subtipos de HIV. clnica para pacientes que no responderam a um ou mais
O plasma humano o tipo de espcime padro para esquemas prvios. Devido limitao e/ou ausncia de
tecnologia de CV e as restries quanto ao processamento infraestrutura e profissionais treinados e ao seu alto custo,
de plasma, manuteno da refrigerao e armazenamento o teste individual de HIVDR no realizado rotineiramente
de espcime so preocupaes genunas. Entretanto, em locais com escassez de recursos. A OMS recomenda o
o uso de DBS como fonte de espcime promissor monitoramento e vigilncia da HIVDR em nvel populacional
e os locais de cuidado primrio podem coletar DBS e para prevenir o desenvolvimento e transmisso de HIVDR
transport-los aos laboratrios centrais para a realizao em pases com programas de TARV, alm de garantir que
do teste de CV. Atualmente, a testagem centralizada lei os regimes de TARV selecionados para incluso em guias
em pases com limitaes, mas o teste POC pode alterar nacionais, e os programas que os administram, continuem
o cenrio desses locais, para que, no futuro, o teste de CV eficientes (18-20).
seja realizado rotineiramente.
15.3.4.1 Teste de HIVDR genotpico
15.3.4 Teste de resistncia a drogas O teste de HIVDR genotpico avalia as sequncias de
A resistncia do HIV s drogas da terapia antirretroviral nucleotdeos das quais so deduzidos os aminocidos
(HIVDR, do ingls HIV drug resistance) se refere das enzimas PR e RT do HIV. As sequncias de
habilidade do HIV de continuar a se replicar na aminocidos das regies da PR e RT do gene pol do HIV
presena de medicamentos antirretrovirais (ARV) que, so comparadas quelas da linhagem viral de referncia
normalmente, suprimem sua replicao. A HIVDR do tipo selvagem ou sequncia de referncia consenso
causada por mutaes ou mudanas nas regies especfica de um subtipo, e qualquer mudana de
importantes do genoma viral de RNA que so alvo dos aminocido em um cdon especfico registrada. As

184 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
mutaes so descritas em um formato-padro baseado selvagens e mutantes presentes em uma quasispecie
na posio numrica de um cdon mutante em uma viral. Alm disso, o teste fenotpico s est disponvel em
sequncia de aminocido da PR ou RT. Por exemplo, uma um nmero limitado de laboratrios, que usam diferentes
mudana de metionina (M) para valina (V) na posio mtodos e podem gerar resultados discordantes.
184 da RT descrita como M184V. A letra esquerda Ainda mais importante, atualmente, o custo do teste
do nmero representa o aminocido naquela posio na fenotpico , pelo menos, trs vezes maior que o do teste
RT de referncia e a letra direita mostra o aminocido genotpico. Devido a essas limitaes, o teste fenotpico
comparvel associado mutao na linhagem de no recomendado para o propsito de vigilncia de
HIV sendo testada. O teste genotpico demonstrou-se rotina da HIVDR na populao.
altamente reprodutvel e sensvel, e fornece a sequncia
gentica completa e precisa do domnio de interesse. 15.3.4.3 Tipos de espcimes para o teste de HIVDR
Estudos indicaram que o teste genotpico pode identificar O plasma o tipo de espcime utilizado rotineiramente
mutaes de HIVDR presentes em cerca de 20% das para o teste genotpico e considerado o padro
quasispcies circulantes. ouro. Os dois testes genotpicos aprovados pela FDA
requerem plasma para a realizao do teste. A OMS
Os testes genotpicos aprovados pela Administrao
tambm recomenda que o plasma seja utilizado para
de Alimentos e Drogas dos Estados Unidos da Amrica
as pesquisas de monitoramento da HIVDR adquirida em
(FDA, do ingls United States of America Food and Drug
pacientes tratados com os ARV de primeira linha por
Administration) disponveis comercialmente, os sistemas
12-15 meses (23). Alm disso, muitos estudos avaliaram
de genotipagem TRUGENE e Viroseq, so desenhados
o uso de DBS para o teste de HIVDR em locais com
e aprovados para a genotipagem do subtipo B do
recursos limitados, o qual foi utilizado com sucesso
HIV-1, que so as linhagens dominantes que circulam
no teste genotpico, em populaes recentemente
na Europa e Amrica do Norte. Embora esses testes
diagnosticadas com HIV e que no foram submetidas a
sejam utilizados para o teste genotpico em subtipos
tratamento antirretroviral, para verificar a transmisso
no-B do HIV-1, suas caractersticas de desempenho
do HIV nos ltimos anos. A OMS tambm recomenda
no foram completamente avaliadas e os resultados
que o DBS seja utilizado para a pesquisa de HIVDR
dos testes podem variar. Laboratrios por todo o mundo
transmitidas em populaes virgens de tratamento
desenvolveram e validaram testes genotpicos que foram
e para o monitoramento de HIVDR adquiridas em
desenhados para a genotipagem dos diversos subtipos
pacientes iniciando a TARV (23-25). Embora haja
do grupo M do HIV-1 e formas recombinantes circulantes
vantagens importantes em utilizar o DBS para o teste de
(CRF, do ingls circulating recombinant forms) (21, 22).
HIVDR, incluindo a facilidade para a coleta de amostra,
transporte e armazenamento sem a necessidade de
15.3.4.2 Teste de HIVDR fenotpico
refrigerao (21, 22, 26-28), existem limitaes para o
Os testes fenotpicos in vitro utilizam as regies da RT
seu uso na coleta de amostras de pacientes tratados
e PR do gene pol do HIV-1 derivados de um indivduo
com ARV de primeira linha, participando de pesquisas
infectado por HIV e incorporam essas regies genmicas
sobre a aquisio de HIVDR nos 12 meses aps o incio
para gerar um vrus recombinante. A susceptibilidade
de TARV (23, 29). Isso se deve principalmente menor
do vrus recombinante , ento, determinada por meio
quantidade de amostra aplicada para a extrao, menor
do teste de susceptibilidade na presena de vrias
carga viral na maioria dos pacientes em tratamento e
concentraes de uma droga relevante. Os resultados
menor sensibilidade do teste de genotipagem na maioria
so expressos como mudanas na susceptibilidade
dos ensaios de genotipagem in-house. Entretanto,
na concentrao inibitria de 50% (IC50) quando
resultados recentes de estudos conduzidos em locais
comparada aos valores de cut-off gerados pelo vrus
com limitaes de recursos, utilizando testes de carga
selvagem de referncia. Existem vrias limitaes no
viral baseados em PCR em tempo real de segunda
teste fenotpico. Notavelmente, o teste fenotpico pode
gerao, revelaram que a quantificao da carga viral
no predizer o desfecho clnico adequadamente se
com DBS em pacientes tratados com ARV de primeira
houver uma mistura de populaes de linhagens virais

Infeces pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV) 185


linha pode ser uma alternativa vivel para a mensurao 4. USAID. HIV/AIDS rapid test kits: process
da carga viral (30-34). Por meio da combinao de for USAID approval and technical guidance.
teste de carga viral baseado em PCR em tempo real de Washington, DC, Agncia dos Estados Unidos para
segunda gerao com ensaios genotpicos in vitro de o Desenvolvimento Internacional, 2010 (http://
menor sensibilidade, o monitoramento de HIVDR em transition.usaid.gov/our_work/global_ health/aids/
pacientes em tratamento utilizando DBS, finalmente, TechAreas/treatment/testkit_explain.pdf, acessado
pode se tornar vivel em locais com recursos escassos. em 5 de abril de 2013).

5. Bhowan K et al. Identifying HIV infection in South


15.3.4.4 Resultados de genotipagem com qualidade
African women: how does a fourth generation HIV
garantida
rapid test perform? African Journal of Laboratory
Assim como em qualquer tcnica molecular, o teste de
Medicine, 2011, 1(1). http:// dx.doi.org/10.4102/
HIVDR genotpico passvel de contaminao cruzada,
ajlm.v1i1.4.
se o teste no for realizado conforme os procedimentos
e as condies laboratoriais para os quais o mesmo 6. Leelawiwat W et al. Dried blood spots for the
foi desenvolvido. A fim de padronizar o teste de diagnosis and quantitation of HIV-1: stability
HIVDR genotpico e garantir a qualidade dos dados de studies and evaluation of sensitivity and specificity
genotipagem em locais com limitaes de recursos, a for the diagnosis of infant HIV-1 infection in
OMS/ResNet desenvolveu uma estratgia laboratorial Thailand. Journal of Virological Methods, 2009,
para verificar a resistncia do HIV aos medicamentos 155(2):109117.
(35). As estratgias do laboratrio de genotipagem,
7. Ou CY et al. Early diagnosis of HIV infection in
incluindo os programas de avaliao externa da
the breastfed infant. Advances in Experimental
qualidade, foram desenvolvidas e implementadas em
Medicine and Biology, 2012, 743:5165.
todos os laboratrios de resistncia a medicamentos
autorizados pela OMS, e somente estes realizam 8. Ou CY et al. Identification of HIV-1 infected
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monitoramento e vigilncia de HIVDR. A equipe de PCR and dried blood spots from Uganda and
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diagnosis of HIV in infants in resource-limited of an internally controlled dried blood spot assay
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21. Yang C et al. Development and application of 30. Johannessen A et al. Dried blood spots perform
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Infeces pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV) 187


31. Mbida AD et al. Measure of viral load by using 34. Lofgren SM et al. Evaluation of a dried blood spot
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measurements obtained with dried blood spots
and those obtained with plasma by use of
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load tests. Journal of Clinical Microbiology, 2009,
47(4):10311036.

188 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Captulo 2

Gesto de qualidade no laboratrio

2.1 Introduo uma infeco em particular ou para a populao a ser


A finalidade de um sistema de qualidade garantir que testada (ver Captulo 1).
todos os laudos emitidos por laboratrios e utilizados
Para uma compreenso comum partilhada, a Tabela 2.1
para a gesto de pacientes sejam de alta qualidade. Para
define os termos utilizados nesse captulo.
manter um servio de alta qualidade, os laboratrios
devem investir em um programa de melhoria de A certificao um procedimento que demanda tempo
qualidade e se credenciarem junto a um organismo e altos custos e no pode ser realizada por muitos
nacional ou internacional idneo, como a Organizao laboratrios, mas todos os laboratrios deveriam
Internacional de Padronizao (ISO, do ingls trabalhar no sentido de melhorar qualquer procedimento
International Organization for Standardization; www.iso. que afete a preciso da informao que orienta a gesto
org). A certificao envolve uma auditoria externa sobre de pacientes. Em vrias partes do mundo, tm sido
a capacidade do laboratrio de fornecer um servio de desenvolvidos mecanismos para fortalecer os sistemas
alta qualidade, por meio da definio de uma prtica laboratoriais por meio da implementao de melhorias
padro, a qual confirmada por uma reviso realizada realizadas passo a passo, de acordo com uma lista de
por especialistas. Entretanto, isso no inclui a avaliao verificao (1-5).
do grau de adequao do teste para o diagnstico de

Tabela 2.1: Definio de termos-chave utilizados no captulo de gesto de qualidade

Certificao Auditoria externa dos procedimentos do laboratrio, que contribui para a qualidade do laudo.
Sistema de gesto Estrutura para uma abordagem sistemtica para a gesto da qualidade dos procedimentos
de qualidade (SGQ) laboratoriais.
Garantia de Processo sistemtico para garantir o cumprimento dos requisitos de qualidade para um produto
qualidade (GQ) ou servio.
Documento contendo a descrio detalhada dos procedimentos individuais para cada protocolo
Procedimento
ou teste usado no laboratrio. A finalidade de um POP garantir que as operaes sejam
operacional padro
realizadas corretamente e sempre da mesma forma. Um POP deve estar sempre disponvel no
(POP)
laboratrio.
Avaliao interna Realizada por meio do reenvio e testagem de amostras clnicas annimas selecionadas
da qualidade (AIQ) randomicamente no mesmo laboratrio para garantir a reprodutibilidade dos resultados.
Avaliao externa Processo que permite a introduo de amostras de contedo conhecido, porm no divulgado no
da qualidade (AEQ) procedimento de testes de rotina de um laboratrio, a partir de uma fonte independente.
Controle interno da
Procedimento usado para detectar problemas e falhas em um ou mais reagentes de um teste.
qualidade (CIQ)
Avaliao dos Processo sistemtico e extenso que compara diferentes sistemas projetados para executar
testes funes iguais ou similares.
Validao dos Procedimento usado para examinar todo o processo que est sendo utilizado, a fim de verificar
testes se os resultados esto corretos.
CSPS Controle de substncias prejudiciais sade

Gesto de qualidade no laboratrio 11


2.2 Gesto de qualidade se encontrar regularmente em geral, de seis a oito
vezes por ano para discutir assuntos relevantes,
O sistema de qualidade deve ser descrito em um
incluindo finanas, administrao, contratao de
manual de qualidade que apresenta o sistema de gesto
pessoal, equipamentos, AIQ e AEQ, certificao e
para o laboratrio. Ele serve para notificar a gerncia
quaisquer outras questes levantadas que afetem a
e os funcionrios do prprio laboratrio e fornecer
oferta dos servios laboratoriais. Nessas reunies,
informaes para os clientes dos servios laboratoriais e
devem-se elaborar atas com os pontos de ao a
para qualquer organismo de certificao.
serem revisados nos encontros seguintes.
Organizao e gesto As reunies de todos os funcionrios devem incluir
Uma estrutura organizacional necessria para todos os nveis de funcionrios do laboratrio. Esse
o laboratrio, na qual estejam claros os papis grupo deve se encontrar pelo menos oito vezes por
e responsabilidades de cada indivduo. Trata-se ano para discutir assuntos relevantes, incluindo
normalmente de uma estrutura hierrquica, dirigida por finanas, administrao, contratao de pessoal,
um diretor ou pelo chefe do departamento, com chefes segurana, certificao e quaisquer outras questes
de sees ou unidades, um gerente de laboratrio e uma levantadas. Nessas reunies, devem-se elaborar
gama de cientistas da sade, de diferentes reas. Um atas com os pontos de ao a serem revisados nos
indivduo deve assumir a liderana pela qualidade, o que encontros seguintes.
pode constituir tanto uma funo especfica como uma
As reunies de gesto de segurana devem incluir
parte integral de um trabalho mais amplo. O manual de
o diretor ou o chefe do laboratrio, o gerente do
qualidade deve incluir um organograma das funes dos
laboratrio, o chefe de segurana do laboratrio,
diferentes indivduos e de suas linhas de gerncia e a
o vice-chefe de segurana, os chefes das sees,
descrio de suas responsabilidades. Cada funcionrio
um representante dos funcionrios e, se disponvel,
deve ter a descrio detalhada de seu trabalho, a qual
um conselheiro de sade e segurana. Esse grupo
deve ser revisada anualmente.
deve se encontrar em intervalos de seis meses,
Treinamento dos funcionrios e registro ou conforme apropriado. As atas devem ser
disponibilizadas a todos e afixadas no quadro de
Todos os funcionrios do laboratrio devem ser
avisos do laboratrio.
devidamente treinados e registrados, quando possvel,
junto a um organismo nacional. Os funcionrios devem As reunies anuais de gerncia tambm devem ser
receber treinamento em todos os mtodos que iro realizadas e os respectivos relatrios apresentados,
empregar em suas atividades dirias e ser regularmente a fim de possibilitar a reviso do desempenho
avaliados quanto sua competncia. Ser mantido completo do laboratrio e dos servios prestados aos
um registro do treinamento de cada empregado. Estes consumidores.
tambm devem participar de formao contnua para
ampliar suas experincias e competncias. A auditoria Procedimentos operacionais padro
dos procedimentos laboratoriais parte de um bom Todos os procedimentos utilizados no laboratrio devem
sistema de qualidade e ser um requisito para a ser documentados como POP e so fundamentais para
certificao. As responsabilidades individuais devem reduzir os erros decorrentes de variaes nos testes.
ser estabelecidas por meio das seguintes reunies dos Devem incluir os principais detalhes dos reagentes
vrios grupos do laboratrio: e metodologias, incluindo os controles internos e os
critrios interpretativos. Os POP devem ser escritos
As reunies dos gerentes ou funcionrios snior
pelos indivduos que executam o mtodo/teste e
devem incluir o diretor ou chefe de laboratrio, o
autorizados por um funcionrio snior. Necessitam
gerente do laboratrio, os chefes de cada seo, o
apresentar referncia cruzada quanto avaliao de
gerente de GQ, o chefe de segurana do laboratrio
risco e informaes de segurana (CSPS qumico e
e o assistente pessoal do diretor. Esse grupo deve

12 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


biolgico), devendo ser revisados e atualizados. Nenhum de qualidade, POP relevantes, registro de erros e
procedimento ser realizado no laboratrio sem que os reclamaes de consumidores.
POP estejam num lugar apropriado e de fcil acesso
A inteno da validao fornecer provas
no laboratrio para o uso dirio. Os POP devem ser
documentais de que um teste para diagnstico
revisados regularmente, verificados e autorizados pelo
ou a pea de um equipamento est de acordo
tcnico snior como parte do SGQ. Em alguns pases, o
com as especificaes do fabricante. Isso
POP local pode ser baseado no POP nacional.
pode envolver resultados de experimentos para
A avaliao e validao de testes essencial em determinar sua preciso, sensibilidade, viabilidade e
qualquer laboratrio para fornecer uma avaliao reprodutibilidade. A validao pode ser extensiva (por
baseada em evidncias sobre a capacidade de exemplo, para validar um novo mtodo desenvolvido
desempenho do teste, antes que este seja incorporado internamente pelo laboratrio) ou de mbito limitado
ao servio oferecido. (por exemplo, para validar um mtodo comercial) que
j est em uso e sofreu pequenas modificaes.
A avaliao um processo sistemtico e extensivo,
que compara diferentes sistemas projetados para Para os mtodos j em uso e que no possuem
executar funes iguais ou similares. Exemplos de uma validao especfica, importante providenciar
avaliaes na microbiologia incluem a comparao provas documentais que justifiquem os motivos para
de diferentes mtodos projetados para detectar o seu uso. Normalmente, suficiente preparar um
mesmo marcador/alvo, a comparao de diferentes documento baseado em evidncias histricas, como
meios de cultura para isolar o mesmo organismo ou o resultado de comparaes ou de outros estudos;
a comparao de diferentes equipamentos com a cpia de artigos publicados; resultados da AEQ, da
mesma funo. Os resultados da avaliao devem ser AIQ e do CIQ; etc. Os registros do trabalho podem ser
encaminhados s partes interessadas, por exemplo, cruzados com referncias, caso seja apropriado para
por meio de uma publicao. Quando dois conjuntos o relatrio de validao.
de reagentes (kits) apresentam caractersticas de
desempenho equivalentes, deve-se dar preferncia Garantia de qualidade (GQ)
quele que seja mais fcil de usar, de menor custo, A GQ fundamental para o trabalho do laboratrio, a fim
mais rpido ou que requeira amostras de mais fcil de manter a qualidade dos servios e garantir que os
obteno. resultados sejam tanto precisos quanto reprodutveis,
sendo a preciso o grau de concordncia entre o valor
A validao usada para examinar todo o processo
mdio obtido por uma ampla srie de resultados do teste
que est sendo utilizado, a fim de verificar se os
e um valor de referncia aceito, e a reprodutibilidade
resultados esto corretos. Cada laboratrio deve
a habilidade de produzir essencialmente o mesmo
validar suas habilidades para alcanar resultados
resultado de diagnstico, independentemente das
aceitveis, segundo o mtodo ou sistema em
variaes de operador, lote do teste, laboratrio ou
questo. Para documentar tais habilidades, os
equipamento auxiliar validado.
laboratrios devem produzir um arquivo de validao
para cada mtodo ou sistema. O arquivo necessita Existem dois elementos principais da GQ: avaliao
incluir uma ampla gama de informaes e envolver da qualidade, ambas as AIQ e AEQ; e o controle de
nfases diferentes, conforme o laboratrio esteja qualidade, o qual engloba a avaliao e a validao
utilizando um sistema comercial ou se desenvolveu dos testes, CIQ e avaliao e monitoramento dos
um sistema prprio (in-house). Tipicamente, o equipamentos (Figura 2.1).
arquivo deve incluir sees como dados de avaliao,
teste em amostras conhecidas, pastas de trabalho,
publicaes relevantes, dados contnuos de controle

Gesto de qualidade no laboratrio 13


Avaliao da qualidade Controle de qualidade

Avaliao interna Avaliao externa Avaliao e Controle interno Avaliao e


da qualidade da qualidade validao de da qualidade monitoramento
testes de equipamentos

Figura 2.1
Diferentes elementos que contribuem para a garantia de qualidade (GQ)

Controle de qualidade (CQ) anormais. Deve-se estabelecer um novo intervalo para


O CIQ usado para detectar problemas ou falhas em cada lote novo de reagentes do CQ.
um ou mais reagentes de um teste. Por exemplo, para
sistemas de cultura, uma ou mais linhagens de controle Avaliao e monitoramento de equipamentos
conhecidas podem ser usadas para garantir que o meio essencial que todos os laboratrios verifiquem
permite o crescimento do organismo desejado, e, se for regularmente o desempenho dos equipamentos e
um meio seletivo, se este tambm inibe os organismos registrem os dados obtidos (6). Isso pode ser feito por
no desejados. Isso ir detectar a ausncia ou a meio da manuteno de um inventrio de equipamentos,
concentrao inadequada de um fator de crescimento ou revisado de forma regular. O fluxo laminar de segurana
de um agente seletivo. microbiolgica deve ser monitorado e registrado
semanalmente quanto ao fluxo de ar; a temperatura
Para testes moleculares, o CIQ deve incluir o controle
de todas as incubadoras, banhos-maria, geladeiras e
da amostragem, o controle do isolamento do cido
congeladores ser registrada diariamente. Qualquer erro
nucleico, um controle de amplificao, um controle de
deve ser reportado ao gerente do laboratrio.
contaminao e um controle de inibio. Isso ir prevenir
resultados falso-positivos das reaes em cadeia da Avaliao da qualidade
polimerase por meio da deteco da falha de um ou mais
Avaliao interna da qualidade (AIQ)
reagentes, da amplificao, da ciclagem da temperatura
ou inibio da reao. A AIQ realizada pelo reenvio e testagem de amostras
clnicas annimas selecionadas randomicamente no
Para qualquer teste sorolgico, as amostras do CQ
mesmo laboratrio, a fim de garantir a reprodutibilidade
devem ser includas diariamente, alm do CIQ fornecido
dos resultados. Todos os espcimes da AIQ devem
pelo kit e das amostras para o CQ externo, quando
ser submetidos a anlises de rotina, sem receber
disponvel, sendo todas elas testadas da mesma
qualquer tratamento especial. Para que o esquema
forma que o espcime do paciente. O intervalo para
fornea informaes relevantes e teis, a AIQ deve ser
as amostras de CQ para cada laboratrio deve ser
realizada regularmente em todos os tipos de amostras.
estabelecido utilizando-se pelo menos 20 medies ao
As amostras so selecionadas por um funcionrio
longo de um perodo de tempo; os valores de mdia,
treinado, o qual no pode ser a mesma pessoa que
desvio-padro (DP) e coeficiente de variao (CV) so
realizar os testes. As amostras devem ser selecionadas
ento calculados. Os grficos de Levey-Jennings devem
randomicamente para evitar vis, sendo reintroduzidas
ser preparados para cada controle, comparando-se
no sistema do laboratrio da mesma maneira que as
os resultados do CQ de cada corrida. As comparaes
amostras normais.
devem ficar entre dois DP e os resultados no devem
ser relatados se o valor do CQ for maior que trs DP. O nmero de espcimes testados e a frequncia
Esses grficos necessitam ser revisados regularmente dos testes dependem do nmero total de espcimes
para verificar se h quaisquer resultados ou tendncias

14 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


recebidos. Sugere-se que aproximadamente 1% do total Processamento das amostras:
recebido seja retestado mensalmente.
1. As amostras devem ser reconstitudas, se
Os resultados devem ser conferidos e comparados necessrio e se possvel. Isso deve ser realizado em
por uma pessoa diferente. Em caso de quaisquer um fluxo laminar de segurana de microbiologia de
discrepncias, o teste ser repetido e investigado. nvel 1, uma vez que provvel que os riscos no
sejam conhecidos.
Avaliao externa da qualidade (AEQ)
2. O exame ou procedimento requerido deve ser
A AEQ realizada pela distribuio de painis de
realizado de acordo com o POP.
proficincia por prestadores de AEQ, como o Servio
Nacional de Avaliao Externa da Qualidade do Reino 3. As amostras residuais devem ser estocadas at
Unido (UK NEQAS, do ingls United Kingdom National que os resultados sejam conhecidos, a fim de
External Quality Assessment Service; http://www. possibilitar a repetio do teste caso ocorra alguma
ukneqas.org.uk), o Sistema de Avaliao de Qualidade discrepncia.
Internacional (http://qasidirect.com), a Faculdade de
4. Quando o provedor externo receber os resultados,
Patologistas Americanos (http://www.cap.org) e o
estes devem ser registrados e o desempenho do
Programa de Avaliao da Qualidade RCPA Pty Ltd
laboratrio deve ser documentado.
da Austrlia (http://www.rcpaqap.com.au), ou, ainda,
por meio de troca de amostras entre laboratrios 5. Quaisquer falhas ou discrepncias devem ser
de referncia, visando acessar o amplo espectro de investigadas por meio da repetio do teste.
tcnicas e ensaios realizados no laboratrio clnico.
6. Os resultados devem ser revisados por um cientista
Cientistas devidamente treinados devem realizar a AEQ, snior experiente e compartilhados com os
e execut-la, tanto quanto possvel, de acordo com funcionrios do laboratrio, incluindo sucessos e
prticas laboratoriais normais. Uma vez que as amostras falhas, para permitir uma discusso completa.
da AEQ so normalmente fceis de serem identificadas,
existe a possibilidade de que estas sejam manejadas 2.3 Indicadores de qualidade
de forma que excede os procedimentos laboratoriais Os laboratrios devem considerar o estabelecimento de
normais, por exemplo: manipulao por funcionrios indicadores que reflitam a qualidade de seus resultados.
snior, repetio de testes, etc., devendo-se tomar Metas para tempos de resposta podem ser utilizadas
medidas para evitar que isso ocorra. para tentar reduzir o perodo entre o recebimento da
A AEQ proporciona vrios benefcios ao laboratrio: amostra e a entrega do resultado ao paciente.

Fornece aos funcionrios uma ideia sobre seu


desempenho dentro do laboratrio;

Permite comparar o desempenho entre laboratrios,


nacional e internacionalmente;

Melhora o nvel dos exames;

Identifica possveis problemas;

Demonstra a clientes, colegas e organismos


de certificao que h um compromisso com a
qualidade;

Educa os funcionrios, fornecendo uma melhor


compreenso do impacto de resultados incorretos.

Gesto de qualidade no laboratrio 15


4. Yao K et al. Improving quality management
O SGQ crucial para melhorar e manter a systems of laboratories in developing countries: an
preciso e reprodutibilidade dos resultados innovative training approach to accelerate laboratory
produzidos pelo laboratrio. accreditation. American Journal of Clinical
Todos os laboratrios devem se esforar para Pathology, 2010, 134(3):401409.
melhorar a qualidade e o trabalho, visando a
5. Westerman LE et al. A quality management systems
certificao.
approach to CD4 testing in resource-poor settings.
A estrutura organizacional e as reunies
American Journal of Clinical Pathology, 2010,
regulares dos funcionrios de diferentes nveis
134(4):556567.
so necessrias para revisar o sistema de
qualidade do laboratrio. 6. Fonjungo PN et al. Laboratory equipment
A avaliao e validao dos testes so maintenance: A critical bottleneck for strengthening
essenciais para fornecer uma base de health systems in sub-Saharan Africa. Journal of
evidncia antes que os testes sejam utilizados Public Health Policy, 2012, 33:3445.
no laboratrio.
A GQ engloba o CQ e a avaliao da qualidade.
Os laboratrios devem usar indicadores
para monitorar a qualidade dos seus testes
laboratoriais.

2.4 Referncias
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proficiency testing program for the HIV-1 BED
incidence assay. Journal of Clinical Microbiology,
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services are critical in global health: time to end
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2010, 134(3):368373.

16 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


Captulo 3

Micoplasmas genitais

3.1 Introduo em 20-50% (1-4). Por conseguinte, os ureaplasmas e


o M. hominis devem ser primariamente considerados
Micoplasma o nome comum para os membros da
comensais quando detectados no trato genital inferior.
classe Mollicutes. Os micoplasmas so bactrias
No entanto, esses micoplasmas so reconhecidos como
muito pequenas de vida livre, com tamanhos variando
a causa de doenas extragenitais em pacientes com
normalmente de 0,3 a 0,5 m. Elas no apresentam
deficincia de clulas B (hipo e agamaglobulinemia) e em
uma parede celular rgida, como outras bactrias, o que
prematuros (5).
torna essas ltimas resistentes penicilina e outros
antibiticos. O M. genitalium, o M. hominis e as duas O M. genitalium teve forte e uniforme associao com a
espcies de Ureaplasma, U. urealyticum (anteriormente uretrite no gonoccica (UNG) em mais de 30 estudos,
conhecido como U. urealyticum, biotipo 2) and U. parvum e foi detectado na uretra de 15-25% dos homens com
(anteriormente conhecido como U. urealyticum, biotipo 1) UNG sintomtica comparados a 5-10% daqueles que no
so encontrados comumente no trato urogenital humano. apresentavam a doena (1). Em estudos que avaliaram
importante esclarecer que antes de o U. urealyticum sua associao com a UNG no clamidial (UNGNC),
e o U. parvum serem reconhecidos como espcies essa associao mostrou-se normalmente mais forte,
diferentes, ambos eram designados como U. urealyticum, indicando que o M. genitalium e o C. trachomatis atuam
tornando difcil a interpretao dos resultados de estudos como causas separadas de UNG. Em vrios estudos,
prvios. A Tabela 3.1 apresenta as doenas associadas a o M. genitalium foi encontrado em mais de um tero
esses microrganismos. dos homens com UNGNC (1). Dentre as populaes
clnicas com doenas sexualmente transmissveis (DST),
O M. genitalium encontrado em 1-3% de homens e
aproximadamente 90% dos homens infectados por M.
mulheres sexualmente ativos, segundo estudos de base
genitalium apresentam sinais microscpicos de uretrite,
populacional. Os ureaplasmas podem ser encontrados
e praticamente trs em cada quatro homens infectados
no colo do tero ou na vagina de 40-80% de mulheres
reportam sintomas desse agravo (6, 7 ).
assintomticas, sexualmente ativas, e o M. hominis

Tabela 3.1: Doenas associadas aos micoplasmas urogenitais

Doenas associadasa
Vaginose Endometrite Nascimento Infertilidade Transmisso
Espcie Uretrite Cervicite bacteriana e/ou PID prematuro (mulheres) do HIV
M. genitalium ++++ +++ +++ +/ + +

M. hominis ++++ +/ +/ ND

Ureaplasmas
(no-diferenciados) +/ +++ ND + +/ ND

U. urealyticum + ND ND ND ND ND ND
U. parvum ND ND ND ND ND ND
ND: no determinado; PID: doena inflamatria plvica (do ingls pelvic inflammatory disease)
a
++++ associao forte, +++ associao na maioria dos estudos, + associao apenas em alguns estudos, +/ resultados conflitantes.

Microplasmas genitais 17
Vrios estudos clnicos mostraram uma forte correlao e sua presena em bipsias endometriais mostrou-se
entre o M. genitalium e UNG persistente ou recorrente, fortemente associada a endometrite histolgica, com
provavelmente devido ao tratamento microbiolgico doena inflamatria plvica (PID, do ingls pelvic
de baixa eficcia das tetraciclinas. O M. genitalium inflammatory disease) recorrente (13, 14). Cicatrizes
foi erradicado em menos de um tero dos pacientes tubrias tm sido indiretamente relacionadas infeco
infectados aps tratamento com doses-padro de por M. genitalium, uma vez que uma proporo
tetraciclinas (8). O M. genitalium foi encontrado em at significativamente alta de mulheres com infertilidade por
41% dos homens com uretrite persistente ou recorrente fator tubrio apresentam anticorpos contra a bactria
aps tratamento com doxiciclina (9, 10). quando comparadas a mulheres com infertilidade devida
a outras causas.
Mais recentemente, foi reportada falha no tratamento
com dose nica de 1g de azitromicina em 28% dos O M. genitalium foi detectado no fluido sinovial de um
homens positivos para M. genitalium com UNG e, na paciente com artrite reativa adquirida sexualmente
maioria dos pacientes, a falha estava correlacionada (SARA, do ingls sexually acquired reactive arthritis) (16)
com a resistncia aos macroldeos desenvolvida durante e experincias clnicas tm mostrado que a SARA no
o tratamento com dose nica (11). incomum aps uma UNG positiva para M. genitalium.
No entanto, no se apresentaram estudos sistemticos
Em contraste com a consistncia dos estudos
e a identificao de M. genitalium no fluido sinovial no
associando o M. genitalium a UNG, o papel dos
foi reproduzida. Demonstrou-se tambm que mulheres
ureaplasmas nessa doena controverso e no h
infectadas por HIV com elevados ttulos de M. genitalium
evidncias que suportem o papel do M. hominis como
eram mais propensas a disseminar o HIV (17 ), mas
causa de uretrite (5). Claramente, a identificao
apenas recentemente comprovou-se que a infeco por
de ureaplasma em um homem com UNG no indica
M. genitalium predispe infeco por HIV (18). No h
necessariamente que o microrganismo a causa da
indicaes de que o M. hominis ou ureaplasmas possam
doena, considerando a alta taxa de colonizao. Esse
desenvolver um papel similar.
o caso mesmo quando a cultura quantitativa aplicada.
Dessa forma, no se conhece a proporo exata de
O M. genitalium uma causa comum de uretrite
casos nos quais os ureaplasmas so responsveis pela
em homens e mulheres, e causa cervicite e
doena. A diviso dos ureaplasmas em duas espcies, U.
infeco no trato genital superior em mulheres.
urealyticum e U. parvum, levou a estudos sugerindo que
o U. urealyticum pode estar associado a UNG em homens O M. hominis e os ureaplasmas so comumente
jovens com poucos parceiros (12) ou quando presente encontrados em indivduos saudveis. Sua
em ttulos altos. Dessa forma, as culturas-padro associao com infeces urogenitais ainda
que no so capazes de discriminar as duas espcies precisa de provas conclusivas.
parecem ser de valor muito limitado.

O M. genitalium tem sido associado com a cervicite;


3.2 Viso geral dos mtodos disponveis para
porm, essa associao mais fraca que a existente
entre M. genitalium e uretrite masculina, possivelmente
o diagnstico de M. genitalium
devido s dificuldades e critrios diferentes utilizados Para fins prticos, o diagnstico de M. genitalium
no diagnstico de cervicite em mulheres (1). Entretanto, limitado ao teste de amplificao de cidos nucleicos
em uma srie de estudos, a associao mostrou-se to (NAAT, do ingls nucleic acid amplification test),
forte quanto a de C. trachomatis (7 ). Em estudos nos uma vez que a cultura extremamente lenta (vrios
quais foram descritos sinais de uretrite em mulheres, meses), desafiadora e de baixa sensibilidade (19). At o
esta foi significantemente associada a infeces por M. momento, nenhum ensaio sorolgico, ensaio de deteco
genitalium (1). de antgeno ou testes remotos provaram ser teis para o
diagnstico de infeces urogenitais por M. genitalium.
O M. genitalium foi detectado no endomtrio de 60%
das mulheres positivas para a infeco no colo do tero,

18 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


ou suas modificaes (25), mostrou-se altamente
O NAAT o nico mtodo prtico para o
reprodutvel e tem a vantagem de que o fragmento
diagnstico de M. genitalium.
amplificado pode ser sequenciado para um ensaio
de tipagem robusto. O gene do RNAr 16S tambm
3.3 Condies dos espcimes para coleta,
pode ser usado como alvo nas PCR do M. genitalium.
transporte e armazenamento
Entretanto, devido homologia entre M. genitalium e
A coleta de amostras deve ser realizada de acordo com M. pneumoniae, o desenho de iniciadores e sondas
o descrito para C. trachomatis (Captulo 5). As hastes e especficos e sensveis relativamente difcil.
meios para transporte no devem conter substncias
inibitrias de NAAT. tambm adequado que se use Para alguns ensaios de PCR para o gene do RNAr 16S,
um sistema de transporte compatvel com o ensaio de a deteco de M. genitalium baseia-se na amplificao
deteco de C. trachomatis, uma vez que a testagem com iniciadores universais para Mollicutes (micoplasma
desse organismo de mxima prioridade. Entretanto, e ureaplasma) e subsequente hibridizao com sondas
vale ressaltar que a carga microbiana de M. genitalium especficas para espcie. Embora essa abordagem
100 vezes menor que a de C. trachomatis (20); assim, permita a deteco de vrias espcies de micoplasma a
devem-se evitar os sistemas de transporte que diluem partir de uma mesma reao primria de amplificao,
o espcime desnecessariamente. Infelizmente, no h a competio, especialmente com a amplificao do
uma orientao clara quanto ao espcime ideal para a gene do RNAr 16S de ureaplasma, ir resultar em baixa
deteco de M. genitalium, uma vez que os materiais sensibilidade para a deteco do DNA de M. genitalium,
de coleta, os mtodos de preparao de amostras e que pode ser significativa mesmo quando este
os sistemas de deteco variam entre os estudos. Se encontrado em baixa quantidade (21, 23).
apenas um espcime de cada paciente for testado,
Vrios testes de PCR em tempo real foram desenvolvidos
acredita-se que o primeiro jato de urina, para homens, e
para M. genitalium (21). Embora a PCR convencional
hastes com secreo vaginal, para mulheres, contenham
otimizada possa apresentar a mesma sensibilidade
as maiores cargas microbianas.
que os ensaios em tempo real, esses ltimos so
menos propensos a contaminao. Dessa forma, a
3.4 Deteco de M. genitalium por NAAT
combinao de alta sensibilidade, especificidade,
A deteco por NAAT o nico mtodo vivel para solidez e risco reduzido de contaminao por produtos
a deteco de M. genitalium, mas nenhum dos de PCR, caracterstica desse tipo de ensaio, sugere
ensaios comerciais disponveis obteve a aprovao que a PCR em tempo real deve ser mantida como o
da Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados mtodo principal para o diagnstico de M. genitalium. A
Unidos da Amrica e, atualmente, a maioria recebeu quantificao do DNA de M. genitalium no parece ser
avaliaes muito limitadas em publicaes. A grande de muito valor para os diagnsticos de rotina.
parte dos ensaios de reao em cadeia da polimerase
(PCR, do ingls polymerase chain reaction) baseia-se Como uma alternativa PCR, o ensaio de amplificao
na deteco do gene da adesina MgPa do M. genitalium mediada por transcrio (TMA, do ingls transcription-
(21). No entanto, algumas partes do gene MgPa so mediated amplification) para o RNAr 16S tem sido
altamente variveis e iniciadores desenhados para essas disponibilizado somente para pesquisa (Gen-Probe,
regies no apresentaro um bom desempenho para So Diego, CA, EUA). A vantagem dessa abordagem
espcimes clnicos (21, 22). Embora possa ocorrer o a presena de mltiplas cpias de molculas de
no pareamento de uma nica base em vrias posies RNAr 16S por clula, levando a um provvel aumento
do iniciador senso em algumas cepas, o ensaio de PCR na sensibilidade da deteco em comparao com a
em tempo real para MgPa utilizando o sistema TaqMan, sensibilidade dos ensaios de PCR que tm como alvo
descrito por Jensen et al. (23), tem sido amplamente genes de cpias nicas. Esse ensaio TMA apresentou-se
utilizado em todo o mundo, gerando bons resultados. como um teste sensvel, especfico e de alto rendimento
Alm disso, a PCR convencional para MgPa, descrita para a deteco de M. genitalium, mas pouqussimos
como uma das primeiras PCR para M genitalium (24) estudos o realizaram para determinar se de fato ele
superior aos outros NAAT (26).

Microplasmas genitais 19
Na ausncia de um NAAT completamente validado mediadoras de resistncia tm sido utilizados em um
comercialmente, de mxima importncia que os nmero crescente de estudos e, em alguns pases, no
laboratrios que realizam o diagnstico de M. genitalium trabalho dirio de clnicas.
validem cuidadosamente e assegurem a qualidade
Vrios estudos clnicos mostraram que as tetraciclinas
de seus ensaios in-house; ver os Captulos 1 e 2 e o
so menos eficazes do que a azitromicina na erradicao
Anexo 3 sobre NAAT e sua garantia de qualidade e a
do M. genitalium (8) e, embora a CIM in vitro sugira que
validao de NAAT no aprovados. Em geral, a maioria
a espcie susceptvel tetraciclina, as experincias
dos ensaios multiplex exibe certa falta de sensibilidade
clnicas contradizem esse dado. Nenhum teste molecular
no diagnstico de M. genitalium, uma vez que esse
foi aplicado para detectar a resistncia tetraciclina. A
organismo est normalmente presente em nveis muito
resistncia de macroldeos foi documentada por meio
baixos, mesmo em pacientes sintomticos (20, 23).
do isolamento de cepas de M. genitalium de pacientes
apresentando falha teraputica com azitromicina
A preparao de amostras e a sensibilidade dos (28), demonstrando-se que as principais mutaes
ensaios devem ser ideais para a testagem do mediadoras de resistncia ocorrem na regio V do gene
M. genitalium, uma vez que esse patgeno est do RNAr 23S, principalmente a A2058G e A2059G
presente em concentraes 100 vezes menores (numerao de acordo com E. coli), mas uma srie de
que a de C. trachomatis. Muitos ensaios outras combinaes foram detectadas em espcimes
multiplex apresentam uma sensibilidade um de pacientes que no responderam terapia com
pouco menor que ensaios com um nico alvo. azitromicina.
Os NAAT para o gene MgPa de M. genitalium
devem ser cuidadosamente desenhados para Essas mutaes podem ser detectadas diretamente
evitar regies variveis do gene. em espcimes clnicos por meio do sequenciamento de
produtos de PCR, permitindo a gerao de informao
clnica til na ausncia de cultura. Alguns estudos
Consequentemente, devem ser feitos mximos esforos
demonstraram que o tratamento com dose nica de 1g
para otimizar a preparao das amostras, por meio
de azitromicina leva ao desenvolvimento de resistncia
do uso de centrifugao em alta velocidade, a fim de
ou seleo de variantes resistentes pr-existentes
concentrar o espcime e evitar a perda de DNA durante
(28, 29), e dados preliminares sugerem que o nvel
a extrao.
comunitrio de resistncia aos macroldeos em M.
3.5 Resistncia antimicrobiana e teste de genitalium altamente dependente do uso da dose
susceptibilidade do M. genitalium nica de 1g de azitromicina para o tratamento de
infeces por C. trachomatis. Isso ilustrado pela
O teste da susceptibilidade antimicrobiana do M.
baixa prevalncia de resistncia em pases que usam
genitalium muito complexo, sendo vivel somente
doxiciclina como droga primria para UNG, e por nveis
em laboratrios de referncia especializados. A
de resistncia que chegam a 100% na Groenlndia,
determinao da concentrao inibitria mnima
onde a azitromicina usada no tratamento de UNG e
(CIM) por diluio em caldo utilizando-se um inculo-
a prevalncia de C. trachomatis extremamente alta
padro empregada como o mtodo de referncia,
(30). A moxifloxacina demonstrou ser um tratamento de
mas a determinao da CIM do M. genitalium apenas
segunda gerao eficaz (31), mas algumas publicaes
pelo crescimento em cultura de clulas tambm j
do Japo sugerem que pode desenvolver-se a resistncia
foi aplicada com sucesso (27 ). A falha no tratamento
fluoroquinolona relacionada gatifloxacina (32) e que
de infeces por M. genitalium levou ao aumento
foram isoladas cepas com resistncia combinada de alto
da ateno dirigida resistncia nessa espcie. No
nvel a quinolonas e macroldeos (J. S. Jensen, dados
entanto, o M. genitalium cultivvel somente em poucos
no publicados, abril de 2013). Embora tenham sido
laboratrios no mundo, e uma vez que seu crescimento
encontradas mutaes em regies determinantes de
muito lento para permitir resultados significativos
resistncia a quinolonas, suas correlaes clnicas no
para o paciente, testes moleculares para as mutaes
foram estabelecidas.

20 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


trachomatis. Sexually Transmitted Infections, 2004,
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Microplasmas genitais 21
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25. Dutro SM et al. Development and performance


of a microwell-plate-based polymerase chain

22 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


Captulo 4

Gonorreia

4.1 Introduo A N. gonorrhoeae infecta apenas humanos, colonizando


superfcies de mucosa, constituindo o agente etiolgico
A gonorreia, causada pela Neisseria gonorrhoeae
das infeces do trato urogenital inferior uretrite
(gonococo), uma doena antiga, transmitida quase
em homens e cervicite em mulheres. A infeco
exclusivamente por contato sexual. Em 2008, de acordo
urogenital assintomtica ocorre em uma minoria dos
com estimativas da Organizao Mundial da Sade
homens, mas mais comum (pelo menos 50%) nas
(OMS), havia, globalmente, 106 milhes de novos
mulheres. A infeco do reto (proctite) e da faringe,
casos entre adultos. Isso coloca a gonorreia como a
comumente assintomtica, pode ocorrer em ambos
mais prevalente doena sexualmente transmissvel
os sexos, dependendo do comportamento sexual, mas
(DST) bacteriana, junto com a infeco por Chlamydia
predominantemente encontrada em homens que
trachomatis (tambm com 106 milhes de novos
fazem sexo com homens (HSH). Se no detectada e
casos) (1). Por conseguinte, a gonorreia, incluindo
no tratada ou tratada de forma imprpria, a infeco
suas complicaes severas, causa morbidade e custos
pode migrar para o trato genital superior e causar uma
econmicos substanciais, e mantm-se, mundialmente,
infeco gonoccica complicada (por exemplo, a doena
como um importante problema de sade pblica.
inflamatria plvica [PID, do ingls pelvic inflammatory
de grande preocupao o fato de essa bactria ter
disease], alm de sequelas relacionadas, como a
desenvolvido resistncia a praticamente todos os
gravidez ectpica e infertilidade) em mulheres, e, em
antibiticos introduzidos para o seu tratamento, e
homens, edema peniano e epididimite. Tambm pode
teme-se que a gonorreia possa se tornar no tratvel em
causar conjuntivite em adultos; porm, mais comumente,
certas circunstncias (2,3).
a infeco dos olhos se apresenta na forma de oftalmia
O gnero Neisseria contm duas principais espcies neonatal em recm-nascidos. A infeco gonoccica
patognicas a humanos, N. gonorrhoeae e N. disseminada (IGD), a qual uma entidade distinta e no
meningitidis, e, aproximadamente, 30 espcies no uma complicao, pode ocorrer em ambos os sexos,
patognicas, tais como N. lactamica, N. sicca, N. mas raramente encontrada. A Tabela 4.1 resume as
cinerea, N. flavescens, N. subflava e N. mucosa. Esses manifestaes clnicas das infeces gonoccicas.
organismos habitam predominantemente o trato
respiratrio superior como comensais, mas podem
ser esporadicamente encontrados no trato urogenital A N. gonorrhoeae causa a DST bacteriana
inferior. Os gonococos so Gram-negativos, aerbicos, globalmente mais comum (em 2008, foi to
capnoflicos (preferem concentraes aumentadas comum quanto a infeco por clamdia), a qual
[3-7%] de dixido de carbono [CO2]), no flagelados, inclui um espectro de doenas em diferentes
no esporulados e constituem cocos produtores de rgos, incluindo o trato urogenital, faringe,
oxidase e catalase, tipicamente dispostos em pares reto e conjuntiva.
(diplococos) com os lados cncavos adjacentes; isto ,
As complicaes e sequelas associadas
em microscopia, eles aparecem com a morfologia tpica
infeco por N. gonorrhoeae no tratada
de um rim ou gro de caf. A N. gonorrhoeae exigente
incluem PID, gravidez ectpica, infertilidade,
e requer meios de cultura complexos e nutricionalmente
edema peniano, epididimite e IGD.
enriquecidos para seu crescimento in vitro.

Gonorreia 23
4.2 Viso geral dos mtodos de diagnstico polimorfonucleares (LPMN) sensvel (95%) e especfico
disponveis (97%) para o diagnstico de gonorreia em homens
sintomticos com corrimento uretral. Em mulheres, no
A gonorreia frequentemente assintomtica,
entanto, o esfregao de secrees cervicais detecta
especialmente em mulheres, e quando ocorre na
apenas 40-60% de espcimes com cultura positiva,
faringe e no reto. Os sintomas, quando presentes,
o que pode refletir o baixo nmero de gonococos em
podem ser inespecficos (ver Tabela 4.1). Portanto,
mulheres. Resultados falso-positivos podem ocorrer
os procedimentos laboratoriais so necessrios para
e a especificidade (80-95%) depende da experincia
diagnstico, deteco de casos e teste para a avaliao
do microscopista. O exame microscpico direto no
da cura. O diagnstico de gonorreia estabelecido pela
recomendado para o diagnstico de infeces no
identificao de N. gonorrhoeae em secrees genitais e
reto ou faringe, devido ao grande nmero de outros
extragenitais.
organismos presentes e baixa sensibilidade. A triagem
A Tabela 4.2 resume os mtodos recomendados para o de indivduos assintomticos por microscopia no
diagnstico da gonorreia, assim como o desempenho e recomendada.
outras caractersticas desses mtodos.
Por muitas dcadas, a cultura de N. gonorrhoeae foi
Um esfregao para microscopia corretamente considerada o padro ouro para o diagnstico tanto
preparado com colorao de Gram para identificar da gonorreia genital quanto extragenital. A cultura,
diplococos Gram-negativos intracelulares em leuccitos em circunstncias otimizadas, sensvel, altamente

Tabela 4.1: Manifestaes clnicas de infeces gonoccicasa

Gonorreia descomplicadaa Gonorreia complicadab


Uretra Corrimento purulento, abundante Complicaes Edema peniano
Corrimento claro, escasso masculinas Abscesso nas glndulas de Tyson
Disria Abscesso nas glndulas de Cowper
Colo do tero Orifcio cervical frivel, avermelhado Vesiculite seminal
Corrimento purulento Epididimite
Disria Infertilidade (raro)
Salpingite Complicaes Endometrite
Desconforto abdominal inferior femininas Salpingite
unilateral ou bilateral Abscesso das glndulas de
Reto Secreo purulenta, abundante Bartholin
Dor pungente ou com queimao Linfagite
Tenesmo Abscesso tubo-ovariano
Sangue nas fezes Gravidez ectpica
Infertilidade
Faringe Faringite leve
Ligeira irritao na garganta Infeco Bacteremia
Eritema gonoccica Febre
disseminada Dermatite (leses na pele: macular,
Conjuntiva Secreo purulenta, abundante
(IGD) eritematosa, pustular, necrtica,
Ceratite e ulcerao da crnea;
hemorrgica)
perfurao, extruso do cristalino
Tenossinovite
Cicatriz, opacificao do cristalino
Articulaes; artrite sptica
Cegueira
Endocardite
Meningite
a
Como mencionado acima, a infeco gonoccica pode ser assintomtica, principalmente em mulheres, na faringe e reto.
b
Estudos epidemiolgicos e biolgicos forneceram evidncias fortes de que a gonorreia facilita significativamente a transmisso do HIV.

24 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


especfica, de baixo custo e, o mais importante, permite que permite testar a susceptibilidade antimicrobiana,
o teste de susceptibilidade antimicrobiana. A resistncia crucial manter e, quando necessrio, fortalecer a
antimicrobiana em gonococos um problema severo capacidade de realizar a cultura em todos os pases.
em todo o mundo e, como a cultura o nico mtodo

Tabela 4.2: Testes de diagnstico comuns (junho de 2012) para a deteco de N. gonorrhoeae

Microscopiaa Cultura NAAT


Tipos de espcime
Haste com secreo Sima Sim Sim
endocervical
Haste com secreo No Simb Sim (alguns ensaios)
vaginal
Urina
Feminina No No Simc
Masculina No No Sim
Haste com secreo Sima Sim Sim
uretral
Haste com amostra retal No Sim Nod
Haste com amostra da No Sim Nod
orofaringe
Haste com amostra da Sim Sim Nod
conjuntiva
Desempenho
Sensibilidadee Baixa-altaa Moderada-alta Muito alta
Especificidadee Moderada-altaa Muito alta Moderada-muito alta
Outras consideraes
Custos Baixo Moderado Alto-muito alto
Instrumentao Microscpio Microbiologia de rotina Grande infraestrutura
Rendimento/ Moderado/no Moderado/no Alto/possvel
automatizao
Complexidade tcnica Baixa Moderada Alta
Nvel de infraestrutura Perifrico Perifrico-intermedirio Intermedirio-central
do laboratrio
Mltiplos patgenos de No No C. trachomatis, T. vaginalis e HPV, em
uma mesma amostra algumas plataformas
Outros comentrios Coleta de amostra, trans- Os NAAT apresentam uma sensibilidade
porte e armazenamento superior quando comparados cultura,
rigorosos so cruciais para principalmente para amostras do reto
manter a viabilidade. e faringe. Entretanto, a especificidade
Esse o nico mtodo que pode ser abaixo da ideal, tornando-
permite o teste de suscep- se necessrio o uso de um NAAT
tibilidade antimicrobiana. suplementar confirmatrio.

Gonorreia 25
HPV: papilomavrus humano; NAAT: teste de amplificao de cidos nucleicos.
a
A microscopia apresenta uma alta sensibilidade e especificidade em homens sintomticos (com uretrite), baixa sensibilidade em homens
assintomticos e em infeces endocervicais, no sendo recomendada para espcimes vaginais, de urina, reto ou faringe.
b
No um espcime ideal, sendo aplicado principalmente em meninas impberes ou mulheres que realizaram histerectomia.
c
A urina no a amostra ideal para a deteco de N. gonorrhoeae em mulheres, devido baixa sensibilidade.
d
No h NAAT licenciado internacionalmente para o uso em amostras extragenitais, mas existem evidncias crescentes de que os NAAT so mais
sensveis para essas regies que a cultura. Recomenda-se que o NAAT positivo para espcimes do reto e da laringe sejam confirmados com um
teste confirmatrio (NAAT utilizando outra sequncia-alvo) para evitar resultados falso-positivos.
e
As estimativas de sensibilidade e especificidade variam amplamente, dependendo das diferentes sensibilidades e especificidades dos ensaios de
uma mesma metodologia, assim como em relao queles usados para comparao (o padro ouro).

Nas duas ltimas dcadas, os testes de amplificao


de cidos nucleicos (NAAT, do ingls nucleic acid A microscopia sensvel e especfica em
amplification test) foram desenvolvidos e introduzidos homens sintomticos com corrimento uretral.
para a deteco especfica do DNA/RNA da N.
A cultura, em circunstncias otimizadas,
gonorrhoeae. Esses testes so geralmente mais sensveis
sensvel, altamente especfica, de baixo
do que a cultura para o diagnstico da gonorreia,
custo e permite o teste de susceptibilidade
especialmente em amostras do reto e faringe (4-6).
antimicrobiana.
No entanto, a Administrao de Alimentos e Drogas
Os NAAT geralmente apresentam sensibilidade
dos Estados Unidos da Amrica (FDA, do ingls United
superior quando comparados cultura,
States of America Food and Drug Administration) ainda
principalmente para amostras do reto e
no aprovou nenhum NAAT comercialmente licenciado
faringe. Entretanto, a especificidade de vrios
para uso em espcimes do reto e faringe. Alm disso,
NAAT para gonococos abaixo da ideal para
a especificidade de vrios NAAT para gonococos
o diagnstico de amostras urogenitais e,
mostrou-se abaixo do ideal para o diagnstico de
em particular, amostras extragenitais, que
amostras urogenitais e, em particular, amostras
resultam em VPP baixos em populaes de
extragenitais, o que resulta em baixo valor preditivo
baixa prevalncia.
positivo, principalmente em populaes de baixa
prevalncia.

At o momento, no h ensaios de imunofluorescncia


direta, imunoensaios enzimticos ou testes 4.3 Coleta, transporte e armazenamento de
rpidos remotos para a deteco de antgeno espcimes
com caractersticas de desempenho apropriadas As regies anatmicas apropriadas para a coleta de
(sensibilidade e especificidade) ao diagnstico de espcimes dependem do sexo, idade e comportamento
gonorreia descomplicada ou complicada. Alm disso, no sexual do indivduo; das manifestaes clnicas; e do
h mtodos comerciais e internacionais aprovados para mtodo diagnstico, incluindo suas caractersticas
a deteco de anticorpos gonoccicos no soro, e esses de desempenho (sensibilidade e especificidade). Em
mtodos no podem diferenciar infeces atuais de mulheres, o canal endocervical o local primrio de
passadas. Estes no devem, ainda, ser utilizados devido coleta para a utilizao em cultura e microscopia; para
baixa sensibilidade e especificidade para o diagnstico o NAAT, colhe-se o material do canal endocervical ou
de gonorreia descomplicada e complicada em pacientes. vagina. Os lugares secundrios incluem a uretra, o reto e
a orofaringe. Em homens heterossexuais, os espcimes
Para um desempenho apropriado de todos os mtodos
para cultura e microscopia devem ser coletados da
de diagnstico, fundamental seguir precisamente os
uretra e, para o NAAT, uma amostra de urina. Em HSH
procedimentos operacionais padro, de acordo com as
e homens e mulheres com sinais clnicos indicativos e/
recomendaes do fabricante na coleta, transporte e
ou prtica sexual oral e/ou anal, amostras adicionais
armazenamento de amostras, assim como na execuo,
devem ser coletadas do reto e da faringe. Os NAAT
incluindo o controle de qualidade (CQ) do ensaio especfico.

26 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


apresentam maior sensibilidade para essas infeces snfise pbica e usar a mesma tcnica aplicada para
do que a cultura e podem aumentar a deteco de homens. No exame de mulheres, a cultura das duas
casos (4, 6), embora, como mencionado, no existam amostras, endocervical e da uretra, pode aumentar a
conjuntos de reagentes (kits) comerciais licenciados deteco de casos.
para uso nessas reas. Para a cultura, que requer
Vagina (somente para NAAT): a haste deve ser girada
organismos vivos, a amostra deve ser coletada em
contra a parede posterior da vagina por cinco segundos.
reas com clulas epiteliais colunares ou cuboides e, se
As hastes com secreo vaginal podem ser obtidas
o carvo no puder ser includo no meio de transporte
tanto pelo paciente quanto pelo mdico, com igual
no nutritivo, devem-se usar preferencialmente hastes
utilidade (7, 8).
com extremidades de dacron ou rayon, revestidas por
carvo estril. Para os diagnsticos utilizando NAAT, Primeiro jato de urina (somente para NAAT): o
devem-se seguir detalhadamente as recomendaes do paciente no precisa limpar a rea genital. Colete
fabricante quanto coleta, transporte e armazenamento 10-20mL do primeiro jato de urina em um coletor estril,
das amostras. O uso de antisspticos, analgsicos e no mnimo, uma hora depois que o paciente tiver urinado.
lubrificantes durante a coleta do espcime deve ser
evitado, uma vez que estes podem inibir os gonococos. Reto: insira 2-3cm de uma haste no reto, girando-a
Toda coleta de espcime deve ser realizada antes do contra a parede retal por 10 segundos. Se ocorrer
incio do tratamento antimicrobiano. contaminao por fezes, descarte a haste e use
outra para a obteno do espcime. Em pacientes
Endocrvice: insira 2-3cm de uma haste no orifcio sintomticos, espcimes anorretais devem ser obtidos
do colo do tero, girando-a, gentilmente, por 5-10 preferencialmente sob viso direta aps a insero de
segundos. Amostras endocervicais no devem ser um protoscpio.
coletadas em meninas impberes ou mulheres que
fizeram histerectomia; em vez disso, os espcimes Orofaringe: utilize uma haste para coletar a amostra da
so colhidos no vestbulo da vagina. Adicionalmente, regio da faringe posterior, acima da borda inferior do
amostras de urina tambm devem ser coletadas para o palato mole e das criptas tonsilares.
diagnstico por NAAT. Conjuntiva: recolha a plpebra inferior e mova uma
Uretra: os espcimes so coletados na uretra, no haste fina ao longo da superfcie da conjuntiva palpebral
mnimo uma hora aps o paciente ter urinado. Coleta-se inferior em direo ao canto mediano do olho.
a secreo diretamente em uma haste. Se no houver
4.4 Diagnstico presuntivo: microscopia
corrimento evidente, a uretra deve ser despida em
direo ao orifcio para extrair o exsudado. Se o 4.4.1 Preparao de lminas para colorao
exsudado no for obtido, insira 2-3cm de uma haste fina
Prepare o esfregao como descrito no Anexo 1
na uretra, girando-a, gentilmente, por 5-10 segundos.
(Microscopia). Fixe o esfregao seco por calor,
Em mulheres, deve-se massagear a uretra contra a
utilizando uma placa de aquecimento ou passando
trs vezes a lmina pela chama, mantendo a lamnula
voltada para cima. Evite superaquecer a lmina, uma
As condies de coleta, transporte e
vez que isso provoca a distoro das clulas. A lmina
armazenamento de espcimes pode variar de
deve estar apenas morna ao ser tocada com a parte de
acordo com o ensaio de deteco e pode ter
trs do punho.
uma influncia significativa na sensibilidade do
teste. Alm de ser simples e rpida, a microscopia aps a
colorao com azul de metileno (Figura 4.1) um mtodo
A seleo de espcimes e ensaios de deteco
confivel para o diagnstico de gonorreia em homens
apropriados crucial para o diagnstico
com uretrite purulenta (9). Entretanto, essa tcnica no
eficiente.
permite a diferenciao de cocos Gram-negativos e,

Gonorreia 27
portanto, apresenta baixa especificidade. A colorao Organismos extracelulares podem ser observados, mas,
de Gram para identificar diplococos Gram-negativos sozinhos, eles so insuficientes para o diagnstico,
intracelulares em LPMN o mtodo de escolha para o embora sejam usados algumas vezes para essa finalidade
diagnstico presuntivo de N. gonorrhoeae (Figura 4.2). quando em combinao com sintomas clnicos.

Figura 4.1 Figura 4.2


Microscopia da colorao de azul de metileno do Microscopia da colorao de Gram do exsudado
exsudado uretral masculino, mostrando diplococos uretral masculino, mostrando diplococos Gram-
intracelulares em LPMN (1000x). negativos intracelulares em LPMN (1000x).
Fonte: Reproduzido de Morse SA et al., eds. Atlas Fonte: Reproduzido de Morse SA et al., eds. Atlas
of sexually transmitted diseases and AIDS, 4th ed. of sexually transmitted diseases and AIDS, 4th ed.
Edinburgh, Saunders/Elsevier, 2010. Edinburgh, Saunders/Elsevier, 2010

Tabela 4.3: Coleta, transporte e armazenamento de amostras

Local Instrumento Procedimento de


anatmico de coleta amostragem Microscopia Cultura NAAT
Endocrvice Haste/plsticoa Use um espculo Gire uma fina Realize inoculao Coloque no
(ou escova vaginal e limpe o camada sobre a imediata em instrumento
endocervical ectocrvice. Insira lmina e deixe-a meio gonoccico de coleta do
ou conjunto 2-3cm de uma secar ao ar livre seletivo e incube fabricante.
de coleta haste e gire-a por (ver Anexo 1). imediatamente. Se a Transporte e
especfico 5-10 segundos. A sensibilidade coleta e inoculao no armazene de
para ensaio de para amostras puderem ser realizadas acordo com
NAAT). endocervicais no mesmo lugar, as instrues
abaixo da ideal. deve-se utilizar meio de de fabricante.
transporte gonoccico Se o meio de
no nutritivo ou transporte no for
nutritivo.b providenciado pelo
Espcimes em meio de fabricante, use
transporte no nutritivo meio de transporte
devem ser inoculados apropriado para
no laboratrio o mais estabilizar o cido
rpido possvel e, no nuclico, por
mximo, em 48 horas exemplo, tubos
(ver tambm seo GeneLock.
4.5).

28 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


Tabela 4.3: Coleta, transporte e armazenamento de amostras (continuao)

Local Instrumento Procedimento de


anatmico de coleta amostragem Microscopia Cultura NAAT
Uretra Haste/ Colete a secreo Gire uma fina Para o transporte e Para o transporte
(coletada aps alumnioc diretamente na camada sobre a armazenagem, ver e armazenagem,
1h aps (ou conjunto haste. Insira lmina e deixe-a cultura de amostras ver cultura
ltima urina) de coleta 2-3cm da haste secar ao ar livre endocervicais. de amostras
especfico na uretra e gire-a (ver Anexo 1). endocervicais para
para ensaio de gentilmente por NAAT.
NAAT). 5-10 segundos.
Vagina Haste/plsticoa A amostra pode NA Usada para meninas Para o transporte
(ou conjunto ser obtida por impberes ou mulheres e armazenagem,
de coleta mdicos ou pelo com histerectomia. ver cultura
especfico prprio paciente. Para o transporte e de amostras
para ensaio de Gire a haste contra armazenagem, ver endocervicais para
NAAT). a parede vaginal cultura de amostras NAAT.d
posterior por 5 endocervicais.
segundos.
Urina (coletada Copo para O paciente no NA NA Para o transporte
1 hora aps coleta de urina deve limpar a rea e armazenagem,
ltima urina) estril. genital. Colete o ver cultura
primeiro jato de de amostras
urina (em geral, endocervicais para
menos de 25mL). NAAT.
Reto Haste/plsticoa Insira 2-3 cm da NA Para o transporte e Para o transporte
(ou conjunto haste no reto e armazenagem, ver e armazenagem,
de coleta gire-a contra todas cultura de amostras ver cultura
especfico as paredes retais endocervicais. de amostras
para ensaio de por 10 segundos. endocervicais para
NAAT). NAAT.d
Orofaringe Haste/plsticoa Utilize uma haste NA Para o transporte e Para o transporte
(ou conjunto para coletar a armazenagem, ver e armazenagem,
de coleta amostra da regio cultura de amostras ver cultura
especfico da faringe posterior endocervicais. de amostras
para ensaio de e criptas tonsilares. endocervicais para
NAAT). NAAT.d

Gonorreia 29
Tabela 4.3: Coleta, transporte e armazenamento de amostras (continuao)

Local Instrumento Procedimento de


anatmico de coleta amostragem Microscopia Cultura NAAT
Conjuntiva Haste/ A secreo Gire uma fina Para o transporte e Para o transporte
alumnioc purulenta deve ser camada sobre a armazenagem, ver e armazenagem,
(ou conjunto removida com uma lmina e deixe-a cultura de amostras ver cultura
de coleta haste. Retraia a secar ao ar livre endocervicais. de amostras
especfico plpebra inferior. (ver Anexo 1). endocervicais para
para ensaio de Mova uma haste ao Principalmente NAAT.d
NAAT). longo da superfcie para neonatos.
da conjuntiva
palpebral inferior.
NA: no se aplica; NAAT: teste de amplificao de cidos nucleicos.
a
Hastes de plstico com extremidades de dacron ou rayon.
b
Deve-se utilizar o meio de transporte para N. gonorrhoeae no nutritivo apropriado, como o Amies ou Stuart (estocar a 4C antes do transporte),
ou o meio de transporte nutritivo (crescimento), como o Jembec, o Transgrow, o Gono-Pak ou o Sistema Intray GC (armazenar a 361C antes do
transporte).
c
Hastes de alumnio com extremidades de dacron ou rayon.
d
Ainda no h NAAT para amostras extragenitais de gonococos aprovado pela Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados Unidos da
Amrica (FDA, do ingls United States of America Food and Drug Administration); no entanto, para espcimes do reto e faringe, NAAT adequados
mostraram-se mais sensveis que a cultura (4-6), os quais podem ser teis caso haja dados de validao.

4.4.2 Procedimento de colorao de Gram 5. Contraste com safranina ou fucsina por um minuto.
1. Cubra o esfregao fixado com cristal de violeta por 6. Lave com gua corrente e seque suavemente com
30 segundos. Lave delicadamente com gua fria da um papel absorvente.
torneira.

2. Inunde a lmina com soluo de iodo por 30 4.4.3 Procedimento da colorao de azul de
segundos. Lave gentilmente com gua fria da metileno
torneira. 1. Cubra o esfregao com azul de metileno por 30-60
segundos.
3. Proceda descolorao com acetona, acetona-
etanol ou apenas etanol, at que a cor roxa pare 2. Lave com gua corrente e seque suavemente com
de ser liberada do esfregao. melhor segurar a um papel absorvente.
lmina utilizando uma luva, perto da gua corrente.
O tempo para descolorao depender do agente 4.4.4 Leitura do esfregao e interpretao
qumico utilizado e da espessura do esfregao Use um microscpio de luz e um leo de imerso de
ser menor (tipicamente alguns segundos) para a boa qualidade, examinando a lmina com uma objetiva
acetona e ir requerer maior tempo (at um minuto) de 100x (ocular de 10x). Os gonococos aparecem como
para o lcool. A descolorao excessiva deve ser diplococos Gram-negativos no interior dos LPMN.
evitada; caso contrrio, a bactria Gram-positiva Sempre descreva exatamente o que se v no esfregao:
aparecer como Gram-negativa. Desconsidere clulas epiteliais, LPMN, morfologia de bactrias e
as pores mais espessas de um esfregao no localizao intracelular e extracelular. Uma lmina deve
uniforme, as quais ainda podem liberar a cor azul. ser examinada por no mnimo dois minutos antes que se
conclua que esta no apresenta diplococos intracelulares
4. Lave rapidamente em gua corrente para parar a
Gram-negativos.
descolorao e seque o excesso de gua.

30 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


4.4.5 Controle de qualidade (CQ) da microscopia principalmente em espcimes de pacientes
utilizando-se esfregaos com colorao assintomticos que possuem um pequeno nmero
de Gram de organismos. Quando se estima que o tempo de
O CQ deve ser realizado em intervalos regulares, deslocamento ser superior a 48 horas, ideal utilizar
utilizando-se uma gama de bactrias com diferentes um meio de transporte nutritivo, (crescimento) que
reaes Gram e/ou espcimes-controle. Isso dever ser incorpore um meio de cultura e fornea uma atmosfera
feito sempre que se utilizar um novo lote de reagentes. com concentrao de CO2 aumentada. O mximo de
sobrevivncia e recuperao de gonococos a partir de
um meio de transporte no nutritivo obtido quando o
A microscopia sensvel e especfica em inoculado em meio de transporte de Stuart ou Amies
homens sintomticos com corrimento uretral. (ver Anexo 4) armazenado em um refrigerador a 2-8C
antes que o mesmo seja transportado para o laboratrio.
Entretanto, a microscopia apresenta uma
Esse meio retarda o crescimento de gonococos,
sensibilidade mais baixa em homens
prevenindo a perda da viabilidade. Em contrapartida,
assintomticos e em infeces endocervicais,
o mximo de sobrevivncia a partir de um meio de
no fornecendo um diagnstico definitivo para
transporte nutritivo (crescimento) obtido quando os
essas infeces.
espcimes so pr-incubados em um meio de transporte
A microscopia no recomendada para o a 361C durante a noite, antes do transporte para o
diagnstico de infeces no reto e na faringe. laboratrio; resultados aceitveis so obtidos se o tempo
de transporte no exceder dois dias (11).

4.5 Cultura e identificao de N. gonorrhoeae A viabilidade de uma cultura para o diagnstico de


(presuntivo e definitivo) gonorreia depende de uma srie de fatores:

Nmero de lugares de amostragem;


4.5.1 Transporte e cultura
A cultura continua sendo essencial para o teste de Tcnica e hastes utilizadas para a coleta dos
susceptibilidade antimicrobiana (ver seo 4.8). Os espcimes;
gonococos so altamente susceptveis s condies
Condies e durao do transporte;
ambientais (temperatura, dessecao, oxidao e
substncias txicas) e o transporte dos espcimes Composio e qualidade do meio de cultura;
da clnica para o laboratrio (Tabela 4.3) reduzir a
viabilidade dos organismos. Os espcimes inoculados Condies de inoculao e incubao;
diretamente em um meio de cultura seletivo nutritivo (ver Reagentes e tcnicas utilizadas para a identificao
abaixo) no consultrio mdico o mtodo ideal, mas caso da espcie N. gonorrhoeae.
isso no seja vivel, as hastes devem ser inseridas em
um meio de transporte no nutritivo, como o de Stuart A prevalncia das cepas gonoccicas susceptveis s
ou Amies (ver Anexo 4) ou inoculadas em um sistema concentraes de antibiticos, normalmente utilizadas
de transporte nutritivo (crescimento) como o Transgrow nos meios de cultura seletivos de gar, negligenciada na
(10, 11), o Jembec (10, 11), o Gono-Pak ou o Sistema maioria dos pases. Sendo assim, recomenda-se que os
InTray GC. Com a utilizao de um meio de transporte meios de cultura seletivos nutritivos, como o de Thayer-
no nutritivo, a taxa de isolamento aps o transporte Martin (13), o meio de Thayer-Martin modificado (MTM;
de espcimes na temperatura ambiente (20-25C) de ver Anexo 4) e o gar New York City (14) sejam utilizados
aproximadamente 100% no intervalo de seis horas e mais para o diagnstico de rotina de gonorreia. Se os recursos
de 90% em 12 horas. permitirem, para espcimes urogenitais, tambm ideal
que se utilize uma placa com meio de cultura no seletivo
Aps 48 horas, no entanto, o nmero de gonococos para cada amostra. Em algumas reas geogrficas, at
diminui e a recuperao pode no ser mais possvel,

Gonorreia 31
5% dos gonococos podem ser susceptveis a vancomicina (dependendo da cepa gonoccica e do meio de cultura;
usada em meio de cultura com concentrao de 3-4mg/L Figura 4.4). Aps a incubao adicional, as colnias
(15); dessa forma, recomenda-se o uso de suplementos podem atingir 3mm em dimetro e tornarem-se menos
seletivos com a concentrao de vancomicina suaves. Frequentemente, aparece na placa uma mistura
reduzida de 2mg/L ou com lincomicina (1mg/L), que de diferentes tipos de colnias.
menos inibitria para a bactria contaminante que a
vancomicina. Se as amostras do reto e da faringe so
testadas frequentemente, recomenda-se o uso de altos
nveis de concentrao de vancomicina.

4.5.2 Controle de qualidade (CQ) dos meios de


cultura
Cada lote de meio deve ser controlado quanto
esterilidade, habilidade de sustentar o crescimento de
gonococos e capacidade de inibir outros microrganismos
contaminantes. Para a avaliao da habilidade de
crescimento e o CQ de todos os mtodos diagnsticos,
as cepas de referncia de N. gonorrhoeae da OMS de
2008 (16) esto disponveis a partir de fontes da OMS
(ver seo 4.8.3.3). Para o controle da inibio de
microrganismos no gonoccicos, podem-se utilizar as Figura 4.3
Jarro de anaerobiose com vela para a incubao de
cepas de referncia de, por exemplo, Escherichia coli
placas de cultura de N. gonorrhoeae.
(ATCC 25922), Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228),
N. sicca (ATCC 9913) e Candida albicans (ATCC 14053).

4.5.3 Inoculao de cultura e incubao


Gire a haste contendo o espcime por, aproximadamente,
um quarto da superfcie da placa, preferencialmente
placas de Petri com um dimetro de 90mm. Use uma
ala bacteriolgica estril para espalhar o inculo na
parte remanescente do meio para garantir o crescimento
isolado de colnias. Alternativamente, o espcime pode
ser inoculado sobre toda a superfcie da placa em um
padro Z e, em seguida, com listras em direo borda;
isso pode gerar colnias mais isoladas. Incubar as placas
inoculadas imediatamente a 361C em uma atmosfera
mida (umidade de aproximadamente 70-80%) contendo
51% de CO2 (jarro de anaerobiose com vela com bola Figura 4.4
de algodo ou toalhas umedecidos [Figura 4.3], jarro Colnias tpicas de N. gonorrhoeae em meios de
com envelopes geradores de CO2 ou incubadores de CO2 cultura gonoccicos de gar seletivos (esquerda:
MTM) e no seletivos (direita: MTM sem antibiticos
com uma vasilha com gua ou outro equipamento para
adicionados), mostrando leve inibio de
aumentar a umidade). Examine as placas aps 18-24
crescimento pelos antibiticos seletivos.
horas e, se negativas, novamente aps 48 horas. Aps
Fonte: Reproduzido de Morse SA et al., eds. Atlas
24 horas de incubao, colnias tpicas podem variar of sexually transmitted diseases and AIDS, 4th ed.
em dimetro, de 0,5-1mm, e, em aparncia, de cinza a Edinburgh, Saunders/Elsevier, 2010.
brancas, transparentes a opacas e convexas a planas

32 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


4.5.4 Identificao presuntiva de N. gonorrhoeae amostras de pacientes de alto risco. Em situaes em
aps cultura que os recursos so limitados, isso suficiente para
A identificao presuntiva de colnias com aparncia que se inicie o tratamento. No entanto, para fornecer
de gonococos em um meio seletivo pode ser feita um diagnstico definitivo de gonorreia, necessrio
utilizando-se colorao de Gram (ver seo 4.4.2) e confirmar a identificao de N. gonorrhoeae por meio da
um teste de oxidase. O teste de oxidase detecta a eliminao de espcies intimamente relacionadas, como
presena de citocromo c oxidase; o teste melhor N. meningitis, N. lactamica e N. cinerea, que tambm
realizado ao esfregar algumas colnias diretamente podem crescer em meios seletivos para isolamento
em uma tira de papel-filtro umedecido com o reagente primrio de gonococos. Sugere-se sempre confirmar
(soluo aquosa a 1% de tetrametil para-fenilenodiamina a identificao de colnias Gram-negativas e oxidase-
dihidrocloreto), preparado tanto in-house quanto positivas de amostras extragenitais, uma vez que h
comercialmente (por exemplo, oxidase BACTIDROP). maior probabilidade de se isolar espcies de Neisseria
Um teste positivo muda a cor de transparente para em vez de N. gonorrhoeae nesses lugares, principalmente
roxo em poucos (mximo de 30) segundos (Figura 4.5). na faringe. Qualquer isolado gonoccico que ir ser
Alternativamente, o teste de oxidase pode ser realizado analisado subsequentemente, por exemplo, por teste de
colocando uma gota do reagente oxidase em poucas susceptibilidade antimicrobiana (ver seo 4.8) ou por
colnias representativas em um meio de cultura puro. determinao de tipos fenotpicos ou genticos, tambm
Deve-se tomar cuidado, uma vez que o reagente dever ter sua identificao confirmada.
toxico para a bactria e, se apenas poucas colnias
esto presentes, estas devem ser subcultivadas antes 4.5.5 Controle de qualidade (CQ) dos reagentes
do teste. A observao de diplococos Gram-negativos para o teste de oxidase
com colnias de morfologia tpica em um meio seletivo, O CQ deve ser realizado em intervalos regulares e sempre
oxidase-positivos, a partir de espcimes genitais, que se for utilizar um novo lote de reagentes. Podem-se
oferece uma identificao confivel e suficiente de N. usar as cepas de referncia oxidase-positivas, como N.
gonorrhoeae para o diagnstico presuntivo e altamente gonorrhoeae (cepa de referncia da OMS de 2008; 16), e
preditiva de N. gonorrhoeae quando os espcimes so negativas, como S. epidermidis (ATCC 12228) ou E. coli
cultivados em gar seletivo para gonococos, a partir de (ATCC 25922).

Figura 4.5
Colnias roxas oxidase-positivas de N. gonorrhoeae em uma placa de cultura (foto esquerda, placa de gar
direita) e papel-filtro ( direita, tambm mostrando uma reao negativa que permanece amarela), aps
reao com soluo aquosa a 1% de tetrametil para-fenilenodiamina dihidrocloreto.

Gonorreia 33
4.5.6 Confirmao da identificao de N.
gonorrhoeae aps cultura
Trs abordagens podem ser utilizadas para a
confirmao: o uso de testes bioqumicos que diferenciam
a Neisseria divergente e outras espcies intimamente
relacionadas e que fornecem uma identificao completa
das espcies; o uso de reagentes imunolgicos; ou o
uso de deteco molecular, que especfica para N.
gonorrhoeae, mas que apenas confirma a identidade de
N. gonorrhoeae e no determina a espcie de isolados
de reaes negativas. A escolha entre essas abordagens
depender do nmero de isolados a serem testados, sua Figura 4.6
especialidade e custos. Em laboratrios que identificam Produo de cido a partir da utilizao de
isolados gonoccicos com pouca frequncia, sugere-se carboidrato em meio gar cistena tripticase (ACT).
Os tubos da esquerda para a direita so meios
o uso de conjuntos de reagentes (kits) comerciais
base de ACT sem carboidrato, meio ACT contendo
disponveis para fornecer a identificao completa.
1% de glicose e meio ACT contendo 1% de maltose.
Em laboratrios que identificam muitos isolados, a N. O isolado bacteriano inoculado N. gonorrhoeae.
gonorrhoeae frequentemente confirmada por meio Fonte: Reproduzido de Morse SA et al., eds. Atlas
de reagentes especficos e, ento, se algum deles for of sexually transmitted diseases and AIDS, 4th ed.
inesperadamente negativo, dever ser testado em Edinburgh, Saunders/Elsevier, 2010.
seguida utilizando-se um conjunto bioqumico. Nenhum
teste 100% sensvel ou especfico; portanto, se
essencial que esse teste seja realizado utilizando-se
houver recursos, recomenda-se frequentemente que os
uma cultura pura; pode ser necessria pelo menos
isolados clnicos de N. gonorrhoeae sejam confirmados
uma subcultura, resultando em um maior tempo para a
por meio de uma combinao de testes bioqumicos e
confirmao da identificao em relao aos testes mais
imunolgicos (ou testes moleculares, quando disponveis).
rpidos descritos adiante.
Essa abordagem especialmente recomendada para os
laboratrios de referncia. O teste de utilizao rpida de carboidrato (RCUT,
do ingls rapid carbohydrate utilization test) (18, 19),
4.5.6.1 Testes que diferenciam as espcies de que depende de enzimas pr-formadas e no do seu
Neisseria crescimento, utilizando meio lquido inoculado com
Tradicionalmente, a habilidade de N. gonorrhoeae de colnias puras crescidas em abundncia, tambm
produzir cido a partir da utilizao de glicose, detectada eficiente, produzindo resultados em quatro horas.
pela mudana de cor de um indicador de pH devido ao
A deteco rpida de enzimas pr-formadas tambm
seu pH reduzido, em comparao, por exemplo, com
exige uma cultura pura (a qual deve sempre ser
N. meningitidis, que utiliza, adicionalmente, a maltose,
selecionada a partir de um meio no seletivo), mas
tem sido o principal mtodo de identificao desse
no requer incubao ao longo da noite para o teste
patgeno (Tabela 4.4). O nico padro de utilizao de
e fornece resultados mais rpidos. Para todos esses
carboidratos a deteco por meio de inoculao de
testes, importante seguir precisamente as instrues
culturas puras em gar cistena tripticase (ACT) contendo
do fabricante. Basicamente, esses testes detectam
glicose, maltose e sacarose, respectivamente, em uma
enzimas diferentes da via de aminopeptidase e
concentrao final de 1-2%, seguida por 24 horas de
incluem o Gonochek-II (E-Y Laboratories) (17, 19) e o
incubao (Figura 4.6; 17 ).
teste de enzima pr-formada (PET, do ingls preformed
enzyme test; Key Scientific) para Neisseria (17). O teste
Gonochek-II utilizado para diferenciar as espcies

34 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


Tabela 4.4: Utilizao de carboidratos (acar) e atividade enzimtica de diferentes espcies de Neisseria e
outras espcies oxidase-positivas como a Moraxella catarrhalis e Kingella denitrificans

Atividade bioqumica
Saccharose Frutose
Espcies Glicose Maltose Lactose (sacarose) (Levulose) ONPGa GGTb PIPc
N. gonorrhoeae + + ()
N. meningitidis + + + () (+)
N. lactamicad + + + + +
N. polysaccharead + + +/ +
N. cineread (+) +
N. subflavad,e + + +/ +/ +
N. sicca + + + + +
N. mucosa + + + + +
N. flavescens +
M. catarrhalis (+)
K. denitrificans + +
a
ONPG, orto-nitrofenil--galactosidase.
b
GGT, -glutamil-aminopeptidase (transferase).
c
PIP, prolyl aminopeptidase (hidroxiprolina aminopeptidase; HPA, prolina arilamidase; PRO)
N. lactamica normalmente cresce em meios seletivos para gonococos, mas tambm podem aparecer essas outras Neisseria saprfita no
d

patognicas.
e
Incluem os biotipos subflava, flava e perflava, os quais diferem em suas atividades contra sacarose e frutose.
+/-, no consistente para a espcie; + (-), maioria positiva, mas existem linhagens negativas; - (+),maioria negativa mas existem linhagens
positivas.

de Neisseria por meio da deteco de trs enzimas gonorrhoeae. Os testes PET para Neisseria funcionam
pr-formadas (Prolyl aminopeptidase [PIP, do ingls com um princpio similar, com pequenas variaes. Aps
prolyliminopeptidase], -glutamil-aminopeptidase e a incubao a 37C por 30 minutos, a mudana de cor
-galactosidase). ocorre de acordo com o descrito para Gonochek-II. Se
no houver colorao aps 30 minutos, uma gota do
Uma mudana para a cor azul indica que h hidrlise
reagente do PET adicionada e a cor registrada aps
do 5-bromo-4-cloro-3-indolil--galactosdeo pela
mais dois minutos.
-galactosidase, que indicativo de N. lactamica.
Uma cor amarela indica a hidrlise de -glutamil- importante observar que algumas espcies de Neisseria
paranitroanilida por -glutamil-aminopeptidase, que saprfitas, como N. cinerea, N. polysaccharea e N.
caracterstico de N. meningitidis. Na ausncia de subflava, podem aparecer em meios especializados
mudana de colorao, a tampa primria removida e para gonococos aps 24-48 horas de incubao; essas
substituda pela secundria, que apresenta um corante espcies apresentam PIP e, portanto, podem produzir
diazo (que um revelador de cor) e o tubo invertido. falso-positivos com o GONOchek-II e os kits de PET
Se a cor vermelha observada, isso indica a hidrlise para Neisseria. Falso-negativos tambm podem ocorrer
de L-prolina-4- metoxinaftilamida e a presena de com isolados de N. gonorrhoeae que no apresentam a
PIP, fornecendo uma identificao presuntiva de N. expresso de enzimas prolilaminopeptidase funcionais, e

Gonorreia 35
existe uma disseminao mundial de clones gonoccicos 4.5.6.2 Controle de qualidade (CQ) para ensaios
PIP-negativos (20). Isolados ocasionais de N. meningitidis bioqumicos de verificao de espcies
colhidos em locais urogenitais no apresentam Cada lote novo de ensaios disponveis comercialmente
-glutamil-aminopeptidase. ou de reagentes in-house deve passar pelo controle de
qualidade, utilizando-se cepas bacterianas de referncia
No se recomenda a verificao de espcies utilizando
apropriadas, como N. gonorrhoeae (cepa de referncia
apenas os testes de enzimas pr-formadas. Entretanto,
da OMS de 2008; 16), N. meningitidis (ATCC BAA-335),
uma combinao da utilizao de carboidratos e
N. lactamica (ATCC 23970), N. sicca (ATCC 9913) e N.
a deteco de enzimas pr-formadas, disponvel
cinerea (ATCC 14685). Alm disso, toda vez que se realiza
comercialmente em kits rpidos, fornece uma
o ensaio de confirmao de espcie, as mesmas cepas
identificao mais confivel.
de referncia devem ser includas como controle.
essencial que se sigam rigorosamente as instrues
Recentemente, a espectrometria de massa (EM) por
dos fabricantes para esses testes. O API NH (bioMerieux)
ionizao e dessoro a laser assistida por matriz
e o RapID NH (Remel) (17) so dois exemplos desses kits
tempo de vo (MALDI-TOF, do ingls matrix-assisted
que, infelizmente, podem ser muito onerosos para lugares
laser desorption ionization time of flight) comeou
com recursos limitados. Ambos contm substratos
a ser introduzida em laboratrios com bons recursos
desidratados em uma srie de cpulas ou poos, que so
para a verificao de espcies da maioria das
preenchidos com uma suspenso de colnias a serem
espcies bacterianas, incluindo as de Neisseria (21). O
identificadas; aps 2-4 horas de incubao a 37C, as
equipamento para esse mtodo sofisticado dispendioso.
reaes de colorao so registradas. Um nmero de
Entretanto, o custo para isolados com espcie verificada
perfil produzido e a identificao obtida por meio da
baixo e o mtodo fcil de ser realizado, alm de muito
comparao com um banco de dados (em papel ou pela
rpido. A EM MALDI-TOF parece distinguir efetivamente
internet). O API NH possui 10 poos (permitindo 13 testes
entre espcies de Neisseria comensais e patognicas,
de identificao), que incluem o teste de -lactamase,
alm de distinguir a N. meningitidis da N. gonorrhoeae.
quatro testes de utilizao de carboidrato e oito testes
No entanto, so necessrias avaliaes adicionais.
bioqumicos para diferentes reaes enzima-substrato
Quando o sistema EM MALDI-TOF utilizado para a
(Figura 4.7). O RapID NH consiste em duas cavidades
verificao de espcies de N. gonorrhoeae, importante
de carboidrato e 11 poos bioqumicos para diferentes
seguir precisamente as instrues do fabricante.
reaes enzima-substrato (ver as principais reaes para
distinguir as espcies de Neisseria na Tabela 4.4).

Figura 4.7
Conjunto de identificao API NH demonstrando o perfil de N. gonorrhoeae.

36 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


4.5.6.3 Testes especficos para N. gonorrhoeae esfregao fino de quatro ou cinco colnias emulsificado
A confirmao por testes especficos para N. gonorrhoeae em gua destilada sobre uma lmina de microscpio,
pode ser de base imunolgica ou molecular, sendo fixado e coberto com o reagente. Aps a incubao a
especialmente til em laboratrios que lidam com um 37C em uma cmara mida, a lmina lavada, seca, e
grande nmero de isolados para identificao e que ento examinada para verificar a presena de diplococos
podem pagar por esses testes relativamente mais verdes fluorescentes sob a objetiva de imerso de 100x,
onerosos. Tais ensaios so realizados diretamente em utilizando um microscpio fluorescente. Esse teste
colnias mediante placas de isolamento seletivas e no tambm era altamente sensvel e especfico e podia ser
exigem o uso de subculturas puras. Isso significa que um usado diretamente no meio primrio de isolamento, mas,
isolado pode ser identificado pelo menos 24 horas antes infelizmente, teve seu uso recentemente descontinuado.
do que os ensaios rpidos de carboidrato ou enzima
substrato.

O teste Phadebact Monoclonal GC (Boule) o conjunto


disponvel comercialmente mais popular (17, 19),
que contm uma mistura de anticorpos monoclonais
direcionados porina principal da membrana externa
PorB (Por). Esses anticorpos so absorvidos, por meio
do seu segmento Fc, pela protena A de Staphylococcus Figura 4.8
aureus e, quando misturados com o antgeno gonoccico, Reao de duas cepas de N. gonorrhoeae (A,
ocorre a aglutinao. O teste requer uma suspenso poos 1 e 2, e B, poos 5 e 6) com reagentes de
coaglutinao Phadebact WI (poos 1 e 5) e WII/III
leve do organismo a ser testado (aproximadamente uma
(poos 2 e 6).
densidade de 0,5 de acordo com a escala nefelomtrica
Fonte: Reproduzido de Morse SA et al., eds. Atlas
de McFarland; ver Anexo 4) feita no tampo do fabricante
of sexually transmitted diseases and AIDS, 4th ed.
ou em soluo salina tamponada com fosfato (PBS, do Edinburgh, Saunders/Elsevier, 2010.
ingls phosphate-buffered saline solution), estril a 0,9%,
que ento fervida por 10 minutos e esfriada antes do
seu uso. A suspenso deve ser fervida imediatamente O GonoGen II (17, 19) tambm emprega um painel
aps preparada, uma vez que atrasos resultaro em lise semelhante de anticorpos, mas, nesse teste, os
da bactria e liberao do DNA bacteriano, o que pode anticorpos monoclonais so adsorvidos em uma
causar auto-aglutinao e dificuldade na leitura do teste. suspenso de partculas sol-metlica. Quando a cultura
Uma gota da suspenso misturada por dois minutos emulsificada nesse tampo solubilizante, a membrana
a cada um dos dois reagentes, que permitem, alm da externa do organismo removida, liberando os
identificao, a determinao do sorogrupo em WI (IA; complexos contendo PorB na soluo. Esses complexos
PorB1a) e WII/III (IB; PorB1b) (Figura 4.8). O reagente PorB liberados so, ento, capturados por partculas de
de colorao azul, para auxiliar na leitura da reao anticorpo/sol-metlicas. A mistura amostra/reagente
de aglutinao. O teste apresenta alta sensibilidade filtrada por meio de um aparato de matriz especial; os
e especificidade, pois uma mistura de anticorpos complexos anticorpo/sol-metlicos de PorB so retidos
especficos (em vez de um nico anticorpo) a um antgeno pela matriz, resultando em um ponto vermelho. As
conservado. Falso-negativos no so habituais, mas partculas anticorpo/sol-metlicas que no se ligaram ao
podem ocorrer. PorB iro passar pela matriz fornecendo um resultado
negativo (que varia de branco a rosa-claro).
O reagente imunofluorescente MicroTrak do teste de
confirmao de cultura de N. gonorrhoeae (Trinity
Biotech) (16, 17) usa um conjunto similar de anticorpos
monoclonais a PorB, mas ligado fluorescena. Um

Gonorreia 37
4.5.6.4 Controle de qualidade (CQ) de testes testes moleculares desenvolvidos foram os ensaios
imunolgicos de identificao de hibridizao de cidos nucleicos no amplificados
Cada lote novo de ensaios disponveis comercialmente (NAH, do ingls non-amplified nucleic acid hybridization
ou de reagentes in-house deve passar pelo controle assays), como o PACE 2 (Gen-Probe) e Captura Hbrida
de qualidade, utilizando-se cepas de referncia de N. 2 (CH2) CT/NG (Digene Corporation). Os ensaios NAH
gonorrhoeae para controles positivos de ambos os baseiam-se na ligao de sondas especficas a cidos
sorogrupos WI (IA, PorB1a; por exemplo, a cepa G de nucleicos complementares e subsequente amplificao
referncia da OMS de 2008; 16) e WII/III (IB, PorB1b; por do sinal para detectar a ligao. No entanto, os ensaios
exemplo, a cepa K de referncia da OMS de 2008; 16) NAH so substancialmente menos sensveis que os
e controles negativos de outras espcies intimamente NAAT e no devem ser usados para diagnstico quando
relacionadas (por exemplo, N. lactamica, ATCC 23970). os NAAT estiverem disponveis.
Alm disso, cepas de referncia idnticas devem ser
Atualmente, os NAAT so usados principalmente para a
includas todas as vezes que o mtodo for executado.
deteco de N. gonorrhoeae. Os NAAT para gonococos
A confirmao molecular da identidade do patgeno detectam uma regio do DNA ou do RNAr especfica
pode ser realizada utilizando os NAAT descritos na seo para N. gonorrhoeae, e essa regio varia entre os
4.6, o que, todavia, mais provavelmente aplicvel aos diferentes kits (ver Tabela 4.5). A sequncia-alvo
laboratrios de referncia. amplificada utilizando uma variedade de mtodos (Tabela
4.5) para produzir mltiplas cpias, que podem ser
facilmente detectadas. Para informaes bsicas sobre
A cultura sensvel e altamente especfica em os ensaios NAH e as diferentes tecnologias para NAAT,
circunstncias otimizadas, relativamente de ver Anexo 3 e Captulo 5 (C. trachomatis). Os NAAT
baixo custo e fornece organismos viveis para o para gonococos so altamente sensveis e especficos
teste de susceptibilidade antimicrobiana. (mas a especificidade varia substancialmente entre os
Devido ao elevado nvel de resistncia NAAT) e podem ser usados com espcimes coletados
antimicrobiana em gonococos no mundo, de forma no invasiva (por exemplo, urina, para homens,
essencial que se mantenha e, em vrios lugares, e hastes com secreo vaginal, para mulheres). Isso
que se fortalea a capacidade de realizao de permite no apenas um nmero maior de pacientes
culturas para permitir a vigilncia da resistncia atendidos nas clnicas ou postos de cuidados primrios
antimicrobiana. de sade, mas tambm fornece os pr-requisitos
para uma triagem efetiva. Os NAAT, normalmente,
Para uma cultura sensvel e especfica,
podem ser realizados em um dia til, fornecendo uma
necessrio otimizar e garantir a qualidade da
resposta mais rpida que a cultura (mnimo de 2-3 dias)
coleta, transporte e armazenamento de amostras
e podem ser frequentemente usados em combinao
e metodologia de cultura.
com a automao, permitindo um alto rendimento.
A sensibilidade dos NAAT frequentemente citada
4.6 Deteco molecular como sendo maior que a da cultura, o que reflete uma
maior tolerncia a inadequaes nos processos de
4.6.1 Introduo e ensaios moleculares coleta, transporte e armazenamento de amostras. As
A deteco molecular de sequncias especficas dos desvantagens em utilizar os NAAT para a deteco
cidos nucleicos (DNA/RNA) de N. gonorrhoeae mais de N. gonorrhoeae incluem o custo de equipamentos
comumente realizada utilizando-se kits disponveis e reagentes, a atual ausncia de NAAT comercial
comercialmente para a deteco tanto de N. gonorrhoeae licenciado para espcimes extragenitais, a incapacidade
como C. trachomatis no mesmo conjunto, algumas vezes de realizar o teste de susceptibilidade antimicrobiana e
simultaneamente, o que frequentemente apresenta a especificidade abaixo do ideal de alguns ensaios NAAT
pouco ou nenhum custo adicional direto. Os primeiros (ver sees 4.6.2-4). Apesar dessas desvantagens, o uso

38 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


de NAAT apropriados, ademais da cultura (para o teste 4.6.2 Tipos de espcimes para NAAT para N.
de susceptibilidade antimicrobiana), deve ser motivado gonorrhoeae
mesmo para lugares com poucos recursos. Tal pode ser Diferentes tipos de espcimes podem ser usados nos
facilitado pela criao e apoio de laboratrios regionais NAAT, incluindo os de coleta invasiva, como espcimes
de referncia que forneam servios de diagnstico de Papanicolau (Pap) lquidos, hastes com secrees
utilizando esses mtodos. Os laboratrios regionais de cervicais e hastes com secrees da uretra (homens);
referncia oferecem muitas vantagens, como o maior e no invasivos, como hastes com secrees vaginais
volume de testes realizados, adeso rigorosa a boas e urina (homens e mulheres). Entretanto, os diferentes
prticas laboratoriais e melhoria na especializao fabricantes produzem NAAT que so licenciados para
tcnica. O uso de laboratrios regionais pode reduzir o tipos de espcimes distintos, sendo, portanto, essencial
custo ao se utilizarem ensaios de maior sensibilidade verificar as instrues do fabricante ou conduzir uma
e resulta em tempos de resposta equivalentes ou extensiva validao de testes in-house. Deve-se notar
reduzidos. que a urina no uma amostra ideal para a deteco de
N. gonorrhoeae em mulheres, devido sua sensibilidade
Os NAAT geralmente oferecem maior reduzida (22). essencial que se sigam precisamente
sensibilidade, especialmente para amostras do as instrues do fabricante referentes s amostras
reto e da faringe (embora no sejam licenciados); aprovadas; coleta, transporte e armazenamento de
so normalmente muito especficos e podem ser amostras; e ao desempenho do NAAT.
utilizados em amostras coletadas de forma no
invasiva. No existem NAAT licenciados para uso em amostras
extragenitais (do reto e faringe), mas h fortes evidncias
Os ensaios moleculares so mais tolerantes a de que os NAAT so mais sensveis para esses locais
inadequaes na coleta, transporte e condies de do que a cultura (4-6). A validao de dados existe para
armazenamento, alm de serem objetivos. apoiar o seu uso, mas se recomenda que um exame
A especificidade de muitos NAAT para gonococos positivo, em ambos os lugares, seja confirmado por
inferior ideal (ver sees 4.6.2-4), o que um teste suplementar (um NAAT com outra sequncia-
resulta em VPP baixo em populaes de baixa alvo) para prevenir resultados falso-positivos (23, 24).
prevalncia; NAAT suplementares que tenham A escolha do NAAT para espcimes da faringe deve ser
como alvo outras sequncias podem ser feita com cautela para evitar aqueles que apresentam
necessrios para confirmao. reao cruzada com espcies comensais de Neisseria ou
N. meningitidis.
Se os NAAT aprovados internacionalmente no
podem ser utilizados, altamente recomendado 4.6.3 Especificidade dos NAAT para N.
que a efetividade do NAAT proposto para uso gonorrhoeae
local seja estritamente validada antes que Historicamente, h uma preocupao quanto
o teste seja usado, e que a qualidade seja especificidade do alvo escolhido, uma vez que as
garantida contra pelo menos um NAAT aprovado espcies do gnero Neisseria so intimamente
internacionalmente. relacionadas geneticamente, e um grande nmero de
Neisseria comensais encontrado na faringe, reto e,
Novos ensaios NAAT esto sendo rapidamente algumas vezes, no trato genital inferior. A identificao
disponibilizados e no podem ser antecipados nesse da sequncia-alvo especfica para N. gonorrhoeae tem
documento. importante que se acesse constantemente sido um desafio, e a reao cruzada com vrias espcies
a literatura relevante para a avaliao de alta qualidade de Neisseria no gonoccicas foi descrita para alguns
dos novos ensaios, a fim de determinar o que melhor se kits, incluindo N. meningitidis, N. cinerea, N. flavescens,
enquadra a cada laboratrio. N. lactamica, N. sicca e N. subflava (22-28). A gerao
mais recente de kits atualmente disponveis no mercado

Gonorreia 39
Tabela 4.5: NAAT aprovados pela Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados Unidos da Amrica (FDA)
para a deteco de N. gonorrhoeae (junho de 2012)
APTIMA Tempo
Probetec GC
Teste Combo 2 Cobas Amplicor Cobas 4800 Probetec ET real CT/
Qx
(AC2) NG
Becton, Becton,
Fabricante Gen-Probe Roche Roche Abbott
Dickinson Dickinson

PivNg
Gene da DNA
Regio (homlogo Pili (regio
metiltransferase
Alvo RNAr 16S Repetida da protena diferente da Opa genes
citosina-
Direta 9 (DR9) inversora de Probetec ET)
especfica
pili)

Amplificao Amplificao
mediada por Reao em por
transcrio cadeia da deslocamento
(TMA, polimerase PCR em de cadeia PCR em
Tecnologia SDA
do ingls (PCR, do ingls tempo real (SDA, do tempo real
transcription- polymerase ingls strand
mediated chain reaction) displacement
amplification amplification)

Sim
Teste
(diferentes
suplementar No No No No No
regies do
disponvel
RNAr 16S)

tem melhorado muito quanto a esse quesito, o qual, Deve-se notar que, mesmo quando a sensibilidade e a
entretanto, ainda permanece como um fator a ser especificidade de um NAAT acima de 95%, o VPP em
considerado na seleo de kits apropriados para o tipo uma populao de tanto 1% quanto 5% ainda , para
de espcime a ser testado, uma vez que nem todos os a maioria dos NAAT, menor que 90%, enquanto que,
NAAT para gonorreia so iguais nesse ponto (26-28). em uma prevalncia de 10%, o VPP da maioria (mas
no todos) dos NAAT maior que 90%. Esse aspecto
4.6.4 Sensibilidade, especificidade e particularmente importante para NAAT duplos que
prevalncia: os efeitos no valor preditivo detectam tanto N. gonorrhoeae como C. trachomatis,
positivo (VPP) porque a prevalncia entre essas duas infeces pode
A prevalncia de gonorreia na populao a ser testada diferir acentuadamente. Em muitos pases, as infeces
deve ser considerada juntamente com a sensibilidade por clamdia so comumente detectadas em uma
e especificidade do NAAT a ser usado, uma vez que prevalncia consideravelmente maior que a da gonorreia
isso afetar o VPP do teste e, desse modo, o nmero e os algoritmos para testar as duas infeces juntas
de falso-positivos obtidos. Tal demonstrado na Tabela talvez no precisem de um teste suplementar para a
4.6. Um VPP de >90% (usando um NAAT simples ou um deteco de C. trachomatis, mas pode ser necessrio
NAAT de triagem alm de um NAAT suplementar com que os exames positivos para gonorreia sejam testados
alvo diferente) foi sugerido como requisito mnimo ao se por um segundo NAAT (com outra sequncia-alvo) para a
utilizar um NAAT para a deteco de N. gonorrhoeae. obteno de VPP aceitveis.

40 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


4.6.5. NAAT no aprovados pela Administrao Tabela 4.6: Efeitos da prevalncia no valor preditivo
de Alimentos e Drogas dos Estados positivo (VPP) de testes simples
Unidos da Amrica (FDA) Testes A B C
Testes de amplificao de cidos nucleicos in-house que Sensibilidade 97,8% 96,4% 98,0%
utilizam como alvo, por exemplo, o gene cppB, gene da Especificidade 99,2% 97,9% 99,7%
DNA metiltransferase citosina-especfica (DMC), genes Prevalncia de 93% 84% 97%
10%
opa e o pseudogene porA, foram descritos (24, 29-32)
VPP Prevalncia de 87% 73% 95%
e so extensivamente utilizados em alguns pases. 5%
Os de maior xito so aqueles que tm como alvo o Prevalncia de 55% 35% 77%
1%
pseudogene porA e os genes opa, tanto separados como
em combinao. O pseudogene porA ausente nas
espcies de Neisseria comensais (sendo o gene porA em Europeia e/ou nacionais, devem fornecer garantias
N. meningitidis bastante diferente) e, consequentemente, da qualidade e desempenho do NAAT diagnstico.
esse alvo mostrou-se altamente especfico para N. altamente recomendado que somente os NAAT
gonorrhoeae. Entretanto, muitos pases recentemente aprovados internacionalmente sejam utilizados.
descreveram isolados raros de N. gonorrhoeae contendo Se isso no for possvel, essencial que o NAAT
um porA meningoccico no lugar do pseudogene porA proposto seja rigorosamente validado para as
gonoccico, resultando em NAAT com resultados necessidades locais contra, pelo menos, um NAAT
falso-negativos (33-36). Os NAAT que apresentam aprovado internacionalmente, antes de ser utilizado
como alvo o gene cppB podem variar em sensibilidade e subsequentemente usado com controles positivo,
e especificidade, uma vez que alguns isolados de N. negativo e de inibio adequados, assim como para fins
gonorrhoeae no carregam esse gene; reciprocamente, de participao de um sistema de avaliao externa da
algumas cepas de N. meningitidis tambm no o qualidade (AEQ) apropriado.
apresentam e geram reao cruzada. Alm disso, os
NAAT que tm como alvo os genes DMC podem mostrar 4.6.6 Controle de qualidade (CQ) e avaliao da
reao cruzada com espcies de Neisseria comensais. qualidade (AQ) dos NAAT
Consequentemente, os NAAT para os genes cppB e O controle interno da qualidade (CIQ) deve ser includo
DMC no so recomendados. Os NAAT in-house podem em cada teste rodado. A avaliao interna da qualidade
necessitar maior conhecimento tcnico; no entanto, (AIQ) deve ser realizada regularmente por meio de
costumam ter sensibilidade e especificidade altas, novos testes em amostras cujo resultado original seja
alm de envolver menor custo, podendo constituir uma velado. O nmero e a frequncia dessas AIQ dependero
opo eficiente, principalmente, para nmeros pequenos do nmero total de testes realizados; um exemplo
de amostras. Tambm foram desenvolvidos ensaios de 1-5% do total testado a cada ms. A AIQ pode ser
de reao em cadeia da polimerase multiplex que alcanada por meio do uso de painis de espcimes de
detectam, por exemplo, N. gonorrhoeae, C. trachomatis, fornecedores de AIQ apropriados, tais como o Servio
Mycoplasma genitalium, e Trichomonasis vaginalis; no Nacional de Avaliao Externa da Qualidade do Reino
entanto, esses testes necessitam de maior avaliao Unido (UK NEQAS, do ingls United Kingdom National
concernente s suas caractersticas de desempenho. External Quality Assessment Service; www.ukneqas.
org.uk), ou o Controle de Qualidade dos Diagnsticos
Consequentemente, existem, no mundo, muitos Moleculares (QCMD, do ingls Quality Control of
NAAT disponveis comercialmente ou desenvolvidos Molecular Diagnostics; www.qcmd.org), os quais
internamente para N. gonorrhoeae sendo utilizados. entregam espcimes para vrios pases, ou por meio de
Se qualquer NAAT no aprovado pela FDA for utilizado, trocas mais informais de amostras entre laboratrios.
processos regulatrios regionais, como os da Unio

Gonorreia 41
4.7 Testes point-of-care (POC) (testes Durante a dcada passada, a susceptibilidade s
rpidos) cefalosporinas de amplo espectro tambm diminuiu em
muitas regies do mundo, e a falha teraputica com
Nenhum teste POC (teste rpido) est disponvel
cefixima foi igualmente observada em vrios pases
para a deteco de antgeno com caractersticas de
(39-44). Recentemente, identificou-se a primeira cepa
desempenho apropriadas, por exemplo, sensibilidade
gonoccica amplamente resistente a drogas (XDR, do
e especificidade; dessa forma, nenhum deles pode
ingls extensively-drug resistant; 2) com ndice elevado
ser recomendado para o diagnstico de gonorreia
de resistncia tambm ceftriaxona (a ltima opo
complicada ou descomplicada. No entanto, alguns testes
disponvel para o tratamento emprico de primeira
POC novos, utilizando tecnologia recente, esto sendo
gerao) (3, 43). Se as cepas resistentes ceftriaxona
desenvolvidos e, com caractersticas de desempenho
se espalharem pelo mundo, a gonorreia no ser mais
apropriadas, seriam extremamente teis para o
tratvel com regimes antimicrobianos simples em
diagnstico rpido no local, por exemplo, em clnicas
algumas circunstncias e, especialmente, em alguns
ou em campo. Em populaes recursos limitados e alta
lugares (2). Consequentemente, o monitoramento local,
prevalncia da infeco, principalmente, a diminuio da
regional e global da susceptibilidade antimicrobiana da
sensibilidade pode ser aceitvel em vista da possibilidade
N. gonorrhoeae crucial. A OMS revisou e reformulou
de testar e tratar enquanto o paciente estiver no local do
o Programa de Vigilncia da Susceptibilidade
atendimento (37, 38). Os testes POC podem tambm ser
Antimicrobiana Gonoccica (GASP; do ingls Gonococcal
utilizados nesses lugares para aumentar a especificidade
Antimicrobial Susceptibility Surveillance Programme)
dos algoritmos de gesto sindrmica, o que reduzir o
Global da OMS. Para mais informaes sobre a
tratamento em excesso e encontrar muitas infeces
vigilncia essencial da resistncia antimicrobiana no
assintomticas, principalmente em mulheres. Para o
mundo e sobre o GASP Global da OMS, ver os Padres
diagnstico de gonorreia em homens, a microscopia
de Vigilncia da OMS para Resistncia Gonoccica
aps a colorao de Gram um tipo de teste POC;
Antimicrobiana, Apndice 4. Em junho de 2012, a OMS
entretanto, esse mtodo no apresenta sensibilidade
tambm divulgou o plano de ao global da OMS para
adequada para mulheres.
o controle da disperso e do impacto da resistncia
antimicrobiana em Neisseria gonorrhoeae (disponvel
Nenhum teste POC com sensibilidade apropriada
em: www.who.int/ reproductivehealth/publications/
est disponvel; dessa forma, nenhum pode ser
rtis/9789241503501/en/).
recomendado para o diagnstico de gonorreia.
O mtodo de diluio em gar recomendado como
Entretanto, alguns testes POC novos, utilizando
o padro ouro para o teste da susceptibilidade
tecnologia avanada, esto sendo desenvolvidos e,
antimicrobiana ou para a determinao da concentrao
com caractersticas de desempenho apropriadas,
mnima inibitria (CMI; em g/mL ou mg/L) de isolados
seriam extremamente teis para o diagnstico
gonoccicos para drogas antimicrobianas. Entretanto,
rpido e tratamento imediato do paciente.
esse mtodo pode ser trabalhoso e menos adequado para
a testagem de susceptibilidade de rotina, principalmente
4.8 Teste de susceptibilidade antimicrobiana
se for realizado em um pequeno nmero de cepas. Dessa
4.8.1 Introduo forma, o mtodo-padro e de qualidade garantida, o
A N. gonorrhoeae desenvolveu resistncia a todos os Etest, intimamente relacionado ao mtodo de diluio
antibiticos prvios de primeira gerao para o seu em gar, comumente utilizado. Uma determinao
tratamento como, por exemplo, penicilina, tetraciclina qualitativa da susceptibilidade antimicrobiana pode
e fluoroquinolonas , deixando apenas as cefalosporinas ser obtida usando um ensaio de disco-difuso.
de amplo espectro, ceftriaxona e cefixima, como os Vrios mtodos de disco-difuso tambm esto em
nicos antibiticos recomendados para o tratamento uso; entretanto, eles exigem uma padronizao bem
de infeces gonoccicas em muitos pases (2). estabelecida e CQ apropriado para atingir um alto nvel
de reprodutibilidade e interpretao correta, a fim de

42 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


refletir adequadamente os valores de CMI dos diferentes 4.8.2 Escolha dos antibiticos inclusos no teste
agentes antimicrobianos. Os mtodos de disco-difuso de susceptibilidade antimicrobiana
tm baixo custo, mas apenas so recomendados quando A lista de antibiticos a serem testados deve incluir
a determinao da CMI no pode ser realizada, devido drogas recomendadas nacional e regionalmente,
limitao de recursos ou outros motivos. Se o mtodo utilizadas para o tratamento de infeces gonoccicas,
de disco-difuso for utilizado, recomenda-se que a bem como as drogas recomendadas pelo programa
identificao de qualquer resistncia nova, emergente local de vigilncia susceptibilidade antimicrobiana. No
ou rara seja confirmada pela determinao da CMI. A entanto, principalmente nos laboratrios de referncia,
produo de -lactamase normalmente determinada antibiticos adicionais podem ser testados, tais como
por um teste de cefalosporina cromognica, utilizando antibiticos recomendados para tratamento em outros
discos ou solues de nitrocefina. lugares, antibiticos candidatos para tratamentos futuros
e drogas teis para estudos longitudinais locais de N.
Todos os mtodos para o teste de susceptibilidade
gonorrhoeae.
antimicrobiana devem ser realizados a partir de culturas
puras e frescas (18-24 horas) de N. gonorrhoeae,
4.8.3 Determinao da CMI (diluio em gar e
retiradas de um meio de cultura no seletivo. O isolado
Etest)
tambm deve ser verificado apropriadamente quanto
espcie e subcultivado pelo menos uma vez. No teste 4.8.3.1 Meios de gar recomendados
de susceptibilidade antimicrobiana, importante seguir
O meio recomendado para a determinao da CMI dos
precisamente todos os passos do mtodo escolhido,
diferentes antibiticos, usando diluio em gar ou
incluindo a seleo e o uso do meio gar, os reagentes
Etest, para isolados de N. gonorrhoeae, um meio gar
(p antimicrobiano, tiras para Etest, discos e tampes), a
base GC apropriado, a exemplo do meio base GC Difco,
inoculao, a incubao e a interpretao.
acrescido de um suplemento de crescimento definido a
1%* ou IsovitaleX/Vitox a 1%. Como um exemplo, ver o
Devido ao elevado nvel de resistncia
meio GCVIT descrito no Anexo 4.
antimicrobiana em gonococos no mundo e ao receio
de que a gonorreia possa se tornar no tratvel em *De acordo com o Instituto de Padres Clnicos e
certas circunstncias e, principalmente em alguns Laboratoriais (CLSI, do ingls Clinical and Laboratory
lugares, essencial monitorar a susceptibilidade Standards Institute; 45): 1,1g de L-cistena; 0,03g de
antimicrobiana de N. gonorrhoeae. guanina HCL; 3mg de tiamina HCl; 13mg de cido
para-aminobenzoico (PABA); 0,01g de B12; 0,1g de
A determinao da CMI realizada pelo mtodo de
cocarboxilase; 0,25g de NAD; 1g de adenina; 10g de
diluio em gar ou Etest.
L-glutamina; 100g de glucose e 0,02g de nitrato frrico
Uma determinao qualitativa da susceptibilidade (em 1L de H2O). O suplemento de crescimento sem
antimicrobiana pode ser obtida usando mtodos de cistena necessrio para os testes de diluio em gar
disco-difuso. com carbapenmicos e clavulanato.

Os mtodos de disco-difuso necessitam de


4.8.3.2 Critrios de interpretao
padronizao e CQ apropriados e, sobretudo,
Os critrios de interpretao para susceptibilidade,
no medem, mas apenas refletem a CMI. Esses
susceptibilidade intermediria (reduzida) e resistncia
mtodos s devem ser utilizados quando a
recomendados mediante a determinao da CMI esto
determinao da CMI no pode ser realizada em
descritos na Tabela 4.7. Esses critrios so do CLSI (45),
razo, por exemplo, de limitaes de recursos.
com exceo do critrio para azitromicina (para o qual
Em todos os testes de susceptibilidade o CLSI (45) no postulou nenhum critrio), que pertence
antimicrobiana, essencial seguir precisamente ao Comit Europeu para o Teste a Susceptibilidade
o mtodo escolhido, o qual deve ser devidamente Antimicrobiana (EUCAST, do ingls European Committee
padronizado, validado e com qualidade garantida.

Gonorreia 43
on Antimicrobial Susceptibility Testing; www.eucast. antimicrobiana para N. gonorrhoeae; em geral,
org). O EUCAST outra organizao que postula critrios seus pontos crticos so levemente inferiores aos
de interpretao para os testes de susceptibilidade recomendados pela CLSI.

Tabela 4.7: Critrios de interpretao da CMI para categorizar a N. gonorrhoeae em categorias de


susceptibilidade de acordo com a CLSI, com exceo do critrio para a azitromicina, da EUCAST

CMI (mg/L)
Antibiticos Susceptibilidade
Susceptvel (S) Resistente (R)
intermediria (I)
Ceftriaxona 0,25 ASDa ASDa

Cefotaxima 0,5 ASDa ASDa

Cefixima 0,25 ASDa ASDa

Cefpodoxima 0,5 ASDa ASDa

Benzilpenicilina 0,06 0,12-1 2

Ciprofloxacina 0,06 0,12-0,5 1

Ofloxacina 0,25 0,5-1 2

Espectinomicina 32 64 128

Azitromicinab 0,25 0,5 1c

CMI: concentrao mnima inibitria.


a
ASD: a ser determinado. Devido ausncia de um nmero adequado de cepas resistentes e correlaes baseadas em evidncia entre a CMI dos
isolados e o resultado do tratamento, os pontos crticos ainda no podem ser determinados.
b
O CLSI (45) ainda no postulou os pontos crticos para a azitromicina e, consequentemente, so fornecidos os pontos crticos do Comit Europeu
para o Teste Susceptibilidade Antimicrobiana (EUCAST, do ingls European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing; www.eucast.org).
c
Nas Amricas do Norte e do Sul, um ponto crtico de resistncia de 2mg/L frequentemente usado, de acordo com a recomendao dos Centros
de Controle e Preveno de Doenas dos Estados Unidos da Amrica (www.cdc.gov/std/GISP2007/).

4.8.3.3 Controle de qualidade (CQ) para a determinao de NCTC 13477-13484, e na Coleo de Culturas da
da CMI (diluio em gar e Etest) Universidade de Gotemburgo, Sucia (CCUG; www.
Idealmente, uma seleo apropriada da cepa de ccug.se), denominadas de CCUG 57595-57602. As
referncia de N. gonorrhoeae da OMS de 2008 cepas de referncia de N. gonorrhoeae da OMS de
(16) deveria ser includa em cada lote de teste de 2008 (16) tambm podem ser utilizadas para o CQ em
susceptibilidade, e sempre que um novo lote de outros testes laboratoriais fenotpicos e de gentica
antibitico em p, meio gar ou tiras de Etest so para N. gonorrhoeae, bem como nos sistemas de AEQ.
usados. A CMI de cada antibitico e a cepa de referncia Os Padres de Vigilncia da OMS para Resistncia
devem ser documentadas em um grfico de CQ. Para Gonoccica Antimicrobiana, Apndice 4, descrevem em
os valores de CMI aceitveis de diferentes antibiticos detalhes as aplicaes das cepas de referncia de N.
no CQ, ver Tabela 4.8. As cepas de referncia de N. gonorrhoeae da OMS de 2008 (16) e as instrues para
gonorrhoeae da OMS de 2008 (16) tambm esto seu uso. No entanto, no necessrio utilizar todas
disponveis na Coleo Nacional de Culturas Tipo (NCTC, as oito cepas de referncia de N. gonorrhoeae da OMS
do ingls National Collection of Type Cultures; www. de 2008 (16) para o CQ no teste de susceptibilidade
hpacultures.org.uk/collections/nctc.jsp), denominadas antimicrobiana. Muitos locais utilizam principalmente a

44 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


WHO G, WHO K, WHO M, WHO O e a WHO P. O painel 4.8.4 Mtodo de diluio em gar para a
de N. gonorrhoeae da OMS de 2008, o painel original determinao da CMI
(cepas A-E) e as cepas de referncia adicionais de N.
4.8.4.1 Introduo
gonorrhoeae tambm esto disponveis em fontes da
OMS, tais como o Centro de Colaborao da OMS para O mtodo de diluio em gar recomendado
HIV e DST, Sidney, Austrlia, e o Centro de Colaborao como padro ouro para o teste quantitativo de
da OMS para Gonorreia e outras DST, rebro, Sucia. susceptibilidade antimicrobiana ou determinao da
CMI de isolados gonoccicos a antibiticos. Agentes
antimicrobianos so incorporados em gar base GC

Tabela 4.8: Intervalos aceitveis da CMI, categorizao da susceptibilidade antimicrobiana (modificado da


referncia 16) e algumas caractersticas adicionais de determinao de tipo para as cepas de referncia de
N. gonorrhoeae da OMS de 2008 recomendadas para CQ. Incluem-se os intervalos aceitveis da CMI para N.
gonorrhoeae ATCC 49226 recomendados pela CLSI

Agentes Cepas de referncia da OMS ATCC


antimicrobianos
WHO F WHO G WHO K WHO L WHO M WHO N WHO O WHO P 49226a
(mg/L)
0,125
0,016 0,251,0 1,04,0 1,04,0 4,016,0 4,016,0
Penicilina G 0,064 (S) (I) (R) (R) (R) (R)
>32 (R) 0,5 0,251,0
(I)
0,125 <0,016
<0,016 <0,016 0,251,0 <0,016 <0,016 <0,016 0,004
Cefixima (S) (S) (SR)b
0,5
(S) (S)
0,032
(S) 0,032
(SR)b (S)
0,004 0,032 0,064 0,008 0,002 0,016 0,002
<0,002 0,004
Ceftriaxona (S)
0,016 0,125 0,25 0,032 0,008 0,064 0,008
0,016
(S) (SR)b (SR)b (S) (S) (S) (S)

0,25 0,5 0,5 1,0 0,5 0,251,0 0,5 2,0 1,0


Eritromicina 1,0 (S) 2,0 (I) 2,0 (I) 4,0 (I) 2,0 (I) (S) 2,0 (I) 8,0 (R) 2,0c

0,125 0,125
0,064 0,125 0,25 0,1250,5 0,064 1,0 0,5
Azitromicina 0,25 (S)
0,5
0,5 (S) 1,0 (I) (S) 0,25 (S)
0,5
4,0 (R) 1,0c
(S) (S)
0,002
0,002 0,064 1,04,0 2,08,0 0,004 0,001
Ciprofloxacina 0,008 (S) 0,25 (I)
>32 (R) >32 (R)
(R) (R) 0,016 (S)
0,008
0,008
(S)

1664 832 >1024 832


Espectinomicina (S) (S)
832 (S) 832 (S) 832 (S) 832 (S)
(R) (S)
8,032,0

Produo de
No No No No Sim Sim Sim No No
-lactamase
Sorotipo Arst Arst Bpyust Brpyust Bpyust Arst Boys Bopt

NG-MASTd ST3303 ST621 ST1424 ST1422 ST3304 ST556 ST495 ST3305

PIP-negativoe No Sim No No No Sim No No

Note-se que as CMI exatas mostradas devem ser usadas e interpretadas com cautela, pois foram definidas utilizando-se apenas um mtodo Etest
especfico e, consequentemente, podem diferir ao se utilizarem outros mtodos. Entretanto, os fentipos de resistncia identificados (categorizao
SIR) devem ser consistentes entre os diferentes mtodos.
a
Intervalos aceitveis da CMI (CLSI; 45).
b
SR: susceptibilidade reduzida, pois os isolados com essas CMI apresentam os determinantes primrios para resistncia s cefalosporinas de
amplo espectro.
c
Intervalo estabelecido pelo Laboratrio Nacional de Microbiologia, Canad.
d
Determinao do tipo de sequncias de mltiplos antgenos de N. gonorrhoeae.
e
No produz a enzima prolilaminopeptidase (PIP, do ingls prolyliminopeptidase), o que pode resultar na identificao duvidosa ou falso-negativa
de espcies de N. gonorrhoeae utilizando alguns testes bioqumicos ou de enzima-substrato (17, 20).

Gonorreia 45
acrescido de suplemento de crescimento definido a 1% Por exemplo, prepare solues-estoque por meio da
ou IsovitaleX/Vitox a 1% (ver seo 4.8.3.1) em diluies dissoluo de 128mg ou o peso equivalente a 128mg do
seriadas duplicadas. Os isolados de N. gonorrhoeae a ingrediente ativo em uma quantidade mnima do solvente
serem testados crescem ao longo da noite em meio apropriado (normalmente 5-10mL; siga precisamente
gar GC no seletivo, sendo posteriormente suspensos as instrues do fabricante), diluindo-as em seguida
em caldo Mueller-Hinton (MH) ou soluo salina estril com gua destilada (ou outro solvente recomendado)
(ou equivalente). Aproximadamente 104 unidades para o volume exato de 25mL. Essas solues-estoque
formadoras de colnias (UFC) so, ento, inoculadas contm o produto antimicrobiano a uma concentrao
na superfcie do meio contendo o antibitico e em de 5120mg/L, que prtica para preparar as solues
duas placas com meio controle sem antibitico, com com as quais de fato se trabalhar. Caso no haja
o repicador de Steer, o inoculador mltiplo ou uma contra indicaes pelo fabricante, os solventes listados
ala calibrada. As placas so finalmente incubadas ao na Tabela 4.9 podem ser utilizados para a preparao
longo da noite e subsequentemente examinadas quanto das solues-estoque. As solues-estoque podem
ao seu crescimento. A CMI do agente antimicrobiano ser esterilizadas por membrana de filtrao (filtro
para um isolado a concentrao mais baixa que inibe de 0,22m) e armazenadas em alquotas em tubos
seu crescimento. A tcnica de diluio em gar por devidamente selados a -20C ou, preferencialmente, a
pontos crticos uma modificao do mtodo completo -70C, por at seis meses. Quando descongeladas, as
de diluio em gar para a CMI, que um mtodo solues devem ser usadas imediatamente, no devendo
similar, mas com meio gar contendo apenas uma ou ser congeladas novamente para uso posterior.
duas concentraes de antibiticos, que podem ser
Para uso subsequente, prepare uma srie de diluies
usadas para categorizar os isolados como resistentes
dobradas para cada antibitico contendo concentraes
(usando uma placa de gar contendo exatamente a
do agente antimicrobiano 10 vezes maior que a
concentrao do ponto crtico para resistncia) ou com
concentrao final a ser obtida no gar. Um exemplo de
susceptibilidade intermediria (usando uma placa de
esquema padronizado para a preparao de diluies
gar contendo exatamente a concentrao do ponto
com as quais se trabalhar mostrado na Tabela 4.10.
crtico para susceptibilidade intermediria). A tcnica
de ponto crtico til para triar um grande nmero de O intervalo de concentraes utilizado no teste de
isolados. susceptibilidade antimicrobiana deve ser adaptado a
cada antibitico e aos nveis de resistncia local. Para
4.8.4.2 Preparo de solues antimicrobianas muitos antibiticos, existe uma grande variao no
Os ps ou pastilhas antimicrobianos prprios para padro de susceptibilidade dos isolados gonoccicos
serem dissolvidos devem ser obtidos diretamente de de diferentes pases. Para se diminuir o nmero de
companhias farmacuticas ou outros fornecedores concentraes a serem testadas, necessrio haver
validados. Uma vez que a maioria dos antibiticos no uma aproximao da variao da susceptibilidade local
so 100% puros, a concentrao incorporada nas aos antibiticos testados. Caso seja desconhecida,
placas de gar deve basear-se na atividade ou potncia essa aproximao pode ser obtida por meio da
(droga ativa por mg) do antibitico, como especificado determinao dos limites inferior e superior do intervalo
pelo fabricante. As instrues do fabricante quanto de susceptibilidade desses antibiticos a um pequeno
dissoluo do p antimicrobiano, a data de expirao e nmero de isolados. Em geral, mais relevante e
as instrues para armazenamento devem ser seguidas importante conhecer o limite superior dos valores da CMI
detalhamente. Os antibiticos so incorporados ao meio do que o inferior.
gar em dissolues dobradas, por exemplo, usando um
esquema no qual uma parte da soluo do antibitico 4.8.4.3 Preparo de placas para o mtodo de diluio
adicionada para nove partes de gar (ver seo 4.8.4.3). em gar
Para cada antibitico e concentrao de antibitico a ser
testada, prepare um volume de, por exemplo, 89mL de

46 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


gar base GC adequado, tais como o meio base Difco estoque as placas invertidas em sacos plsticos selados,
GC (3,6 g de gar base GC e 89mL de gua destilada), a 4C, at que sejam utilizadas. Nessas condies, no
em uma garrafa de vidro, que servir para a preparao h perda significativa da atividade antimicrobiana por at
de quatro placas. Autoclave o meio gar na garrafa e, duas semanas. Entretanto, para penicilina, que menos
ento, deixe esfriar a at uma temperatura de 50C estvel, recomenda-se que as placas sejam usadas em
em banho-maria, antes de adicionar assepticamente uma semana. Da mesma forma, placas com gar sem
suplementos estreis (1mL de suplemento/IsoVitalex/ antibiticos devem ser preparadas para ser utilizadas
Vitox) e 10mL de soluo antimicrobiana pronta para como controle negativo.
ser utilizada, isto , na concentrao a ser testada
(ver Tabela 4.10). Imediatamente, misture de forma 4.8.4.4 Procedimento da determinao da CMI
gentil, invertendo a garrafa trs vezes; remova a tampa utilizando diluio em gar
da garrafa, passe o bocal pela chama e derrame, Preparao do inculo bacteriano: use uma ala ou
aproximadamente, 20-25mL do meio nas placas uma haste estril para coletar a N. gonorrhoeae a partir
(90mm de dimetro) para formar uma camada de de uma cultura pura de 18-24 horas em um meio gar
aproximadamente 3,5-4,5mm. Certifique-se de eliminar no seletivo para gonococos, e prepare uma suspenso
as bolhas, movendo as placas gentilmente ou flambando homogeneizada de clulas (equivalente a 0,5 no padro
rapidamente a superfcie do gar, por exemplo, com o nefelomtrico de McFarland, aproximadamente 108 UFC
auxlio da chama de um bico de Bunsen. Uma vez que por mL) em 1mL de caldo MH ou soluo salina estril
o gar esteja solidificado em temperatura ambiente, (a soluo deve ser usada em no mximo 15 minutos).
Dilua em 1:10 a suspenso em caldo MH ou soluo
Tabela 4.9: Solventes usados na preparao de
salina estril para obter 107UFC/mL. Cuidadosamente,
solues antimicrobianas para a determinao da
CMI, utilizando o mtodo de diluio em gara transfira 0,5mL de cada suspenso para o repicador
correspondente ou para o poo do inoculador mltiplo.
Antibitico Solvente
Inoculao de placas: as placas de gar devem secar
Ceftriaxona gua destilada antes da inoculao, isto , devem ser colocadas em
uma incubadora na posio invertida com a tampa
Cefixima Tampo fosfato a 0,1mol/L aberta. O repicador ou o inoculador mltiplo deve
Benzilpenicilina gua destilada transferir aproximadamente 1-2L de cada suspenso
para a superfcie do gar em reas circulares com
Ciprofloxacina gua ou HCL a 0,1mol/L dimetros de 5-7mm, resultando em um inculo
Etanol a 95% ou cido actico bacteriano final de aproximadamente 104 UFC por local.
Azitromicina glacialb Ao testar um pequeno nmero de isolados, pode-se
Etanol a 95% ou cido actico
Eritromicina utilizar uma ala plstica estril de 1L. Inocule
glacialb
primeiramente uma placa de controle negativo (no
Espectinomicina gua destilada
contendo antibitico), seguindo com a srie de placas
Gentamicina gua destilada contendo concentraes diferentes de antibitico,
comeando com a de menor concentrao de cada
Canamicina gua destilada
antibitico.
Tetraciclina gua destilada
Finalmente, inocule uma segunda placa de controle
Cloranfenicol Etanol a 95% negativo para garantir que no houve contaminao
a
Se o solvente ou o mtodo para a dissoluo do antibitico em p
durante a inoculao. As cepas de referncia de N.
fornecido pelo fabricante, siga precisamente as instrues includas. gonorrhoeae da OMS de 2008 (16) so recomendadas
b
Para o cido actico glacial, use gua destilada para a metade do como CQ (ver Tabela 4.8). Deixe o inculo secar e incube
volume e adicionar o cido actico glacial gota a gota, at que este se
dissolva; no exceder 2,5L/mL. as placas invertidas por 20-24 horas a 361C em uma
atmosfera enriquecida com CO2 a 51% com umidade

Gonorreia 47
Tabela 4.10: Preparo de diluies dos agentes antimicrobianos para a determinao da CMI, utilizando o
mtodo de diluio em gar

Soluo antimicrobiana Concentrao da Concentrao


Volume
diluio com a final na diluio
Passo Concentrao Volume de gua =
Fonte + qual se trabalhar de 1:10 em gar
(mg/L) (mL) destilada
(mg/L) (mg/L)
1 5120 Estoque 1
2 5120 Estoque 1 1 2560 256
3 5120 Estoque 1 3 1280 128
4 5120 Estoque 1 7 640 64
5 640 Passo 4 1 1 320 32
6 640 Passo 4 1 3 160 16
7 640 Passo 4 1 7 80 8
8 80 Passo 7 1 1 40 4
9 80 Passo 7 1 3 20 2
10 80 Passo 7 1 7 10 1
11 10 Passo 10 1 1 5 0,5
12 10 Passo 10 1 3 2,5 0,25
13 10 Passo 10 1 7 1,25 0,125
14 1,25 Passo 13 1 1 0,625 0,06
15 1,25 Passo 13 1 3 0,3125 0,03
16 1,25 Passo 13 1 7 0,156 0,016
17 0,156 Passo 16 1 1 0,08 0,008
18 0,156 Passo 16 1 3 0,04 0,004
19 0,156 Passo 16 1 7 0,02 0,002

Figura 4.9
Resultados da determinao da CMI para N. gonorrhoeae usando o mtodo de diluio em gar. O meio
contendo 0,5mg/L de penicilina (placa esquerda) mostra a inibio de vrias cepas gonoccicas, enquanto
todas as cepas crescem satisfatoriamente no meio controle (placa a direita).

48 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


alta (70-80%). Esterilize os alfinetes e poos: envolva-os 2. Deixe que as tiras do Etest alcancem a temperatura
em papel alumnio e os autoclave, colocando-os em ambiente por aproximadamente 30 minutos. Um
forno quente a 160C por duas horas ou mergulhando-os pacote de Etest aberto dever ser armazenado em
em etanol a 70%; em seguida, passe-os pela chama. um recipiente hermtico com dessecante.

Leitura dos resultados: os resultados das cepas 3. Use uma ala ou uma haste estril para coletar
de referncia da OMS de 2008 (ver Tabela 4.8 para a N. gonorrhoeae a partir de uma cultura pura
valores aceitveis da CMI de diferentes antibiticos) e de 18-24 horas em um meio gar no seletivo
as placas de controle negativo (deve haver crescimento para gonococos e prepare uma suspenso
puro e aderente de gonococos em ambas as placas) homogeneizada de clulas (0,5 no padro
devem ser revisados e aprovados antes de se ler os nefelomtrico de McFarland, aproximadamente 108
outros resultados. Se no forem aprovados, verificar os UFC por mL) em 1mL de soluo salina estril ou
possveis problemas e repetir o teste. Para os isolados PBS (a suspenso deve ser usada em no mximo 15
testados, registre a CMI como a menor concentrao minutos). No use um caldo nutritivo para preparar
de agente antimicrobiano que inibe completamente o a suspenso.
crescimento.
4. Mergulhe uma haste estril na suspenso e remova
Interpretao de resultados: interprete os o excesso de fluido, pressionando e girando a haste
resultados para os isolados testados em categorias de contra a parede do tubo.
susceptibilidade (ver Tabela 4.7).
5. Passe a haste por toda a superfcie do gar da
placa com GCVIT, uniformemente, em trs direes
4.8.5 Mtodo Etest para a determinao da CMI
(Figura 4.10) para produzir uma camada aderente.
4.8.5.1 Introduo
6. Recoloque a tampa da placa e deixe a superfcie de
O Etest uma tcnica quantitativa para a determinao
gar secar por aproximadamente 10 minutos.
da CMI de agentes antimicrobianos contra
microrganismos. O Etest utiliza tiras plsticas calibradas 7. Pressione o aplicador do Etest em uma tira do Etest
com uma escala de CMI em g/mL (mg/L) e um para colet-la (ou use uma pina estril), coloque-a
cdigo para identificar o agente antimicrobiano. Um na superfcie do gar e empurre o pisto para baixo
gradiente de concentrao pr-definido de antibiticos para soltar a tira.
imobilizado na outra superfcie da tira. Uma vez aplicado
8. Confira se a tira est em completo contato
na superfcie de uma placa de gar, o antibitico se
com o gar e remova possveis bolses de ar,
difunde no meio. A N. gonorrhoeae inoculada no meio
cuidadosamente, com o auxlio de uma ala da
(antes da adio da tira) mostrar uma zona elptica
menor para a maior concentrao do antibitico.
de inibio de crescimento aps incubao ao longo
da noite, se susceptvel ao teste antimicrobiano. A CMI 9. Coloque no mximo quatro tiras de Etest por placa
dever ser lida como uma interseco da elipse e da de 140-150mm e uma tira por placa de 90mm.
escala gradiente marcada na tira. As instrues do
fabricante devero ser seguidas cuidadosamente quanto 10. Uma vez aplicada no gar, a tira de Etest no deve
ao armazenamento das tiras, desempenho e leitura dos ser removida (o antibitico prontamente liberado).
resultados do Etest. 11. Incube, imediatamente, as placas invertidas por
20-24 horas a 361C em uma atmosfera mida
4.8.5.2 Procedimento de determinao da CMI usando (70-80%) rica em CO2 a 51% (incubador de CO2
Etest ou, caso este no esteja disponvel, um jarro de
1. Seque (retire a umidade visvel, mas no enxugue anaerobiose com vela com umidade adicional).
em excesso) o nmero de placas de gar GCVIT (ver
Anexo 4) necessrias.

Gonorreia 49
1. Pincele a cultura de cima 2. Gire a placa 90 e pincele de 3. Gire a placa 45 e pincele,
para baixo com um trao nico cima para baixo com um trao novamente, de cima para baixo
sobre toda a superfcie de gar. nico sobre toda a superfcie com um trao nico sobre toda
de gar. a superfcie de gar.
Figura 4.10
Pincelagem da placa de cultura para Etest.

4.8.5.3 Leitura e interpretao dos resultados do Etest


aps incubao
1. Os resultados das cepas de referncia da OMS de
2008 (ver Tabela 4.8 para as CMI aceitveis dos
diferentes antibiticos), quando includas como
CQ, devem ser revisados e aprovados antes que
os outros resultados sejam lidos. Se no forem
aprovados, verificar os possveis problemas e
repetir o teste. Para os isolados testados, leia as
placas apenas se observar crescimento suficiente e
se a elipse de inibio for claramente visvel. Caso
contrrio, o teste dever ser repetido com maior
crescimento.
Figura 4.11
2. Leia a CMI exata onde a elipse (zona) intercepta a Resultado da determinao da CMI em N.
escala de CMI na tira do Etest (Figura 4.11). Se a gonorrhoeae usando o Etest. A CMI da penicilina G
elipse de inibio intercepta a tira do Etest entre (PG) determinada no ponto em que a elipse cruza a
dois valores de CMI, o valor mais alto deve ser tira (0,094mg/L).
considerado. Sempre leia o ponto final da completa
inibio de todo o crescimento, incluindo nvoas, 4.8.6 Mtodo de disco-difuso
microcolnias e macrocolnias isoladas.
4.8.6.1 Introduo
3. O crescimento ao longo de toda a tira implica a
Os ensaios de disco-difuso so tcnicas qualitativas
ausncia de inibio, isto , a CMI maior que (>)
para categorizar os isolados como susceptveis,
a maior concentrao da tira. Se a elipse de inibio
susceptveis intermedirios (ou susceptibilidade
est abaixo da tira e no a intercepta, a CMI
reduzida) ou resistentes para os diferentes antibiticos.
menor que (<) a concentrao mais baixa da tira.
Consequentemente, esses mtodos no determinam a
4. Interprete os resultados para os isolados testados CMI exata dos antibiticos contra os microrganismos;
em uma categoria de susceptibilidade (ver Tabela entretanto, eles devem refletir a CMI. Os mtodos de
4.7). disco-difuso usam discos disponveis comercialmente,
impregnados com uma concentrao conhecida de

50 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


antibitico. O agente antimicrobiano no disco se difunde manual da OMS descreve o mtodo do teste de disco-
sobre a superfcie de gar inoculada com o isolado difuso de sensibilidade dicotmica calibrada (SDC) (47,
bacteriano e produz um gradiente de concentrao que 48). O mtodo SDC usado para o teste e vigilncia
maior prximo ao disco e diminui proporcionalmente da susceptibilidade antimicrobiana gonoccica, por
ao se distanciar do disco. Aps a incubao, a zona exemplo, na OMS do Pacfico Ocidental ou do Sudeste da
de inibio visvel, a qual deve ser medida e, sia. NOTA: o meio gar, o procedimento e os critrios
subsequentemente, interpretada em uma categoria de interpretao do mtodo SDC difere dos outros
de susceptibilidade. Vrios mtodos de disco-difuso mtodos de disco-difuso. Se esses mtodos forem
so usados internacionalmente; entretanto, todos utilizados, necessrio que suas instrues sejam
exigem uma padronizao rigorosa e CQ apropriado estritamente seguidas.
para obter um alto nvel de reprodutibilidade e reflexo
suficiente da CMI dos antibiticos analisados. A principal 4.8.6.2 Meio gar recomendado para o mtodo SDC
diferena entre eles a potncia dos discos (contedo O meio de teste utilizado no mtodo SDC para isolados
de antibitico) e o gar utilizado, o que resulta em de N. gonorrhoeae o gar-chocolate, incluindo o gar
diferentes pontos crticos para a categorizao da base Columbia (o da Oxoid adequado; outras marcas
susceptibilidade. Os mtodos de disco-difuso do comerciais devem ser avaliadas quanto qualidade) com
CLSI (45) e da Sociedade Britnica para Quimioterapia 8% de sangue de cavalo achocolatado a 70C por 30
Antimicrobiana (BSAC, do ingls British Society for minutos (ver Anexo 4). Outros meios no foram validados
Antimicrobial Chemotherapy; www.bsac.org.uk) so e no devem ser utilizados sem uma avaliao estrita e
usados e recomendados em vrias regies (46). Este provveis ajustes dos critrios interpretativos.

Tabela 4.11: Critrios interpretativos para categorizar a N. gonorrhoeae em categorias de susceptibilidade


utilizando o mtodo SDC; o halo de inibio deve ser medido em mm, e no o dimetro da zona

Contedo do Categorias de susceptibilidade


Antibitico
disco Susceptibilidade
Resistncia Susceptibilidade
reduzida
Benzilpenicilina 0,5UI <3mm 3-9mm 9mm

Azitromicina 15g <8mm - 8mm

Teste de ciprofloxacinaa

- cido nalidxico 30g 0mm 0mm >6mm

- Ciprofloxacina 1g 6mm >6mm >6mm

Teste de ceftriaxonab

- Ceftriaxona 0,5g ASDc 5-9mm >9mm

- Cefpodoxima 10g ASDc 12mm >12mm

Espectinomicina 100g <6mm - 6mm

a
Para testar a susceptibilidade de fluoroquinolonas (ciprofloxacina), ambos os discos com cido nalidxico e ciprofloxacina devem ser utilizados e
interpretados simultaneamente.
b
Para testar a susceptibilidade de ceftriaxonas, ambos os discos com ceftriaxona e cefpodoxima devem ser utilizados e interpretados
simultaneamente.
c
ASD: a ser determinado. Devido ausncia de um nmero adequado de cepas resistentes e correlaes baseadas em evidncias entre as CMI dos
isolados e o resultado do tratamento, os pontos crticos ainda no podem ser determinados. Os isolados com susceptibilidade reduzida/resistncia
ceftriaxona devem ser confirmados pelo teste de CMI (diluio em gar ou Etest) pelo laboratrio local ou, idealmente, em um Laboratrio de
Referncia da OMS.

Gonorreia 51
4.8.6.3 Critrios interpretativos para o mtodo SDC secar). Se s estiverem disponveis colnias
A Tabela 4.11 descreve os critrios interpretativos para pequenas (<1mm), talvez seja necessrio coletar
susceptibilidade, susceptibilidade reduzida e resistncia, 3-5 colnias antes que o material esteja visvel na
recomendados para o uso do mtodo SDC (48). ponta do arame.

3. Prepare uma suspenso em 2,5mL de soluo


4.8.6.4 Controle de Qualidade (CQ) do mtodo SDC
salina estril (aproximadamente 107 UFC por mL),
As cepas de referncia de N. gonorrhoeae WHO C, WHO girando o arame pelo menos 10 vezes com a ponta
K e WHO P (se a azitromicina for examinada) devem ser em contato com o fundo do tubo de teste. Confirme
includas em cada srie de testes de susceptibilidade que o material se desprendeu da ponta, misture
antimicrobiana e sempre que um novo lote de meio o inculo pelo menos 10 vezes utilizando uma
gar ou discos for utilizado. O halo de inibio para pipeta de Pasteur estril e verifique se a soluo
cada antibitico e a cepa de referncia devem ser est homognea. Um inculo muito denso causar
documentados em um grfico de CQ. Para os raios uma pequena diminuio nos tamanhos da zona.
anulares aceitos no CQ, ver Tabela 4.12. Um inculo pouco denso causar um aumento
considervel nos tamanhos da zona.
4.8.6.5 Procedimento do mtodo SDC
1. Seque (retire a umidade visvel, mas no enxugue 4. Use a mesma pipeta para transferir toda a
em excesso) o nmero de placas de gar chocolate suspenso para a superfcie da placa de gar
(ver Anexo 4) necessrias. Seque as placas chocolate j seca.
invertidas, com as tampas removidas, a 361C, 5. Distribua o inculo, balanando a suspenso, at
por uma hora. que esta cubra toda a superfcie do gar.
2. Selecione a maioria das colnias de N. gonorrhoeae 6. Remova o excesso de inculo com uma pipeta de
(com pelo menos 1-2mm de dimetro, crescidas Pasteur estril.
ao longo da noite) em meio gar no seletivo para
gonococos com uma ala de plstico (1L) ou fio de 7. Deixe a placa secar por aproximadamente 10-15
nicromo reto (aps pass-lo pela chama e deix-lo minutos, temperatura ambiente (as placas no

Borda do crescimento aderente


Halo de
inibio

Borda do disco

Figura 4.12
O halo de inibio (mm) a menor distncia medida da borda do disco para a borda do crescimento aderente.
A borda do crescimento aderente corresponde normalmente borda mais acentuada da zona de inibio.
Fonte: Reproduzido do Teste de Susceptibilidade Antibitica SDC (http://web.med.unsw.edu.au/cdstest/).

52 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


devem ser deixadas no lugar por mais de 15 ou um jarro de anaerobiose com vela com umidade
minutos aps o inculo estar seco). adicional.

8. Aplique os discos de antibitico (mantido 10. Mea o halo de inibio com uma rgua de
temperatura ambiente) placa inoculada usando plstico calibrada em mm ou com compassos
uma pina estril ou um distribuidor de disco. de calibre vernier (Figura 4.12) Os resultados das
Podem-se aplicar at seis discos em uma cepas de referncia da OMS, usadas como CQ,
placa de 90mm. Os discos devem ser aplicados devem ser lidos e aprovados antes que se leiam
uniformemente e no devem ser removidos aps o os outros resultados (ver Tabela 4.12). Se no
contato inicial com o gar. forem aprovados, devem-se verificar os possveis
problemas e repetir o teste.
9. Incube as placas por 18 horas a 361C em
uma atmosfera rica em CO2 a 51% (70-80% de 11. Interprete os tamanhos da zona em categorias de
umidade). Pode-se utilizar uma incubadora de CO2 susceptibilidade (ver Tabela 4.11).

Tabela 4.12: Antibiticos, potncia dos discos e raio de inibio anular aceitvel para as cepas de referncia
de N. gonorrhoeae da OMS, recomendados para o controle de qualidade (CQ)

Cepa/antibitico Potncia do disco Halo de inibio (mm)


N. gonorrhoeae ACM 5239 (WHO C)
Azitromicina 15g 8,9-12,5
Benzilpenicilina 0,5UI 2,1-4,1
Cefpodoxima 10g 10,9-14,5
Ceftriaxona 0,5g 8,2-11,0
Ciprofloxacina 1g 12,7-16,3
cido nalidxico 30g 11,3-14,5
Espectinomicina 100g 6,9-8,9
N. gonorrhoeae WHO K
Cefpodoxima 10g 7,6-11,1
Ceftriaxona 0,5g 7,3-9,3
N. gonorrhoeae WHO P
Azitromicina 15g 3,8-7,4

4.8.7 Deteco de resistncia penicilina detectar a -lactamase em gonococos. Quando o anel


mediada por plasmdeo -lactmico da cefalosporina cromognica, a nitrocefina,
A N. gonorrhoeae pode carregar plasmdeos produtores hidrolisado pela -lactamase, ocorre uma mudana
de uma enzima (-lactamase [penicilinase]) que inativa de colorao do amarelo para o vermelho. O teste est
penicilinas tais como a benzilpenicilina, penicilina, comercialmente disponvel em vrios formatos, e a
ampicilina e amoxicilina. Vrios mtodos qualitativos nitrocefina liofilizada tambm pode ser adquirida para
foram utilizados para detectar a produo de uso em testes in-house (49). Tambm existem outros
-lactamase por microrganismos. mtodos menos padronizados e de qualidade garantida
para detectar a -lactamase, tais como o mtodo
O mtodo da cefalosporina cromognica simples, acidomtrico e o teste Iodomtrico.
sensvel, especfico e amplamente utilizado para

Gonorreia 53
4.8.7.1 Mtodo do disco de nitrocefina Pode-se utilizar soluo de nitrocefina disponvel
1. Hidrate, em gua destilada, o disco de nitrocefina comercialmente ou preparada in-house utilizando o p
em uma lmina de vidro ou em uma placa vazia de nitrocefina.
limpa.
Teste direto na placa:
2. Selecione vrias colnias da cultura pura de
1. Adicione uma gota da soluo de nitrocefina
gonococos crescida ao longo da noite com uma ala
diretamente nas colnias de gonococos puras
estril e risque na superfcie do disco.
isoladas no meio gar. As placas de diluio em
3. Uma reao positiva normalmente produz cor gar ou Etest podem ser utilizadas aps a leitura da
vermelha em um minuto. Entretanto, reaes CMI dos antibiticos examinados.
positivas fracas podem demorar um pouco mais
2. Uma mudana de cor na soluo de nitrocefina do
para revelar a cor, mas isso muito raro. Um
amarelo para o vermelho em um minuto indica um
resultado negativo no mostrar mudana de cor
resultado positivo. No entanto, reaes muito raras,
(continuar amarelo).
fracamente positivas, podem demorar um pouco
mais para serem reveladas. Um resultado negativo
4.8.7.2 Mtodo de soluo de nitrocefina
no mostrar mudana de colorao (continuar
O mtodo de soluo de nitrocefina realizado tanto ao amarelo) (Figura 4.13).
gotejar o reagente diretamente nas colnias crescendo
em meio seletivo ou no seletivo, como por meio da Teste na lmina/papel-filtro:
inoculao da soluo em uma lmina de vidro/papel-
1. Adicione uma gota da soluo de nitrocefina em
filtro com colnias.
uma lmina de vidro limpa/papel-filtro.

Figura 4.13
Atividade da -lactamase em N. gonorrhoeae determinada em placa de cultura com cefalosporina
cromognica, nitrocefina. O meio da esquerda demonstra uma reao positiva (vermelho) e o meio da direita
demonstra uma reao negativa (permanece amarelo).

54 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


2. Selecione vrias colnias da cultura pura de 4.9 Preservao dos isolados de N.
gonococos crescida ao longo da noite com uma ala gonorrhoeae
estril e a emulsifique na gota de nitrocefina.
Para manter a viabilidade das cepas de N. gonorrhoeae
3. Uma mudana de cor do amarelo para o vermelho em meio gar gonoccico, necessrio a subcultura
em um minuto indica um resultado positivo. a, pelo menos, cada 48 horas. Consequentemente,
Reaes muito raras, fracamente positivas, podem mtodos efetivos para a preservao em longo prazo das
demorar um pouco mais para serem reveladas. cepas gonoccicas so essenciais.
Um resultado negativo no mostrar mudana de
colorao (continuar amarelo). 4.9.1 Conservao em rampas de gar chocolate
(50, 51)
4.8.7.3 Mtodo acidomtrico Armazenamento por at nove meses (as cepas so
Coloque uma tira de papel-filtro em uma placa de mantidas viveis durante o transporte por at cinco dias):
Petri limpa e vazia. Sature o papel com soluo
Uma cultura pura crescida ao longo da noite em
de penicilina (tampo fosfato a 0,05mol/L, pH 8,0;
meio gar gonoccico inoculada em uma rampa
prpura de bromocresol e benzilpenicilina sem tampo
com 3mL de gar chocolate em uma garrafa Bijou
a 50g/L [armazenado congelado]). Com uma ala
de policarbonato com tampa de rosca (volume de
bacteriolgica, espalhe 10-20 colnias em uma rea
5mL; deve-se usar garrafa plstica) e incubada com
de aproximadamente 5mm do papel-filtro. Incube o
a tampa de rosca frouxa por no mnimo 24 horas
papel-filtro inoculado temperatura ambiente por 30
a 361C em atmosfera rica em CO2 a 51% ou
minutos com a placa de Petri tampada. A atividade da
at que o crescimento visvel esteja presente na
-lactamase resultar em mudana de cor do azul para o
superfcie do gar. Utiliza-se ento parafina lquida
amarelo, normalmente visvel em menos de 10 minutos.
estril para preencher completamente a rampa
de gar; a tampa de rosca apertada e a garrafa
4.8.7.4 Teste iodomtrico
Bijou estocada a 37C. Quando os gonococos so
Prepare uma mistura de penicilina-iodo fresca, necessrios para teste, uma ala bacteriolgica
adicionando 1,1mL de soluo de iodo (1,5mg de estril inserida atravs da cobertura de parafina
potssio iodado e 0,3g de iodo em 100mL de tampo para remover algumas N. gonorrhoeae crescidas,
fosfato a 0,1mol/L, pH 6,4, estocada em garrafa fum a sendo ento inoculada em um meio de cultura
4C) para um recipiente contendo 0,15mL de soluo de seletivo para gonococos. Aps incubao, por
benzilpenicilina (1 milho de Unidades Internacionais por 48 horas a 361C em atmosfera rica em CO2 a
mL, estocada a -20C). A mistura de reagente deve ser 51%, as colnias gonoccicas so prontamente
usada em uma hora. Uma ala contendo o organismo discernveis e podem ser subcultivadas para exame
em teste removida das colnias crescidas em placa apropriado (glbulos de parafina tambm estaro
de gar e emulsificada em uma gota da mistura iodo- presentes, mas podem ser facilmente distinguidos
penicilina em uma placa de vidro. Uma gota de soluo das colnias gonoccicas). A rampa original coberta
de amido (4g/L em gua destilada, autoclavada e de parafina pode voltar a ser armazenada para uso
estocada a 4C) adicionada, acrescentando uma cor futuro.
roxa escura mistura. Um resultado negativo indicado
quando essa cor permanece por cinco minutos. Uma
mudana de cor para transparente em cinco minutos
(normalmente em um minuto) indica um teste positivo.

Gonorreia 55
4.9.2 Conservao por congelamento ou disponvel, pode-se utilizar leite desnatado estril) e
liofilizao preservadas por liofilizao.
Armazenamento por at 1-3 meses:
4.10 Recuperao de isolados de N.
Todas as colnias crescidas em uma placa de
gonorrhoeae congelados
cultura pura em meio gar para gonococos podem
ser inoculadas em um pequeno recipiente contendo Remova do congelador ou nitrognio lquido o criotubo
0,5mL de caldo nutritivo estril (por exemplo, caldo contendo o isolado e no o deixe descongelar. Utilizando
nutritivo, caldo triptona de soja, caldo de infuso de a ponta de uma pipeta Pasteur estril, remova
crebro-corao) com glicerol a 15-20%, suspenso gentilmente uma pequena amostra de suspenso
com pipeta estril e imediatamente congelado bacteriana congelada (ou uma criobead) e a transfira
a -20-25C. No indicado o armazenamento para um meio gar de cultura para gonococos. Use uma
prolongado a essa temperatura, uma vez que os ala para riscar o inculo de colnias simples isoladas
gonococos perdero a viabilidade. e incube a placa de cultura por 24 horas a 361C, em
atmosfera rica em CO2 a 51%. Retorne imediatamente
Armazenamento em longo prazo: o criotubo ao congelador.

Todas as colnias crescidas em uma placa de


cultura pura em meio gar para gonococos podem 4.11 Referncias
ser inoculadas em um pequeno recipiente contendo 1. Global incidence and prevalence of selected curable
0,5-1mL de caldo nutritivo crioprotetor estril com sexually transmitted infections2008. Genebra,
glicerol a 15-20%, suspensas com pipeta estril e Organizao Mundial da Sade, 2012 (http://
imediatamente congeladas a -70C. www.who. int/reproductivehealth/publications/
rtis/2008_STI_ estimates.pdf, acessado em 2 de
Todas as colnias crescidas em uma placa de cultura
abril de 2013).
pura em meio gar para gonococos podem ser
inoculadas em um pequeno criorecipiente contendo 2. Tapsall JW et al. Meeting the public health challenge
meio crioprotetor estril (por exemplo, caldo nutritivo of multidrug- and extensively drug-resistant
com glicerol a 15-20%), suspensas com pipeta e Neisseria gonorrhoeae. Expert Review of Anti-
imediatamente congeladas em nitrognio lquido. Infective Therapy, 2009, 7(7):821834.

Todas as colnias crescidas em uma placa de 3. Ohnishi M et al. Is Neisseria gonorrhoeae initiating
cultura pura em meio gar para gonococos podem a future era of untreatable gonorrhea?: detailed
ser inoculadas em um pequeno recipiente contendo characterization of the first strain with high-level
aproximadamente 0,5-1,0mL de fluido Microbank resistance to ceftriaxone. Antimicrobial Agents and
estril com cryobeads (disponveis comercialmente), Chemotherapy, 2011, 55(7):35383545.
suspensas por meio da inverso do recipiente
por cinco vezes. Subsequentemente, remove-se 4. Bachmann LH et al. Nucleic acid amplification
o mximo de lquido possvel e o recipiente tests for diagnosis of Neisseria gonorrhoeae and
imediatamente congelado a -70C. Chlamydia trachomatis rectal infections. Journal of
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Todas as colnias crescidas em uma placa de cultura
pura em meio gar para gonococos podem ser 5. Mimiaga MJ et al. Gonococcal, chlamydia, and
inoculadas em um caldo nutritivo estril (por exemplo, syphilis infection positivity among MSM attending
caldo nutritivo, caldo triptona de soja, caldo de a large primary care clinic, Boston, 2003 to
infuso de crebro-corao) com glicerol a 15-20% 2004. Sexually Transmitted Diseases, 2009,
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Gonorreia 59
60 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Captulo 5 infertilidade por fator tubrio) em mulheres. Esses
sorotipos tambm podem ser isolados a partir de
infeces oculares em recm-nascidos, adquiridos
Infeces por clamdia durante a passagem por um canal de parto infectado,
mas no so amplamente responsveis por tracoma. Os
recm-nascidos ainda podem desenvolver pneumonia
5.1 Introduo
por clamdia, devido exposio a esses sorotipos
A Clamydia trachomatis, agente etiolgico da clamdia, durante o parto vaginal (no confundir com infeco por
causa morbidade e custos econmicos substanciais C. pneumoniae).
no mundo. Em 2008, a Organizao Mundial da
Sade (OMS) estimou a ocorrncia de 106 milhes Finalmente, a biovariante LGV, que consiste dos
de novos casos de clamdia urogenital entre adultos, sorotipos L1-L3, tambm uma biovariante transmitida
mundialmente. Isso coloca a clamdia como a mais sexualmente, mas com preferncia tecidual por clulas
prevalente doena sexualmente transmissvel (DST) linfoides e com uma progresso da doena mais
bacteriana, junto com a gonorreia (tambm com 106 agressiva. As infeces por LGV so consequentemente
milhes de novos casos). mais invasivas e mais propensas a causar infeces
sistmicas que as outras biovariantes. A LGV endmica
A C. trachomatis classifica-se em trs biovariantes, cada em muitas regies em desenvolvimento no mundo. Alm
uma contendo vrios sorotipos e gentipos (dependendo disso, desde 2003, surtos de proctites e proctocolites
do mtodo utilizado para classificao). As biovariantes por LGV foram documentados entre homens que fazem
so definidas com base no tipo de infeco, localizao sexo com homens (HSH) na Europa e Amrica do Norte,
comum da infeco (tropismo por tecido) e virulncia onde, previamente, apenas se observavam casos
relativa da doena (Tabela 5.1), dividindo-se entre espordicos dessas infeces (ver Captulo 11).
aquelas que causam tracoma (a maior causa de cegueira
evitvel em todo o mundo, endmica em muitos pases
em desenvolvimento), as que causam infeces genitais A C. trachomatis causa a DST bacteriana
(a DST bacteriana mais frequente no mundo) e as que mundialmente mais comum, a qual inclui um
causam linfogranuloma venreo (LGV, uma doena de espectro de doenas encontradas em diversos
lcera genital que afeta os tecidos linfoides) (ver Captulo tecidos (isto , genital, ocular, linftico e bronquial).
11).
Resultados negativos associados a infeces
A biovariante ocular consiste dos sorotipos A-C, os quais por C. trachomatis no tratadas incluem PID,
so encontrados predominantemente em infeces na gravidez ectpica, infertilidade por fator tubrio,
conjuntiva. O tropismo por esse tecido no absoluto, epididimites, prostatites, dentre outros.
uma vez que esses organismos, especialmente o
sorotipo B, tambm podem ser isolados de infeces
genitais, mas a frequncia dessas ocorrncias rara.
5.2 Reviso dos mtodos de diagnstico
A biovariante predominante consiste dos sorotipos disponveis
D-K, os quais so transmitidos sexualmente e infectam Embora a clamdia seja altamente prevalente, o
o epitlio genital, causando uretrite em homens e conhecimento sobre essa infeco era bastante limitado
cervicite (e uretrite) em mulheres (Tabela 5.2). Infeces nos servios de sade pblica antes da dcada de 80,
urogenitais assintomticas ocorrem em at 50% dos devido a limitaes nos mtodos de diagnstico. As
homens e at 90% das mulheres. Se no for detectada tcnicas de diagnstico precoce desenvolveram-se mais
e tratada, a infeco pode ascender para o trato genital no mbito dos esforos para deter o tracoma do que
superior, causando epididimite em homens e doena para conter a prpria DST. A sorologia foi utilizada para
plvica inflamatria (PID, do ingls pelvic inflammatory distinguir infeces agudas
disease) e sequelas relacionadas (gravidez ectpica,

Infeces por clamdia 61


Tabela 5.1: Caractersticas e infeces associadas a diferentes sorotipos de C. trachomatis
Tropismo por tecido/
Sorotipo Caractersticas Infeco
biovariante
Cegueira endmica
A-C (incl. Ba) No invasivo Clulas epiteliais/tracoma
causada por tracoma
Urogenital, conjuntivite,
D-K (incl. Da, Ia, Ja) No invasivo Clulas epiteliais/tracoma
pneumonia neonatal
L1, L2, L3
Invasivo Clulas linfticas/LGV LGV
(incl. L2a, L2b)
LGV: linfogranuloma venreo

Tabela 5.2: Manifestaes clnicas da infeco por C. trachomatis


Infeco genital Primria Sequelas
Mulheres Cervicite, corrimento purulento Doena inflamatria plvica, gravidez
abundante, colo do tero resistente ectpica, salpingite, infertilidade por
a altas temperaturas, disria, dor fator tubrio
plvica, sensibilidade a movimentos
cervicais
Homens Corrimento uretral, disria, dor Epididimite, prostatite
testicular
Infeces no genitais Primria Sequelas
Reto Corrimento, dor retal, sangue nas Proctite
fezes
Orofaringe Faringite, leve dor de garganta
Linfonodos Inflamao linftica
Ocular Conjuntivite Cicatrizes, cegueira por tracoma
Pneumonia neonatal Pneumonia
Nota: estudos forneceram evidncias de que as infeces por C. trachomatis podem facilitar a transmisso do HIV; entretanto, o odds ratio
relativamente baixo.

de crnicas, mas esta no apresenta sensibilidade o diagnstico de clamdia mais acessvel. Conforme mais
e especificidade suficientes para o diagnstico testes ELISA foram sendo desenvolvidos, vrios ensaios
de infeces agudas, nem para obter estimativas point-of-care (POC), rpidos, tornaram-se disponveis.
populacionais de exposio ao longo da vida. A Os EID, ELISA e POC apresentavam baixa sensibilidade
cultura foi padronizada na dcada de 70, tornando o quando comparados cultura, e especificidade inferior
isolamento do organismo uma importante ferramenta ideal. Entretanto, a rapidez para a liberao do resultado
de diagnstico. No entanto, a necessidade de manter a e as necessidades menos restritivas para o transporte do
viabilidade do espcime, que exige condies rigorosas espcime tornaram esses ensaios uma opo atraente,
de transporte e armazenamento, limitou a disponibilidade especialmente em lugares de alta prevalncia.
desse teste apenas aos mdicos que trabalham em
Outro grande avano no diagnstico de clamdia foi
laboratrios mais desenvolvidos. Ensaios de deteco de
a utilizao de sequncias de cido nucleico no lugar
antgeno, ensaios de imunofluorescncia direta (EID) e o
de antgenos como alvos de deteco. A sensibilidade
ensaio imunossorvente ligado enzima (ELISA, do ingls
dos ensaios de hibridizao de cidos nucleicos no
enzyme-linked immunosorbent assay) de fase slida
amplificados (NAH, do ingls non-amplified nucleic
foram desenvolvidos no incio da dcada de 80, tornando

62 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


acid hybridization assays) inicialmente desenvolvidos 5.3 Coleta, transporte e condies de
foi similar da cultura, mas novamente houve armazenamento de espcimes
questionamentos quanto sua especificidade. A
A coleta, o transporte e as condies de armazenamento
incluso de Neisseria gonorrhoeae no mbito do teste
de espcimes (Tabela 5.3) dependem, em muitos
tornou esse ensaio extremamente atraente. Os testes
casos, do tipo do ensaio. Essa seo ir apresentar
de amplificao de cidos nucleicos (NAAT, do ingls
algumas diretrizes gerais, mas os detalhes relacionados
nucleic acid amplification test) foram desenvolvidos
a qualquer ensaio de diagnstico especfico devem
em seguida. Os NAAT usam mtodos enzimticos para
ser seguidos de acordo com as instrues de uso
amplificar exponencialmente o DNA ou RNA alvo em
apropriadas.
bilhes de cpias. O produto amplificado detectado
por diversos meios, o que confere a cada ensaio As regies anatmicas de amostragem iro variar
caractersticas nicas de desempenho. Similares ao dependendo da apresentao e histrico clnico do
teste NAH, os NAAT combinaram a testagem de clamdia paciente e da sensibilidade do ensaio. Para a cultura, que
e gonorreia a partir de uma mesma amostra. Devido requer organismos vivos, a amostra deve ser coletada
s caractersticas superiores de desempenho, como, a partir de lugares com clulas epiteliais colunares ou
por exemplo, sensibilidade, especificidade, variedade cuboides, as quais tm maior probabilidade de estar
dos tipos de espcimes, automao e independncia ativamente infectadas. Dessa forma, nas mulheres,
para manter a viabilidade do organismo, os NAAT so devem-se coletar as amostras do orifcio endocervical
fortemente recomendados para o diagnstico e triagem e, nos homens, do epitlio uretral. Esse ltimo, quando
de infeces por clamdia. Para informaes adicionais necessrio, tambm pode servir como local de coleta de
sobre as caractersticas de desempenho dos diferentes amostras em mulheres. A coleta em ambos os locais,
mtodos para o diagnstico de clamdia, ver a pgina da na testagem de mulheres, aumentar a identificao de
internet sobre clamdia, www.chlamydiae.com. casos.

Questes associadas avaliao dos ensaios e As amostras endocervicais devem ser obtidas por meio
variedade dos desempenhos (1,2) ressaltam a da insero de 2-3cm do aparato de coleta no orifcio,
necessidade da verificao de ensaios e da estrita seguida de um giro de 360 completos. As amostras
garantia de qualidade (GQ) em cada laboratrio, no endocervicais no devem ser coletadas em meninas
apenas antes da adoo de um mtodo, mas tambm pr-pberes; em vez disso, os espcimes devem ser
de forma regular. Para maiores informaes sobre colhidos no vestbulo da vagina, obtendo-se tambm
esse tpico, ver Captulo 2 e Anexo 3. Para obter as uma amostra de urina. As amostras da uretra so
caractersticas de desempenho adequadas a todos os coletadas por meio da insero de 2-3cm de uma
mtodos de diagnstico, crucial seguir precisamente haste na uretra, seguida de giro completo para obter o
as recomendaes do fabricante no concernente material celular. A coleta inadequada tem sido descrita
coleta, ao transporte e ao armazenamento das amostras, como um problema comum, que afeta negativamente a
bem como aquelas relativas ao desempenho de ensaios sensibilidade da cultura.
especficos, incluindo os controles de qualidade.
Embora outros ensaios, diferentes da cultura e dos
As tecnologias para o diagnstico de clamdia NAAT, no necessitem de organismos viveis, a
continuam avanando e apresentam melhor sensibilidade limitada desses ensaios requer a coleta de
sensibilidade. uma quantidade suficiente de organismos para que se
obtenha um resultado positivo. Alm disso, os mtodos
Devido s caractersticas de desempenho
de deteco de antgeno geralmente necessitam de
superiores, os NAAT so fortemente recomendados
organismos intactos. Assim, as mesmas restries de
para o diagnstico e triagem de infeces por
amostragem necessrias para a cultura geralmente se
clamdia. Entretanto, a escolha do teste depende
aplicam a esses mtodos de diagnstico. Alguns ELISA
dos recursos disponveis e da infraestrutura do
foram aprovados para uso em amostras de urina de
laboratrio.

Infeces por clamdia 63


homens, uma vez que esse mtodo de amostragem lava coleta de amostra pelo paciente para o uso em NAAT
os organismos da uretra. Se o volume do primeiro jato de pode aumentar a captao da triagem e reduzir o tempo
urina for cuidadosamente controlado (em geral, menos dos trmites clnicos (9, 10). As amostras da orofaringe
de 25mL), e o paciente no tiver urinado durante a hora so colhidas a partir da faringe posterior e das criptas
anterior, provvel que a carga do microrganismo esteja tonsilares. Essas amostras devem ser coletadas ao se
suficientemente concentrada para que seja detectvel identificarem infeces transmitidas durante o sexo oral.
por esses ensaios. Isso no verdadeiro para a urina preciso tambm obter uma amostra da nasofaringe
de mulheres, uma vez que a ocorrncia de infeces em caso de recm-nascidos com suspeita de terem
na uretra menos comum e a urina no contempla contrado pneumonia clamidial durante o parto. Esse
amostras do tecido cervical. tipo de amostra ser utilizado para cultura ou EID, no
tendo sido ainda avaliado rigorosamente por outros
Os NAAT apresentam a vantagem de depender de
sistemas. No entanto, devido carga bacteriana baixa,
cidos nucleicos que no necessitam de organismos
os NAAT tendem a ser mais eficazes e, portanto,
intactos ou viveis. Como resultado, esses ensaios
necessrio realizar mais pesquisas nessas reas. Uma
aumentaram nossa capacidade de coletar amostras
haste deve ser inserida pela narina at que se possam
menos invasivas, que requerem ambientes clnicos.
coletar amostras da parede da faringe. Amostras da
Os NAAT so altamente sensveis quando se utilizam
conjuntiva devem ser colhidas por meio da retrao da
amostras colhidas pelo prprio paciente (por exemplo,
plpebra inferior, passando-se uma haste ao longo da
hastes contendo secrees vaginais ou urina masculina).
superfcie da conjuntiva palpebral inferior em direo ao
Os NAAT tambm so teis para o teste de resduos
canto mediano do olho. Em caso de suspeita de LGV, ver
de citologia em meio lquido, permitindo a triagem em
Captulo 11.
mulheres por meio do teste de Papanicolau (Pap). As
hastes contendo secreo vaginal podem ser obtidas Dada a necessidade de uma avaliao rigorosa antes
pelo prprio paciente ou pelo mdico, com o mesmo que um teste de diagnstico seja aprovado pela
grau de validade (3, 4). Insira a haste na vagina e gire-a Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados
para que sejam coletadas amostras de todas as paredes Unidos da Amrica (FDA, do ingls United States of
vaginais. America Food and Drug Administration), a qual inclui
triagens clnicas em mltiplos locais e comparao
Em alguns casos, dependendo dos sinais clnicos e
com os padres apropriados, o desempenho do ensaio
prticas sexuais, necessrio coletar amostras no
aprovado pela FDA bem documentado. Dessa forma,
genitais. A cultura pode identificar infeces no reto
utilizamos esse nvel de avaliao como o padro para a
e na orofaringe, mas a sensibilidade nesses casos
determinao de ensaios de alta qualidade. A Tabela 5.4
relativamente baixa, devido microbiota contaminante.
resume as caractersticas de desempenho dos diferentes
No entanto, os NAAT apresentam alta sensibilidade para
testes diagnsticos aprovados para a deteco de C.
essas infeces, embora nenhum fabricante se refira
trachomatis.
a esse tipo de amostra. O uso de NAAT em amostras
extragenitais de homens que fazem sexo com homens As condies de coleta, transporte e
aumenta substancialmente a identificao de casos armazenamento de espcimes variam de acordo
(5-8). As amostras do reto podem ser coletadas tanto com o ensaio de deteco e podem influenciar
pelo prprio paciente como pelo mdico, por meio da significativamente a sensibilidade do teste.
insero de uma haste com extremidades de dacron
A seleo do espcime apropriado e do ensaio de
no reto at um limite confortvel (2-3cm), seguida de
deteco crucial para um diagnstico efetivo.
um giro de 360. No mais necessrio visualizar o
reto para a coleta adequada da amostra, em razo
do aumento de sensibilidade dos ensaios NAAT. Para
qualquer indivduo que reporte a prtica de relao anal
receptiva, aconselha-se testar uma amostra do reto. A

64 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


Tabela 5.3: Coleta, transporte e armazenamento de amostras
Local Aparato de Procedimento de NAAT Cultura EID POC
coleta amostragem
Endocrvice Haste/ Use uma haste Coloque a Coloque a Passe a Coloque a
plsticoa, de limpeza amostra no amostra amostra pela amostra no
escova ou para remover o aparato de diretamente lmina (uma tampo de
vassoura excesso de muco coleta do em meio de fina camada) extrao do
para citologia antes da coleta fabricante transporte e deixe-a kit e siga as
em meio da amostra. O ou use meio apropriado secar ao ar instrues do
lquido uso de vassoura lquido para para clamdia livre. manual.
para a coleta s citologia. (por exemplo,
vlido para NAAT. Armazene e tampo SPG
Insira 2-3cm transporte a com inibidores
do aparato de amostra de antimicrobianos).
coleta no orifcio acordo com Mantenha a
endocervical as instrues amostra a 4C
e gire 360. A do manual. para inoculaes
coleta de clulas em 24h ou a
endocervicais -70C para
essencial para o armazenamentos
procedimento de mais longos.
EID.
Uretra Haste/ Insira 2-3cm da Coloque a Coloque a Passe a Coloque a
alumniob haste na uretra amostra no amostra amostra pela amostra no
e gire 360. A aparato de diretamente lmina (uma tampo de
coleta de clulas coleta do em meio de fina camada) extrao do
epiteliais cuboides fabricante. transporte e deixe-a kit e siga as
essencial para Armazene e apropriado secar ao ar instrues do
o EID. transporte a para clamdia livre. manual.
amostra de (por exemplo,
acordo com tampo SPG
as instrues com inibidores
do manual. antimicrobianos).
Mantenha a
amostra a 4C
para inoculaes
em 24h ou a
-70C para
armazenamentos
mais longos.

Infeces por clamdia 65


Tabela 5.3: Coleta, transporte e armazenamento de amostras (continuao)
Local Aparato Procedimento NAAT Cultura EID POC
de coleta de amostragem
Urina Copo O paciente no Coloque a NA NA NA
estril para deve limpar a amostra no
coleta de rea genital. aparato de coleta
urina Obter o primeiro do fabricante.
jato (em geral, Armazene e
menos de 25mL). transporte a
amostra de acordo
com as instrues
do manual.

Vagina Haste/ As amostras Coloque a NA NA Siga as


plsticoa podem ser amostra no instrues
obtidas pelo aparato de coleta do
mdico ou pelos do fabricante. manualc.
pacientes. Gire a Armazene e
haste para que transporte a
esta entre em amostra de acordo
contato com toda com as instrues
a parede vaginal. do manual. Vrios
ensaios toleram
esfregaos secos
recebidos sem
meio.
Reto Haste/ Insira 2-3cm da Atualmente, Coloque a amostra Passe a NA
plsticoa haste no reto e nenhum fabricante diretamente em amostra
gire 360. faz referncia meio de transporte pela
a esse tipo de apropriado para lmina
amostrad. Trate-a clamdia (por (uma fina
como uma amostra exemplo, tampo camada)
endocervical. As SPG com inibidores e deixe-a
amostras podem antimicrobianos). secar ao
ser enviadas sem Mantenha a ar livre.
o meio, caso o amostra a 4C
ensaio utilizado para inoculaes
aceite esse tipo em 24h ou a
de amostragem -70C para
para espcimes armazenamentos
endocervicais. mais longos.

66 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


Tabela 5.3: Coleta, transporte e armazenamento de amostras (continuao)
Local Aparato Procedimento NAAT Cultura EID POC
de coleta de amostragem
Orofaringe Haste/ Passe a haste na Atualmente, nenhum Coloque a amostra Passe a NA
plsticoa faringe posterior fabricante faz diretamente em amostra pela
e nas criptas referncia a esse meio de transporte lmina (uma
tonsilares. tipo de amostrad. apropriado para fina camada)
Trate-a como clamdia (por e deixe-a
uma amostra exemplo, tampo secar ao ar
endocervical. As SPG com inibidores livre.
amostras podem antimicrobianos).
ser enviadas sem o
meio, caso o ensaio
utilizado aceite esse
tipo de amostragem
para espcimes
endocervicais.
Nasofaringe Haste/ Passe a haste na NA Coloque a amostra NA NA
(para alumniob nasofaringe ou diretamente em
casos de colete o aspirado meio de transporte
suspeita de traqueobronqueal. apropriado para
pneumonia clamdia (por
neonatal) exemplo, tampo
SPG com inibidores
antimicrobianos).
Mantenha a
amostra a 4C para
inoculaes em 24h
ou a -70C para
armazenamentos
mais longos.
Conjuntiva Haste/ Passe a haste NA Coloque a amostra Passe a NA
alumniob na superfcie diretamente em amostra pela
da conjuntiva meio de transporte lmina (uma
palpebral inferior. apropriado para fina camada)
clamdia (por e deixe-a
exemplo, tampo secar ao ar
SPG com inibidores livre.
antimicrobianos).
Mantenha a
amostra a 4C para
inoculaes em 24h
ou a -70C para
armazenamentos
mais longos.

Infeces por clamdia 67


EID: ensaio de imunofluorescncia direta; NA: no se aplica; NAAT: teste de amplificao de cidos nucleicos; POC: teste point-of-care; SPG:
sacarose-fosfato-glutamato.
a
Hastes de plstico com extremidades de dacron ou de rayon.
b
Hastes de alumnio com extremidades de dacron ou de rayon.
c
Somente alguns testes POC esto licenciados para espcimes vaginais.
d
Os dados indicam que os NAAT apropriados apresentam um bom desempenho para esse tipo de amostra, mas nenhum fabricante se refere a
espcimes extragenitais.

Tabela 5.4: Testes diagnsticos avaliados* (at junho de 2012) para a deteco de C. trachomatis
NAAT Cultura EID POC
Tipos de espcimes
Hastes com amostra Sim Sim Sim Sim
endocervical
Meio lquido para Sim (alguns testes) No No No
citologia
Hastes com amostras
vaginais

Obtidas pelo Sim (alguns testes) No No Sim (alguns testes)


paciente

Coletadas pelo Sim (alguns testes) No No Sim (alguns testes)


mdico
Urina
Mulheres Sim No No No
Homens Sim No No No
Hastes com amostras Sim Sim Sim Sim
da uretra de homens
Hastes com amostras Noa Simb Simb No
do reto
Hastes com amostras Noa Simb Simb No
da orofaringe
Hastes com amostras Noa Sim Sim No
da conjuntiva
Desempenho
Sensibilidadec Muito alta Moderada-alta Baixa-moderada Baixa-moderada
Especificidade Muito alta Muito alta Moderada Muito alta
Outras consideraes
Custo Muito alto Moderado Baixo Baixo
Transporte e Em temperatura 4C por 24h Temperatura NA
armazenamento ambiente por at ambiente
-70C aps 24h
60 dias (checar o
manual)
Instrumentao Grande presena de Microbiologia de Microscpio de Pequena-nenhuma
instrumentao rotina/virologia fluorescncia
Rendimento/ Alto/sim Baixo/no Baixo/no Baixo/no
automatizao

68 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


Tabela 5.4: Testes de diagnstico avaliados* (at junho de 2012) para a deteco de C. trachomatis (continuao)
NAAT Cultura EID POC
Outras consideraes
Complexidade tcnica Alta Alta Moderada (habilidade Baixa
em microscopia)
Nvel de Referncia Referncia Central Local
infraestrutura do
laboratrio
Mltiplos patgenos N. gonorrhoeae, No No No
de uma mesma Trichomonas
amostra vaginalis e HPV em
algumas plataformas
Outros comentrios Devido s O rigor na coleta Altamente As infeces
caractersticas e no transporte recomendado para identificadas
de desempenho essencial a identificao podem ser tratadas
superiores, para manter a imediata de antes que o
os NAAT so viabilidade do infeces na paciente deixe a
altamente teste essa a conjuntiva. clnica.
recomendados maior barreira
para o diagnstico nesse ensaio para
e triagem. a sensibilidade.
Requer adeso O potencial para
estrita aos obter isolados
protocolos devido viveis til em
ao potencial de testes adicionais,
contaminao do como o de
laboratrio. determinao de
Alguns exigem gentipos e o teste
grandes lotes, o de susceptibilidade
que pode aumentar a antibiticos.
o tempo de retorno
do resultado.
EID: ensaio de imunofluorescncia direta; HPV: papilomavrus humano; NAAT: teste de amplificao de cidos nucleicos; POC: teste point-of-care.
* Avaliado pela Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados Unidos da Amrica.
a
Os dados indicam que os NAAT apropriados apresentam um bom desempenho para esse tipo de amostra, mas nenhum fabricante se refere a
espcimes extragenitais.
b
Comparada aos NAAT modernos, a sensibilidade da cultura e do EID tende a ser ainda menor para esse tipo de espcime.
c
A estimativa das sensibilidades varia muito, dependendo das diferentes sensibilidades dos ensaios de uma mesma metodologia, bem como
dos ensaios utilizados para comparao (o padro ouro). Os NAAT so superiores a qualquer outra classe de testes quanto sensibilidade e
apresentam excelente especificidade.
Fonte: Adaptado de Unemo M, Papp JR. Infections caused by Chlamydia trachomatis. In: Morse SA et al., eds. Atlas of sexually transmitted diseases
and AIDS, 4th ed. Edinburgh, Saunders/Elsevier, 2010:4063.

Infeces por clamdia 69


5.4 Teste de amplificao de cido nucleico em pases com poucos recursos. Esses ensaios tambm
(NAAT) so susceptveis contaminao do ambiente, devido
amplificao exponencial das sequncias-alvo. Qualquer
A deteco molecular de sequncias especficas
atividade que envolva um tubo aberto de amostra
de cidos nucleicos e a subsequente validao e
amplificada uma fonte em potencial para a formao
comercializao desses ensaios trouxe grandes
de aerossol e contaminao do ambiente. Uma vez que
melhorias para a deteco laboratorial de C. trachomatis.
as instalaes laboratoriais e os equipamentos (por
Testes NAH, como o PACE 2 e o PACE 2C da Gen-Probe
exemplo, pipetas) se contaminam, sua recuperao pode
(Gen-Probe, EUA), que se baseiam na ligao de sondas
ser extremamente difcil.
de cidos nucleicos complementares especficas
e subsequente amplificao do sinal para detectar Outra questo envolve o potencial de resultados falso-
a ligao, foram os primeiros a ser desenvolvidos. negativos. O processo de extrao de cido nucleico
Esses testes so aproximadamente 10-15% menos fundamental para o procedimento, mas difcil
sensveis que os NAAT e no devem ser utilizados se os de ser garantido para cada amostra. A amplificao
NAAT estiverem disponveis e forem economicamente requer concentraes precisas de sal, nucleotdeos
acessveis. Os NAAT apresentam caractersticas de e enzimas para ocorrer de forma eficiente, o que
desempenho superiores quando comparados a qualquer exige grande preciso no uso da pipeta. A enzima que
outro tipo de teste para a deteco de infeces por promove a amplificao tambm pode ser sensvel a
clamdia (11-14) e, dessa forma, so o tipo de ensaio componentes de sangue, muco e urina. Dessa forma,
recomendado pelos Centros de Controle e Preveno um resultado negativo pode, na verdade, refletir uma
de Doenas dos Estados Unidos da Amrica (CDC, ausncia do cido nucleico-alvo, em virtude da coleta
do ingls Centers for Disease Control and Prevention), ou extrao inadequadas da amostra ou deficincia
alm de outros organismos regulatrios e assessores, na amplificao, ao invs de uma efetiva ausncia de
para o diagnstico tanto de infeces genitais como sequncia-alvo. A proporo de amostras inibitrias
extragenitais e para a triagem de infeces por clamdia pode variar dependendo da metodologia do teste e,
(15). O teste confirmatrio de amostras positivas conforme os mtodos utilizados, pode chegar a 7,5%
para C. trachomatis no mais recomendado. Os em certas populaes (16). Entretanto, o desempenho
NAAT validados e eficientes apresentam uma srie de desses testes ainda altamente prefervel ao da cultura,
vantagens que independem do fabricante. Eles so que pode fornecer resultados falso-negativos devido
claramente os ensaios disponveis mais sensveis, o perda da viabilidade dos organismos, e ao de outros
que tambm permite o agrupamento de amostras em mtodos diferentes da cultura cuja sensibilidade
lugares com limitaes de recursos; eles no necessitam menor (ou no mximo igual) desta e que tambm
que a viabilidade do organismo seja mantida; a maioria apresentam especificidade abaixo do ideal. Dessa forma,
dos ensaios disponveis comercialmente pode testar embora haja a necessidade de cuidados laboratoriais
tanto a clamdia quanto a gonorreia; e esses ensaios apropriados, as vantagens dos NAAT prevalecem
apresentam uma gama mais ampla de tipos de amostras substancialmente em relao s desvantagens. O uso
teis, que incluem coletas menos invasivas de urina ou dos NAAT deve ser incentivado mesmo em lugares
de amostras vaginais, alm das amostras endocervicais com limitaes de recursos, por meio da criao de
e uretrais previamente requeridas. Ademais, esses laboratrios de referncia regionais que possam fornecer
ensaios so bem adequados para a automatizao, o que os servios de diagnstico utilizando esses mtodos.
resulta no aumento da padronizao e na GQ na extrao Os laboratrios de referncia regionais oferecem
e na deteco, bem como no aumento significativo muitas vantagens, que resultam de grandes volumes de
do rendimento. Entretanto, os ensaios NAAT tambm testes, adeso rigorosa s boas prticas laboratoriais e
compartilham algumas dificuldades. As tecnologias de melhoria na especializao tcnica. O uso de laboratrios
amplificao exigem uma instrumentao substancial e regionais pode implicar reduo de custos na utilizao
no so apropriadas para muitos laboratrios localizados de ensaios de alta sensibilidade. Apesar da necessidade

70 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


de enviar amostras para uma instituio regional, o Tecnologias moleculares oferecem a melhor
tempo para o retorno do resultado pode ser equivalente sensibilidade, com excelente especificidade.
ou at menor, considerando-se o grande volume de
testagem e o uso de automatizao de alto rendimento. Ensaios moleculares reduzem a necessidade de
Por essas razes, os laboratrios que no podem custear condies estritas de transporte e armazenamento
a realizao dos ensaios NAAT mais sensveis devem e eliminam anlises subjetivas (por exemplo,
considerar a utilizao dos servios de um laboratrio microscopia).
de referncia regional ao invs de utilizar ferramentas de
Se NAAT aprovados internacionalmente no
diagnstico menos sensveis.
puderem ser utilizados, altamente recomendado
Atualmente, quatro companhias possuem NAAT que o NAAT proposto pela instituio local tenha
aprovados pela FDA e disponveis comercialmente sua eficincia estritamente validada e a sua
para a deteco de C. trachomatis. Os ensaios qualidade assegurada em relao a pelo menos,
comercializados por esses fabricantes esto descritos um NAAT aprovado internacionalmente, antes de
a seguir. Todos os NAAT aprovados e comercialmente sua utilizao.
disponveis detectam o LGV como positivo para C.
Novos ensaios esto sendo rapidamente
trachomatis, sem, entretanto, distinguir os resultados
disponibilizados e no podem ser previstos neste
como positivos L1-L3. Para essa finalidade, necessria
documento. importante o acesso contnuo
a determinao do gentipo (ver Captulo 11).
literatura para a realizao de avaliaes de alta
importante notar que, no mundo, h muitos outros
qualidade dos novos ensaios, a fim de determinar o
NAAT para C. trachomatis disponveis comercialmente
que melhor se adequa a cada laboratrio.
ou desenvolvidos internamente por laboratrios (17,
18). Se NAAT no aprovados pela FDA forem utilizados,
5.4.1 Ensaios moleculares da Abbott
processos regulatrios regionais (como os da Unio
Os ensaios RealTime CT/NG e somente CT, da Abbott,
Europeia [UE]) e/ou nacionais devem fornecer garantias
so realizados pelo sistema automatizado m2000
da qualidade e desempenho do NAAT para diagnstico. O
(Abbott Molecular, EUA). Esse ensaio substituiu o
uso de NAAT aprovados internacionalmente altamente
aprovado pela FDA, LCx, o qual foi um dos primeiros
indicado. Se isso no for possvel, recomenda-se
NAAT disponveis comercialmente. O ensaio da reao
que o NAAT proposto pela instituio local tenha sua
em cadeia da polimerase (PCR, do ingls polymerase
eficincia rigorosamente validada e sua qualidade
chain reaction) RealTime utiliza o m2000sp, um
assegurada em relao a, pelo menos, um NAAT
instrumento automatizado de preparao de amostra,
aprovado internacionalmente antes de sua utilizao
que extrai o DNA utilizando um sistema de captura
e, subsequentemente, que o teste seja usado com os
baseado em partcula magntica. Em seguida extrao,
devidos controles positivos, negativos e de inibio. A
o instrumento m2000p carrega a mistura principal
participao em sistemas idneos de avaliao externa
de reagentes (master mix) na placa de PCR, adiciona
da qualidade tambm fortemente recomendada (ver
as amostras purificadas e, ento, est pronto para a
Captulo 2 e Anexo 3). Para informaes bsicas sobre
amplificao em tempo real e deteco no m2000rt (19).
as diferentes tecnologias de NAAT, ver Anexo 3.
Esse termociclador em tempo real detecta a amplificao
pela fluorescncia emitida quando sondas se ligam
especificamente a sequncias-alvo amplificadas durante
cada ciclo de amplificao. O ensaio passa a incluir dois
alvos, isto , duas sequncias no plasmdeo crptico
(7-10 cpias por organismo) para C. trachomatis, a
fim de garantir a deteco da nova variante sueca
de C. trachomatis (nvCT), a qual causou milhares de
resultados falso-negativos na Sucia e em alguns outros

Infeces por clamdia 71


pases nrdicos que utilizaram NAAT disponibilizados, 5.4.2 Ensaio de diagnstico da Becton,
na poca, pela Roche e pela Abbott (20-22). O sistema Dickinson (BD)
pode detectar mltiplos sinais, que permitem ao ensaio O ensaio da BD para clamdia e gonorreia aprovado
identificar clamdia, gonorreia e um controle interno no pela FDA, o ProbeTec ET (Becton, Dickinson and
competitivo para medir potenciais inibies em cada Company, EUA), foi o primeiro ensaio em tempo real
amostra. A sequncia de controle interno baseada no disponvel comercialmente. Esse teste usa amplificao
DNA de planta, adicionado durante a extrao de DNA, por deslocamento de cadeia (SDA, do ingls strand
para fornecer uma medida da eficincia dessa extrao displacement amplification) isotrmico para amplificar e
e possveis inibies da PCR. Esse o nico ensaio que detectar as sequncias-alvo, simultaneamente, a 52,5C.
fornece uma indicao precisa do sucesso do isolamento A amplificao de uma sequncia do plasmdeo crptico
do DNA. O sistema capaz de processar 96 amostras de clamdia ocorre em uma placa selada com um leitor
por corrida, incluindo trs controles, permitindo que de transferncia de energia fluorescente. Esse esquema
186 amostras e seis controles sejam testados em foi desenhado para minimizar possveis contaminaes
aproximadamente oito horas. ambientais cruzadas, uma vez que as amostras
amplificadas nunca so abertas.
As amostras aprovadas incluem urina e hastes com
secrees vaginais, endocervicais e uretrais. As As amostras aprovadas para o teste ProbeTec incluem
amostras so coletadas utilizando o kit multi-Collect urina e hastes com secreo endocervical e amostra
fornecido pelo fabricante e so mantidas estveis a da uretra. Mais uma vez, as evidncias sugerem que
2-30C por at 14 dias antes de serem testadas. O hastes com secrees vaginais so um tipo de amostra
kit compreende um dispositivo de coleta nico para til, e esto sendo realizados estudos para investigar o
todos os tipos de amostra que podem ser processadas desempenho do ensaio com outros tipos de amostras.
simultaneamente no sistema m2000. A alta estabilidade As amostras em hastes so coletadas utilizando-se o
das hastes contendo amostras e da urina a temperatura kit fornecido pelo fabricante e permanecem estveis
ambiente torna esse ensaio atraente para os a temperatura ambiente por at seis dias antes da
estabelecimentos de sade pblica que enviam amostras realizao do teste. O primeiro jato de urina estvel por
para o laboratrio de referncia. at 24 horas a 4C. Se um conservante for adicionado
amostra, a estabilidade da urina estendida para dois
O ensaio RealTime CT/NG apresenta sensibilidade
dias a temperatura ambiente ou 4-6 dias a 4C.
analtica excelente, sendo comparvel at ao ensaio
APTIMA Combo 2 (23). O processo de purificao de Esse ensaio pode detectar tanto clamdia quanto
DNA desenhado para remover possveis inibidores, gonorreia e permite um timo controle externo de
enquanto o controle interno fornece um alerta em caso amplificao (14). A escolha do teste solicitado
de inibio. O desenho do processo tambm prev a especfica em relao fita (isto , cada fita de oito
remoo de fluorforos que ocorrem naturalmente e amostras deve ser testada para a mesma combinao de
que podem interferir no desempenho do teste. O uso da organismos) de clamdia ou gonorreia.
tecnologia de deteco de fluorescncia homognea com
iniciadores de PCR especficos combina amplificao No entanto, o uso do controle de amplificao
e deteco em um sistema fechado de nico passo. especfico em relao placa, de modo que, ao se
A natureza fechada do sistema reduz a possibilidade realizar uma opo, esta ser aplicada a todas as
de contaminao cruzada e o uso do controle amostras da placa. O teste apresenta-se no formato de
negativo fornece ao usurio um mtodo rpido para a 96 poos, com poos diferentes para cada sequncia-
identificao de contaminao do ambiente. alvo. Dessa forma, se for solicitado o teste para clamdia
e gonorreia e o controle de amplificao, para cada um
desses sero utilizados os poos de trs colunas e um
total de 32 amostras e controles podero ser testados
em uma placa. Alternativamente, se s for pedido o teste

72 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


para clamdia, um total de 96 amostras podero ser As amostras aprovadas incluem urina; hastes com
analisadas em uma placa. secrees vaginais, endocervicais e uretrais; e amostras
coletadas com meio lquido para citologia (12, 26).
Uma vez que o ensaio foi desenhado para ser um
As amostras coletadas por hastes utilizam o meio de
sistema fechado, no foram includos mtodos
transporte fornecido pelo fabricante e so estveis por
enzimticos para degradar contaminantes de
at 60 dias a temperatura ambiente, o que as torna
amplificaes anteriores. Infelizmente, ocorreram vrios
ideais para o transporte a laboratrios distantes. O
episdios de contaminao do ambiente a partir da
primeiro jato de urina estvel por at 24 horas aps
amostra bruta. Esses eventos podem implicar semanas
a coleta e, uma vez colocado no meio do fabricante,
para a completa limpeza e recuperao do ambiente, o
permanece estvel a temperatura ambiente por at
que muitas vezes resulta em atrasos dispendiosos e na
30 dias. O teste APTIMA Combo 2 tambm detecta
necessidade de relocao para uma rea nunca exposta
N. gonorrhoeae (RNAr 16S) e, no total, podem ser
previamente ao ensaio. Os laboratrios que utilizam
analisadas aproximadamente 500 amostras durante
esse ensaio devem aderir rigorosamente a um plano
um perodo de oito horas, utilizando um sistema
de monitoramento ambiental para detectar eventos de
automatizado (o sistema TIGRIS). A popularidade desse
contaminao em tempo hbil. Um ensaio de segunda
ensaio est aumentando rapidamente em muitos
gerao que parece ser mais resistente a esse tipo de
pases devido sua alta sensibilidade, especificidade,
contaminao est sendo avaliado.
estabilidade estendida da amostra e automatizao do
A BD tambm desenvolveu um ensaio de ltima gerao processo.
aprovado pela FDA, o ProbeTec ET CTQx/GCQX no
Uma vez que as amostras continuam seladas aps
Sistema Viper com XTR (Viper). Esse ensaio totalmente
a amplificao, espera-se que a possibilidade de
automatizado e pode gerar 278 resultados em uma nica
contaminao cruzada do ambiente seja muito baixa.
jornada de trabalho de oito horas. Ele usa uma qumica
Entretanto, o monitoramento ambiental altamente
em dupla, que inclui uma deteco de amplificao
recomendado na ausncia de uma medida de controle
pareada com cada reao de deteco de clamdia
enzimtica, ou de outra natureza, da degradao
ou gonorreia. O sistema altamente resistente e tem
do produto amplificado. O fabricante recomenda
excelentes caractersticas cronolgicas de andamento
a adeso rigorosa a procedimentos de limpeza e
(24).
descontaminao. A reprodutibilidade deve ser
monitorada. Alm disso, para uma especificidade
5.4.3 Ensaio de diagnstico da Gen-Probe
ideal, esto disponveis ensaios confirmatrios que
O ensaio APTIMA Combo 2 (Gen-Probe, EUA), aprovado detectam o RNAr 16S especfico de C. trachomatis e o
pela FDA, baseado no princpio de captura do RNAr- RNAr 16S especfico de N. gonorrhoeae (APTIMA GC;
alvo (com a inteno de reduzir ou eliminar a inibio outra sequncia de RNAr 16S comparada utilizada
da amplificao), isto , no isolamento das sequncias no APTIMA Combo 2). Esses ensaios so ideais para a
de RNAr-alvo utilizando oligonucleotdeos de captura e confirmao de resultados positivos, assim como para a
esferas magnticas com DNA, seguido pela amplificao repetio de testes (26).
utilizando a tecnologia de amplificao mediada por
transcrio (TMA, do ingls transcription-mediated 5.4.4 Ensaio de diagnstico da Roche
amplification) de uma sequncia do RNAr 23S de C.
O ensaio Cobas Amplicor CT/NG (Roche Diagnostics,
trachomatis. A amplificao detectada por meio da
EUA), tambm aprovado pela FDA, utiliza a tecnologia de
cintica da emisso de luz por sondas de DNA marcadas
PCR para amplificar as sequncias de DNA-alvo, fazendo
e complementares regio-alvo. Os dados confirmando
uso de pares de iniciadores biotinilados especficos
a ausncia de inibio por esse ensaio foram obtidos
em relao a um organismo. Na clamdia, o alvo est
principalmente por meio do uso de amostras negativas
localizado no plasmdeo crptico. Seguindo um processo
de pacientes, misturadas com cepas laboratoriais de C.
de amplificao intermediado por trs temperaturas,
trachomatis (25).

Infeces por clamdia 73


os produtos so hibridizados em esferas magnticas utilizados tanto no Cobas TaqMan CT v2.0 como no
cobertas por sondas com sequncias especficas Cobas 4800 CT/NG j foram redesenhados e incluem
para cada espcie, localizadas nas sequncias dos dois alvos para clamdia, a fim de garantir a deteco da
iniciadores. O processo de deteco baseado em cepa sueca nvCT (20-22). O segundo alvo no se localiza
interaes entre biotina e avidina. Um equipamento no plasmdeo, mas em regies conservadas do gene
Cobas pode testar aproximadamente 96 amostras, ompA que codifica a principal protena da membrana
incluindo espcimes e controles, em um perodo de externa (MOMP). As caractersticas de desempenho se
oito horas. As amostras so coletadas em um meio enquadram no observado para outros NAAT. Esse ensaio
de transporte disponvel comercialmente. A urina e as fornece um controle de amplificao e um processo de
amostras em hastes so estveis a 4C por at sete preveno de contaminao cruzada juntamente com
dias. Os tipos de espcimes aprovados incluem hastes um sistema totalmente automatizado, que pode testar
com amostras endocervicais e uretrais, meio lquido at 278 amostras em um turno de oito horas. O ensaio
para citologia e o primeiro jato de urina, embora a funciona bem tanto em amostras invasivas quanto
urina de mulheres no deva ser utilizada para o teste em amostras vaginais para mulheres e em urina para
de gonorreia. Demonstrou-se que hastes contendo homens, e ainda est sob avaliao para meios lquidos
secreo vaginal geraram resultados aceitveis por essa de citologia.
plataforma (27, 28).
5.4.5 Outros ensaios NAAT
Esse ensaio inclui uma medida de inibio baseada
Os ensaios descritos anteriormente baseiam-se na
em uma sequncia de DNA irrelevante, adicionada
informao disponvel poca de preparo deste
previamente em cada tubo de reao. Isso tem como
manual. Atualmente, vrios outros NAAT esto em
objetivo fornecer evidncias de que um resultado
desenvolvimento e avaliao e, devido rpida mudana
negativo seja realmente negativo, e no meramente
nesse campo de atuao, pode-se esperar a divulgao
influenciado por contedos na amostra. O ensaio
de novos testes. Os laboratrios devem revisar a
tambm utiliza, na mistura de amplificao, uma
literatura conforme a descrio desses novos mtodos
enzima (uracil-N-glicosilase) que degrada sequncias
for disponibilizada. Alm disso, em muitos lugares,
previamente amplificadas com base na presena de
os ensaios aprovados pela FDA no so prontamente
dUTP no lugar de dTTP no produto amplificado. Isso
liberados ou no podem ser executados devido
fornece ao usurio uma rede de segurana para evitar
necessidade de instrumentao especializada ou altos
pequenos espirros e formao de aerossol, o que ocorre
custos. Em consequncia, os ensaios comercialmente
frequentemente ao se manusear um grande nmero de
disponveis que no foram revisados pela FDA e aqueles
amostras, alm de aumentar a reprodutibilidade dos
desenvolvidos in-house so utilizados como mtodos
resultados.
que oferecem maior sensibilidade comparados a outras
O Cobas TaqMan CT v2.0, com a marca CE na Europa, classes de deteco (por exemplo, EID ou ELISA). Se um
um ensaio de segunda gerao fabricado pela Roche. NAAT no aprovado pela FDA for utilizado, processos
Essa plataforma usa PCR em tempo real e pode ser regulatrios regionais (como os da UE) e/ou nacionais
acoplada a um sistema de processamento automtico devem garantir a qualidade e desempenho do NAAT
para minimizar o tempo de manuseio por tcnicos. O diagnstico (17, 18). Nesses casos, tambm essencial
ensaio pode ser utilizado apenas para clamdia, sem que os laboratrios se mobilizem para a validao
estar associado ao teste de gonorreia. O ensaio de ltima rigorosa do desempenho desses ensaios NAAT antes
gerao da Roche (Cobas 4800 CT/NG), que tambm do seu uso para o fornecimento de resultados aos
pode detectar N. gonorrhoeae, j foi aprovado pela FDA. pacientes; ver tambm o Captulo 2 e o Anexo 3 sobre
Esse ensaio usa a tecnologia de PCR em tempo real em NAAT e sua validao e GQ.
uma plataforma totalmente automatizada. Os iniciadores

74 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


5.5 Mtodos de deteco no baseados em 5.5.2 Testes point-of-care (POC)
cidos nucleicos Os testes ELISA apresentam baixa sensibilidade
e especificidade inferior ideal (especialmente os
5.5.1 Ensaio de imunofluorescncia direta (EID)
ELISA que detectam LPS) quando comparados aos
O EID utiliza um anticorpo monoclonal marcado com NAAT, o que pode requerer um teste confirmatrio de
fluorescncia que permite a visualizao microscpica resultados positivos. Os resultados negativos devem ser
de corpos elementares de C. trachomatis em esfregaos interpretados com cautela devido ao baixo desempenho
celulares coletados da conjuntiva, uretra e endocrvice. do teste, que pode resultar na no deteco de
Este continua sendo o nico tipo de teste que apresenta infeces. Por causa das limitaes apresentadas pelos
a capacidade de avaliar diretamente a qualidade do ELISA, estes no devem ser utilizados quando qualquer
espcime; entretanto, o EID possui sensibilidade abaixo outra opo de teste estiver disponvel.
da ideal, mesmo em relao cultura.
No entanto, diferentemente dos ELISA, os testes
Dois ensaios de anticorpos com fluorescncia direta, o point-of-care (POC) (testes rpidos), que utilizam a
MicroTrak de colorao direta (Trinity Biotech, Irlanda) e tecnologia ELISA, apresentam vantagens que tornam
o Pathfinder de colorao direta (BioRad Laboratories, seu uso conveniente para determinados lugares.
EUA) esto disponveis para a colorao de esfregaos Vrios testes POC, comumente baseados no fluxo
a partir de amostras coletadas da uretra, endocrvice, lateral e captura de antgenos por membrana em tiras
reto, orofaringe e conjuntiva para a visualizao de imunocromatogrficas (TIC), foram desenvolvidos
corpos elementares de clamdia. O ensaio MicroTrak para diagnosticar infeces por C. trachomatis. Muitos
utiliza um anticorpo monoclonal marcado com desses testes foram criados e comercializados,
fluorescena especfico para a MOMP de C. trachomatis e mas no passaram por uma avaliao apropriada e
no apresenta reao cruzada com C. pneumoniae. detalhada. Entretanto, quando comparados aos NAAT,
os testes rpidos apresentam claramente sensibilidade
Em contrapartida, o reagente Pathfinder usa um
insuficiente e s devem ser utilizados quando no houver
anticorpo policlonal especfico para o lipopolissacardeo
estruturas laboratoriais adequadas. O Anexo 2 discute
(LPS) que mais amplamente reativo e colore tanto C.
os princpios dos testes POC. Mesmo com a baixa
pneumoniae quanto C. trachomatis. O uso mais comum
sensibilidade dos testes POC, em lugares com limitaes
de EID a colorao de esfregaos de amostras da
de recursos e com populaes de alta prevalncia, a
conjuntiva, principalmente em recm-nascidos de
queda da sensibilidade pode ser aceitvel em troca da
pases desenvolvidos. Os EID oferecem as vantagens
possibilidade de testar e tratar enquanto o paciente
de rpido retorno de resultado, alta especificidade
ainda est no local da testagem.
e deteco de organismos no viveis. Alm disso,
nenhum outro ensaio comercial apresenta uma clusula Em um estudo de anlise de decises, realizado por
regulamentar para amostras da conjuntiva ou permite Gift et al., quando a taxa de retorno do paciente para
avaliar diretamente a qualidade do espcime. Entretanto, tratamento foi de 65% ou menos, o diagnstico rpido
os EID possuem sensibilidade substancialmente mais por POC proporcionou um aumento no nmero de
baixa que a dos NAAT, so de execuo trabalhosa pacientes tratados, ainda que tenham sido identificadas
no se mostrando adequados para altas demandas menos infeces (30). Os testes POC podem tambm ser
de diagnstico e necessitam de microscopistas utilizados nesses locais para aumentar a especificidade
especializados. Os resultados negativos devem dos algoritmos de gerenciamento sindrmico, o que
ser interpretados com cuidado em razo do baixo ir reduzir o tratamento excessivo e triar infeces
desempenho desses testes, o que pode resultar na no assintomticas.
deteco de infeces.
Os testes rpidos POC oferecem maior oportunidade
de alcanar populaes que no tm acesso a clnicas
e fornecer-lhes tratamento imediato. Em algumas

Infeces por clamdia 75


situaes, o impacto dessa ampliao no tratamento risco biolgico. Aspire o meio do frasco aderente
pode compensar a menor sensibilidade desses testes usando uma pipeta estril e um frasco a vcuo.
quando comparados aos NAAT.
Lave a monocamada com 10mL de soluo
Os testes rpidos POC oferecem maior glicose-potssio-sdio-fosfato (GKNP) (ver Anexo
oportunidade de alcanar populaes que no 4) e aspire.
tm acesso a clnicas e fornecer-lhes tratamento
Adicione 4mL de tripsina e incube as clulas a
imediato. Em algumas situaes, o impacto dessa
temperatura ambiente at que a monocamada se
ampliao no tratamento pode compensar a menor
desprenda do frasco (em aproximadamente 3-7
sensibilidade desses testes quando comparados
minutos). Bata levemente nas laterais do frasco
aos NAAT.
para remover as clulas.

5.6 Metodologias a serem utilizadas apenas Adicione 4mL do meio de Dulbecco modificado
nos laboratrios de referncia por Iscove (IMDM-VGA, do ingls Iscoves
modified Dulbecco medium) (ver Anexo 4) para
5.6.1 Cultura
inativar a tripsina e agite vigorosamente. Use o
At o incio dos anos 80, o mtodo principal e padro lquido para lavar qualquer clula remanescente
ouro para o diagnstico de infeces por C. trachomatis na parede do frasco.
era a inoculao associada centrifugao dos
espcimes clnicos em clulas viveis susceptveis Adicione 1mL da suspenso de clulas para cada
de culturas de tecidos, seguida da demonstrao de frasco novo de 175cm2 e complete com o meio
incluses clamidiais caractersticas aps incubao. Em IMDM-VGA para um volume final de 75mL. Ao
resumo, o espcime coletado utilizando hastes com utilizar frascos de 75cm2, adicione 0,5mL de
extremidades de dacron ou citoescovas e colocado em clulas e complete com meio para um volume
um meio de transporte, como, por exemplo, tampo final de 35mL.
sacarose-fosfato-glutamato (SPG) (ver Anexo 4),
Incube os frascos a 37C por 48-96 horas, com
contendo soro fetal bovino e antibiticos tais como
as tampas bem fechadas.
vancomicina, gentamicina e nistatina, para inibir
o crescimento de outra bactria ou fungo. Embora Cultivo em placas de microtitulao e tubos de ensaio
atualmente esse mtodo deva ser reservado para uso
Siga os passos 1-6 descritos acima.
em laboratrios de referncia, importante manter a
habilidade de obter isolados extrados de pacientes, e Cada placa necessita de 15mL de suspenso
isso requer o uso de cultura de tecidos. celular diluda. Calcule o volume total necessrio
com base no nmero de placas desejado.
5.6.1.1 Cultura de C. trachomatis em linhagens de Exemplo: 10 placas requerem 150mL de
clulas McCoy IMDM-VGA. Cada tubo de ensaio necessita de
Diviso de frascos 1mL de meio de Eagle modificado (MEM-VG, do
ingls Modified Eagles Medium) (Ver Anexo 4).
Verifique se o meio foi esterilizado antes de sua
Calcule o volume total necessrio com base no
utilizao.
nmero de tubos de ensaio desejados.
Verifique visualmente as monocamadas quanto
Para cada 50mL de IMDM-VGA das placas de
aderncia e ausncia de contaminao
microtitulao, adicione 1mL de suspenso
microbiana.
celular do frasco tripsinizado. Exemplo: 150mL
Proceda utilizando uma tcnica estril, de IMDM-VGA necessita de 3mL de clulas. Para
trabalhando em uma capela de conteno de cada 100mL de IMDM-VGA dos tubos de ensaio,
adicione 1mL das clulas.

76 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


Coloque a suspenso de clulas diludas em Aspire as placas contendo as monocamadas
um hemacitmetro. Conte cinco quadrados (os aderidas.
quatro cantos e o meio); a mdia do nmero de
Adicione 100L de cada espcime e imerja na
clulas por quadrado multiplicado por 105 para
monocamada celular. Cada espcime deve ser
fornecer o nmero de clulas por mililitro. As
inoculado em trs monocamadas consecutivas.
placas de microtitulao necessitam de 1-1,4 x
Aps completar a inoculao em cada placa,
10 6 clulas/mL (10-14 clulas por quadrado); os
adicione 200L de IMDM-VGA em cada poo.
tubos de ensaio requerem 7-10 x 105 clulas/
mL para que sejam aderentes em 48 horas. Se Sele as placas com a pelcula de vedao e
o nmero de clulas contadas estiver fora do centrifugue a 1.400g por uma hora a 30C.
intervalo, ajuste a concentrao adicionando Incube a 37C por 48 horas.
IMDM-VGA ou mais clulas ao frasco, como for
mais apropriado. Conte novamente e ajuste at Armazene os espcimes a -70C at que
que se atinja a concentrao correta. os resultados estejam disponveis. Todos os
espcimes positivos so armazenados por mais
Adicione 200L em cada poo. Sele as placas de duas semanas.
com a pelcula de vedao. Adicione 1mL em
cada tubo de ensaio e tampe bem. Incube a 37C Remova o meio das placas. Fixe as
at que as placas sejam utilizadas (48-96 horas). monocamadas cobrindo-as com metanol por 10
minutos. Remova o metanol.
Inoculao em placas de microtitulao
Inoculao em tubos de ensaio
Confira a aderncia da monocamada de clulas
McCoy. As clulas devem estar encostadas umas Somente os espcimes excepcionais so
nas outras e levemente amontoadas. O meio cultivados em tubos de ensaio. Alguns exemplos
deve estar transparente. incluem bipsias endometriais ou tubrias e
tecidos linfticos.
Os espcimes a seguir devem ser testados no
formato de microtitulao: cervicais, uretrais, Confira a aderncia das clulas McCoy nos
vaginais, do reto, da orofaringe e da conjuntiva. tubos; as clulas devem estar encostadas umas
nas outras e levemente alongadas. O meio deve
Agite vigorosamente (em vrtice) as amostras por estar transparente.
cinco segundos e ento, se possvel, sonifique
por 20 segundos. Durante a sonificao, deve-se Agite vigorosamente (em vrtice) os espcimes
utilizar proteo nos ouvidos e olhos. por cinco segundos e ento sonifique-os por 20
segundos. Durante a sonificao deve-se utilizar
Os espcimes que exibirem ampla contaminao proteo nos ouvidos e olhos.
bacteriana (por exemplo, meio de transporte
turvo ou mudana de pH no meio) podem causar Os espcimes que exibirem ampla contaminao
toxicidade cultura de tecido. Esses espcimes bacteriana (por exemplo, meio de transporte
devem ser testados das seguintes formas: sem turvo ou mudana de pH no meio) podem causar
estarem diludos; diludos a 1:2; e diludos a 1:10 toxicidade cultura de tecido. Esses espcimes
(em SPG). devem ser testados das seguintes formas: sem
estarem diludos; diludos a 1:2; e diludos a 1:10
Trabalhe em uma capela de conteno de risco (em SPG).
biolgico, colocando metade de cada espcime
no criotubo com o mesmo nmero do espcime. Trabalhando na capela, etiquete e aspire trs
tubos de ensaio por espcime. Adicione 0,2mL

Infeces por clamdia 77


de espcime a cada tubo. Acrescente 1mL de especificidade (mas pode ocorrer contaminao cruzada
IMDM-VGA. entre amostras), e para o teste de cura, que solicitado
em menos de 14 dias aps o tratamento. Na verdade,
Centrifugue a 2.500g por uma hora a 30C.
a especificidade dos NAAT tanta que esses ensaios
Incube a 37C por 72 horas.
tambm deveriam ser aceitos para os casos mdico-
Armazene todos os espcimes a -70C at que legais; mas a confiana na cultura reflete a lentido
os resultados estejam disponveis. Todos os das mudanas nos padres legais. O teste de cura
espcimes positivos so armazenados por tempo raramente realizado, dada a eficincia dos tratamentos
indeterminado. de dose nica disponveis. No entanto, alguns estudos
recentes indicaram uma eficcia de erradicao abaixo
Aspire o meio de um tubo por espcime e fixe-o do ideal para o uso de 1g de azitromicina. Se realizado,
cobrindo a monocamada com metanol por 10 o teste normalmente executado em mais de duas
minutos. ou trs semanas aps o tratamento em cada local. Na
Marque com anticorpos fluorescentes. maioria dos casos, os ensaios de NAAT so apropriados
para essa finalidade, uma vez que a perda de DNA da
Siga as instrues do manual para o anticorpo infeco inicial j deve estar completa nesse momento.
anticlamdia especfico utilizado. Em geral: Entretanto, o tempo ideal para a realizao do teste de
cura pode diferir para os NAAT baseados em RNA.
Adicione o antissoro monocamada fixada
(aps a remoo do metanol). Cada poo de Dessa forma, a menos que os isolados dos organismos
microtitulao recebe 40L utilizando-se uma sejam requeridos para fins de pesquisa, no h uma
micropipeta multicanal. justificativa vlida para o uso da cultura como um
mtodo de diagnstico de rotina. Isso consistente com
Incube a temperatura ambiente por 30 minutos.
as recomendaes das diretrizes laboratoriais atuais
Lave gentilmente trs vezes com soluo para doenas sexualmente transmissveis dos CDC (15).
salina tamponada com fosfato (PBS, do ingls
Os isolados recuperados nos locais em que a cultura
phosphate-buffered saline solution) (ver Anexo 4).
ainda realizada deveriam ser preservados em um
As lamnulas redondas de 13mm so removidas repositrio de espcimes para estudos epidemiolgicos.
dos tubos de ensaio e, utilizando-se fluido de Esses estudos podem incluir a investigao da
montagem, colocadas em lminas de vidro com susceptibilidade antimicrobiana (ver adiante) e a
lamnulas de 22x50mm. Mantenha as culturas determinao de gentipos. Esta ltima pode ser
marcadas no escuro at que sejam lidas. As realizada mediante tcnicas moleculares e no necessita
culturas devem ser lidas no mesmo dia em que o uso de organismos viveis (31-33). Assim, os
forem marcadas. repositrios de amostras positivas para NAAT tambm
devem ser mantidos nas diferentes regies do mundo.
Na maioria dos laboratrios, a cultura no mais
adequada como teste de diagnstico, uma vez que
apresenta menor sensibilidade que os NAAT, implica
tempo de retorno do resultado significativamente
longo, demanda o uso de amostras invasivas, requer
condies de manipulao mais restritivas para
preservar a viabilidade de C. trachomatis, tecnicamente
complexa e no possui uma metodologia padronizada
internacionalmente e de qualidade garantida. A cultura
hoje requisitada predominantemente para uso em
casos mdico-legais, devido suposio de 100% de

78 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


A cultura apresenta uma sensibilidade abaixo da os repositrios de isolados sero de utilidade para a
ideal quando comparada aos NAAT disponveis avaliao retrospectiva em instituies de pesquisa.
comercialmente e aprovados internacionalmente, e
no pode ser recomendada para diagnstico se um
5.6.3 Sorologia
NAAT apropriado estiver disponvel e for acessvel Os mtodos sorolgicos para o diagnstico das infees
economicamente. por clamdia esto entre as tecnologias mais modernas
disponveis. Esses mtodos identificam e, em alguns
A capacidade da realizao de cultura deve ser casos, titulam o nvel da resposta do anticorpo aos
mantida em alguns laboratrios de referncia, antgenos da clamdia. Enquanto o primeiro ensaio,
e o repositrio de isolados deve ser conservado fixao complementar e microimunofluorescncia
para possveis estudos genticos e/ou fenotpicos (MIF) dependiam de organismos inteiros, os ensaios
futuros. subsequentes foram desenvolvidos para apresentar
respostas especficas a protenas individuais ou classes
5.6.2 Teste de susceptibilidade antimicrobiana de anticorpos. A sorologia pode ajudar o diagnstico e/
No h evidncias inequvocas da emergncia de ou a triagem de infeces complicadas de C. trachomatis
resistncia adquirida homotpica (fenotpica e genotpica) (artrite reativa, PID, gravidez ectpica, infertilidade
e estvel aos antibiticos recomendados em isolados por fator tubrio); diagnosticar pneumonia neonatal e
clnicos de C. trachomatis, embora registros de casos infeces de LGV (ver Captulo 11); e pode ainda ser
tenham sugerido a resistncia bacteriana como til em pesquisa e estudos epidemiolgicos, como, por
causa de falhas teraputicas. Alm disso, o teste exemplo, para o histrico cumulativo de exposies
de susceptibilidade antimicrobiana in vitro para C. de uma populao amostral a infeces por clamdia.
trachomatis nunca foi realizado rotineiramente; no h Entretanto, importante que os resultados sorolgicos
uma metodologia aceita universalmente, padronizada, sejam sempre interpretados com cautela e no fora de
reprodutvel e com qualidade garantida; e tambm no contexto.
foi realizada uma correlao baseada em evidncias
entre a atividade in vitro e a eficincia in vivo (desfechos Em uma infeco primria aguda por clamdia,
de tratamentos clnicos) (34). podem-se detectar IgM especficas, assim como IgG
e IgA. No entanto, muitas vezes a resposta sistmica
O teste de susceptibilidade antimicrobiana para C. de anticorpo retardada ou no mensurvel aps
trachomatis envolve grande demanda de mo de infeco urogenital descomplicada. Em contrapartida,
obra, requer experincia em cultura de tecidos e s nveis altos de anticorpos contra C. trachomatis podem
vivel em laboratrios de referncia. Entretanto, persistir muito tempo aps a eliminao da infeco.
no se deve excluir a possibilidade de uma futura Consequentemente, devido baixa sensibilidade e
emergncia e propagao da resistncia antimicrobiana especificidade, a mensurao de anticorpos contra
clinicamente relevante em C. trachomatis. Isso enfatiza clamdia de pouco valor para o diagnstico de
a necessidade de uma avaliao adequada dos atuais infeces agudas por C. trachomatis e no deve
mtodos de teste de susceptibilidade antimicrobiana e ser usada para o diagnstico de rotina de infeces
do desenvolvimento de um mtodo efetivo, padronizado, descomplicadas por C. trachomatis.
objetivo e de qualidade garantida, assim como uma
correlao apropriada entre a atividade in vitro e o
resultado do tratamento. Esse mtodo pode ser til no
futuro para o monitoramento de possveis resistncias
antimicrobianas, estudos de tratamentos clnicos e
acesso atividade in vitro de novos antibiticos. Na
ocorrncia de eventos de propagao de resistncia
antimicrobiana clinicamente relevante em C. trachomatis,

Infeces por clamdia 79


No utilize a sorologia para o diagnstico de 7. Annan NT et al. Rectal chlamydiaa reservoir
infeces urogenitais descomplicadas por C. of undiagnosed infection in men who have sex
trachomatis. with men. Sexually Transmitted Infections, 2009,
85(3):176179.
Somente use a sorologia como uma possvel ajuda
para o diagnstico e/ou triagem de infeces 8. Schachter J et al. Nucleic acid amplification tests
complicadas por C. trachomatis, pneumonia in the diagnosis of chlamydial and gonococcal
neonatal e infeces de LGV, assim como em infections of the oropharynx and rectum in men who
estudos epidemiolgicos. have sex with men. Sexually Transmitted Diseases,
2008, 35(7):637642.

9. 9. Rosenberger JG et al. Reactions to self-


5.7 Referncias sampling for ano-rectal sexually transmitted
infections among men who have sex with men: a
1. Schachter J et al. Confirming positive results
qualitative study. Archives of Sexual Behavior, 2011,
of nucleic acid amplification tests (NAATs) for
40(2):281288.
Chlamydia trachomatis: all NAATs are not created
equal. Journal of Clinical Microbiolowgy, 2005, 10. 10. Dodge B et al. Field collection of rectal samples
43(3):13721373. for sexually transmitted infection diagnostics among
men who have sex with men. International Journal
2. Martin DH et al. Use of multiple nucleic acid
of STD and AIDS, 2010, 21(4):260264.
amplification tests to define the infected-patient
gold standard in clinical trials of new diagnostic 11. 11. Black CM et al. Head-to-head multicenter
tests for Chlamydia trachomatis infections. Journal comparison of DNA probe and nucleic acid
of Clinical Microbiology, 2004, 42(10):47494758. amplification tests for Chlamydia trachomatis
infection in women performed with an improved
3. Masek BJ et al. Performance of three nucleic acid
reference standard. Journal of Clinical Microbiology,
amplification tests for detection of Chlamydia
2002, 40(10):37573763.
trachomatis and Neisseria gonorrhoeae by use
of self-collected vaginal swabs obtained via an 12. 12. Gaydos CA et al. Performance of the APTIMA
Internet-based screening program. Journal of Combo 2 assay for detection of Chlamydia
Clinical Microbiology, 2009, 47(6):16631667. trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in female
urine and endocervical swab specimens. Journal of
4. Hobbs MM et al. From the NIH: proceedings of
Clinical Microbiology, 2003, 41(1):304309.
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vaginal specimens for detection of sexually 13. 13. Horner P et al. Enhanced enzyme immunoassay
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5. Bachmann LH et al. Nucleic acid amplification
men. Journal of Clinical Microbiology, 2005,
tests for diagnosis of Neisseria gonorrhoeae and
43(5):20652069.
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2004. Sexually Transmitted Diseases, 2009,
2001, 39(3):10081016.
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80 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


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RealTime CT/ NG for detection of Chlamydia
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14(5):262268.
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associated with inhibition and removal of inhibitory concentration of Chlamydia trachomatis added can
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Infeces por clamdia 81


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2005, 191(6):917923.

82 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


Captulo 6 os programas de controle de DST e definir os alvos
apropriados para a triagem. A distribuio especfica da
infeco em homens por idade ainda no foi estudada
Tricomonase adequadamente.

A segunda diferena que, embora o T. vaginalis


6.1 Introduo dependa da transmisso sexual para mover-se de
O Trichomonas vaginalis o agente etiolgico da hospedeiro para hospedeiro, a distribuio das infeces
doena sexualmente transmissvel (DST) no viral diagnosticadas em laboratrio altamente desigual
mais prevalente em todo o mundo. Em 2008, a entre homens e mulheres, com uma razo de sexos de
Organizao Mundial da Sade estimou a ocorrncia at 4:1 (6-8). Essa distribuio demonstrada pelas
de 276,4 milhes de novos casos de T. vaginalis taxas de infeco de parceiros masculinos de mulheres
mundialmente entre adultos com 15-49 anos. Isso infectadas, que varia de 22% a 72% (9), e dos poucos
representa, substancialmente, mais casos de DST do estudos realizados simultaneamente em homens e
que os causados por Chlamydia tracomatis e Neisseria mulheres. Isso ocorre provavelmente pelo fato de a
gonorrhoeae juntas (1). Apesar da alta prevalncia de infeo em homens ser mais transitria, pelo curto
infeces causadas por T. vaginalis, os esforos para perodo em que a deteco do organismo possvel e
o controle das DST tm, historicamente, subestimado pela ausncia de triagem e diagnstico em homens. O
esse patgeno. Embora T. vaginalis possa causar T. vaginalis adere membrana mucosa associada ao
um corrimento vaginal anormal (tricomonase) em epitlio escamoso, mas no invade a mucosa. Devido
mulheres e ser responsvel por at 10-12% dos ao ambiente da uretra masculina, menos provvel que
casos de uretrites no gonoccicas em homens (2), a o organismo se mantenha nesse local do que no meio
infeco pode ser assintomtica em pelo menos 50% vaginal. Existem dados limitados sobre a patognese
das mulheres e 70-80% dos homens (3). Assim, o da infeco por T. vaginalis em homens (8). Em homens
diagnstico laboratorial essencial para complementar e mulheres, o organismo normalmente promove uma
as estratgias de gesto sindrmica para o tratamento resposta inflamatria robusta, que resulta no corrimento
dessa infeco. tpico da doena j instalada. Ver Tabela 6.1 para a
descrio das manifestaes clnicas da infeco por T.
O T. vaginalis um protozorio mvel, ovoide, em vaginalis.
formato de pera e flagelado (10-20m de comprimento).
Os organismos apresentam quatro flagelos anteriores O diagnstico de tricomonase baseado no odor,
livres e um quinto flagelo imerso em uma membrana qualidade e quantidade de corrimento vaginal, no
ondulada que se estende anteriormente at cerca de dois pH vaginal e na possvel presena de friabilidade
teros da clula. Esse flagelo impele o protozorio com cervical. Normalmente, o pH vaginal >6.0, o corrimento
movimentos irregulares. exacerbado ou branco espumoso e a friabilidade
cervical pontuada (colo do tero com aspecto de
A epidemiologia de infeces por T. vaginalis difere morango) so sugestivos de infeco por T. vaginalis.
em dois importantes aspectos de outras infeces que Entretanto, a ausncia desses sinais clnicos no
causam corrimento vaginal. Primeiro, a faixa etria suficiente para eliminar a possibilidade de infeco,
em que a infeco incide distinta daquela na qual principalmente devido ao fato de esta ser assintomtica
ocorre a infeco por clamdia ou gonorreia. Nessas em aproximadamente 50% das mulheres e 70-80%
ltimas, em menor medida no que se refere infeco dos homens (5,6). Consequentemente, os mtodos
gonoccica, o pico de prevalncia ocorre em mulheres laboratoriais so necessrios para aumentar a
com 15-25 anos, enquanto que as infeces por T. sensibilidade e a especificidade do diagnstico.
vaginalis apresentam o seu pico substancialmente
mais tarde na vida (entre 40-50 anos de idade). Essa
diferena na distribuio relevante para orientar

Tricomonase 83
Tabela 6.1: Manifestaes clnicas da infeco por Trichomonas vaginalis
Infeco genital Primria Sequelas
Mulheres Corrimento exacerbado, purulento ou Desfechos negativos da gravidez,
espumoso branco a amarelo; disria; aumento do risco de transmisso e
dor plvica; prurido infeco por HIV
Homens Corrimento uretral, disria, dor no Possvel epididimite e prostatite
testculo

A resposta inflamatria da tricomonase em mulheres aproximadamente trs vezes maiores em relao a


e da uretrite causada por T. vaginalis em homens esta ltima, o diagnstico apropriado e o tratamento da
significativa e aumenta substancialmente o risco infeco por T. vaginalis merece maior priorizao.
de transmisso e infeco por HIV, como tambm a
As infeces por T. vaginalis so as DST no virais
probabilidade de desfechos negativos da gravidez.
mais comuns, as quais aumentam o risco de
Em homens, o tratamento de uretrite causada por
transmisso e infeco por HIV, alm de elevar a
T. vaginalis resulta em uma diminuio de 0,5-2
probabilidade de desfechos negativos da gravidez.
log da carga viral do HIV no lquido seminal (10, 11).
Resultados similares foram observados em mulheres
6.2 Reviso dos mtodos de diagnstico
que receberam tratamento para o corrimento vaginal
disponveis
(12, 13). Uma vez que a carga viral no compartimento
genital um dos principais fatores de risco para Existem quatro classes principais de ensaios de
a transmisso para um parceiro no infectado, o diagnstico laboratorial: microscopia de preparao
diagnstico apropriado e o tratamento das infeces a fresco, deteco de antgenos, cultura e testes de
por T .vaginalis devem ser prioridade na sade pblica amplificao de cidos nucleicos (NAAT, do ingls
como estratgia de enfrentamento ao HIV. Da mesma nucleic acid amplification test). A microscopia de
forma, dados disponveis h muitos anos indicam que preparao a fresco pode ser realizada em clnicas e
a presena de corrimento resultante de DST aumenta em combinao com testes para vaginose bacteriana.
o risco de infeco por HIV. Estudos realizados na Esse um mtodo de diagnstico de primeira linha
frica subsaariana estimaram que o aumento do risco ideal, isto , quando realizado e interpretado de forma
de soroconverso em mulheres com tricomonase adequada, fornece um diagnstico definitivo com alta
de 1,5-3,0 vezes (9). Esses estudos foram conduzidos especificidade. Entretanto, preciso usar de cautela ao
em populaes de mulheres em alto risco para HIV descartar a possibilidade de infeco com base somente
(profissionais do sexo) e em populaes mais gerais na microscopia negativa, devido a trs razes. Primeiro,
(mulheres atendidas em clnicas de planejamento os tricomonaddeos so sensveis a temperaturas altas
familiar). Anlises de sobrevivncia realizadas durante e perdem sua mobilidade em at 10 minutos aps a
longos ensaios clnicos estimaram um aumento de coleta da amostra. Uma vez que a mobilidade uma
duas vezes quanto ao risco relativo de infeco por marca caracterstica, sua perda pode resultar em
HIV por mulheres com tricomonase durante um resultados falso-negativos. Segundo, o tamanho dos
perodo de 30 meses (14). Por outro lado, mulheres tricomonaddeos similar ao das clulas brancas do
com HIV apresentaram um aumento de 2,1 vezes no sangue (linfcitos ou pequenos granulcitos neutrfilos),
risco de adquirir trichomonas durante os 30 meses que esto comumente presentes como resultado do
de acompanhamento (14). Isso indica um aumento de processo inflamatrio. Assim, os tricomonaddeos podem
risco de transmisso do HIV a parceiros no infectados. ser confundidos com esses tipos de clulas. Finalmente,
Dado o maior risco de transmisso do HIV, semelhante em muitas mulheres e na maioria dos homens, a carga
ao observado para gonorreia, e taxas de prevalncia do organismo pode ser inferior ao limite de deteco da

84 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


microscopia. Alm das amostras vaginais, a microscopia lugares a ser utilizados e antes da implementao para o
pode ser realizada em secrees uretrais ou sedimentos diagnstico de rotina nos laboratrios.
urinrios de homens, mas essa tcnica apresenta baixa
Uma srie de mtodos foram descritos para a deteco
sensibilidade, provavelmente tambm devido baixa
de anticorpos contra T. vaginalis. No entanto, os
carga de organismos (15).
testes de anticorpos apresentam baixa sensibilidade
Os testes point-of-care (POC) de deteco de antgeno e especificidade inferior ideal para a deteco de
esto atualmente disponveis em muitos lugares. Esses infeces por T. vaginalis, e no devem ser utilizados
so aprovados apenas para amostras vaginais. A ltima para o diagnstico de rotina de tricomonases.
gerao desses testes, por exemplo, o Teste Rpido
A Tabela 6.3 resume as caractersticas de desempenho
para Trichomonas OSOM (Genzyme Diagnostics, EUA),
dos testes de diagnstico disponveis para a deteco
apresenta uma sensibilidade maior quando comparado
de T. vaginalis. Para o desempenho apropriado de
microscopia (16, 17 ) e pode fornecer resultados
todos os mtodos de diagnstico, essencial seguir
em aproximadamente 30 minutos, isto , enquanto o
precisamente os procedimentos operacionais-padro
paciente espera. Assim como em outros ensaios POC,
e recomendaes dos fabricantes quanto coleta,
a oportunidade de tratar as infeces imediatamente
transporte e armazenamento das amostras, assim
uma vantagem desse teste em relao queles que
como o desempenho do ensaio especfico, incluindo os
necessitam de encaminhamento a um laboratrio
controles de qualidade.
central.
Os testes POC apropriados e a cultura apresentam
As culturas laboratoriais foram utilizadas por muitos
maior sensibilidade que a microscopia.
anos e, na ltima dcada, kits de cultura disponveis
comercialmente, tais como o sistema de cultura InPouch Os NAAT apropriados e validados apresentam
TV (BioMed Diagnostics, EUA), tornaram-se acessveis. sensibilidade superior a outros mtodos de
Amostras vaginais, da uretra e de sedimentos urinrios diagnstico.
de homens so espcimes licenciados para a cultura
(ver Tabela 6.2). Esse mtodo exige at 5-7 dias aps a 6.3 Condies de coleta, transporte e
coleta e a determinao de resultados positivos requer armazenamento de espcimes (ver
a avaliao por microscopia. Entretanto, a cultura Tabela 6.2)
aumenta a sensibilidade para alm daquela observada na
Mulheres
microscopia de preparao a fresco (15, 17 ).
As amostras vaginais so ideais para a deteco de T.
Finalmente, os NAAT esto disponveis para a deteco
vaginalis. A coleta de amostra do frnice posterior deve
do DNA ou RNA especfico de T. vaginalis. Em programas
ser realizada por meio de uma haste de plstico com
que empregam os NAAT para clamdia e gonorreia,
extremidades de dacron ou rayon. As hastes de madeira
a incluso do teste para T. vaginalis pode ser uma
com extremidades de algodo so aceitveis para
estratgia razovel. At a escrita do presente manual,
microscopia ou inoculao de culturas, mas no so
a Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados
recomendadas para POC ou NAAT. Dessa forma, para
Unidos da Amrica (FDA, do ingls United States of
evitar confuses, mais prtico evitar o uso de hastes
America Food and Drug Administration) aprovou apenas
com extremidades de algodo. Os mdicos devem
um ensaio, mas outros ensaios esto sob avaliao
coletar as amostras antes da insero do espculo
e j podem estar disponveis em alguns lugares. A
durante os exames plvicos, ou o prprio paciente pode
sensibilidade e a especificidade do ensaio aprovado
obter a amostra. necessrio orientar os pacientes
pela FDA (APTIMA TV, Gen-Probe, EUA) so muito
para que estes entendam como coletar sua prpria
altas (5, 16, 18). As caractersticas de desempenho de
amostra. O fornecimento de instrues adequadas um
outros NAAT devem ser avaliadas rigorosamente, de
fator determinante para a concordncia do paciente em
preferncia em relao ao teste aprovado pela FDA, nos
coletar sua prpria amostra. As amostras residuais

Tricomonase 85
vaginal, cervical ou de urina coletadas para o teste de ou rayon. Essas amostras podem ser usadas para a
clamdia/gonorreia podem ser utilizadas para o NAAT de microscopia de preparao a fresco, para a cultura
T. vaginalis. ou para o NAAT. O primeiro jato de urina pode ser
centrifugado para a obteno do sedimento apropriado
Homens
para a cultura. A urina no centrifugada adequada para
Secrees da uretra podem ser coletadas utilizando-se o NAAT.
uma haste de alumnio com extremidade de dacron

Tabela 6.2: Coleta, transporte e armazenamento de amostras


Local Aparato Procedimento de Microscopia POC Cultura NAAT
de coleta amostragem
Vaginal Haste/ Colete a amostra Dilua a Coloque a Coloque a Coloque a
(coletado plsticoa do frnice amostra em amostra no amostra amostra no
pelo mdico) posterior antes 0,5mL de tampo de diretamente em aparato de
da insero do soluo salina extrao do meio de cultura coleta do
espculo. e aplique kit e siga as (por exemplo, fabricante.
uma gota da instrues meio de Diamond Pode ser
soluo na do manual. ou InPouch).b enviada seca
lmina com Incube a 37C. ao laboratrio.
lamnula. Armazene e
transporte de
acordo com as
instrues do
manual.
Vaginal Haste/ Gire a haste 360, Entregue a Entregue a Entregue a Coloque a
(coletado plsticoa tocando todas as amostra ao amostra ao amostra ao amostra no
pelo paciente) paredes vaginais. fornecedor fornecedor fornecedor para aparato de
para a diluio para a inoculao em coleta do
e preparao que seja meio de cultura. fabricante.
da lmina. processada Pode ser
como enviada seca
descrito ao laboratrio.
acima. Armazene e
transporte de
acordo com as
instrues do
manual.

86 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


Tabela 6.2: Coleta, transporte e armazenamento de amostras (continuao)
Local Aparato Procedimento de Microscopia POC Cultura NAAT
de coleta amostragem
Uretra Haste/ Colete secrees Dilua a NA Coloque a Coloque a
(apenas em alumnioc da uretra >1 hora amostra em amostra amostra no
homens aps a ltima 0,5mL de diretamente em aparato de
sintomticos) urina. soluo salina meio de cultura coleta do
e aplique (por exemplo, fabricante.
uma gota da meio de Diamond Armazene e
soluo na ou InPouch).b transporte de
lmina com Incube a 37C. acordo com as
lamnula. instrues do
manual.
Urina Copo O paciente no Centrifugue NA Centrifugue Coloque a
estril deve limpar a rea a amostra a amostra a amostra no
para genital. Obter a a 500g por 500g por cinco aparato de
coleta de primeira parte do cinco minutos. minutos. Coloque coleta do
urina jato de urina (em Coloque o o sedimento fabricante.
geral, menos que sedimento em um meio Armazene e
25mL), >1 hora em 0,5 de cultura (por transporte de
aps a ltima de soluo exemplo, meio acordo com as
urina. salina. Aplique de Diamond ou instrues do
uma gota da InPouch).b Incube manual.
soluo na a 37C.
lmina com
lamnula.

NA: no se aplica; NAAT: teste de amplificao de cidos nucleicos; POC: testes point-of-care.
a
Hastes de plstico com extremidades de dacron ou rayon.
b
Para lugares que no tm acesso a meio de cultura, as hastes podem ser colocadas em tubos contendo meio Amies, sendo armazenadas a 4C e
transportadas ao laboratrio central em at 24 horas.
c
Haste de alumnio com extremidades de dacron ou rayon.

Tricomonase 87
Tabela 6.3: Caractersticas de desempenho dos testes de diagnstico para a deteco de T. vaginalis
Microscopia POC Cultura NAAT
Tipos de espcime
Haste com amostra No No No Sim
endocervical
Meio lquido para citologia No No No Sim
Haste com amostra vaginal

Obtida pelo paciente Sim Sim Sim Sim


Coletada pelo mdico Sim Sim Sim Sim
Urina

Feminina No No No Sim
Masculina Sim No Sim Sim
Haste com amostra uretral Sim No Sim Sim
masculina
Desempenho
Sensibilidade Baixa Altaa Moderada-alta Muito alta
Especificidade Muito alta Muito alta Muito alta Muito alta
Outras consideraes
Custo Baixo Moderado Moderado Alto
Transporte e NA NA Ambiente Ambiente
armazenamento
Instrumentao Microscpio Nenhuma Estufa, microscpio Grande infraestrutura
Rendimento/automatizao Baixo/no Baixo/no Baixo/no Alto/possvel
Complexidade tcnica Moderada Baixa Moderada (experincia Alta
(experincia em em microscopia)
microscopia)
Nvel de infraestrutura do Perifrica Perifrica Intermedirio-central Central
laboratrio
Outros comentrios Resultados As infeces necessrio necessria a
falso-negativos identificadas um mximo de adeso estrita aos
so mais podem ser ateno para uma protocolos, devido
provveis que tratadas microscopia precisa. possibilidade
resultados antes que de contaminao
Com a probabilidade
negativos o paciente laboratorial.
de obter isolados
reais. Assim, o deixe a
viveis, til para Alguns exigem
contexto clnico clnica.
testes adicionais, grandes lotes, o
essencial.
como a determinao que pode atrasar o
de gentipos e o teste tempo de entrega
de susceptibilidade de resultados.
antimicrobiana.

NA: no se aplica; NAAT: teste de amplificao de cidos nucleicos; POC: teste point-of-care.
a
Refere-se ao teste rpido para trichomonas OSOM (Genzyme Diagnostics, EUA).

88 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


6.4 Mtodos de diagnstico A microscopia deve ser realizada e interpretada em
at 10 minutos para obter bons resultados e uma
6.4.1 Microscopia
maior sensibilidade em mulheres sintomticas.
Imediatamente aps a coleta, as amostras so diludas
em 0,5mL de soluo salina estril a temperatura
ambiente, e uma lmina deve ser preparada com uma 6.4.2 Testes point-of-care (POC) com deteco
gota da amostra em soluo salina e uma lamnula. A de antgenos
lmina deve ser analisada com um aumento de 100x, Vrios ensaios de deteco de antgenos foram
em at 10 minutos aps a coleta, para visualizar os desenvolvidos para a identificao de T. vaginalis (16,
tricomonaddeos mveis. A confirmao da morfologia 17, 20). As exigncias de equipamentos e os custos dos
em formato de pra, incluindo a visualizao do reagentes variam, assim como o desempenho do ensaio.
flagelo, deve ser realizada utilizando um aumento Vrios desses ensaios so direcionados apenas para o
de 400x (Figura 6.1). As clulas no mveis no uso em mulheres sintomticas, tornando-os menos teis
podem ser diagnosticadas como tricomonaddeos e, que as outras opes. A ltima gerao desses testes,
consequentemente, importante que a microscopia como, por exemplo, o Teste Rpido para Trichomonas
seja realizada imediatamente, uma vez que os OSOM (Genzyme Diagnostics, EUA) apresenta maior
organismos perdem rapidamente sua mobilidade (19). A sensibilidade quando comparado microscopia (16,
sensibilidade da microscopia limitada (apenas 40-65% 17 ). Os procedimentos iro variar de acordo com
para mulheres em alguns lugares, e ainda menos o fabricante, e as instrues do manual devem ser
para amostras de homens) (6, 15, 16) e os resultados seguidas precisamente para cada ensaio.
negativos devem ser interpretados com cautela.
Os testes POC apropriados apresentam sensibilidade
Em alguns lugares, a microscopia constitui o diagnstico substancialmente maior que a microscopia e fornecem
e triagem de primeira linha e as amostras negativas so resultados rpidos com um mnimo de experincia
encaminhadas a um laboratrio central para maiores tcnica.
avaliaes, principalmente as de indivduos sintomticos.
Os testes POC apropriados apresentam
Entretanto, quando a mobilidade do organismo,
sensibilidade substancialmente maior que a
estritamente exigida, e a morfologia so identificadas,
microscopia e fornecem resultados rpidos com
a especificidade da microscopia excelente e todos
um mnimo de experincia tcnica.
os pacientes com microscopia positiva devem ser
considerados infectados.

A microscopia necessita ser realizada e interpretada em 6.4.3 Cultura


at 10 minutos para obter bons resultados e uma maior Por muitos anos, a cultura foi fundamental para
sensibilidade em mulheres sintomticas. o diagnstico de T. vaginalis. O T. vaginalis um
organismo anaerbico, que cresce muito devagar
em condies aerbicas. Atualmente, a cultura
normalmente realizada utilizando-se o meio de Diamond
modificado ou o sistema de cultura InPouch TV (BioMed
Diagnostics, EUA) (Figura 6.2). As culturas devem ser
incubadas por at 5-7 dias. importante ressaltar que o
T. vaginalis deve crescer no fundo do tubo de cultura e,
consequentemente, os tubos necessitam ser incubados
em uma posio vertical. Alm disso, o meio de cultura
deve ser pr-reduzido e os tubos de cultura levemente
Figura 6.1 abertos antes de serem colocados no recipiente
Trichomonas vaginalis em microscopia de anaerbico para incubao a 37C.
preparao a fresco.

Tricomonase 89
O meio de Diamond original (21, 22) (ver Anexo 4) foi a ponta. importante ressaltar que a espessura da bolsa
subsequentemente modificado de acordo com Fouts requer que todos os planos de foco sejam avaliados;
e Kraus, isto , com a substituio da estreptomicina isso exige a movimentao do topo para o fundo e de
por netilmicina (22, 23). O meio modificado melhora a um lado para o outro. As lminas devem ser avaliadas
sensibilidade em aproximadamente 75% em relao diariamente at o quinto dia. Se nenhum trichomonas for
aos NAAT. No entanto, a cultura de T. vaginalis tambm identificado at o dia 5, a cultura considerada negativa.
apresenta desvantagens. A sensibilidade da cultura
A cultura tem sensibilidade similar dos testes POC
baixa se comparada aos resultados obtidos por NAAT
apropriados, mas tambm pode ser utilizada para
(principalmente para homens), alm de constituir um
realizar exames em homens.
procedimento que demanda muito tempo e requer que
os pacientes voltem para buscar os resultados. Outros
meios de cultura tambm foram descritos (22, 24-26)
(ver Anexo 4). As amostras coletadas por hastes devem
ser diludas, ou os sedimentos de urina inoculados,
diretamente no meio de cultura na clnica. Nos lugares
que no tm acesso a meio de cultura, devido ao prazo
de validade curto ou outras razes, as hastes podem ser
colocadas em tubos contendo meio Amies, armazenadas
a 4C e transportadas ao laboratrio central em at 24
horas. As culturas devem ser misturadas gentilmente,
coletando-se uma gota do fundo do tubo (onde h maior
concentrao de tricomonaddeos) para microscopia de
preparao a fresco, diariamente, por at sete dias. Se
no for possvel realizar o exame todos os dias, o exame Figura 6.2
realizado aps 3-4 dias e novamente no stimo dia ir Sistema de cultura InPouch TV.
detectar quase todos os espcimes positivos.

Em meados dos anos 90, um sistema de cultura 6.4.4 Testes de amplificao de cidos
tornou-se comercialmente disponvel, ampliando o uso nucleicos (NAAT)
de cultura para diagnstico (22, 27-30). O sistema para Os NAAT oferecem a maior flexibilidade quanto aos
cultura InPouch TV utiliza uma bolsa com duas cmaras mtodos de coleta de amostras e apresentam a maior
independentes (Figura 6.2). As amostras coletadas sensibilidade dentre todos os mtodos de diagnstico
por hastes so diludas, ou os sedimentos de urina so disponveis. Amostras genitais residuais utilizadas para
inoculados, no meio no primeiro compartimento. O meio o diagnstico de clamdia e gonorreia por meio de NAAT
ento forado para o segundo compartimento e a bolsa so adequadas para a deteco dos cidos nucleicos de
selada. As bolsas so transportadas ao laboratrio T. vaginalis. Os laboratrios que realizam rotineiramente
para incubao a 37C por at cinco dias. O sistema NAAT para clamdia e gonorreia devem considerar testes
de bolsa pode ser concludo mais rapidamente que a para tricomonase. Apesar da diferena na faixa etria
cultura tradicional, j que, a cada vez, todo o volume de maior prevalncia, em muitos locais, a prevalncia
avaliado. As bolsas seladas esto prontas para ser da infeco por T. vaginalis na populao suficiente
colocadas no microscpio, utilizando um aumento de para que haja uma preocupao em inclu-la no painel
100x. Suportes para essas bolsas, que se encaixam nos de testes das causas de corrimento. A descrio de
grampos que seguram as lminas, j esto disponveis e ensaios desenvolvidos em laboratrios que utilizam
devem ser utilizados para auxiliar na movimentao da muitas das plataformas de NAAT acessveis atualmente
bolsa durante a anlise de microscopia. Toda a cultura para clamdia e gonorreia esto disponveis (6, 15,
avaliada por meio de uma varredura cuidadosa de ponta 31-42). Todos esses ensaios envolvem o isolamento do

90 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


cido nucleico, a amplificao das sequncias-alvo e a Entretanto, os dados de resistncia so escassos
deteco do material amplificado. Apesar da excelente e estudos adicionais nessa rea so necessrios
sensibilidade e especificidade, esses ensaios podem para determinar os mecanismos, a prevalncia e a
ser afetados pela contaminao ambiental e, dessa epidemiologia dessa resistncia. Contudo, uma vez que
forma, justifica-se a adeso estrita s boas prticas a maioria dos organismos so susceptveis, o teste de
laboratoriais. tambm altamente recomendado que susceptibilidade antimicrobiana (47, 48) no realizado
a efetividade do NAAT para T. vaginalis proposto para rotineiramente. No entanto, alguns laboratrios de
os estabelecimentos locais, antes de ser utilizado no referncia precisam manter a capacidade de realizar o
diagnstico, seja estritamente validado em relao a, teste de susceptibilidade antimicrobiana em isolados
pelo menos, um NAAT certificado internacionalmente, de T. vaginalis, principalmente quando houver falha na
de preferncia o aprovado pela FDA, o APTIMA TV terapia com metronidazol. Os pacientes que retornam
(ver adiante), e, subsequentemente, utilizado com um continuamente com sintomas devem ser avaliados
sistema adequado de garantia de qualidade (ver Captulo quanto a possveis comportamentos de exposio e a
2 e Anexo 3). adeso aos regimes de tratamento.

Como mencionado acima, um ensaio (APTIMA TV, Os mdicos devem estar cientes de que a
Gen-Probe, EUA) foi aprovado pela FDA. Esse teste resistncia antimicrobiana tem sido descrita e
altamente sensvel e especfico (16, 18, 43, 44) e pode considerar esse dado em relao a pessoas com
ser realizado em uma plataforma semiautomtica ou sintomas continuados.
totalmente automatizada. O ensaio, como todos os NAAT,
exige ateno especial aos procedimentos de manuseio
de lquidos, para minimizar os eventos de contaminao. 6.6 Referncias
A infraestrutura de equipamentos e os requisitos de 1. Global incidence and prevalence of selected curable
energia para o teste so ambos substanciais. Esse sexually transmitted infections2008. Geneva,
ensaio deve ser restrito aos laboratrios de referncia World Health Organization, 2012 (http://www.who.
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sensibilidade muito alta e so especialmente teis 2. Wetmore CM, Manhart LE, Golden MR. Idiopathic
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essas ocorrem raramente (45, 46). Entretanto, em
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alguns locais, foi identificado um ligeiro nvel de
resistncia em 2-5% dos casos de tricomonase em 5. Van Der Pol B. Trichomonas vaginalis infections.
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no clara, mas muitas das cepas resistentes de T. infections, 2nd ed. New Delhi, Elsevier,
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Tricomonase 91
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94 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


Captulo 7 Amsel (4) ou por meio da avaliao (5) ou pontuao (6)
de bactrias em um esfregao vaginal com colorao de
Gram.
Vaginose bacteriana
A VB a causa mais comum de corrimento vaginal
e est relacionada a mudanas na microbiota, com
7.1 Introduo a reduo da populao de lactobacilos da vagina
A vaginose bacteriana (VB) a causa mais comum de e um crescimento acentuado de anaerbios e G.
corrimento vaginal entre mulheres na idade reprodutiva. vaginalis.
Embora no seja considerada uma doena sexualmente
transmissvel, a atividade sexual um fator para sua
aquisio (1). Isso foi demonstrado pelo aumento de 7.2 Diagnstico
sua incidncia em relao ao aumento no nmero de A VB uma manifestao clnica caracterizada pelo
parceiros recentes e ao longo da vida, e em relao a aumento da quantidade de corrimento vaginal ftido. O
ter um novo parceiro sexual. A identificao de vaginose diagnstico baseia-se na presena de pelo menos trs
bacteriana tambm em mulheres virgens se ope dos quatro critrios seguintes (critrios de Amsel) (4):
ideia da transmisso sexual exclusiva. A condio
provavelmente muito mais relacionada a alteraes na Corrimento branco ou cinzento, homogneo e viscoso;
microbiota vaginal (devido a mecanismos at o momento Fluido vaginal com pH >4,5;
desconhecidos e a fatores do hospedeiro), causando
um aumento no pH local, o que resulta na reduo de Liberao de odor de amina, semelhante a peixe, do
lactobacilos produtores de perxido de hidrognio. Os fluido vaginal quando misturado a soluo a 10% de
lactobacilos ajudam a manter a acidez do pH de vaginas hidrxido de potssio (KOH);
saudveis e a inibir outros microrganismos anaerbicos.
Clulas indicadoras visveis em anlise no
Normalmente, vaginas saudveis apresentam altas
microscpio.
concentraes de lactobacilos. Na VB, a populao de
lactobacilos muito reduzida, enquanto as populaes Corrimento. A avaliao desse sinal clnico subjetiva.
de vrios anaerbios e de Gardnerella vaginalis so O corrimento em mulheres com VB normalmente no
aumentadas. Os anaerbios envolvidos na VB incluem muito maior do que o observado em mulheres saudveis.
Mobiluncus spp., Prevotella spp., Bacteroides spp., Alm disso, a aplicao de duchas vaginais pode reduzir
Peptostreptococcus, Fusobacterium, Eubacterium a quantidade de corrimento.
spp., Mycoplasma hominis e Ureaplasma urealyticum.
pH vaginal. O pH do fluido vaginal deve ser mensurado
Com as atuais tcnicas independentes de cultura,
utilizando-se tiras de papel indicador de pH no intervalo
um maior nmero de organismos foram identificados
adequado (3,8 a 6,0), tais como o papel com intervalo
como parte da microbiota encontrada em mulheres
estreito de Whatman. Um espcime dos frnices laterais
com VB, incluindo Atopobium vaginae (2). Muitas
e posterior da vagina coletado com uma haste, a qual
das bactrias associadas a VB so encontradas em
, ento, colocada diretamente sobre a tira de papel.
mulheres saudveis, embora em menor nmero.
Alternativamente, o papel de pH pode ser tocado com
Assim, o diagnstico laboratorial de VB repleto de
a ponta do espculo aps este ser retirado da vagina
dificuldades, com vrios mtodos descritos na literatura.
(Figura 7.1). O contato com o muco cervical deve ser
O isolamento e identificao de organismos individuais
evitado, uma vez que este apresenta pH >7,0. Uma
como a G. vaginalis frequentemente proposto, mas no
vagina madura normal apresenta um pH cido de 4,0. Na
adequado para o diagnstico clnico de VB (3), alm de
VB, o pH geralmente elevado a >4,5.
poder levar ao excesso de tratamentos. O diagnstico
melhor realizado usando tanto os critrios clnicos de

Vaginose bacteriana 95
imediatamente volteis, produzindo um odor tpico
de peixe. Coloque uma gota de fluido vaginal em uma
lmina de vidro e adicione uma gota de KOH a 10%.
Segure a lmina prximo ao nariz para detectar o cheiro
de amina. Aps uma reao positiva, o espcime se
tornar rapidamente inodoro devido rpida e completa
volatizao das aminas. Em algumas partes do mundo, o
KOH no est disponvel devido sua natureza custica
e, ento, se forem realizados apenas trs dos quatro
critrios, perde-se a sensibilidade destes.
Figura 7.1
Teste do pH do fluido vaginal, comparado a uma Clulas indicadoras. Misture uma gota do fluido
escala padronizada de cores. vaginal com uma gota de soluo salina em uma lmina
de vidro. Coloque uma lamnula sobre a suspenso
O teste do pH vaginal apresenta a maior sensibilidade e examine microscopicamente a lmina com um
das quatro caractersticas, mas a menor especificidade. aumento de 400x. As clulas indicadoras so clulas
Tambm se observa um pH elevado se o fluido vaginal epiteliais escamosas cobertas com vrios organismos
estiver contaminado por sangue menstrual, muco cocobacilares granulares pequenos, gerando um aspecto
cervical ou smen e em mulheres com infeco por T. pontilhado, granular. As bordas dessas clulas epiteliais
vaginalis. no so claramente definidas, devido ao grande nmero
de bactrias presentes e aparente desintegrao
Odor. Mulheres com VB normalmente reclamam de celular (Figuras 7.2A e 7.2B). Na maioria dos pacientes
um odor desagradvel na vagina. Esse odor devido com VB, ser visualizada uma mistura de clulas
liberao de amina, produzida pela descarboxilao dos epiteliais vaginais normais esfoliadas e 20% ou mais de
aminocidos lisina (para cadaverina) e arginina (para clulas indicadoras. As bactrias aderidas s clulas so
putrescina) por bactrias anaerbicas. Quando o KOH G. vaginalis misturadas com anaerbios.
adicionado ao fluido vaginal, essas aminas se tornam

A. Clulas indicadoras em preparao a fresco de B. Clulas indicadoras em esfregao vaginal com


amostra vaginal (400x). colorao de Gram.

Figura 7.2
Microscopia de esfregaos vaginais

96 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


Grau I (microbiota normal): somente ou
predominantemente morfotipos de lactobacilos (Figura 7.4)

7.3 Critrios de Ison-Hay


Esse mtodo avalia as propores relativas dos
diferentes morfotipos bacterianos e os classifica como
descrito a seguir:

Grau I (microbiota normal): somente ou


predominantemente morfotipos de lactobacilos (Figura
Figura 7.3 7.4)
Colorao de Gram de esfregao vaginal normal
mostrando os lactobacilos (1000x).
Figura 7.4
Fonte: Reproduzido com permisso da Associao
Grau I
Britnica para Sade Sexual e HIV (BASHH, do ingls
British Association for Sexual Health and HIV).
Grau II (microbiota intermediria): reduo dos
morfotipos de lactobacilos, com morfotipos bacterianos
A VB reconhecida em um esfregao vaginal
misturados (Figura 7.5).
com colorao de Gram. As lminas podem ser
examinadas na clnica, quando houver infraestrutura,
ou armazenadas para ser examinadas no laboratrio,
visando verificaes posteriores independentes.
Podem ser observados no esfregao diversos graus de
microbiota vaginal, variando de normal (Figura 7.3) a
morfotipos de VB intermediria. Em um esfregao de
uma mulher com VB, os lactobacilos esto ausentes
ou tm seu nmero muito reduzido, e so substitudos
por uma microbiota misturada. Dois mtodos so
comumente utilizados para a anlise dos esfregaos:
os critrios de Ison-Hay (5), que verificam a microbiota Figura 7.5
e so mais adequados para o uso na prtica clnica Grau II
de rotina; e a pontuao de Nugent (6), que classifica
as bactrias individualmente e fornece uma anlise Grau III (VB): morfotipos bacterianos misturados com
quantitativa particularmente til para propsitos de poucos ou nenhum morfotipo de lactobacilos (Figura 7.6).
pesquisa, mas oferece poucas vantagens no uso clnico.
A variabilidade intrnseca gerada pelos observadores foi
descrita como sendo a mesma para ambos os critrios
de Nugent e Ison-Hay (7 ).

7.3 Critrios de Ison-Hay


Esse mtodo avalia as propores relativas dos
diferentes morfotipos bacterianos e os classifica como
descrito a seguir:

Figura 7.6
Grau III

Vaginose bacteriana 97
Dois graus adicionais no sistema Ison-Hay so: 7.4 Pontuao de Nugent
Grau 0: clulas epiteliais sem bactrias visveis (Figura
Esse mtodo baseado na pontuao de tipos
7.7).
individuais de organismos. Uma pontuao de 0 a 10
resulta de uma combinao ponderada de: grandes
bastonetes Gram-positivos (lactobacilos), pequenos
bastonetes Gram-negativos ou variveis (G. vaginales ou
outros anaerbios) e bastonetes curvos Gram-negativos
ou variveis (Mobiluncus spp.). Cada um desses
trs grupos so avaliados quantitativamente em um
esfregao segundo uma pontuao de 0-4, da seguinte
forma:

0 = nenhum morfotipo por campo de viso


Figura 7.7 1+ = menos que um morfotipo por campo de viso
Grau 0
2+ = um a quatro morfotipos por campo de viso
Grau IV: clulas epiteliais cobertas somente com cocos
3+ = cinco a 30 morfotipos por campo de viso
Gram-positivos (Figura 7.8).
4+ = mais que 30 morfotipos por campo de viso

A abundncia de morfotipos de lactobacilos em um


esfregao considerada normal. Assim, as pontuaes
de lactobacilos so inversamente relacionadas aos seus
nmeros. A quantidade 4+ para lactobacilos pontua 0;
3+, pontua 1, e assim por diante. Mobiluncus recebem
menor peso; dessa forma, organismos classificados
como 1+ e 2+ pontuam 1 e organismos 3+ e 4+
pontuam 2.

Figura 7.8 Um diagnstico de VB severa pontua 10 (4 pela


Grau IV ausncia de morfotipos de lactobacilos, 4 por morfotipos
de Gardnerella 4+ e 2 por morfotipo de Mobiluncus 4+).
Fonte: Figuras 7.4-7.8 reproduzidas com permisso da Um esfregao Gram vaginal normal pontua 0 (0 para
Associao Britnica para Sade Sexual e HIV (BASHH,
morfotipos de lactobacilos 4+, 0 para morfotipos de
do ingls British Association for Sexual Health and HIV).
Gardnerella 0 e 0 por morfotipo de Mobiluncus 0).

Ambos os graus 0 e IV so encontrados em mulheres Na pontuao de Nugent, uma pontuao total de 7 a 10


saudveis. O grau 0 ocorre principalmente aps (a soma das pontuaes de classificao dos trs grupos
tratamento antimicrobiano intravaginal e o grau IV descritos acima) indicativa de VB; uma pontuao de 4
encontrado em menor nmero em mulheres que a 6, de microbiota intermediria; e uma pontuao de 0
so colonizadas longitudinalmente com cocos Gram- a 3, de microbiotas normais.
positivos, normalmente streptococos, com lactobacilos
reduzidos ou ausentes.

98 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana


7.5 Outros testes para VB 7.6 Referncias
A microscopia de esfregaos vaginais com colorao de 1. Bradshaw CS et al. High recurrence rates of
Gram, atualmente, continua sendo o mtodo laboratorial bacterial vaginosis over the course of 12 months
preferido para o diagnstico de VB. Uma srie de outros after oral metronidazole therapy and factors
testes foram descritos, que podem ser teis caso no associated with recurrence. Journal of Infectious
haja microscpios disponveis. Isso inclui: Diseases, 2006, 193(11):14781486.

1. Affirm VP III (8) Usa hibridizao de DNA para 2. Tabrizi SN et al. Prevalence of Gardnerella vaginalis
detectar nveis altos de Gardnerella. and Atopobium vaginae in virginal women. Sexually
Transmitted Diseases, 2006, 33(11):663665.
2. BV Blue (9) Teste point-of-care disponvel
comercialmente. Mede a sialidase, uma enzima que 3. Krohn MA, Hillier SL, Eschenbach DA. Comparison
produz algumas das aminas liberadas durante a VB. of methods for diagnosing bacterial vaginosis
Comparado com os critrios de Nugent e Amsel, among pregnant women. Journal of Clinical
apresenta uma especificidade de 95% e 91%, Microbiology, 1989, 27(6):12661271.
respectivamente, e uma sensibilidade de 88%.
4. Amsel R et al. Non specific vaginitis. Diagnostic
3. FemExam (10) Consiste em dois cartes com criteria and microbial and epidemiologic
indicadores que medem o pH vaginal, aminas e associations. American Journal of Medicine, 1983,
atividade enzimtica. Os indicadores do carto 74(1):1422.
do FemExam medem o pH maior ou igual a
5. Ison CA, Hay PE. Validation of a simplified grading
4,7 e aminas com concentrao maior que
of Gram stained vaginal smears for use in
0,5mmol. O carto 2 mede a atividade da prolina
genitourinary medicine clinics. Sexually Transmitted
aminopeptidase. Comparado com a pontuao de
Infections, 2002, 78(6):413415.
Nugent, o carto 1 do FemExam apresenta uma
sensibilidade e uma especificidade de 71,4% e 6. Nugent RP, Krohn MA, Hillier SL. Reliability of
72,8%, respectivamente; e o carto 2, sensibilidade diagnosing bacterial vaginosis is improved by a
e especificidade de 70% e 81%, respectivamente. standardized method of Gram stain interpretation.
Journal of Clinical Microbiology, 1991,
Os mtodos moleculares foram usados recentemente
29(2):297301.
para detectar bactrias tambm no identificadas
anteriormente na VB e apresentam o potencial de 7. Forsum U et al. An international study of the
fornecer um diagnstico para VB sensvel e especfico interobserver variation between interpretations of
(11, 12). vaginal smear criteria of bacterial vaginosis. APMIS,
2002, 110(11):811818.
O diagnstico pode ser realizado utilizando-se os
critrios de Amsel por meio da demonstrao da 8. Gazi H et al. Use of DNA hybridization test for
presena de pelo menos trs dos quatro critrios diagnosing bacterial vaginosis in women with
seguintes: corrimento vaginal branco a cinzento, symptoms suggestive of infection. APMIS, 2006,
homogneo e viscoso, pH>4,5, odor de amina e 114(11):784787.
presena de clulas indicadoras.
9. Bradshaw CS et al. Evaluation of a point-of-care
A cultura de organismos associados a VB no tem test, BVBlue, and clinical and laboratory criteria for
valor para diagnstico. diagnosis of bacterial vaginosis. Journal of Clinical
Microbiology, 2005, 43(3):13041308.
Onde houver infraestrutura, a colorao de Gram
do corrimento vaginal, mostrando os graus da 10. West B et al. Evaluation of a new rapid diagnostic kit
microbiota vaginal de normal a VB, pode ter os (FemExam) for bacterial vaginosis in patients with
morfotipos pontuados de acordo com os critrios vaginal discharge syndrome in the Gambia. Sexually
de Ison-Hay e Nugent para o diagnstico de BV. Transmitted Diseases, 2003, 30(6):483489.

Vaginose bacteriana 99
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is possible? PLoS ONE, 2013, 8(4):e60670.

100 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Captulo 8 parceiros sexuais, causando balanite ou balanopostite
e, raramente, uretrite. Tipicamente, os homens
desenvolvem uma resposta alrgica ao antgeno
Candidase da cndida, embora a infeco repentina possa ser
observada mais frequentemente em pacientes com os
fatores de risco mencionados acima (6).
8.1 Introduo
A candidase vulvo-vaginal (CVV) causada pelo fungo 8.2 Diagnstico
Candida albicans (1) em aproximadamente 85% dos
O diagnstico de CVV normalmente estabelecido por
casos, sendo a C. glabrata responsvel pelos 15%
meio da combinao entre as manifestaes clnicas
restantes (2). Outras espcies, tais como C. krusei e C.
e anlise microscpica de preparao a fresco. Os
tropicalis, raramente causam vaginites (3). As Candida
sintomas clssicos e os sinais de CVV incluem prurido
spp. so geralmente de origem endgena e podem ser
vaginal, corrimento branco e coalhado sem odor (queijo
isoladas a partir do trato genital de at 25% de mulheres
cottage), sensao de queimao na vulva, disria e
saudveis assintomticas em idade reprodutiva. Para
eritema dos lbios e vulva. Entretanto, os sintomas e
as Candida spp. colonizarem a vagina, elas devem
sinais so frequentemente mais ambguos. A deteco
primeiro aderir s clulas epiteliais vaginais, onde
do brotamento de clulas de levedura por meio de
crescem, proliferam-se e germinam antes de finalmente
microscopia de preparao a fresco ou com hidrxido
causarem os sintomas de inflamao. Normalmente,
de potssio (KOH) pode ser realizada em laboratrios
so necessrias alteraes no ambiente vaginal antes
ou clnicas e apresenta um valor preditivo muito alto
que o organismo possa induzir os efeitos patolgicos.
para o diagnstico de CVV. Embora essa combinao
Provavelmente, a microbiota natural a defesa mais
seja geralmente usada, frequentemente razovel
importante contra a colonizao e a inflamao. O
oferecer terapia a mulheres com sinais clssicos de
mecanismo pelo qual a cndida induz a inflamao
CVV, com base em um diagnstico clnico presuntivo,
ainda no foi determinado, mas fatores importantes de
sem uma confirmao adicional por microscopia. O uso
predisposio colonizao e inflamao incluem:
de esfregaos com colorao de Gram e a deteco
Alteraes nos nveis dos hormnios reprodutivos do brotamento de clulas de levedura e pseudo-hifas
associados a perodos pr-menstruais, gravidez e preferido em alguns centros para a determinao de
contraceptivos orais; candidase.

Uso de antibiticos; Em mulheres com corrimento vaginal anormal, e na


ausncia de um microscpio, a deteco de um pH <4,5
Diabetes mellitus; um bom indicador de CVV e pode ajudar a diferenci-la
Imunossupresso. de uma vaginose bacteriana ou tricomonase, as quais
tipicamente produzem um pH >4,5. Um papel de pH
A candidase normalmente de origem endgena com intervalo estreito (Whatman) um mtodo de baixo
e no se transmite sexualmente. A CVV crnica ou custo, sensvel e simples de usar e est disponvel na
recorrente ocorre em um pequeno nmero de mulheres, maioria dos lugares.
causando sintomas persistentes, e pode estar associada
aos fatores de risco descritos acima (4, 5). Produtos A cultura atualmente o mtodo mais sensvel para
qumicos, alergias locais e hipersensibilidade tardia a deteco de Candida spp., mas deve ser usada
tambm podem contribuir para a induo de vaginite com cautela, uma vez que Candida spp. tambm so
sintomtica ou vulvite. encontradas em mulheres sem CVV. Dessa forma,
a cultura s deve ser considerada em caso de CVV
Em homens, a importncia de Candida spp. no clinicamente suspeita, mas com microscopia negativa
clara, embora o agente possa ser transmitido entre (embora, nesse caso, o tratamento presuntivo possa
ser aplicado, resultando em menor custo financeiro) ou

Candidase 101
quando o teste de susceptibilidade antimicrobiana for
requisitado.

A deteco molecular de Candida spp. utilizando


a reao em cadeia da polimerase (PCR, do ingls
polymerase chain reaction) foi descrita, mas no oferece
vantagens em relao aos testes disponveis atualmente,
uma vez que a alta sensibilidade demonstrada pela PCR
ir detectar leveduras de Candida spp. em mulheres
sem CVV e resultar em diagnsticos excessivos e Figura 8.1A
tratamentos desnecessrios. Preparao de hidrxido de potssio (KOH) de
secreo vaginal, mostrando o brotamento de
8.3 Coleta de espcimes leveduras e pseudo-hifas (400x).

Obtenha uma amostra de secreo da parede lateral


da vagina com uma haste (o tipo de fibra no
importante). Em pacientes com corrimento vaginal leve e
comprometimento excessivo da vulva e lbios, melhor
que seja coletado um espcime da mucosa irritada. A
microscopia direta pode ser realizada imediatamente
na clnica, ou ento o espcime pode ser transportado
para o laboratrio. O uso de um meio de transporte
como o de Amies no necessrio para a finalidade de
identificao de leveduras, mas prefervel manter a
viabilidade e mobilidade no caso dos tricomonaddeos. Figura 8.1B
Preparao a fresco de leveduras sem pseudo-hifas.
Em homens com balanite, use uma haste umedecida
Fonte (A e B): reproduzidas com permisso da
previamente em soluo salina para coletar a amostra da Associao Britnica para Sade Sexual e HIV (BASHH,
glande do pnis. do ingls British Association for Sexual Health and HIV).

8.4 Microscopia direta


Coloque o espcime em uma lmina de vidro e, se
necessrio, dependendo da sua fluidez, misture-o
com uma gota de soluo salina. Cubra a preparao
com uma lamnula e examine ao microscpio com um
aumento de 400x no apenas para detectar leveduras,
mas tambm para verificar a presena de trichomonas
e clulas identificadoras. As leveduras so clulas
arredondadas a ovais, com 4m de dimetro, mostrando
um brotamento tpico (blastocondia) (Figuras 8.1A
Figura 8.2A
e 8.1B). A adio de KOH a 10% para a preparao Esfregao de secreo vaginal com colorao de
aumenta levemente a sensibilidade de deteco de Gram mostrando as leveduras Gram-positivas e
leveduras, tornando o reconhecimento de miclias pseudo-hifas (1000x).
(pseudo-hifas) muito mais fcil. As leveduras podem
ser reconhecidas facilmente em um esfregao com
colorao de Gram, uma vez que so clulas Gram-
positivas (Figuras 8.2A e 8.2B).

102 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
O diagnstico de candidase estabelecido
pela combinao de caractersticas clnicas e
microscopia de uma amostra de um espcime
apropriado.

A cultura de secreo vaginal deve ser considerada


para casos de microscopia negativa, na presena
de sintomas clnicos.

O teste de susceptibilidade antimicrobiana de


Figura 8.2B Candida spp. ocasionalmente justificado e deve
Brotamento de leveduras sem pseudo-hifas. ser realizado em centros especializados.
Fonte (A e B): reproduzidas com permisso da
Associao Britnica para Sade Sexual e HIV (BASHH,
do ingls British Association for Sexual Health and HIV).
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Candidase 103
104 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Captulo 9 na borda circundante e na camada drmica subjacente.
Entretanto, apenas 10-30% das infeces novas so
sintomticas (Figura 9.1).
Infeces pelo vrus do herpes Aps a recuperao da infeco inicial, o vrus
simples (HSV) permanece latente no gnglio sensorial por toda a
vida do hospedeiro.