Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Diagnstico laboratorial
MINISTRIO DA SADE
Secretaria de Vigilncia em Sade
Departamento de DST, Aids e Hepatites Virais
SAF Sul Trecho 2, Bloco F, Torre 1, Edifcio Premium
CEP: 70070-600, Braslia - DF de doenas sexualmente
transmissveis, incluindo o vrus
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Para mais informaes, por favor, contatar:

Departamento de Sade Reprodutiva e Pesquisa da imunodeficincia humana
Organizao Mundial da Sade
Avenue Appia, 20, CH-1211, Genebra 27, Sua
Fax: +41 22 791 4171
E-mail: reproductivehealth@who.int
Home page: www.who.int/reproductivehealth
Diagnstico
laboratorial de doenas
sexualmente transmissveis,
incluindo o vrus da
imunodeficincia humana
Publicado pela Organizao Mundial da Sade em 2013 sob o ttulo Laboratory diagnosis of sexually transmitted
infections, including human immunodeficiency virus

Organizao Mundial da Sade 2013

A Organizao Mundial da Sade concedeu os direitos de traduo e publicao da presente edio em portugus
Coordenao de Laboratrio do Departamento de DST, AIDS e Hepatites Virais, que a nica responsvel pela
qualidade e fidelidade da traduo em portugus. Em caso de qualquer inconsistncia entre as edies em ingls e
portugus, a edio original em ingls dever ser considerada a edio juridicamente vinculativa e autntica.

Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana /

Coordenao de Laboratrio do Departamento de DST, AIDS e Hepatites Virais 2014.

1.Doenas sexualmente transmissveis diagnstico. 2.Infeces por HIV - diagnstico. 3.Tcnicas e procedimentos de
diagnstico. 4.Laboratrios.
Diagnstico laboratorial do diagnstico de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia
humana

2013 2015

Responsveis pela publicao em ingls: Responsveis pela publicao em portugus:

Editor-chefe Departamento de DST, AIDS e Hepatites Virais

Magnus Unemo Fabio Mesquita

Centro de Colaborao da OMS para Gonorreia e outras Diretor do Departamento de DST, AIDS e Hepatites Virais
DST
Adele Schwartz Benzaken
Hospital Universitrio de rebro, rebro, Sucia
Diretora-Adjunta do Departamento de DST, AIDS e
Editores Hepatites Virais

Ronald Ballard Miriam Frachini

Centros de Controle e Preveno de Doenas Coordenadora de Laboratrio do Departamento de DST,
Atlanta, Georgia, Estados Unidos da Amrica AIDS e Hepatites Virais

Catherine Ison Traduo:

Sade Pblica da Inglaterra (anteriormente Agncia de Nazle Mendona Collao Vras

Proteo Sade)
Londres, Reino Unido Reviso tcnica:
David Lewis Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho
Instituto Nacional de Doenas Transmissveis Roberta Barbosa Lopes Francisco
Joanesburgo, frica do Sul Jos Boullosa
Francis Ndowa Bruna Lovizutto Protti
Organizao Mundial da Sade Ana Flvia Pires
Genebra, Sua Mariana Villares

Rosanna Peeling Regina Comparini

Escola de Higiene e Medicina Tropical de Londres Pmela Cristina Gaspar

Reviso ortogrfica:

Angela Gasperin Martinazzo

Projeto grfico e diagramao:

Ademildo Coelho Mendes

Fernanda Dias Almeida Mizael
Marcos Cleuton de Oliveira
Sumrio

Siglas e abreviaturas vii

Prefcio xi
Agradecimentos xiii
1 Escolha de testes para doenas sexualmente transmissveis
Edward W. Hook III, Francis Ndowa, David Mabey, Manju Bala e Ye Tun 1
2 Gesto da qualidade no laboratrio
Catherine Ison e Ronald Ballard 11
3 Micoplasmas genitais
Jrgen Skov Jensen e Magnus Unemo 17
4 Gonorreia
Magnus Unemo e Catherine Ison 23
5 Infeces por clamdia
Barbara Van Der Pol e Magnus Unemo 61
6 Tricomonase
Yaw Adu-Sarkodie, Magnus Unemo, and Barbara Van Der Pol 83
7 Vaginose bacteriana
Yaw Adu-Sarkodie e Catherine Ison 95
8 Candidase
Yaw Adu-Sarkodie e Catherine Ison 101
9 Infeces pelo vrus da herpes simples (HSV)
Laurent Blec 105
10 Sfilis
Ronald Ballard e Edward W. Hook III 121
11 Linfogranuloma venreo (LGV)
Ronald Ballard 147
12 Cancro mole
David Lewis 149
13 Donovanose (granuloma inguinal)
David Lewis 157
14 Infeces pelo papilomavrus humano (HPV)
Suzanne Garland 161
15 Infeces pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV)
Bharat S. Parekh, Dennis Ellenberger, Larry Westerman, Chunfu Yang
e John N. Nkengasong 175

Sumrio v
 Anexos
Anexo 1. Microscopia e princpios de colorao
Catherine Ison 189
Anexo 2. Princpios dos testes point-of-care rpidos
Rosanna Peeling 197
Anexo 3. Princpios dos testes moleculares para o diagnstico de doenas sexualmente
tranmissveis
Cheng Y. Chen e Magnus Unemo 205
Anexo 4. Meios, reagentes, testes de diagnstico e corantes (protocolos)
Stefania Starnino e Jo-Anne R. Dillon 223
Anexo 5. Materiais de laboratrio
Stefania Starnino e Jo-Anne R. Dillon 245

vi Diagnstico laboratorial do diagnstico de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Siglas e abreviaturas

ACT gar cistena tripticase DNA cido desoxirribonucleico; do ingls

AEQ Avaliao externa da qualidade deoxyribonucleic acid
AIDS Sndrome da imunodeficincia DP Desvio padro
adquirida; do ingls acquired dsDNA DNA de fita dupla; do ingls double-
immunodeficiency syndrome stranded DNA
AIQ Avaliao interna da qualidade DST Doenas sexualmente transmissveis
ARV Antirretroviral EA ster de acridnio
AVAI Anos de vida ajustados por ECD Ensaio cintico duplo
incapacidade EDL Ensaios desenvolvidos por laboratrios
BD Becton, Dickinson and Company EIA Imunoensaio enzimtico; do ingls
bDNA DNA em cadeia ramificada; do ingls enzyme immunoassay
branched chain DNA EID Ensaio de imunofluorescncia direta
C2CA Amplificao crculo a crculo; do ingls ELISA Ensaio imunossorvente ligado enzima;
circle-to-circle amplification do ingls enzyme-linked immunosorbent
CCUG Coleo de Culturas da Universidade de assay
Gotemburgo (Gotemburgo, Sucia) EM Espectrometria de massa
CDC Centros de Controle e Preveno de EQI Ensaio de quimioluminescncia
Doenas; do ingls Centers for Disease EUCAST Comit Europeu para o Teste a
Control and Prevention (Atlanta, Susceptibilidade Antimicrobiana;
Gergia, Estados Unidos da Amrica); do ingls European Committee on
CH/CH2 Captura hbrida/captura hbrida II Antimicrobial Susceptibility Testing
CIM Concentrao inibitria mnima FCE Fluido cerebroespinal
CIQ Controle interno da qualidade FDA Administrao de Alimentos e Drogas
CLSI Instituto de Padres Clnicos e dos Estados Unidos da Amrica; do
Laboratoriais; do ingls Clinical and ingls United States of America Food
Laboratory Standards Institute and Drug Administration
CO2 Dixido de carbono FITC Isotiocianato de fluorescena; do ingls
CQ Controle de qualidade fluorescein isothiocyanate
CSPS Controle de substncias prejudiciais FO Fuido oral
sade FRET Transferncia de energia de
Ct Ciclo limiar ressonncia por fluorescncia; do ingls
CV Carga viral fluorescence resonance energy transfer
CV Coeficiente de variao FTA-Abs Absoro do anticorpo treponmico
CVA Cofatores vitaminas aminocidos fluorescente; do ingls fluorescent
CVV Candidase vulvovaginal treponemal antibody absorption
DBS Mancha de sangue seco; do ingls dried g Acelerao da gravidade
blood spot GASP Programa de Vigilncia da
DIP Diagnstico infantil precoce Susceptibilidade Antimicrobiana;
DMC DNA metiltransferase do ingls Gonococcal Antimicrobial
citosina-especfica Susceptibility Surveillance Programme
GC Meio gar base GC

Siglas vii
 gG Glicoprotena G LR Tipos de baixo risco; do ingls low-risk
GKNP Soluo glicose-potssio-sdio-fosfato types
GQ Garantia de qualidade LSIL Leso intraepitelial de baixo grau; do
HBV Vrus da hepatite B; do ingls hepatitis ingls low-grade intraepithelial lesion
B virus MALDI-TOF Ionizao e dessoro a laser assistida
HCV Vrus da hepatite C; do ingls hepatitis por matriz tempo de vo; do ingls
C virus matrix-assisted laser desorption
HIV Vrus da imunodeficincia humana; do ionizationtime of flight
ingls human immunodeficiency virus MH Mueller-Hinton
HIVDR Resistncia do HIV s drogas da terapia MIF Microimunofluorescncia
antirretroviral; do ingls HIV drug MOMP Protena principal da membrana
resistance externa; do ingls major outer
HPA Ensaio de proteo da hibridizao; do membrane protein
ingls hybridization protection assay MTM Meio de Thayer-Martin modificado
HPV Papilomavrus humano; do ingls NAAT Teste de amplificao de cido nucleico;
human papillomavirus do ingls nucleic acid amplification test
HR Tipos de alto risco; do ingls high-risk NAH Ensaios de hibridizao de cidos
types nucleicos no amplificados; do ingls
HSH Homens que fazem sexo com homens non-amplified nucleic acid hybridization
HSIL Leso intraepitelial de alto grau; do assays
ingls high-grade intraepithelial lesion NASBA Amplificao baseada na sequncia de
HSV Vrus da herpes simples; do ingls cido nucleico; do ingls nucleic acid
herpes simplex virus sequence-based amplification
ICT Teste imunocromatogrfico; do ingls NCTC Coleo Nacional de Cultura Tipo;
immunochromatographic test do ingls National Collection of Type
IF Imunofluorescncia Cultures
IFA Ensaio de imunofluorescncia; do ingls NIBSC Instituto Nacional de Padres e Controle
immunofluorescence assay Biolgicos; do ingls National Institute
IgA/IgG/IgM Imunoglobulinas A, G, M for Biological Standards and Control
IGD Infeco gonoccica disseminada NIC Neoplasia intraepitelial cervical
IMDM-VGA Meio de Dulbecco modificado por nvCT Nova variante de Chlamydia trachomatis
Iscove; do ingls Iscoves modified NYC gar New York City
Dulbecco medium OMS Organizao Mundial da Sade
IP Imunoperoxidase Pap Papanicolau
ISO Organizao Internacional de PBS Soluo salina tamponada com fosfato;
Padronizao; do ingls International do ingls phosphate-buffered saline
Organization for Standardization solution
KOH Hidrxido de potssio PCR Reao em cadeia da polimerase; do
LGV Linfogranuloma venreo ingls polymerase chain reaction
LIA Imunoensaio em linha; do ingls line PET Teste de enzima pr-formada; do ingls
immunoassay preformed enzyme test
LJ Grfico de Levey-Jennings PID Doena inflamatria plvica; do ingls
LPMN Leuccitos polimorfonucleares pelvic inflammatory disease
LPS Lipopolissacardeo

viii Diagnstico laboratorial do diagnstico de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
PIP Prolilaminopeptidase; do ingls TPHA Ensaio de hemaglutinao para
prolyliminopeptidase Treponema pallidum; do ingls
POC Teste point-of-care Treponema pallidum haemagglutination
POP Procedimento operacional padro assay
PR Regies da protease; do ingls protease TPPA Ensaio de aglutinao passiva de
regions partculas para Treponema pallidum;
PRR Papilomatose respiratria recorrente do ingls Treponema pallidum passive
RCA Amplificao por crculo rolante; do particle agglutination assay
ingls rolling circle amplification TRUST Teste da toluidina vermelha com soro
RCUT Teste de utilizao rpida de no aquecido; do ingls toluidine red
carboidrato; do ingls Rapid unheated serum test
carbohydrate utilization test TSB Caldo triptona de soja; do ingls
RHR Departamento de Sade Reprodutiva trypticase soy broth
e Pesquisa; do ingls Department of UE Unio Europeia
Reproductive Health and Research UFC Unidades formadoras de colnia
RNA cido ribonucleico; do ingls ribonucleic UG lcera genital de etiologia sexualmente
acid transmissvel
RPR Reagina plasmtica rpida UK NEQAS Servio Nacional de Avaliao Externa
RT Transcriptase reversa; do ingls reverse da Qualidade do Reino Unido; do ingls
transcriptase United Kingdom National External
SARA Artrite reativa adquirida sexualmente; Quality Assessment Service
do ingls sexually acquired reactive UNAIDS Programa Conjunto das Naes Unidas
arthritis sobre HIV/AIDS; do ingls Joint United
SDA Amplificao por deslocamento de Nations Programme on HIV/AIDS
cadeia; do ingls strand displacement UNG Uretrite no gonoccica
amplification UNGNC UNG no clamidial
SDC Sensibilidade dicotmica calibrada VB Vaginose bacteriana
SGQ Sistema de gesto de qualidade VDRL Laboratrio de Pesquisa de Doenas
SNP Polimorfismo de nucleotdeo simples; do Venreas; do ingls Venereal Disease
ingls single nucleotide polymorphism Research Laboratory
SPG Sacarose-fosfato-glutamato VPN Valor preditivo negativo
spp. Espcies VPP Valor preditivo positivo
TARV Terapia antirretroviral WB Western blot
TC Captura de alvo; do ingls target capture WR Reao de Wasseman; do ingls
TDR/OMS Programa Especial para Pesquisa e Wasserman reaction
Treinamento em Doenas Tropicais
da OMS; do ingls WHO Special
Programme for Research and Training in
Tropical Diseases
TMA Amplificao mediada por transcrio;
do ingls transcription-mediated
amplification
TOC Teste de cura; do ingls test-of-cure

Siglas ix
Prefcio

As doenas sexualmente transmissveis (DST), incluindo aquelas causadas pelos vrus da imunodeficincia humana
tipos 1 e 2, permanecem como uma rea de importante foco para a sade pblica. Isso se deve alta morbidade
associada s DST, tais como as sequelas de infeces no trato reprodutivo, cncer cervical, sfilis congnita,
gravidez ectpica e infertilidade, assim como a morbidade de doenas relacionadas ao HIV e morte pela sndrome da
imunodeficincia adquirida (AIDS). As estratgias de sade pblica para o controle das DST incluem a promoo de um
comportamento sexual mais seguro e oferta de preservativos (preveno primria), assim como o gerenciamento eficaz
e precoce de pacientes com DST, usando tanto abordagens de gesto sindrmica quanto etiolgicas.

Na abordagem de gesto sindrmica, o gerenciamento fsica e economicamente acessvel e eficiente de indivduos

portadores de DST baseia-se na utilizao de fluxogramas (algoritmos) para cada DST. Os fluxogramas permitem o
diagnstico de DST comuns, a oferta de tratamentos atuais e apropriados para cada pas, o aconselhamento na gesto
de parceiros sexuais e a nfase na importncia dos testes para HIV no mesmo dia da visita ao profissional de sade.
Os fluxogramas devem ser baseados na etiologia local e os dados de susceptibilidade antimicrobiana obtidos por
meio de pesquisas laboratoriais peridicas. Em geral, os testes de laboratrio no so realizados para a maioria dos
pacientes com DST que recebem gesto sindrmica. No entanto, pode ser apropriado coletar espcimes para exames
laboratoriais dos pacientes que no responderam s terapias de primeira gerao, para definir o diagnstico e/ou
determinar se a falha do tratamento se deve a resistncia antimicrobiana. Nos pases que podem custear a abordagem
do diagnstico etiolgico, os exames laboratoriais desenvolvem um papel muito maior em termos de diagnstico
de patgenos de DST especficos e determinao de susceptibilidade antimicrobiana. Os laboratrios tambm
desempenham um papel-chave na vigilncia das DST e nos programas de pesquisa tanto em naes com menos
recursos quanto naquelas mais ricas.

A Organizao Mundial da Sade publicou uma verso anterior deste manual, intitulada Diagnstico laboratorial de
doenas sexualmente transmissveis, em 1999, com o objetivo de oferecer um guia completo de procedimentos-padro
para isolar, detectar e diagnosticar as DST por microbiologistas e tecnlogos mdicos. O guia foi concebido como um
manual de bancada, sintonizado com as necessidades e capacidades dos laboratrios nos diferentes nveis do sistema
de sade. O manual, subsequentemente, mostrou-se muito popular tanto em laboratrios nacionais como particulares.

Desde a publicao do manual de 1999, houve uma srie de avanos fundamentais nos procedimentos de diagnstico,
em especial no que se refere amplificao de cido nucleico e testes rpidos, assim como as metodologias e
recomendaes dos testes de susceptibilidade antimicrobiana. Um conjunto de especialistas internacionais atualizaram
extensivamente os captulos do manual de 1999. Alm disso, a verso revisada inclui novos captulos abordando
uma srie de tpicos, a exemplo das tcnicas de diagnstico de Mycoplasma genitalium, os testes rpidos para
DST e gesto da qualidade de laboratrios. Embora este manual atualizado aborde os mais importantes patgenos
causadores de DST, ele no deve ser visto como completo, cabendo ao leitor consultar outras fontes de referncia
para maiores informaes, por exemplo, no que diz respeito s polticas nacionais dirigidas s DST, guias para teste de
susceptibilidade microbiana, questes mdico-legais e testes de DST em menores.

Este novo manual, Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da
imunodeficincia humana, fornece o conhecimento bsico sobre os princpios dos testes laboratoriais no contexto das
abordagens de triagem e diagnstico, assim como o teste de susceptibilidade antimicrobiana, como componentes do
controle das DST. Assim como na publicao de 1999, este manual trata de cada doena em um captulo separado,
fornecendo informao detalhada quanto coleta, transporte e testagem laboratorial de espcimes. Dois anexos teis,
abordando equipamentos, testes, meios, reagentes e corantes, encontram-se no final do manual.

Prefcio xi
 Prev-se que o manual atualizado ser informativo para administradores, gerentes de programas, equipes de mdicos
e enfermeiros, assim como para o pblico-alvo primrio, que continua sendo formado pelos microbiologistas e
tecnlogos mdicos. O manual deve constituir uma ferramenta til para auxiliar na escolha dos testes diagnsticos
mais apropriados no cenrio individual, idealmente por meio de comits nacionais e/ou locais de especialistas
em aconselhamento. O manual tambm uma fonte valiosa de informaes para estudantes e estagirios, tanto
dentro quanto fora do ambiente de laboratrio. Finalmente, prev-se que a ampliao de produtos e metodologias
de diagnstico continuar nos prximos anos e, dessa forma, ser importante para todos os leitores manterem-se
atualizados quanto aos progressos mais recentes no campo.

xii Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Agradecimentos

O Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana, foi
revisado utilizando a estrutura testada e comprovada do manual de 1999, criada por Eddy Van Dyck, do Instituto de
Medicina Tropical, Anturpia, Blgica; Andr Z. Meheus, da Universidade de Anturpia, Blgica; e Peter Piot, Diretor-
Executivo do Programa Conjunto das Naes Unidas sobre HIV/AIDS (UNAIDS). O Departamento de Sade Reprodutiva e
Pesquisa (RHR), da Organizao Mundial da Sade (OMS) em Genebra, Sua, reconhece e expressa sua gratido para
com a viso desses autores e agradece-lhes a permisso para atualizar o manual, a fim de garantir que este mantenha
sua relevncia global, incorporando a ele novas tecnologias e mtodos de diagnstico.

Especialistas experientes e qualificados em diferentes reas da medicina diagnstica atualizaram o documento

para garantir que a diversidade de mtodos disponveis para o diagnstico das doenas sexualmente transmissveis
(DST) estivesse nele representada, tornando-o o mais atual possvel nessa rea da medicina, que est em constante
mutao. A OMS/RHR gostaria de agradecer a diversos especialistas e suas instituies pela dedicao e entusiasmo,
que garantiram a alta qualidade e a perspectiva global deste documento no que diz respeito ao diagnstico das DST.

Agradecimentos sinceros so dirigidos a Yaw Adu-Sarkodie, Manju Bala, Ronald Ballard, Alan Herring, Edward W. Hook
III, Catherine Ison, David Mabey, Rosanna Peeling e Magnus Unemo, que revisaram o manual de 1999 e determinaram
as sees que necessitavam de mudanas e atualizaes, alm de identificar os novos captulos a ser adicionados. O
grupo tambm props uma lista de possveis autores para a reviso dos captulos existentes e a elaborao dos novos
captulos, e indicaram alguns dos possveis revisores desses contedos.

A OMS/RHR gostaria de agradecer aos seguintes autores, que revisaram a primeira verso dos captulos e continuaram
o trabalho para sua finalizao: Manju Bala, Ronald Ballard, Laurent Blec, Fatim Cham, Jo-Anne Dillon, Suzanne
Garland, Edward W. Hook III, Catherine Ison, David Lewis, Bharat Parekh, Rosanna Peeling, Ye Tun, Magnus Unemo e
Barbara Van Der Pol. Os seguintes funcionrios do Departamento da OMS forneceram informaes e orientaes para
a finalizao do manual: Nathalie Broutet, Lori Newman e Igor Toskin. Francis Ndowa liderou o processo de reviso do
manual.

A OMS/RHR tambm reconhece e agradece aos autores remanescentes: Cheng Y. Chen, Dennis Ellenberger, Jrgen
Skov Jensen, John Nkengasong, Stefania Starnino, Larry Westerman e Chunfu Yang pelo grande esforo e tempo
empregados para garantir que a qualidade dos captulos fosse a mais alta possvel.

A OMS/RHR grata s seguintes pessoas por concordarem em revisar os captulos relacionados aos seus respectivos
campos de especializao: Rajesh Bhatia, Xiang-Sheng Chen, Charlotte Gaydos, Monica Lahra, Jrme Le Goff, Jeanne
Marrazzo, Allan Ronald e Patricia Totten.

A OMS/RHR tambm reconhece a dedicao de Fatim Cham, que conferiu os comentrios dos revisores, compilou os
captulos e garantiu a harmonizao entre os diferentes captulos e anexos.

A OMS/RHR agradece a assistncia fornecida pelos Centros de Controle e Preveno de Doenas (CDC), em Atlanta,
Gergia, pela edio das cpias da verso final do manual e o auxlio da equipe da Green Ink, Reino Unido, pelo design,
layout e reviso.

Agradecimentos xiii
Captulo 1
Escolha de testes para doenas sexualmente transmissveis
1.1 Introduo
Mais de 30 bactrias, vrus e patgenos parasitas
so transmitidos sexualmente e constituem um grupo
de infeces denominadas doenas sexualmente
transmissveis (DST). Embora alguns patgenos possam
ser adquiridos por meio de outras rotas de transmisso
que no a sexual, epidemiologicamente o contato sexual
mais importante para a sua transmisso de uma
pessoa para a outra (Tabela 1.1).
Os testes laboratoriais e os testes rpidos (TR) ou
point-of-care (POC) so instrumentos potencialmente
poderosos para a gesto e controle das DST, por
facilitarem a preveno da transmisso das DST e
suas sequelas. O alto nmero de DST, assim como a
variedade dos possveis testes para cada DST tornam
difcil a escolha do teste de diagnstico apropriado. No
momento, uma ampla variedade de testes disponveis
para as DST apresentam atributos e possveis limitaes
que podem influenciar sua aplicao, a fim de aumentar
o controle das DST. Alm disso, em uma era de recursos
limitados, a deciso sobre em quais e em quantas DST
se deve investir para a realizao de testes, quem deve
ser testado e quais dos mltiplos testes disponveis
devem ser utilizados para um determinado propsito
pode ser difcil. A seleo do teste deve refletir um
processo de priorizao que considera a prevalncia
da infeco, o impacto e complicao das infeces
nos indivduos e populaes, as caractersticas de
desempenho do teste, os custos do teste e a razo pelo
qual o teste est sendo realizado.
Os testes para DST podem ser utilizados para uma
variedade de diferentes propsitos que, por sua vez,
podem afetar a escolha do teste. Essas diferentes
razes para testagem incluem fins de vigilncia,
validao de algoritmos de gesto sindrmica, garantia
de qualidade (GQ), diagnstico de pessoas com sinais
ou sintomas de possveis DST, triagem de pessoas
de risco assintomticas, e testes de susceptibilidade
antimicrobiana. Alguns elementos-chave para esses
termos esto descritos a seguir:
Vigilncia. Vigilncia a coleta sistemtica,
agrupamento e anlise de dados que determinam a
frequncia de uma infeco em uma comunidade ou
populao. um elemento essencial de planejamento
para o controle das DST. Investimentos em vigilncia
para infeces com baixo impacto direto na sade
pblica no devem ser altamente priorizados se os
recursos so limitados, se a infeco for incomum
(por exemplo, cancro mole, especialmente em
naes desenvolvidas) ou se estiver associada a uma
baixa morbidade (por exemplo, piolhos pubianos).
Geralmente, o tempo necessrio para a obteno do
resultado de um teste com propsito de vigilncia
no um fator crtico. Em alguns casos, o espcime
coletado para vigilncia tambm pode ser utilizado
para o monitoramento de outros fatores clinicamente
importantes, como a resistncia antimicrobiana (por
exemplo, na Neisseria gonorrhoeae).
Validao da gesto sindrmica. O diagnstico
sindrmico um elemento til para o controle de
DST, oferecendo uma avaliao rpida quanto ao
diagnstico, a qual pode ser utilizada para guiar a
terapia oportuna de pessoas com sinais ou sintomas
de uma infeco. Em lugares em que o diagnstico
sindrmico representa um elemento importante para
a gesto das DST, o teste laboratorial peridico de
pacientes diagnosticados e tratados utilizando os
algoritmos de gesto sindrmica para DST deve ser
realizado para garantir que o diagnstico sindrmico
esteja conseguindo identificar as infeces que
so alvos de interveno. Em situaes em que o
diagnstico sindrmico no esteja resultando no
tratamento de sua DST-alvo, necessrio haver
empenho para avaliar as razes do fracasso. As
informaes adquiridas por meio do uso peridico de
testes para avaliar a qualidade dos servios clnicos
Escolha de testes para doenas sexualmente transmissveis 1
 podem ser usadas como uma forma de melhorar o
tratamento do paciente.
Garantia/melhoria da qualidade. A grande rea
da GQ inclui tanto o controle de qualidade, para
assegurar que os testes estejam sendo realizados
conforme o esperado, quanto a avaliao da
qualidade, para garantir que os testes sejam
utilizados adequadamente e que todas as etapas
necessrias gesto dos pacientes sejam seguidas
de forma correta. A preciso dos testes de DST pode
ser impactada por muitos fatores, incluindo a variao
nos reagentes, o funcionamento dos equipamentos e
a proficincia tcnica. Como resultado, recomenda-se
a realizao de testes peridicos de espcimes-
padro para avaliar a proficincia laboratorial e
garantir a preciso esperada do teste. Espcimes-
padro podem ser obtidos a partir de organizaes
certificadas, ou ento ser gerados no prprio
laboratrio. A avaliao de espcimes-padro pode
identificar a necessidade de novo treinamento ou
de uma avaliao da qualidade dos componentes
individuais do teste laboratorial.
Diagnstico. Os sintomas das DST comuns tendem
a ser no especficos e, tipicamente, apresentam
uma variedade de possveis agentes causadores
que podem requerer diferentes tratamentos. Como
resultado, os testes de diagnstico so teis tanto
para a obteno de um diagnstico preciso quanto
para guiar a gesto de parceiros sexuais, assim
como a GQ de algoritmos de gesto sindrmica,
como notado acima. Quando os testes so usados
para diagnstico, o tempo necessrio para a
disponibilizao dos resultados a fim de guiar a
gesto deve ser considerado para a escolha do
2 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
teste, uma vez que as pessoas infectadas podem
transmitir a doena para outros, sofrer complicaes
na infeco ou abandonar o acompanhamento
no intervalo entre a testagem e a notificao
do resultado do teste (1, 2). Quando o teste de
diagnstico realizado como parte dos servios
clnicos, pode ser til monitorar o intervalo entre a
testagem e o tratamento das pessoas com testes
positivos, como uma medida de qualidade de
atendimento.
Triagem. A triagem um elemento essencial para
uma gesto tima das DST e para a elaborao de
estratgias de controle baseadas nas contribuies
da gesto sindrmica e dos testes de diagnstico.
Todas as DST podem ocorrer de forma assintomtica
ou no ser reconhecidas pela pessoa infectada.
Apesar da ausncia de sintomas identificados, as
pessoas com infeces assintomticas podem
estar em risco de transmisso para outros e de
complicaes da infeco. Como resultado, a triagem
(isto , o teste de pessoas em alto risco sem sinais
ou sintomas reconhecidos) ir identificar as pessoas
infectadas, reduzindo, desse modo, o risco de
complicaes ou de transmisso de infeces. Assim
como no teste de diagnstico, o intervalo de tempo
entre o teste e o incio do tratamento, bem como a
proporo de pessoas recebendo o tratamento, caso
alguns indivduos abandonem o acompanhamento,
so medidas teis de qualidade. A triagem por DST
pode ser mais eficiente em termos de custo quando
puder ser direcionada a subgrupos de populaes
de alto risco; normalmente, esse direcionamento
melhor realizado utilizando-se dados de vigilncia.
Tabela 1.1: Principais patgenos transmitidos sexualmente e doenas por eles causadas
Patgeno
Infeces bacterianas
Neisseria gonorrhoeae
Chlamydia trachomatis
Chlamydia trachomatis
(sorotipos L1L3)
Treponema pallidum
Haemophilus ducreyi
Klebsiella (Calymmatobacterium)
granulomatis
Mycoplasma genitalium
Manifestaes clnicas e outras doenas associadas
GONORREIA
Homens: corrimento uretral (uretrite), epididimite, orquite, infertilidade
Mulheres: cervicite, endometrite, salpingite, doena inflamatria plvica,
infertilidade, ruptura prematura de membranas, perihepatite; comumente
assintomtica
INFECO CLAMIDIAL
Homens: corrimento uretral (uretrite), epididimite, orquite, infertilidade
Mulheres: cervicite, endometrite, salpingite, doena inflamatria plvica,
infertilidade, ruptura prematura de membranas, perihepatite; comumente
assintomtica
Ambos os sexos: proctite, faringite, sndrome de Reiter
Recm-nascidos: conjuntivite, pneumonia
LINFOGRANULOMA VENREO
Ambos os sexos: lcera, inchao inguinal (bubo), proctite
SFILIS
Ambos os sexos: lcera primria (cancro) com adenopatia local, erupes na
pele, condiloma lata; danos sseos, cardiovasculares e neurolgicos
Mulheres: perda da gravidez (aborto, natimorto), parto prematuro
Recm-nascidos: natimorto, sfilis congnita
CANCRO MOLE
Ambos os sexos: lceras genitais doloridas; podem ser acompanhadas por
bubo
DONOVANOSE (GRANULOMA INGUINAL)
Ambos os sexos: inchaos nodulares e leses ulcerativas das reas inguinal
e anogenital
Homens: corrimento uretral (uretrite no gonoccica)
Mulheres: cervicite, endometrite, provvel doena inflamatria plvica
Homens: corrimento uretral (uretrite no gonoccica)
Mulheres: cervicite, endometrite, provvel doena inflamatria plvica
Escolha de testes para doenas sexualmente transmissveis 3
 Tabela 1.1: Principais patgenos transmitidos sexualmente e doenas por eles causadas (continuao)

Patgeno Manifestaes clnicas e outras doenas associadas

Infeces virais
SNDROME DA IMUNODEFICINCIA ADQUIRIDA (AIDS)
Vrus da imunodeficincia humana
Ambos os sexos: doenas relacionadas ao HIV, AIDS
(HIV)

Vrus da herpes simples tipo 2 HERPES GENITAL

Vrus da herpes simples tipo 1 (menos Ambos os sexos: leses vesiculares anogenitais e ulceraes
comum) Recm-nascidos: herpes neonatal (frequentemente fatal)

VERRUGAS GENITAIS
Homens: verrugas penianas e anais; carcinoma no pnis
Mulheres: verrugas vulval, anal e cervical; carcinoma cervical, carcinoma
Papilomavrus humano
vulval, carcinoma anal
Recm-nascidos: papiloma de laringe

HEPATITE VIRAL
Vrus da hepatite B Ambos os sexos: hepatite aguda, cirrose heptica, cncer de fgado

INFECO POR CITOMEGALOVRUS

Ambos os sexos: febre subclnica ou no especfica, inchao difuso no
Citomegalovrus
linfonodo, doenas hepticas, etc.

MOLUSCO CONTAGIOSO
Ambos os sexos: ndulos firmes e umbilicados na pele, genitais ou
Vrus do molusco
generalizados

SARCOMA DE KAPOSI
Herpesvrus associado ao sarcoma de
Ambos os sexos: tipo de cncer agressivo em pessoas imunossuprimidas
Kaposi (herpesvrus humano tipo 8)

Infeces por protozorios

Trichomonas vaginalis
TRICOMONASE
Homens: Corrimento uretral (uretrite no gonoccica); frequentemente
assintomtico
Mulheres: vaginose com corrimento vaginal abundante e espumoso,
nascimento prematuro, bebs de baixo peso ao nascer
Recm-nascidos: baixo peso ao nascer

4 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Tabela 1.1: Principais patgenos transmitidos sexualmente e doenas por eles causadas (continuao)

Patgeno Manifestaes clnicas e outras doenas associadas

Infeces por fungos
CANDIDASE
Homens: infeco superficial na glande do pnis
Candida albicans
Mulheres: vulvo-vaginite com secreo vaginal espessa e aspecto de
coalhada, prurido ou queimao vulvar
Infeces parasitrias
Phthirus pubis INFESTAES POR PIOLHOS PUBIANOS
Sarcoptes scabiei SARNA

Determinao de susceptibilidade cada tipo de teste de diagnstico tem suas vantagens e

antimicrobiana. Para algumas DST (vale
ressaltar como exemplo a N. gonorrhoeae),
o desenvolvimento continuado de resistncia
tem levado, periodicamente, a mudanas na
terapia recomendada. A vigilncia sistemtica
da susceptibilidade antimicrobiana e/ou o teste
de isolados especficos para a susceptibilidade a
agentes antimicrobianos utilizados em terapias
fornecem informaes que podem ser usadas para
ajustar as recomendaes de tratamento de forma
antecipada, preferencialmente antes que a falha
teraputica se torne um problema. A determinao
da susceptibilidade antimicrobiana melhor realizada
em isolados clnicos vivos de culturas de organismos
e tipicamente melhor utilizada para guiar terapias
recomendadas populao do que para a gesto
individual de pacientes. Na maioria das vezes, a
vigilncia da resistncia antimicrobiana melhor
conduzida por laboratrios de referncia, utilizando
espcimes coletados a partir de um espectro de
localidades geograficamente representativo e de
populaes de interesse.
1.2 Tipos de testes de diagnstico
O progresso cientfico tem fornecido uma ampla
gama de testes para a identificao das DST. Esses
testes apresentam grande variedade no seu nvel de
complexidade (isto , os requisitos tcnicos para um
timo desempenho do teste), nos custos necessrios
para realiz-los (tanto materiais como em relao a mo
de obra) e em termos de desempenho. Dessa forma,
desvantagens. Como resultado, em alguns contextos, o
teste mais preciso pode no ser o mais adequado, caso
seja to oneroso que no possa ser realizado em um
grande nmero de pessoas em risco, ou to complexo
que os resultados no estaro disponveis a tempo para
guiar a gesto de pacientes. Finalmente, em alguns
casos, os testes laboratoriais para DST esto disponveis
em uma variedade de formas e plataformas, o que
influencia o nmero de testes que podem ser realizados
em um determinado intervalo de tempo. Desse modo, o
rendimento do teste (o nmero de testes completados
em um determinado intervalo de tempo) tambm
considerado na seleo de testes. Em alguns contextos,
volumes maiores ou menores de testagem tornam alguns
testes ou plataformas preferveis.
Em geral, os testes de diagnstico podem ser separados
em pelo menos trs tipos. Primeiro, a deteco direta
de microrganismos a finalidade mais bvia para o
diagnstico das DST. Pode ser realizada por meio de
microscopia e colorao apropriada ou preparao a
fresco para a visualizao de patgenos. A cultura, a
deteco de antgeno ou a deteco de cido nucleico,
por meio da amplificao ou no, so frequentemente
mais sensveis que a microscopia. No entanto, podem
implicar necessidades tcnicas mais complexas para um
timo desempenho do teste, o que aumenta o intervalo
entre a coleta do material e a disponibilidade dos
resultados do teste (o teste rpido ajuda a superar essa
ltima possvel limitao). Cada uma dessas abordagens
apresenta suas prprias vantagens e desvantagens.
A microscopia, principalmente quando realizada

Escolha de testes para doenas sexualmente transmissveis 5

 na presena do paciente, pode fornecer resultados
imediatos para auxiliar nas decises de gesto,
mas, como outros testes, necessita equipamentos
especializados (como microscpios), eletricidade ou
procedimentos especiais de colorao, alm de depender
do treinamento e experincia do microscopista.
Em contraste, outros testes laboratoriais, como a cultura
ou a amplificao de cido nucleico, podem necessitar
mtodos especiais para o transporte do espcime e
equipamentos e procedimentos especializados para
um timo desempenho, atrasando, dessa forma,
a disponibilidade dos resultados para a tomada de
decises imediatas.
Em segundo lugar, para muitas DST importantes (a sfilis
e o HIV representam exemplos comuns), a deteco
da resposta do hospedeiro para a infeco (anticorpos)
representa um teste de diagnstico mais favorvel. A
vantagem dos testes sorolgicos que eles podem
ser teis no s para o propsito de diagnstico, mas
tambm para a vigilncia. Todos os testes sorolgicos
apresentam resultados falso-positivos ocasionais. O
problema dos testes sorolgicos falso-positivos pode
frequentemente ser reduzido por meio de um segundo
teste sorolgico confirmatrio, o qual tem como alvo um
antgeno diferente do teste sorolgico inicial de triagem
(o uso de teste confirmatrio discutido em maiores
detalhes na seo de testes sorolgicos para sfilis e
HIV). Alguns testes sorolgicos podem ser capazes de
diferenciar infeces adquiridas recentemente daquelas
mais antigas ou previamente tratadas por meio da
deteco da imunoglobulina M (IgM) para infeces
recentes. Uma deficincia do diagnstico sorolgico
que os anticorpos para um patgeno causador
de DST podem persistir por um longo perodo aps
um tratamento bem-sucedido. Dessa forma, o teste
sorolgico de populaes pode ser uma indicao do
total cumulativo de infeces, em vez do nmero de
infeces adquiridas mais recentemente.
Em terceiro lugar, existem os testes que detectam
metablitos microbianos, como materiais que alteram
o pH das secrees genitais e aminas biognicas. Em
certos contextos, esses testes so teis para o propsito
de diagnstico. Um exemplo disso a importncia
6 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
do teste de pH ou sopro/amina para o diagnstico de
vaginose bacteriana.
1.3 Desempenho do teste
Em ltima anlise, o valor dos testes para a deteco
das DST tambm depende muito do seu desempenho
(Tabela 1.2). Como medidas do desempenho, os
clculos da sensibilidade e da especificidade (3) desde
que realizados com base em um tamanho amostral
suficientemente grande representam estimativas
confiveis do desempenho geral dos testes. No entanto,
os valores preditivos (tanto positivo como negativo)
desses testes podem variar substancialmente de
populao para populao, dependendo da prevalncia
da infeco na comunidade.
Assim, os testes que apresentam taxas substanciais de
falso-positivos e os testes para infeces relativamente
incomuns (isto , de baixa prevalncia) podem
apresentar um valor preditivo positivo baixo, mesmo
havendo alta sensibilidade para a deteco da infeco.
Em geral, a literatura cientfica revisada por especialistas
fornece estimativas confiveis de testes de sensibilidade
e especificidade. No entanto, para qualquer situao
especfica, a prevalncia local da doena ir determinar
parcialmente o valor preditivo dos testes laboratoriais.
Assim, a vigilncia para determinar a prevalncia local
da doena fornece dados importantes para a escolha do
teste para DST.
1.4 Tipos de laboratrios e funes
Embora o mtodo tradicional para o diagnstico de DST
se constitua em anlises laboratoriais para determinar
os agentes etiolgicos, nem todos os testes precisam
ser realizados em todos os laboratrios, para todos os
propsitos. O diagnstico laboratorial de DST tende a
ser dispendioso em termos de equipamento, reagentes,
infraestrutura e manuteno. Ainda mais importante,
especialmente em lugares com recursos limitados,
as amostras da maioria dos pacientes com DST so
processadas em locais sem instalaes laboratoriais
(2). Para adequao s situaes em que no se dispe
de instalaes laboratoriais, a Organizao Mundial da
Sade desenvolveu guias sobre o uso da abordagem
sindrmica para a gesto de algumas DST e defende seu
uso desde meados da dcada de 80, aps avaliaes de
campo sobre o seu desempenho (3). Subsequentemente,
uma srie de estudos de campo mostraram que a
abordagem sindrmica funciona bem no tratamento de
homens com corrimento uretral sintomtico e na gesto
de homens e mulheres com lcera genital bacteriana (4,
5). No entanto, esse no o caso para o diagnstico e
gesto de infeces cervicais por N. gonorrhoeae ou C.
trachomatis, exceto nos casos em que o exame mostra
mucopus, eroses e friabilidade cervicais, ou quando h
um histrico de sangramento entre as menstruaes e
durante a relao sexual (6). No entanto, o diagnstico
sindrmico acompanhado de tratamento tem a vantagem
de proporcionar cuidados imediatos ao paciente na sua
primeira procura por avaliao, alm de ser de baixo
custo no h incidncia de custos laboratoriais diretos
sobre o paciente, o prestador de servio ou o Estado.
O uso da abordagem sindrmica tambm permite a
padronizao do diagnstico e tratamento e a elaborao
de relatrios em um ambiente ou situao em particular.
Os pacientes com suspeita de DST podem ser
direcionados a instituies de ateno primria sade,
clnicas de planejamento familiar, mdicos particulares
e s prprias clnicas especializadas em DST (7 ).
Inevitavelmente, porm, a abordagem sindrmica tem
o potencial de superdiagnosticar e tratar pacientes que
possam no estar infectados com qualquer ou algum dos
organismos presumidos como causadores da sndrome
em questo (8).
Dessa forma, para apoiar a abordagem sindrmica
voltada ao diagnstico, os laboratrios clnicos locais
devem ser incentivados a realizar os testes necessrios
para facilitar a gesto clnica de pessoas com DST ou em
risco para esses agravos. Em alguns lugares em que o
transporte de espcime no representa um problema, a
economia de escala torna o processamento do espcime
em laboratrios centrais to rpido quanto e mais
eficiente do que quando realizado em stios locais. Nem
todos os laboratrios precisam realizar as atividades
do laboratrio central, como o teste de susceptibilidade
antimicrobiana.
Os sistemas de laboratrio podem ser arbitrariamente
categorizados em trs nveis, com base nos nveis
dos servios de cuidado e tratamento inerentes a
cada categoria. Entretanto, deve-se ter em mente
que a infraestrutura laboratorial e as capacidades de

Tabela 1.2: Efeito da sensibilidade, especificidade e prevalncia no valor preditivo positivo, usando somente o
teste primrio ou, adicionalmente, o teste suplementar

Prevalncia na populao = 1%
A B C D E
Sensibilidade/especificidade do
99%/99% 99%/99,9% 99%/99% 99,5%/99,5% 99,5%/99,5%
teste primrio
Sensibilidade/especificidade do
ND ND 99%/99% ND 99,5%/99,5%
teste suplementar/confirmatrio
Nmero testado 1000 1000 11 1000 15
Negativos
Nmero total 980 989 1 985 5
Negativos verdadeiros 980 989 1 985 5
Falso-negativos 0 0 0 0 0
Positivos
Total 20 11 10 15 10
Positivos verdadeiros 10 10 10 10 10
Falso-positivos 10 1 0 5 0
Valor preditivo positivo (VPP) 50% 91% 100% 67% 100%
ND: no determinado.

Escolha de testes para doenas sexualmente transmissveis 7

 diagnstico podem variar imensamente entre os pases
com recursos limitados e aqueles industrializados.
Considere as seguintes categorias como um guia geral:
1. Laboratrios perifricos que apoiam o nvel
de servio de sade primrio, apresentando
equipamentos laboratoriais limitados e equipe
de laboratrio minimamente treinada. Esses
laboratrios so projetados para fornecer
diagnstico rpido de DST no prprio local.
2. Laboratrios de nvel intermedirio, que do suporte
aos laboratrios do servio de sade primria e
clnicas e hospitais de nvel intermedirio.
3. Laboratrios centrais que apoiam as clnicas de
sade tercirias, incluindo as clnicas de referncia
especializadas em DST, assim como clnicas e
laboratrios de cuidado sade de menor nvel.
Embora os testes rpidos possam carecer de
sensibilidade, normalmente apresentam boa
especificidade e podem oferecer uma economia na
gesto de algumas condies, como corrimento vaginal,
no nvel de cuidados de sade perifricos.
Este manual descreve testes abrangendo desde a
abordagem bsica econmica at os procedimentos mais
sofisticados e de alto custo. Os gestores de programas
e os especialistas de laboratrios, em colaborao com
os agentes polticos, devem determinar a viabilidade e
utilidade da incorporao dos testes em diferentes nveis
de centros de sade. A escolha tambm depender das
abordagens usadas pelos diferentes nveis de centros de
sade: a abordagem sindrmica (bsica ou modificada),
a abordagem etiolgica, ou ambas.
1.5 Sintetizando
No existe um nico teste ideal para a deteco de
agentes causadores de DST. Para uma tomada de
deciso programtica, as vrias DST e as populaes
impactadas devem ser consideradas como uma matriz
para definir no somente qual teste laboratorial o mais
apropriado para a comunidade em questo, mas tambm
qual a proporo do total de recursos disponveis
(oramento, pessoal, etc.) deve ser alocada para cada
DST a ser testada (Tabela 1.3).
8 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
As decises quanto escolha de testes devem ser
conduzidas no contexto da prevalncia da infeco
em questo, do impacto da infeco na comunidade,
dos recursos disponveis para apoiar a testagem e
tratamento e da priorizao da infeco em relao a
outras DST. Alm disso, fatores como a complexidade,
o tempo para obter o resultado do teste e os custos so
consideraes essenciais para a escolha dos testes
de diagnstico. Modelos matemticos demonstraram
claramente que em situaes e ambientes nos quais
os resultados so disponibilizados no momento
da avaliao inicial do paciente e onde h atraso
no tratamento, quando o mesmo no iniciado
no momento da avaliao, testes menos sensveis
oferecidos nas unidades de sade podem de fato
aumentar o nmero de pessoas tratadas e reduzir as
complicaes das infeces quando comparados a
testes mais sensveis, que necessitam de mais tempo
para gerarem o resultado (2).
Tabela 1.3: Possveis fatores que influenciam a
escolha dos testes para DST
1. Finalidade do teste
Vigilncia
Garantia de qualidade
Avaliao do diagnstico sindrmico
Diagnstico
Triagem
Teste de susceptibilidade antimicrobiana
2. Consideraes especficas em relao ao teste
Desempenho (sensibilidade, especificidade, valor
preditivo)
Coleta de espcime e necessidades de transporte
Prevalncia
Morbidade associada
Recursos
Finanas
Pessoal
Infraestrutura (servios, etc.)
Importncia relativa em relao a outras prioridades
1.6 Referncias
1. Geisler WM et al. The natural history of
untreated Chlamydia trachomatis infection in
the interval between screening and returning for
treatment. Sexually Transmitted Diseases, 2008,
35(2):119123.

2. Gift TL et al. The rapid test paradox: when fewer

cases detected lead to more cases treated:
a decision analysis of tests for Chlamydia
trachomatis. Sexually Transmitted Diseases, 1999,
26(4):232240.

3. Kuypers J, Gaydos CA, Peeling RW. Principles of

laboratory diagnosis of STIs. In: Holmes KK et al.,
eds. Sexually transmitted diseases, 4th ed. Nova
York, McGraw-Hill Medical, 2008:937958.

4. Adler MW et al. Sexual health and care: sexually

transmitted infections: guidelines for prevention and
treatment. [Occasional paper]. Londres, ODA, 1996

5. Management of patients with sexually transmitted

diseases. Genebra, Organizao Mundial da Sade,
1991 (WHO Technical Report Series No. 810).

6. Alary M et al. Evaluation of clinical algorithms

for the diagnosis of gonococcal and chlamydial
infections among men with urethral discharge or
dysuria and women with vaginal discharge in Benin.
Sexually Transmitted Infections, 1998, 74(Suppl.
1):S4449.

7. Moherdaui F et al. Validation of national algorithms

for the diagnosis of sexually transmitted diseases
in Brazil: results from a multicentre study. Sexually
Transmitted Infections, 1998, 74(Suppl. 1):S3843.

8. Vuylsteke B. Current status of syndromic

management of sexually transmitted infections
in developing countries. Sexually Transmitted
Infections, 2004, 80(5):333334.

Escolha de testes para doenas sexualmente transmissveis 9

10 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Captulo 10
Sfilis
10.1 Introduo
A sfilis uma doena sexualmente transmissvel
crnica, caracterizada por manifestaes pontuais e
longos perodos de quiescncia. Ela causada pelo
Treponema pallidum subsp. pallidum, um organismo
espiralado e delicado, intimamente relacionado com
os organismos causadores das treponematoses no
venreas, denominados T. pallidum subsp. pertenue
(bouba), T. pallidum subsp. endemicum (sfilis endmica)
e T. carateum (pinta). Esses quatro patgenos so
morfolgica e antigenicamente idnticos. Eles s podem
ser diferenciados entre si pelo modo de transmisso,
epidemiologia, manifestaes clnicas e, mais
recentemente, por sequenciamento gentico (1).
A sfilis venrea normalmente transmitida como
resultado do contato sexual com uma leso infecciosa
da membrana mucosa ou pele desgastada ou por meio
da placenta de uma gestante para o feto. A multiplicao
bacteriana ocorre preferencialmente no momento da
inoculao, resultando na formao da ulcerao genital normalmente associados linfadenopatia inguinal
primria, seguida de um perodo de incubao de 9-90
dias. Entretanto, a sfilis deve ser considerada uma
doena sistmica, uma vez que a bactria causadora
entra na corrente sangunea logo aps a infeco.
6 semanas a
6 meses
Infeco
Primria Secundria
(cancro) (erupes)
(Sfilis meningovascular)
Perodo de incubao
9-90 dias
1 ano
Sfilis precoce
Figura 10.1
Representao esquemtica do curso da sfilis no tratada
A Figura 10.1 mostra o curso de uma sfilis no tratada.
A primeira manifestao da doena em adultos
uma pequena mcula, a qual se transforma em
uma ppula que, por sua vez, se torna uma lcera.
A lcera tpica (cancro primrio) classicamente
uma leso nica e indolor, que apresenta uma base
limpa e relativamente avascular. Em homens, a
leso comumente encontrada no sulco coronal, na
glande e na haste peniana e, nas mulheres, na vulva,
nas paredes vaginais ou no colo do tero. Leses
extragenitais so raras, mas o cancro oral pode
ocorrer como resultado de sexo oral, e leses perianais
ou no reto so frequentemente vistas em homens
que fazem sexo com homens ou em mulheres que
praticaram relao sexual anal receptiva. Por serem
frequentemente indolores, as leses primrias podem
no ser percebidas. Se no forem tratadas, a lcera
ir curar-se espontaneamente em 3-8 semanas sem
deixar cicatriz. Os cancros primrios genitais so
bilateral, a qual classicamente discreta e suave.
Muitos anos at
por toda a vida
Sfilis latente
Terciria
(sem sinal da doena)
Doena gomosa benigna
Sfilis cardiovascular
Neurossfilis tardia
Muitos anos at
por toda a vida
Sfilis tardia
Sfilis 121
 Em pacientes no tratados, o surgimento do segundo
estgio da doena costuma ocorrer entre seis semanas
e seis meses aps a infeco inicial. O cancro primrio
pode ainda estar presente quando as leses secundrias
clinicamente aparentes ocorrerem. A principal
caracterstica da sfilis secundria uma erupo
na pele, no irritvel e distribuda uniformemente,
que pode ser macular, papular ou papulo-escamosa.
frequentemente observada na palma das mos e
na sola dos ps. A erupo pode ser acompanhada
de linfadenopatia, febre, dor de cabea e mal-estar
generalizado. Em reas quentes e midas, como a
vulva ou regio perianal, a erupo muitas vezes se
torna maior e forma uma estrutura elevada semelhante
a uma verruga, conhecida como condiloma lata, e, em
regies mucosas, forma leses superficiais brancas
acinzentadas serpiginosas, conhecidas como lceras em
rastro de caracol.
Se a sfilis secundria permanecer sem diagnstico
e, portanto, sem tratamento, todas as manifestaes
visveis da doena iro sarar espontaneamente e o
paciente passar por um perodo de latncia que pode
durar muitos anos. A sfilis latente convenientemente
dividida em infeco latente precoce e tardia, com a
linha de diviso ocorrendo um ano aps a aquisio da
doena (Figura 10.1). Entretanto, deve-se ter em mente
que muitas vezes impossvel determinar a durao
exata da infeco no tratada e, por padronizao,
esses casos devem ser classificados como doena
tardia latente. Durante os estgios latentes da doena,
no h leses na pele ou membrana mucosa para
serem coletadas; dessa forma, um diagnstico deve
ser baseado no resultado de testes sorolgicos e na
ausncia de sinais e sintomas de sfilis terciria.
A sfilis terciria , normalmente, considerada o estgio
destrutivo da doena. Em geral, os sinais e sintomas
dessas manifestaes tardias ocorrem, frequentemente,
muitos anos aps a infeco inicial, embora o
processo da doena possa cursar significantemente
mais rpido em pacientes coinfectados com o vrus
da imunodeficincia humana (HIV, do ingls human
immunodeficiency virus). As vrias manifestaes
da sfilis terciria foram classificadas em doena
gomosa benigna, sfilis cardiovascular e neurossfilis.
No entanto, essas manifestaes clnicas podem
122 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
coexistir. As gomas so leses destrutivas da sfilis
terciria que podem ocorrer em qualquer rgo do
corpo, porm mais frequentemente na pele, cartilagem
e ossos (doena gomosa benigna); nas paredes da
aorta (sfilis cardiovascular); nos vasos cerebrais (sfilis
meningovascular); ou no crebro e na medula espinhal
(neurossfilis).
Essas manifestaes tardias so frequentemente
diagnosticadas em centros clnicos combinadas com
os resultados de raio-x do trax ou outra imagem (para
sfilis cardiovascular); avaliao de raio-x dos ossos
afetados para detectar gomas nos ossos; e testes
sorolgicos, incluindo o exame do lquido cefalorraquidiano
para neurossfilis. Uma descrio mais completa das
manifestaes da doena pode ser encontrada em textos
oficiais (2).
10.2 Mtodos de deteco direta para o
diagnstico de sfilis
Uma vez que o T. pallidum no pode ser cultivado em
meio artificial, os mtodos de deteco direta, tais como
a microscopia de campo escuro, imunofluorescncia
direta (IF) e testes para detectar sequncias de DNA
especficas de T. pallidum em espcimes obtidos
de leses na pele ou tecidos so os mtodos de
escolha para diagnosticar a sfilis precoce. O teste de
infectividade em coelhos (RIT, do ingls rabbit infectivity
test) vem sendo considerado, h muito tempo, o padro-
ouro para a deteco direta de T. pallidum em espcimes
clnicos (3). Esse mtodo tem uma sensibilidade de
aproximadamente um nico organismo, quando so
utilizadas passagens repetidas em coelhos. Entretanto,
esses testes raramente so realizados, exceto em
laboratrios de pesquisa, uma vez que so demorados
(necessitam de aproximadamente 1-2 meses para
serem completados) e requerem o acesso a biotrios
adequados.
10.2.1 Microscopia de campo escuro
A microscopia de campo escuro o nico teste point-of-
care (POC) capaz de determinar um diagnstico direto
de sfilis, em casos de doena primria ou secundria,
em adultos, ou doena congnita precoce. Seu uso ,
portanto, recomendado para clnicas especializadas em
DST e laboratrios hospitalares prximos a clnicas. Uma
vez que necessria uma microscopia especializada
adaptada com um condensador de campo escuro,
somada adeso a condies tcnicas estritas para
que se produzam resultados confiveis, o teste deve ser
limitado a laboratrios especializados.
Na microscopia de campo escuro, apenas os raios de
luz que atravessam os organismos ou partculas em
um ngulo oblquo entram na objetiva do microscpio,
dando origem a corpos brilhantes, brancos e
luminescentes contra um fundo preto. A microscopia
de campo escuro deve ser realizada por profissionais
bem treinados e experientes, capazes de ajustar o
microscpio corretamente e de diferenciar o T. pallidum
de treponemas no patognicos e outros organismos
espiralados comumente encontrados nas membranas
genitais ou mucosa anal. Uma vez que a cavidade oral
frequentemente colonizada por outras espiroquetas,
diferentes dos treponemas, no se recomenda o exame
em campo escuro de material de leses orais.
Tanto as leses primrias como secundrias de sfilis
podem ser examinadas por microscopia de campo
escuro. O espcime ideal um exsudato seroso de
leses ativas, livre de clulas sanguneas vermelhas.
A leso ativa deve ser cuidadosamente lavada com
gaze e soluo salina estreis. Deve ser, ento,
raspada gentilmente, com uma haste estril e seca,
e espremida para produzir um exsudato seroso. Se
ocorrer sangramento, as gotas de sangue devem ser
removidas e o lquido seroso transferido para uma
lmina de vidro, utilizando uma esptula fina de ao inox
ou platina ou uma ala bacteriolgica, ou pressionando
a lmina diretamente no fluido. O material deve ser
misturado com uma gota de soluo salina para formar
uma suspenso homognea que pode ser, ento,
coberta por uma lamnula. A lmina deve ser examinada
imediatamente, uma vez que a mobilidade caracterstica
do organismo um fator importante para a identificao.
Qualquer atraso no exame diminui rapidamente essa
mobilidade. A chance de visualizar treponemas tambm
diminui se a leso estiver seca ou em processo de
regenerao.
O alinhamento ptico correto do microscpio de campo
escuro essencial para o sucesso da microscopia de
campo escuro. Algumas gotas de leo de imerso devem
ser colocadas no condensador de um microscpio
previamente alinhado. O condensador deve ser, ento,
ligeiramente rebaixado, de modo que o leo fique abaixo
do nvel da platina. O espcime a ser examinado ento
colocado na platina e o condensador elevado at que
haja um bom contato entre o leo e a parte de baixo
da lmina. importante evitar a formao de bolhas
no leo. O espcime deve ser examinado inicialmente
utilizando uma objetiva de baixo poder de aumento (10x).
Aps focar a objetiva, a luz deve ser centralizada no
meio do campo mediante o ajuste dos parafusos de
centralizao localizados no condensador, e esse ltimo
deve ser focalizado com movimentos de subida e descida
at que seja obtido o menor dimetro de luz possvel. A
luz deve ser, ento, novamente centralizada, caso seja
necessrio. O espcime focalizado utilizando uma
objetiva seca de aumento de 40x, e a lmina examinada
cuidadosamente. A microscopia de campo escuro
melhor conduzida em uma cmara escura.
Os T. pallidum aparecem como corpos espiralados
brilhantes e brancos, iluminados contra um fundo
preto. O organismo identificado por sua morfologia,
tamanho e movimento tpicos. Ele um organismo fino
(0,10-0,18m de largura), com 6-20m de comprimento
e 8-14 espirais profundas e regulares (Figura 10.2).
Exibe movimentos rpidos e bastante abruptos, girando
relativamente devagar ao redor do seu eixo longitudinal.
Essa rotao acompanhada por flexes sincopadas
e tores no meio do organismo. Podem-se notar
movimentos de alongamento e encurtamento (como
uma mola em expanso). Distores podem ocorrer
em circunvolues tortuosas. Outras espiroquetas,
normalmente saprfitas, podem ser observadas.
No entanto, elas so frequentemente enroladas de
forma mais frouxa, ou ento aparecem mais espessas
e grossas, com diferentes movimentos, incluindo
contores com flexo e relaxamento acentuados dos
espirais.
A demonstrao de treponemas com morfologia e
mobilidade caractersticas de T. pallidum constitui um
diagnstico positivo para sfilis primria e secundria
(4). Os pacientes com cancro primrio positivos para
a microscopia de campo escuro podem apresentar
sorologia negativa, mas normalmente espera-se que
Sfilis 123
 a soroconverso ocorra em poucos dias. Entretanto,
a no visualizao do organismo no exame de campo
escuro no exclui um diagnstico de sfilis. Os resultados
negativos podem significar que:
O nmero de organismos presentes no espcime no
suficiente (um nico exame de campo escuro tem
uma sensibilidade menor que 50%);
O paciente j recebeu tratamento ou uma preparao
tpica antibacteriana foi aplicada na leso;
A leso est prxima de uma cura natural;
A leso no sfilis.
Figura 10.2
Treponema pallidum, microscopia de campo escuro.
Fonte: cortesia de David Cox, Centros de Controle e
Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.
Independentemente do resultado do exame de campo
escuro, deve-se sempre coletar sangue para a realizao
do teste sorolgico.
NOTA: pode-se praticar a tcnica de campo escuro
e otimizar a ptica do microscpio por meio do
uso de espcimes obtidos ao longo da margem da
gengiva dentria. As clulas epiteliais da gengiva e
bactrias orais, incluindo organismos espiralados,
podem ser visualizados como corpos brilhantes e
brancos contra um fundo escuro.
124 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
10.2.2 Teste de anticorpo de fluorescncia
direta (EID)
O mtodo utilizado para coletar material de leso para
o EID idntico ao usado para a microscopia de campo
escuro. Os espcimes devem ser passados em uma
rea de 1cm2 da lmina do microscpio, secos ao ar livre
e fixados com acetona ou metanol, podendo, depois,
ser acondicionados para o transporte ao laboratrio.
Aps adicionar globulina anti-T. pallidum marcada com
fluorescena, obtida comercialmente, incubar e lavar, as
lminas devem ser examinadas com um microscpio
de fluorescncia. Qualquer espiroqueta T. pallidum no
espcime aparece como um organismo colorido verde-
ma, com a morfologia tpica de T. pallidum contra
um fundo preto (Figura 10.3). Tanto a sensibilidade
quanto a especificidade do teste EID so superiores s
da microscopia de campo escuro, principalmente se
forem utilizados anticorpos monoclonais para realizar o
conjugado com a fluorescena, uma vez que a tcnica
de EID elimina a confuso com outros organismos
espiralados; alm disso, um pequeno nmero de
treponemas marcados com fluorescena podem ser mais
facilmente detectados no esfregao corado do que na
preparao no colorida (5). Infelizmente, o conjugado
Figura 10.3
Teste de imunofluorescncia direta positivo para T.
pallidum.
Fonte: cortesia de David Cox, Centros de Controle e
Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.
especfico de fluorescena no comercializado em
muitos pases.
NOTA: o conjugado de fluorescena
convenientemente titulado por meio da aplicao
de diluies em duas vezes do conjugado em
lminas comerciais que podem ser compradas para
a realizao do teste de absoro do anticorpo
treponmico fluorescente (FTA-Abs, do ingls
fluorescent treponemal antibody absorption),
incubando, lavando e examinando o espcime como
no procedimento do teste de imunofluorescncia
direta anteriormente descrito. A diluio a ser
utilizada no teste de imunofluorescncia direta a
maior diluio possvel do conjugado, que mostra
uma fluorescncia clara e especfica na ausncia
de colorao no fundo.
10.2.3 Teste de amplificao de cidos
nucleicos para T. pallidum
O teste da reao em cadeia da polimerase (PCR, do
ingls polymerase chain reaction) pode detectar o
DNA equivalente a <10 organismos em um espcime,
por meio da amplificao de segmentos de genes
especficos de DNA genmico de T. pallidum. Esse
teste pode ser utilizado para examinar espcimes de
qualquer exsudato de leso, tecido ou fluido corpreo,
podendo o espcime ser fresco, congelado ou fixado
e embebido em parafina. Uma vez que no h testes
disponveis de PCR comerciais para T. pallidum liberados
pela Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados
Unidos da Amrica, alguns laboratrios implementaram
testes de PCR desenvolvidos internamente.
Vrios ensaios de PCR foram desenvolvidos e vm sendo
usados com sucesso para detectar sequncias-alvo de
DNA especficas para T. pallidum em leses primrias
e secundrias (6-8). A sensibilidade analtica desses
ensaios equivalente a aproximadamente 10 organismos.
O uso de iniciadores marcados com fluorescena e uma
analisador gentico ABI 310 para detectar sequncias
amplificadas melhorou a sensibilidade analtica da PCR
para polA para aproximadamente um organismo por
reao de PCR. Esses mtodos, teoricamente, podem
ser aplicados no diagnstico de sfilis congnita e
neurossfilis, nos quais mais provvel que o nmero
de organismos seja baixo. Entretanto, os testes no
podem ser recomendados para a deteco de rotina
de T. pallidum no sangue, mesmo no caso de doenas
primrias e secundrias, devido presena de inibidores
de PCR. Todavia, um ensaio de PCR em tempo real
semiquantitativo foi utilizado para indicar que o nmero
de espiroquetas no sangue de pacientes muda de acordo
com o estgio de sfilis, variando de 200 a 105 organismos
por mL de sangue (9).
Ensaios de PCR mltipla foram desenvolvidos para
detectar simultaneamente as causas mais comuns de
lcera genital de etiologia sexualmente transmissvel
(UG), T. pallidum, Haemophilus ducreyi e o vrus do
herpes simples (10). O alvo de T. pallidum na PCR
mltipla o gene 47-kDa, e um ensaio imunossorvente
ligado enzima (ELISA, do ingls enzyme-linked
immunosorbent assay) de captura utilizado para
detectar as sequncias amplificadas especficas. Esse
ensaio foi adaptado para um formato mltiplo em tempo
real que vem sendo utilizado para determinar as causas
de ulceraes genitais em diferentes lugares no mundo
e, subsequentemente, para determinar algoritmos
sindrmicos adequados gesto de UG.
10.3 Testes sorolgicos para sfilis
Os testes sorolgicos para sfilis podem ser,
convenientemente, divididos em dois tipos: os testes
no treponmicos ou reaginas, tais como a reao de
Wasserman (WR, do ingls Wasserman reaction), a
reagina plasmtica rpida (RPR), o teste do Laboratrio
de Pesquisa de Doenas Venreas (VDRL, do ingls
Venereal Disease Research Laboratory) e o teste da
toluidina vermelha com soro no aquecido (TRUST,
do ingls toluidine red unheated serum test); e os
testes treponmicos, tais como o FTA-Abs, o ensaio
de hemaglutinao para Treponema pallidum (TPHA,
do ingls Treponema pallidum haemagglutination
assay), o ensaio de aglutinao passiva de partculas
para Treponema pallidum (TPPA, do ingls Treponema
pallidum passive particle agglutination assay), o ELISA,
a quimioluminescncia e a grande maioria dos testes
rpidos ou POC atualmente disponveis comercialmente.
Sfilis 125
 10.3.1 Testes sorolgicos no treponmicos
Atualmente, todos os testes sorolgicos no
treponmicos para sfilis detectam a reagina, uma
mistura de anticorpos IgG e IgM no soro de pacientes
com sfilis que capaz de reagir com um antgeno
complexo (uma mistura de cardiolipina, lecitina e
colesterol) nos testes. O primeiro teste sorolgico
no treponmico a usar esse antgeno foi o teste
WR, baseado no princpio da reao de fixao do
complemento. No entanto, os testes utilizados mais
frequentemente baseiam-se nas reaes de floculao,
que podem ou no incluir partculas indicadoras.
Acredita-se que anticorpos IgG e IgM antilipdeos
so formados como parte da resposta do hospedeiro
ao material liberado por suas clulas danificadas no
incio da infeco como, tambm, para os lipdeos da
superfcie celular do organismo causador (11, 12).
Embora sejam muito sensveis e possam ser
quantificados, os testes no treponmicos no
apresentam especificidade adequada para sfilis,
tendo-se estimado que reaes falso-positivas podem
ocorrer em 0,2-0,8% dos testes. Essas reaes esto
associadas a vrias condies mdicas no relacionadas
com sfilis (11, 12). As reaes falso-positivas agudas
(que persistem por perodos inferiores a seis meses)
geralmente esto associadas a outras doenas
infecciosas como a malria, hepatite, catapora ou
sarampo, ou com vacinao recente. Em contrapartida,
reaes falso-positivas crnicas (que persistem por mais
de seis meses) esto associadas a distrbios no tecido
conjuntivo, neoplasias e infeces crnicas, como lepra,
abuso de drogas intravenosas e envelhecimento. Dessa
forma, teoricamente, os soros reativos nos testes no
treponmicos devem ser confirmados com um teste
treponmico mais especfico.
importante ressaltar que, embora a gravidez tenha
sido por muito tempo considerada uma condio
possivelmente associada a testes no treponmicos
falso-positivos, a taxa de testes positivos em mulheres
gestantes no maior do que nas no gestantes e pode
estar associado apenas ao grande nmero de mulheres
grvidas testadas para a doena, principalmente em
lugares com baixa prevalncia (13). Via de regra, a
grande maioria dos soros falso-positivos apresentam
ttulos de anticorpos 1:4. Para excluir os resultados no
126 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
treponmicos falso-positivos, todos os soros reativos nos
testes no treponmicos devem ser confirmados por um
teste treponmico.
Entretanto, ttulos baixos no excluem a possibilidade de
infeco por sfilis e so frequentemente encontrados na
doena latente tardia ou terciria.
A determinao dos ttulos de soros no treponmicos
utilizando um procedimento quantitativo pode ser til
para uma interpretao mais correta dos resultados e
para avaliar os pacientes aps o tratamento.
Quando utilizados como testes de triagem inicial, os
testes no treponmicos tornam-se positivos por volta
de seis semanas aps a infeco. Dessa forma, at 40%
das leses primrias positivas na microscopia de campo
escuro ou na PCR podem ser inicialmente soronegativas.
Em seguida soroconverso, os ttulos de anticorpos
no treponmicos aumentam at atingirem o pico entre
1-2 anos aps a infeco, se no for administrado
nenhum tratamento efetivo. Aps isso, durante os
estgios latentes tardios e tercirios da doena, os ttulos
diminuiro lentamente, tornando-se frequentemente
soronegativos na doena j bastante tardia. A grande
vantagem dos testes no treponmicos que estes
podem ser utilizados para verificar a eficcia da terapia.
Assim, aps o tratamento efetivo da sfilis precoce (isto
, primria, secundria ou doena latente primria), os
ttulos de anticorpos diminuiro significativamente (ou
seja, uma reduo de pelo menos quatro vezes no ttulo),
tornando-se finalmente negativos. Entretanto, a oferta
de tratamento eficiente durante os estgios tardios da
doena pode resultar em soropositividade persistente,
embora em ttulos baixos (Figura 10.4). importante
ressaltar que qualquer aumento subsequente (de quatro
vezes ou mais) na titulao pode indicar tanto recada
como reinfeco.
10.3.1.1 Teste do Laboratrio de Pesquisa de Doenas
Venreas (VDRL)
No teste VDRL, o antgeno no estabilizado e uma
suspenso fresca deve ser preparada no dia em que for
usada. O teste realizado em um soro aquecido (56C)
e os resultados devem ser lidos com um microscpio
utilizando um aumento de 100x. O VDRL continua
sendo o teste escolhido para a deteco de reagina nos
espcimes no lquido cefalorraquidiano (LCR) obtidos de para VDRL pode ser comprada ou preparada no
pacientes com neurossfilis. Uma descrio detalhada laboratrio.
do teste VDRL fornecida a seguir. O teste de reagina
A soluo salina tamponada para VDRL inclui:
com soro no aquecido um aperfeioamento na verso
do teste do VDRL, utilizando o soro no aquecido e um Formaldedo, neutro (ACS) 0,5mL
antgeno estabilizado.
Na2HPO4, andrico 0,037g
Procedimento do teste VDRL (adaptado de Larsen et
KH2PO4 0,170g
al., 1998; 3).
NaCl 10,00g
Reagentes e equipamentos necessrios:
1. Antgeno VDRL. Uma soluo sem cor, alcolica, gua destilada 1000,0mL
contendo 0,03% de cardiolipina, 0,9% de colesterol e
O pH da soluo deve ser mensurado e a soluo
0,21%+0,01% de lecitina. O antgeno armazenado
armazenada em garrafas com tampa de rosca.
no escuro a temperatura ambiente (23-29C) ou
refrigerado a 2-8C, mas no deve ser congelado. Nota: quando uma mudana inexplicvel ocorre na
Nessas temperaturas, os componentes do antgeno reatividade dos controles, o pH da soluo salina deve
continuam em soluo. Garrafas ou frascos que ser mensurado para determinar se esta seria a causa da
contm o precipitado devem ser descartados. alterao. A soluo salina tamponada que estiver fora
do intervalo de 6,00,1 deve ser descartada.
2. Soluo salina tamponada para VDRL, pH 6,00,1
(NaCl a 1,0%). A soluo salina tamponada

Sfilis precoce Sfilis tardia

Primria Secundria Latente precoce Latente tardia Terciria

Normalmente
Negativo
No tratado Normalmente Normalmente positivo mas
tornando-se Sempre positivo
positivo positivo tornando-se
positivo
negativo

Tratado com Tornando-se Tornando-se Tornando-se Permanece Resultado sem

sucesso negativo negativo negativo positivo alterao

Teste de anticorpo no treponmico positivo Teste de anticorpo no treponmico negativo

Figura 10.4
Reatividade dos testes sorolgicos no treponmicos durante o curso da sfilis no tratada (quadrados) e resposta
dos testes acompanhando uma terapia bem sucedida (crculos), por estgio da doena.

Sfilis 127
 3. Amostras de soro-controle. Soros reativos (R),
fracamente reativos (F) ou no reativos (N) nas
formas liofilizadas ou lquidas so usados como
controle no teste. Se testes quantitativos forem
realizados, um soro-controle, que pode ser titulado
a uma diluio de pelo menos 1:4, deve ser
utilizado.
4. Acetona.
5. lcool, etanol a 95%.
6. Parafina.
7. Soluo salina a 0,9%. Adicione 0,9g de cloreto de
sdio seco para cada 100mL de gua destilada.
8. Soluo salina a 10,0%. Adicione 10g de cloreto de
sdio seco para cada 100mL de gua destilada.
Equipamentos:
1. Agulhas calibradas no descartveis sem bisel
a. Para teste sorolgico: calibre 18
b. Para teste do LCR: calibre 21 ou 22
2. Garrafas, 30mL com fundo de superfcie interna
plana.
3. Dispositivo para pipetagem de segurana com
pontas descartveis que liberem 50mL.
4. Pipetas de 1,0mL, 5,0mL e 10,0mL.
5. Lminas para microscpio, medindo 5x7,5cm,
com 12 anis de parafina ou cermica de
aproximadamente 14mm de dimetro. Nota: os
anis devem ser altos o suficiente para prevenir o
derramamento durante a rotao.
6. Suporte para lmina, para lminas de 5x7,5cm.
7. Montador de anis, para fazer anis de parafina de
aproximadamente 14mm de dimetro (Cat.# 2600,
Eberback Corp., Ann Arbor, MI, EUA).
8. Agitador mecnico ajustvel para 1802rpm,
circunscrevendo um crculo de 19mm de dimetro
em um plano horizontal.
128 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
9. Microscpio binocular com oculares de 10x,
objetiva de 10x.
10. Recipientes para descarte; desinfetantes.
11. Luvas de ltex descartveis, culos de segurana e
roupa de proteo.
12. Proteo para lminas enquanto estiverem no rotor
para manter umidade e evitar o ressecamento.
13. Seringas, 2mL ou 5mL.
Procedimentos do teste para espcimes de soro
Preparao da suspenso do antgeno:
1. Prepare uma suspenso de antgeno VDRL fresca
para cada dia. Enquanto a suspenso est sendo
preparada, mantenha a temperatura da soluo
salina tamponada, do antgeno e dos equipamentos
entre 23-29C.
2. Dispense 0,4mL de soluo salina tamponada para
VDRL no fundo de uma garrafa com rolha redonda,
de 30mL, com o fundo de superfcie interna plana,
ou em um frasco com rolha de 25mL.
3. Adicione 0,5mL da suspenso de antgeno VRDL
diretamente na soluo salina, enquanto gira a
garrafa de forma contnua, mas gentil, em uma
superfcie plana. O antgeno deve ser adicionado
gota a gota, num ritmo de aproximadamente seis
segundos para cada 0,5mL de antgeno.
4. A ltima gota do antgeno deve ser expulsa da
pipeta sem encost-la na soluo salina e a rotao
da garrafa deve continuar por 10 segundos.
5. Adicione 4,1mL de soluo salina tamponada.
6. Tampe a garrafa e agite-a aproximadamente 30
vezes em 10 segundos. A suspenso de antgeno
est, ento, pronta para o uso e pode ser utilizada
durante o dia de trabalho.
7. Misture a suspenso de antgeno VDRL,
agitando-a gentilmente cada vez que for utiliz-la.
(A suspenso no deve ser misturada com
movimentos de trs para frente por meio de uma
seringa ou agulha, uma vez que isso pode causar a
quebra de partculas e perda da reatividade.)
Teste qualitativo (soro):
1. Os testes de floculao em lmina para sfilis
so afetados pela temperatura ambiente. Para
resultados de teste confiveis e reprodutveis,
a suspenso de antgeno VDRL, controles e os
espcimes a serem testados devem ser mantidos a
temperatura ambiente, 23-29C, quando os testes
forem realizados.
2. Adicione 50L de soro a ser testado em cada anel
da lmina com anel de parafina ou cermica.
3. Segurando a agulha ou seringa de distribuio de
suspenso na posio vertical, dispense vrias
gotas do antgeno para descartar bolhas de ar
na agulha. Adicione, ento, uma gota (17L) da
suspenso de antgeno para cada anel contendo o
soro.
4. Posicione a lmina no rotor mecnico e gire-a
por quatro minutos a 1802rpm, debaixo de uma
proteo para manter a umidade atmosfrica e
evitar a evaporao em excesso.
5. Imediatamente aps girar, analise a lmina e anote
os resultados do teste.
6. Todos os espcimes de soro que produzirem
resultados reativos, fracamente reativos, ou no
reativos irregulares no teste de lmina qualitativo
VDRL devem ser testados quantitativamente e a
titulao do ponto final deve ser registrada.
Leitura e registro dos resultados:
1. Analise as lminas microscopicamente, utilizando
oculares de 10x e objetivas de 10x.
2. Registre os resultados como segue:
Leitura Registro
Aglomerados mdios Reativo (R)
ou grandes
Aglomerados Fracamente reativo (F)
pequenos
Sem aglomerados No reativo (N)
ou rugosidade muito
discreta
Teste quantitativo (soro):
1. Prepare uma diluio dupla do soro a ser titulado.
Testes quantitativos para trs espcimes de soro
com diluies de at 1:8 podem ser realizados em
uma lmina.
2. Realize o teste na diluio de duas vezes do soro
exatamente da mesma forma que para o teste
qualitativo.
3. Analise os resultados microscopicamente, utilizando
oculares de 10x e uma objetiva de 10x, assim como
no teste qualitativo.
4. Registre os ttulos da maior diluio que apresenta
resultado reativo (no fracamente reativo).
5. Aps completar os testes do dia, descarte a
suspenso de antgeno e limpe a agulha e a seringa
lavando-as com gua, lcool e acetona, nessa
ordem. Remova a agulha da seringa aps limp-la.
Nota: o teste VDRL o preferido para realizao
em LCR no diagnstico de neurossfilis. O teste
realizado de forma idntica quela utilizada para
soro. Entretanto, o espcime de LCR no deve ser
aquecido a 56C antes da realizao do teste.
10.3.1.2 Teste de reagina plasmtica rpida (RPR)
As principais vantagens do RPR em relao ao VDRL
que o primeiro inclui o uso de um antgeno estabilizado,
o emprego de cartes no lugar de lminas e a adio
de partculas de carvo no antgeno como um indicador
de floculao. O antgeno no coberto por essas
partculas, mas o carvo preso na estrutura formada
pelo complexo antgeno-anticorpo nas amostras reativas,
tornando a reao visvel a olho nu. O teste pode ser
realizado em soro ou plasma no aquecido e conduzido
em crculos de 18mm em cartes plastificados. O
RPR constitui o teste no treponmico macroscpico
mais amplamente disponvel, sendo utilizado em todo
o mundo. A Figura 10.5 mostra o procedimento para
realizar o teste RPR.
Como uma modificao do RPR, o TRUST usa toluidina
vermelha no lugar de carvo para visualizar a reao
de floculao. Os reagentes do TRUST no precisam de
Sfilis 129
 armazenamento refrigerado, ao contrrio dos utilizados
no teste RPR.
10.3.2 Testes sorolgicos treponmicos
Ao contrrio dos testes no treponmicos, os testes
treponmicos so considerados mais especficos.
Entretanto, foram relatados raros resultados
falso-positivos, que podem ser transitrios e de
causa desconhecida ou associados a distrbios
no tecido conjuntivo (11). de pouca importncia
o monitoramento de respostas terapia utilizando
testes treponmicos, uma vez que estes normalmente
permanecero positivos por toda a vida mesmo
aps a oferta de terapia eficaz (ver Figura 10.6).
Dessa forma, no h motivos para realizar ensaios
treponmicos quantitativos como parte dos
algoritmos de diagnstico. Uma vez que alguns testes
treponmicos podem se tornar reativos antes dos no
treponmicos (o teste FTA-Abs pode tornar-se reativo
em aproximadamente trs semanas aps a infeco),
alguns pacientes com infeco primria muito recente
podem resultar soronegativos para o teste no
treponmico e soropositivos para o teste treponmico.
Entretanto, deve-se tomar muito cuidado quanto
interpretao dos resultados desses testes sorolgicos,
uma vez que a identificao de um teste no treponmico
negativo e um treponmico positivo frequentemente
uma indicao de doena recente previamente tratada,

(A)

1. Use luvas, jaleco e culos de 2. Coloque o kit e todos os reagentes 3. Prepare o equipamento. Umedea
proteo quando estiver necessrios em temperatura uma esponja e coloque-a na tampa
manipulando espcimes e reagentes. ambiente. do agitador

4. Prepare a folha de trabalho e 5. Aspire 50L de amostra de soro para 6. Dispense 50L (1 gota) do soro a ser
etiquete o carto de teste com a o interior de uma ponteira de pipeta testado e controles em cada crculo
identificao (ID) da amostra. de preciso ou dispensador. rotulado no carto de teste.

7. Espalhe as amostras e os controles 8. Fixe a agulha do conta-gotas garrafa de 9. Coloque o carto no agitador a
gentilmente dentro dos crculos, antgeno para RPR. Assegure-se de que o 100rpm por oito minutos.
utilizando a extremidade plana do antgeno esteja bem misturado. Adicione
dispensador. uma gota do antgeno a cada crculo.

10. Manualmente, agite algumas vezes o 11. Use uma boa luz para interpretar os 12. Registre os resultados em formulrios
carto, gentilmente. resultados. apropriados.

Figura 10.5
Procedimentos para a realizao (A) e interpretao (B) do teste de reagina plasmtica rpida (RPR)
Fonte: Centros de Controle e Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.

130 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
a menos que existam sinais bvios de infeco primria usando eritrcitos sensibilizados ou partculas de gelatina;
atual (ver e comparar Figura 10.4 e 10.6). os ELISA, inclusive as variantes que utilizam a tecnologia
de quimioluminescncia e imunocromatografia (fluxo
Todos os testes treponmicos atuais usam os lisados
lateral) ou testes POC. Entretanto, esses testes passveis
completos de clulas de T. pallidum ou antgenos
de automatizao, ou seja, alguns ELISA e ensaios de
recombinantes treponmicos, isolados ou misturados,
quimioluminescncia, foram licenciados em alguns pases
para detectar anticorpos contra componentes celulares
para utilizao como testes de triagem iniciais e os testes
treponmicos especficos. Existem vrias plataformas
POC treponmicos so frequentemente utilizados como
diferentes de testes utilizadas para a testagem sorolgica
o nico indicador de infeco, principalmente em lugares
treponmica, incluindo a IF indireta; o teste de aglutinao
com limitao de recursos.

(B) Resultados qualitativos: Reativo

(Aglomerao/
Minimamente reativo
(Leve aglomerao/
No reativo
(Padro cinza suave)
surgimento de aglutinao)
aglutinao).

As amostras apresentando um grau de Todas as amostras Todas as amostras Relate como no reativo
reatividade igual ou maior em relao ao reativas devem ser reativas devem ser
controle minimamente reativo (Rm) so reativas testadas por RPR testadas por RPR
(R). Os trs crculos inferiores do lado direito do quantitativa para obter quantitativa para obter
carto so os controles: reativo R, um nvel de titulao. um nvel de titulao.
minimamente reativo Rm e no reativo N.

Procedimentos do teste RPR quantitativo:

1.
1. Rotule um carto de teste com a
identificao (ID) das amostras e as
diluies em duas vezes seriadas. Cada
amostra ser testada sem estar diluda
(1:1) e diluda (1:2, 1:4, etc.).
2. 3.
2. Adicione 50L de soluo salina a 0,9% 3. Adicione 50L de amostra no primeiro
em cada crculo que conter a amostra (1:1) e segundo (1:2) crculos.
diluda ou o controle. NO adicione
soluo salina no primeiro crculo para
cada amostra (poo 1:1).

4. Utilizando uma pipeta, misture os
espcimes com a gota de soluo
salina, movimentando o lquido para
cima e para baixo na ponteira da pipeta
5-6 vezes.
5. Transfira 50L dessa mistura (crculo 2)
para o prximo crculo (3) e repita o
passo da mistura at que a ltima
diluio seja realizada. Descarte os
ltimos 50L.
6. Siga os passos 7-12 na pgina 1 (RPR
qualitativo) e anote os resultados de
modo que os nveis de diluio sejam
registrados; isto , a maior diluio
reativa a 1:4 ser registrada como R4.

Resultados quantitativos:

Registre a diluio mais alta reativa. No caso acima, o
espcime 7 (primeira fileira) mostra a reatividade para a
diluio 1:1 e registrada como R1. O espcime 8 (segunda
fileira) um R4. Os trs crculos de baixo do lado direito do
carto so os controles: reativo R, minimamente reativo
Rm e no reativo N.
No caso acima, o espcime reativo at a diluio 1:64 e ser
registrado como R64. Se a diluio mais alta ainda for reativa,
deve-se continuar com a diluio do espcime: prepare um
novo carto de teste e estenda as diluies at que a mistura
em um crculo no seja reativa.

Figura 10.5 (continuao)

Procedimentos para a realizao (A) e interpretao (B) do teste de reagina plasmtica rpida (RPR)
Fonte: Centros de Controle e Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.

Sfilis 131
 Sfilis precoce Sfilis tardia
Primria Secundria Latente precoce Latente tardia Terciria
Normalmente
Negativo positivo,
Sempre Sempre Sempre
No tratado tornando-se tornando-se
positivo positivo positivo
positivo eventualmente
negativo

Permanece
Tratado com positivo (se Permanece Permanece Permanece Resultado sem
sucesso inicialmente positivo positivo positivo alterao
positivo)

Teste treponmico positivo Teste treponmico negativo

Figura 10.6
Reatividade dos testes sorolgicos treponmicos durante o curso da sfilis no tratada (quadrados) e resposta dos
testes acompanhando uma terapia bem-sucedida (crculos), por estgio da doena.

10.3.2.1 Teste de absoro do anticorpo

treponmico fluorescente (FTA-Abs)
O teste FTA-Abs foi considerado por muito tempo o
teste treponmico padro ouro, tendo sido, entretanto,
recentemente substitudo por testes mais sensveis,
com menos demandas tcnicas e subjetividade bem
menor. Tanto o desempenho do teste como a leitura
dos resultados devem ser verificados cuidadosamente.
Um microscpio de fluorescncia de boa qualidade,
experincia na leitura de resultados por parte do
executante, reagentes de qualidade e uma diluio
apropriada do conjugado so todos fatores crticos para Figura 10.7
a confiabilidade do teste (Figura 10.7). Infelizmente, Teste FTA-Abs positivo mostrando espiroquetas T.
resultados de FTA-Abs tanto falso-positivos como falso- pallidum fluorescentes.
negativos so comuns devido a erros laboratoriais e Fonte: adaptado de Larsen et al., 1998 (3)
leitura subjetiva do teste (14, 15). Veja a seguir o mtodo
detalhado.

132 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Reagentes: Reagentes a serem preparados:

1. As lminas de antgeno do T. pallidum podem 1. Soluo salina tamponada com fosfato (PBS, do
ser obtidas comercialmente. Alternativamente, o ingls phosphate-buffered saline solution). Deve
antgeno pode ser adquirido como uma suspenso ser preparada utilizando a seguinte formulao em
ou preparado a partir de T. pallidum (cepa Nichols) gua destilada e armazenada em grandes volumes:
extrado do tecido testicular de coelho e lavado
NaCl 7,65g
com soluo salina tamponada com fosfato (PBS,
Na2HPO4 0,724
do ingls phosphate-buffered saline solution) para
KH2PO4 0,21g
remover a globulina de rato. Guarde os frascos
H2O destilada 1000mL
fechados a 2-8C.

2. Imunoglobulina anti-humana marcada com O pH deve ser determinado e ajustado para pH 7,20,1
isotiocianato de fluorescena (FITC, do ingls com NaOH 1N.
fluorescein isothiocyanate). 2. Tween 80 a 2,0% em PBS.

3. Prepare o reagente absorvente a partir de Aquea os reagentes a 56C em banho-maria.

culturas de treponemas Reiter no patognicos, Para 49mL de PBS estril, adicione 1mL de Tween
normalmente sem a adio de conservante. O 80. Ajuste o pH para 7,2 com NAOH 1N. Descarte
reagente geralmente distribudo em volumes de o reagente caso se forme um precipitado ou se
5mL e liofilizado ou mantido como suspenso. houver mudana no pH.

4. Soro controle reativo. Obtenha uma mistura 3. Meio de montagem. Adicione uma parte de PBS, pH
de soros humanos de doadores soropositivos 7,2, para nove partes de glicerina (grau reagente).
com reatividade 4+. Distribua a mistura de
soros em alquotas e armazene-os congelados, Equipamentos:
preferencialmente a -70C ou menos. O soro 1. Estufa, 35-37C.
altamente reativo pode ser diludo apropriadamente
com soro no reativo para produzir um controle 2. Banho-maria, ajustvel para 56C.
minimamente reativo 1+. O controle 1+ exibe o
3. Centrfuga.
menor grau de fluorescncia relatado como reativo
e usado como um padro para leitura. 4. Dispositivos para pipetagem de segurana.

5. Soro controle inespecfico. O soro controle 5. Micropipetas de 10L e 200L.

inespecfico uma mistura de soro obtida de
indivduos sem sfilis. Nenhum conservante 6. Ala bacteriolgica de platina padro com 2mm de
adicionado. Esse controle mostra uma reatividade dimetro, calibre 26.
no especfica >2+ a uma diluio em PBS de 1:5 7. Papel absorvente.
e, praticamente, nenhuma colorao quando diludo
no reagente absorvente em 1:5. 8. Placa de lminas com cmera mida e papel toalha.

6. leo de imerso no secante e de baixa 9. Cubas de colorao de vidro ou plstico, com

fluorescncia. porta-lminas removvel.

7. Acetona. 10. Lminas para microscpio, 1x3 polegadas, com

extremidade fosca, espessura de 1mm, com dois
crculos, dimetro interno de 1cm.

11. Lamnulas, no 1, 22mm2.

Sfilis 133
 12. Tubos de teste (12x75mm) e suporte.
13. Recipientes para descarte e desinfetantes.
14. Luvas de ltex descartveis, culos de segurana e
roupa de proteo.
15. Microscpio de fluorescncia com ocular de 10x e
objetivas de 10x e 40x.
16. Agitador (vrtice).
Se as lminas de antgeno no forem adquiridas
comercialmente, elas podem ser preparadas a partir
de suspenses treponmicas, como descrito a seguir:
1. Higienize as lminas com gaze limpa e armazene-as
em lcool.
2. Se necessrio, reidrate o antgeno de acordo com
as instrues do fabricante. Armazene os frascos
abertos a 2-8C. Estes devem permanecer estveis
por uma semana.
3. Misture vigorosamente as suspenses de antgeno
em um agitador (vrtice) por 10 segundos e
examine as amostras com um microscpio de
campo escuro para garantir que os treponemas
estejam distribudos adequadamente ( melhor
obter organismos nicos que amontoados) antes da
preparao das lminas para o teste FTA-Abs.
4. Prepare esfregaos bem finos do antgeno de T.
pallidum dentro de cada crculo, utilizando uma ala
de arame de 2mm. Coloque uma ala completa de
antgeno dentro dos dois crculos de 1cm e deixe
secar ao ar livre por, pelo menos, 15 minutos.
5. Fixe as lminas em acetona por 10 minutos e
deixe-as secar ao ar livre. Armazene os esfregaos
fixados com acetona a -20C. Os esfregaos no
devem ser descongelados e congelados novamente.
Soluo absorvente
Reidrate a soluo absorvente com gua destilada estril
ou de acordo com as instrues do fabricante. Armazene
a soluo absorvente reidratada a 2-8C ou a -20C.
Ela pode ser utilizada enquanto apresentar reatividade
aceitvel e o produto no estiver contaminado.
134 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Imunoglobulina anti-humana marcada com
fluorescena (conjugado):
1. Reidrate o conjugado marcado com FITC de acordo
com as instrues do fabricante. Se for observada
turvao, centrifugue a 500g por 10 minutos. Faa
alquotas de volumes pequenos e armazene-os a
-20C. O conjugado descongelado no deve ser
congelado novamente, mas armazenado a 2-8C.
2. Prepare diluies seriadas em duplicata do novo
conjugado em PBS pH 7,2, contendo Tween 80 a
2%, de modo que as diluies incluam a titulao
sugerida pelo fabricante.
3. Teste cada diluio do conjugado com o soro
controle reativo 4+ diludo em PBS em 1:5 e com a
diluio do controle reativo mnimo 1+ apropriado,
utilizando o procedimento de FTA-Abs descrito
adiante.
4. Inclua um controle de colorao inespecfico em
cada diluio do conjugado.
5. Prepare um conjugado testado previamente em sua
diluio de trabalho e realize testes com um soro-
controle reativo 4+, um soro controle minimamente
reativo 1+ e um controle de colorao inespecfico
com PBS para atuarem como controles ao testar
pela primeira vez um lote novo do conjugado.
6. Leia as lminas de acordo com a seguinte ordem:
a. Examine as trs lminas controle (descritas
acima no item 5) para garantir que os
reagentes e as condies de teste sejam
satisfatrias.
b. Examine as lminas de conjugados novos,
comeando pela de menor diluio do
conjugado, e registre as leituras como 1+, 2+,
3+ ou 4+.
c. A maior diluio o ponto final da titulao,
resultando em uma fluorescncia mxima 4+
com o soro controle reativo e uma leitura 1+
com a diluio 1+. A titulao de trabalho do
novo conjugado uma diluio de duas vezes
abaixo do ponto final e deve ser o ponto final
do controle minimamente reativo.
 d. O novo conjugado no pode colorir
inespecificamente trs diluies de duas vezes
abaixo da titulao de trabalho do conjugado.
e. Armazene o conjugado de acordo com o
fabricante e distribua-o em alquotas no
inferiores a 0,3mL a menos de -20C. Um
conjugado com uma diluio de trabalho de
1:1000 ou maior deve ser diludo em 1:10 com
PBS estril contendo 0,5 de albumina de soro
bovino e 0,1% de azida de sdio antes de ser
congelado.
f. Verifique a titulao do conjugado aps o
armazenamento por vrios dias no congelador.
Procedimento do teste
1. Identifique as lminas de antgenos preparadas
previamente por meio da numerao da parte
fosca.
2. Enumere cada tubo e lmina para corresponderem
ao soro teste e ao soro controle.
3. Prepare as diluies dos soros controle reativo (4+),
minimamente reativo (1+) e inespecfico na soluo
absorvente ou em PBS, de acordo com o fabricante.
4. Pipete 200L de soluo absorvente em um tubo
de teste para cada soro-teste.
5. Adicione 50L de soro-teste aquecido ao tubo
apropriado e misture.
6. Cubra os esfregaos de antgeno adequados com
30L das diluies dos soros-controle reativo (4+),
minimamente reativo (1+) e inespecfico.
7. Cubra os esfregaos de antgeno adequados com
30L de PBS e 30L de soluo absorvente para os
controles de colorao inespecficos.
8. Cubra os esfregaos de antgeno adequados com
30L das diluies do soro teste.
9. Coloque as lminas em uma cmara mida e
incube-as a 35-37C por 30 minutos, para evitar a
evaporao.
10. Coloque as lminas no suporte e enxague por cinco
segundos em PBS corrente. Ento, coloque as
lminas na cuba de colorao contendo PBS por
cinco minutos e agite as lminas, colocando-as
dentro e fora do PBS, pelo menos 20 vezes.
Utilizando PBS fresco, repita o procedimento de
enxgue mais uma vez. Finalmente, enxague as
lminas por cinco segundos em gua destilada
corrente e passe levemente o papel absorvente.
11. Dilua a IgG anti-humana marcado com FITC sua
titulao de trabalho em PBS contendo Tween 80 a
2% e verta aproximadamente 30L do conjugado
diludo em cada esfregao.
12. Repita os passos 9 e 10.
13. Monte as lminas imediatamente, colocando uma
pequena gota de meio de montagem em cada
esfregao e sobrepondo uma lamnula.
14. Coloque as lminas em uma cmara escura e
prossiga com a leitura em at quatro horas.
15. Verifique os esfregaos por microscopia de campo
escuro, utilizando primeiro uma lmpada de
tungstnio para verificar a presena de treponemas
no esfregao e, ento, analise-os em um
microscpio de fluorescncia, utilizando os filtros
apropriados para FITC.
10.3.2.2 Ensaios de aglutinao treponmicos
Os testes TPHA e TPPA so mais fceis de ser realizados
que o FTA-Abs e apresentam sensibilidade similar do
FTA-Abs. Esses ensaios de aglutinao so tambm
mais prticos que o teste FTA-Abs para o processamento
de lotes com grande nmero de espcimes. O TPHA
e, mais recentemente, o TPPA, surgiram como testes
confirmatrios treponmicos escolhidos por muitos
laboratrios. A Figura 10.8 mostra o procedimento de
execuo do teste TPPA. O mtodo para realizar o TPHA
semelhante.
10.3.2.3 Imunoensaios enzimticos (EIA) e ensaios de
quimioluminescncia (EQI) treponmicos
Os EIA e EQI para a deteco do anticorpo para T.
pallidum foram desenvolvidos ainda mais recentemente.
Suas sensibilidades e especificidades so comparveis
s do FTA-Abs e ensaios de aglutinao.
A maioria dos EIA treponmicos empregam tanto
antgenos de T. pallidum sonicados, um antgeno
Sfilis 135
 recombinante treponmico, ou uma mistura de
recombinantes revestidos nos poos de placas de
microtitulao. Uma diluio do soro dos pacientes
adicionada a cada poo. Se anticorpos especficos para
T. pallidum estiverem presentes no soro, eles se ligaro
aos antgenos treponmicos. Aps lavar o excesso de
anticorpos, um conjugado composto por IgG de cabra
biotinilada anti-humana marcado com estreptavidina-
peroxidase adicionado para detectar anticorpos
de ligao especfica. Aps um passo seguinte de
lavagem para remover qualquer excesso de conjugado,
um substrato de enzima adicionado para detectar o
complexo antgeno-anticorpo-conjugado. Uma reao
de colorao ocorre caso o paciente tenha anticorpos
para o(s) antgeno(s) de T. pallidum. A intensidade do
aparecimento da cor diretamente proporcional
concentrao de anticorpos presente. A mudana de cor
lida utilizando um leitor de placas.
Em alguns EIA, utiliza-se uma abordagem diferente para
a deteco de anticorpos especficos. Os antgenos
recombinantes treponmicos especficos com 15kD,
17kD, 44,5kD e 47kD so imobilizados nos poos de
microplacas. O soro do paciente ento adicionado
aos poos e, se houver presena de anticorpos
antitreponmicos, eles se ligaro especificamente aos
antgenos imobilizados. Todas as protenas no ligadas
so ento removidas durante a fase de lavagem. Os
mesmos antgenos recombinantes que foram conjugados
peroxidase de rbano so adicionados aos poos
da placa. Aps um passo seguinte de lavagem para
remover os conjugados no ligados, adiciona-se um
substrato cromognico peroxidase. A mudana de cor
resultante medida espectrofotometricamente aps se
adicionar uma soluo de parada. A intensidade da cor
proporcional quantidade de anticorpos presentes
no soro do paciente. Como um resultado dessa
configurao, a especificidade e a sensibilidade do teste
so superiores s dos ELISA treponmicos de primeira
gerao.
Os EQI para detectar os anticorpos treponmicos
so quase que exclusivamente utilizados em grandes
laboratrios clnicos em pases industrializados, onde
o custo de mo de obra alto e se prev uma grande
demanda de espcimes. Esses ensaios ora usam o
princpio de ligao de um anticorpo especfico a prolas
136 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
revestidas por antgeno e subsequente deteco das
prolas que foram marcadas com ficoeritrina conjugada
a IgG de cabra anti-humana, ora detectam os anticorpos
utilizando um conjugado de isoluminol-antgeno para
gerar emisso de quimioluminescncia, que detectada
por um sistema fotomultiplicador sofisticado (16).
Devido ao grande nmero de EIA e EQI disponveis
comercialmente no mundo, uma descrio detalhada do
procedimento do teste para cada fabricante est alm
do escopo deste captulo. Dessa forma, solicita-se que
o leitor siga as instrues includas no manual fornecido
pelo fabricante em cada kit.
10.3.2.4 Ensaios de western blot treponmicos
O teste WB treponmico tem sido utilizado como um
teste confirmatrio para anticorpos treponmicos no
soro de pacientes com sfilis. Antgenos individuais
de T. pallidum so fracionados por eletroforese de
poliacrilamida de lisados celulares totais. As bandas de
polipeptdeos resolvidas de vrias massas moleculares
so, ento, transferidas para folhas de membrana
de nitrocelulose. Essas folhas so secas e cortadas
em tiras para ser utilizadas em amostras de soro
individuais. O soro de um paciente diludo e incubado
com cada tira. Se houver presena de anticorpos IgM
especficos para T. pallidum na amostra, eles se ligaro
a um ou mais antgenos de peso molecular 15kD, 17kD,
44,5kD e 47kD na tira. Qualquer anticorpo no ligado
removido por lavagem.
Os anticorpos ligados so detectados com fosfatase
alcalina conjugada IgG ou IgM anti-humana. A tira ,
ento, lavada para remover o excesso de conjugados e,
finalmente, reage com um precipitado desenvolvendo
uma soluo que forma bandas de antgeno roxas. A
reatividade nas bandas especficas dos antgenos de
15kD, 17kD e 47kD considerada significativa (Figura
10.9). Em contraste, a reatividade em outras posies
da tira no considerada significativa. Os WB foram
utilizados no passado para estudar a resposta imune
sfilis (17, 18) e, subsequentemente, para selecionar os
antgenos adequados a ser includos nos imunoensaios
em linha.
(A) Verifique o kit antes de utiliz-lo. Coloque todos os espcimes e reagentes em temperatura ambiente. Anote o nmero do
lote e a data de validade.
Sempre use as medidas universais de segurana quando estiver manipulando espcimes.
Tempo de execuo: aproximadamente uma hora. O nmero mximo de espcime/placa de 21.

Este guia no tem a inteno de substituir o manual do produto ou seu procedimento operacional padro (POP).

Use luvas, jaleco e culos de Prepare os materiais necessrios Coloque o kit e todos os reagentes
proteo quando estiver (kit, agitador de placa, pipetas, placa necessrios em temperatura
manipulando espcimes e reagentes. de microtitulao em formato de U). ambiente antes de utiliz-los.

Identifique a folha de trabalho e as
placas de microtitulao com a
identidade das amostras (ID). Divida cada
placa de modo que cada espcime
ocupe um conjunto de quatro poos
consecutivos. O controle positivo
ocupar toda a primeira fileira (oito
poos). O controle negativo ocupar
quatro poos.
Adicione 100L de diluente de amostra
para TPPA no primeiro poo de cada
conjunto de espcime e controle.
Adicione 25L de diluentes de amostra
para TPPA nos poos restantes da
placa.
Inverta a amostra de soro para
mistur-la. Adicione 25L de amostra
no primeiro poo de cada conjunto
de espcime. Misture pipetando para
cima e para baixo 5-6 vezes.
Transfira 25L para o segundo poo
e misture 5-6 vezes. Repita para o
poo 4, descartando 25L do poo 4
de cada espcime.

Reconstitua os reagentes contendo Adicione uma gota (25L) de partculas Adicione uma gota (25L) de partculas
partculas sensibilizadas e no no sensibilizadas (tampa cinza) ao sensibilizadas (tampa vermelha) ao
sensibilizadas. Misture gentilmente para terceiro poo de cada amostra e quarto poo de cada amostra e aos
garantir a ressuspenso completa. controle. poos 5-8 do controle positivo.

Cubra a placa com um protetor e Incube por duas horas em Leia, interprete e registre os
misture por 30 segundos. temperatura ambiente. resultados nos formulrios
apropriados.

Figura 10.8
Procedimentos de execuo (A) e interpretao dos resultados (B) do ensaio de aglutinao passiva de partculas
para Treponema pallidum (TPPA).
Fonte: Centros de Controle e Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.

10.3.2.5 Imunoensaios em linha tiras de membrana de nitrocelulose com um suporte de

plstico rgido. O soro do paciente adicionado s tiras
Os imunoensaios em linha para sfilis so designados
dos testes. Se anticorpos especficos para T. pallidum
como testes confirmatrios treponmicos. Eles so
estiverem presentes nas amostras, eles se ligaro s
planejados para uso como testes suplementares quando
linhas de antgenos individuais (19). Aps lavar qualquer
os resultados dos testes treponmicos de rotina so
excesso de soro, adiciona-se uma IgG ou IgM de cabra
ambguos. Quatro protenas recombinantes, TpN47,
anti-humana, marcada com fosfatase alcalina, a qual
TpN17, TpN15 e TmpA, so revestidas como linhas em

Sfilis 137
 (B)
O controle positivo
ocupa toda a
primeira fileira.
O controle
negativo ocupa
quatro poos
consecutivos.
Cada espcime
ocupa quatro
poos
consecutivos.

Adicione
partculas
sensibilizadas.

Adicione
partculas no
sensibilizadas.

Interpretao dos resultados de TPPA

Diluio do
controle
positivo

Interpretao Clulas-teste Clulas-controle Padro de organizao

Anel grande definido com uma margem externa
irregular multiforme e aglutinao perifrica, ou
partculas aglutinadas espalhadas, cobrindo
uniformemente o fundo do poo.
Positivo

As partculas se concentram no formato de um

boto no centro do poo, com uma margem
externa suave e arredondada.
Negativo
As partculas se concentram no formato de um
anel compacto, com uma margem externa suave
e arredondada.
Inespecfico
O uso de nome e recursos comerciais apenas para a identificao e no implica apoio pela OMS.

Figura 10.8 (continuao)

Procedimentos de execuo (A) e interpretao dos resultados (B) do ensaio de aglutinao passiva de partculas
para Treponema pallidum (TPPA).
Fonte: Centros de Controle e Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.

se ligar a qualquer complexo antgeno-anticorpo de especficos presentes na amostra. Quando no h

sfilis formado. A adio subsequente de um substrato anticorpos para T. pallidum presentes, pode aparecer
para a enzima produz linhas de cor marrom-escura, cuja apenas uma cor de fundo padro.
densidade proporcional concentrao de anticorpos

138 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
10.3.2.6 Testes POC para sfilis da Organizao Mundial da Sade para a Eliminao
Global da Sfilis Congnita (24). O uso desses testes
Mundialmente, existem vrios fabricantes para testes de
simples permite a triagem e o tratamento no mesmo
diagnstico POC para sfilis. Esses testes so geralmente
dia em clnicas perifricas distantes dos laboratrios.
formatados seja como testes de fita com fluxo lateral,
Esses testes podem ser realizados utilizando o sangue
seja como dispositivos de escoamento. No formato
completo (obtido por uma picada no dedo), plasma ou
de fluxo lateral, um ou mais antgenos recombinantes
soro e no necessitam de equipamentos especiais (a
so distribudos em uma tira imunocromatogrfica de
exemplo de refrigerador ou centrfuga). Embora sejam
nitrocelulose para capturar anticorpos treponmicos
de fcil execuo, necessria a adeso rigorosa s
especficos e uma linha colorida produzida ao associar
instrues do fabricante para garantir sua preciso. A
imunoglobulina anti-humana ligada a uma enzina, ouro
adoo de testes POC em clnicas requer a superviso
coloidal ou partculas de ltex coloridas.
contnua por um laboratrio de referncia, incluindo o
Uma linha de controle separada incorporada ao teste, estabelecimento de um programa de avaliao externa
atuando tanto como um controle de procedimento da qualidade.
(em alguns testes) ou indicando a adequao do
Alm das aplicaes de triagem, esses testes podem ser
espcime (por meio da indicao da presena de
utilizados para confirmar a especificidade dos testes no
imunoglobulina humana inespecfica no espcime
treponmicos reativos no lugar de ensaios treponmicos
do paciente) (20-22). Em formato de escoamento,
laboratoriais mais complexos. importante notar que o
pontos de antgenos substituem as linhas, e a ligao
uso desses testes treponmicos rpidos sozinhos (isto
do anticorpo especfico ao antgeno ocorre durante a
, sem a subsequente confirmao no treponmica dos
passagem pela membrana ao invs da passagem lateral
testes rpidos reativos), inevitavelmente, resultar em
ao longo da tira de membrana. Todos esses testes
tratamento excessivo, uma vez que, assim como todos
fornecem uma identificao rpida de exposio prvia
os testes treponmicos, eles provavelmente continuaro
infeco por treponema e vm sendo convenientemente
reativos por toda a vida, mesmo aps a realizao
utilizados na triagem de mulheres grvidas em pases
de tratamento bem-sucedido. Idealmente, um teste
em desenvolvimento para prevenir a sfilis congnita.
quantitativo no treponmico deve ser realizado visando
O uso desses testes para a triagem de sfilis durante
aumentar a especificidade do diagnstico da infeco
a gravidez mostrou-se extremamente econmico (23)
ativa e servir de base para monitorar o tratamento. Pela
e surgiu como um componente-chave da Estratgia
mesma razo, esses testes rpidos treponmicos no

Cont + + + + + + _ _ _ Cont

Figura 10.9
Deteco de anticorpos para Treponema pallidum por western blot (WB).
Fonte: Centros de Controle e Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.

Sfilis 139
 podem ser utilizados sozinhos para a sorovigilncia
de sfilis, a menos que um teste no treponmico seja
realizado em todos os casos reativos na triagem por
teste rpido; somente aqueles duplamente reativos sero
considerados casos de infeco.
A Figura 10.10 mostra um exemplo de procedimento a
ser seguido e os resultados que podem ser obtidos em
um teste rpido treponmico de fluxo lateral. Para outros
tipos de dispositivo, devem-se seguir precisamente
as instrues do fabricante. Ambos os formatos de
escoamento ou de fluxo lateral permitem a realizao
de ensaios multiplex. Como resultado, testes POC
imunocromatogrfico duplo treponmico/HIV esto
atualmente em desenvolvimento.
importante ressaltar que, atualmente, existe
pelo menos um teste POC duplo no treponmico/
treponmico disponvel comercialmente em algumas
regies do mundo (25, 26). Ao detectar tanto anticorpos
treponmicos como no treponmicos (Figura 10.11),
prev-se que esses testes reduziro fortemente as taxas
de tratamento excessivo inerentes ao teste rpido atual e
permitiro que um nico dispositivo POC seja usado para
a sorovigilncia de sfilis.
10.3.3 Uso apropriado de testes sorolgicos
para sfilis
A Tabela 10.1 mostra a sensibilidade e a especificidade
de testes para sfilis no treponmicos e treponmicos,
para as diferentes fases da doena.
A abordagem convencional para o teste sorolgico de
sfilis envolve a triagem do soros com um teste no
treponmico de baixo custo, sensvel, mas relativamente
menos especfico e trabalhoso e, se este gerar
resultado reativo, realiza-se a confirmao por meio
de um teste treponmico mais especfico, porm mais
caro. Ao longo dos anos, essa abordagem mostrou-se
eficiente, principalmente em lugares nos quais a
doena frequentemente encontrada. A subsequente
titulao do soro reativo confirmado, utilizando um teste
no treponmico quantitativo, tambm fornece uma
interpretao mais precisa desses resultados, com uma
mensurao da linha de base (ttulo) em relao qual
se pode avaliar a eficcia da terapia.
140 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
O desenvolvimento recente de ELISA e EQI treponmicos
com possibilidade de automao resultou em uma
mudana nessa abordagem, particularmente em
muitos laboratrios com grandes demandas em
pases industrializados, nos quais o custo de mo de
obra alto e a soroprevalncia baixa, tais como em
bancos de sangue. Assim, a triagem de lotes de soros
realizada por meio de um desses testes ELISA ou
EQI mais recentes e, somente se um soro for reativo,
realiza-se um teste no treponmico. Se tanto os testes
treponmicos como no treponmicos forem reativos, tal
como anteriormente descrito, deve-se realizar um teste
no treponmico quantitativo.
Essas duas abordagens devem, teoricamente, produzir
o mesmo resultado. Entretanto, a segunda abordagem
resulta na deteco de testes treponmicos positivos
e testes no treponmicos negativos, que no foram
detectados pela abordagem convencional (27 ). Uma
vez que esse padro de reatividade sorolgica pode
ser encontrado na sfilis primria recente, na doena
primria previamente tratada e raramente na infeco
terciria tardia, deve-se dar considervel ateno aos
resultados do exame fsico de pacientes, histria prvia
da doena e ao risco sexual recente, antes de qualquer
tratamento e notificao do parceiro.
Os laboratrios devem considerar os seguintes fatores
antes de escolher a abordagem mais apropriada
(frequentemente em termos de custo-benefcio) para
fornecer servios sorolgicos de sfilis a uma populao
em particular, a saber: o nmero de soros triados para
sfilis em um determinado lugar; a soroprevalncia de
sfilis (tanto treponmica quanto no treponmica);
o custo da aquisio de equipamentos para ELISA e
EQI; o custo dos kits para testes no treponmicos e
treponmicos; e o custo da mo de obra.
Nos casos em que se detectarem reaes
indeterminadas em qualquer dos testes, estes devem
ser repetidos, se possvel, no espcime de um soro
novo. Se os ensaios iniciais no resultarem reativos e
caso se suspeite de sfilis primria, os testes devem
ser repetidos aps 2-3 semanas em uma nova amostra
de soro. Finalmente, alguns pacientes que receberam
o devido tratamento logo no incio da infeco primria
permanecero negativos para o teste de anticorpo.
(A) Verifique o kit antes de utiliz-lo. Use apenas os itens no expirados e no danificados.
Sempre use as medidas universais de segurana quando estiver manipulando espcimes. Mantenha a rea de trabalho limpa e organizada.

Este guia no tem a inteno de substituir o manual do produto ou seu procedimento operacional padro (POP).

Separe os itens do teste e todos os Abra um envelope laminado do teste. Identifique a tira do teste com o
outros materiais de laboratrio nmero de identificao do paciente.
necessrios.

Realize a puno digital ou venosa.
Colete 20L de sangue total. Para a Aplique o espcime na almofada
puno digital, use duas gotas de sangue absorvente da tira.
da ponta do dedo. Para a puno venosa,
abra um tubo para a coleta de sangue a
vcuo (Vacutainer) e utilize uma pipeta de
preciso.

Adicione 3 gotas do diluente do Espere 10 minutos e leia, Leia e registre os resultados e outras
ensaio no espcime sobre a imediatamente, os resultados. informaes pertinentes no
almofada. questionrio do estudo.

Figura 10.10
Procedimentos de execuo (A) e interpretao dos resultados (B) de um teste rpido treponmico de fluxo lateral.
Fonte: Centros de Controle e Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.

A sororreverso dos testes no treponmicos em 10.4 Diagnstico laboratorial de sfilis congnita

pacientes devidamente tratados ocorre normalmente
Qualquer leso na pele ou membrana mucosa presente
dentro de um perodo de seis meses a alguns anos
em um recm-nascido de me soropositiva deve ser
e est associada durao da infeco e titulao
examinada por microscopia de campo escuro, IF direta
de anticorpos no soro no momento da terapia (28).
ou PCR para obter evidncias diretas de infeco por
Entretanto, em alguns indivduos, principalmente
T. pallidum. Treponemas saprfitos no aparecem na
naqueles que receberam tratamento 1-2 anos aps
boca do neonato at, aproximadamente, seis semanas
o incio da infeco, os anticorpos no treponmicos
aps o nascimento. Assim, existe pouca chance de obter
podem persistir por longos perodos, mesmo aps o uso
resultados falso-positivos a partir de espcimes orais.
de terapia adequada. Esses indivduos so conhecidos
como soro-rpidos. A sororreverso de testes A deteco de um teste sorolgico reativo em um
treponmicos pode ocorrer tambm em uma minoria dos neonato pode ser resultado de transferncia passiva
pacientes em poucos anos. de anticorpos maternais atravs da placenta durante

Sfilis 141
 (B) Positivo
Aparecem duas linhas de qualquer intensidade em ambas as reas de controle e do paciente.

Negativo
Aparece uma linha na rea do controle e nenhuma linha na rea do paciente.

Invlido
No aparece linha na rea do controle.
No registre resultados invlidos. Repita o teste com um novo dispositivo de teste.

Invlido
Nenhuma linha aparece na rea de controle e aparece uma linha na rea do paciente.
No registre resultados invlidos. Repita o teste com um novo dispositivo de teste.

Figura 10.10 (continuao)

Procedimentos de execuo (A) e interpretao dos resultados (B) de um teste rpido treponmico de fluxo lateral.
Fonte: Centros de Controle e Preveno de Doenas, Atlanta, GA, EUA.

Tabela 10.1 Caractersticas de desempenho de testes sorolgicos para sfilis selecionados, por estgio da
doena
Sensibilidade (%)
Estgio da infeco por sfilis
Teste Primria Secundria Latente Terciria Especificidade (%)
FTA-Abs 98 (93-100) 100 100 96 99
TPHA/PA 82 (69-90) 100 100 94 99
RPR 86 (81-100) 100 80 (53-100) 73 (36-96) 98
VDRL 80 (74-87) 100 80 (71-100) 71 (37-94) 98
FTA-Abs: absoro do anticorpo treponmico fluorescente; TPHA: ensaio de hemaglutinao para Treponema pallidum; TPPA: ensaio de
aglutinao passiva de partculas para Treponema pallidum; RPR: reagina plasmtica rpida; VDRL: Laboratrio de Pesquisa de Doenas Venreas.

a gravidez, o que no pode ser considerado um
diagnstico. Entretanto, a identificao de ttulos por
RPR/VDRL significativamente superiores (isto , 4
vezes maior) no soro de um neonato comparados
titulao materna, ou a deteco de um aumento
significativo dos ttulos por RPR/VDRL durante
um perodo de trs meses, foram previamente
considerados indicadores de infeco congnita.
As verses modificadas dos testes FTA-Abs (FTA-IgM),
EIA especficos e imunoensaios em linha que detectam
somente IgM podem ser utilizadas para detectar IgM
antitreponmico especfico, o qual no capaz de

142 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
atravessar a barreira placentria. A identificao desses
anticorpos IgM na circulao do beb uma indicao de
infeco congnita, mas o IgM especfico no pode ser
detectado em todos os casos da doena congnita (29).
Testes de IF indireta para IgM especficos apresentam
especificidade notoriamente baixa e o teste FTA-IgM,
assim como o teste FTA-Abs, inerentemente subjetivo.
Alm disso, as colunas usadas para separar as fraes
de imunoglobulinas na utilizao do teste 19S-FTA-IgM,
o qual substituiu em grande parte o teste FTA-IgM, no
esto mais disponveis em muitos pases.
No reativo
Somente a linha do
controle
Reativo (2 linhas)
Treponmico e controle
(caso antigo ou tratado)
Figura 10.11
Teste point-of-care (POC) duplo, no treponmico/treponmico, indicando os padres de reatividade e as
possveis interpretaes.
no ligados, adiciona-se o substrato enzimtico e os
indicadores cromognicos. Se o soro contm anticorpos
IgM especficos para T. pallidum, ocorrer uma reao
colorida, com a intensidade de cor proporcional
concentrao de anticorpos presentes.
10.5 Neurossfilis
Anormalidades no LCR so comuns em pacientes
com sfilis precoce que no apresentam sintomas
neurolgicos. Enquanto uma grande proporo desses
Em EIA para IgM especfico, o anticorpo IgM de coelho
anti-humano (cadeia especfica) colocado nos poos
de placas de microtitulao. Uma diluio mensurada
do soro do paciente adicionada aos poos da placa. A
IgM de coelho anti-humana captura qualquer anticorpo
IgM disponvel no soro do paciente. O antgeno de T.
pallidum purificado adicionado aos poos da placa,
e seu excesso lavado. Uma mistura de antissoro
anti-T. pallidum biotinilado humano ou de coelho e
estreptavidina conjugada peroxidase de rbano
adicionada aos poos da placa. Aps lavar os complexos
Reativo confirmado
3 linhas
Reativo (2 linhas)
No treponmico e controle
(falso-positivo)
casos possuem treponemas no sistema nervoso central,
eles no precisam do tratamento reforado necessrio
para a neurossfilis (30). Consequentemente, a puno
lombar de rotina no realizada rotineiramente para
sfilis precoce, a menos que indicado clinicamente.
Entretanto, quando indicado, os espcimes de LCR
devem ser examinados para protena total e contagem
de leuccitos, realizando-se tambm o teste VDRL-LCR.
Esse ltimo apresenta alta especificidade (99-100%),
mas baixa sensibilidade para neurossfilis (31, 32).
Sfilis 143
 Assim, enquanto o teste VDRL-LCR reativo um
indicador de neurossfilis, um teste no reativo no pode
ser utilizado como um meio de excluir a possibilidade de
neurossfilis. Por outro lado, o teste FTA-Abs para LCR
apresenta alta sensibilidade, mas baixa especificidade
para neurossfilis, devido transferncia passiva de
anticorpos IgG especficos atravs da barreira hemato-
enceflica. Assim, quando se obtm um resultado
negativo no teste FTA-Abs para LCR, existe uma alta
probabilidade de excluso de neurossfilis (33).
10.6 Deteco de IgM anti-treponmico no soro
adulto
Como em outras infeces bacterianas e virais, na sfilis,
a sntese de anticorpos IgM especficos a primeira
resposta imune humoral ps-infeco. Entretanto, o
anticorpo treponmico IgM no est apenas presente em
pacientes com sfilis precoce, mas tambm encontrado
durante o perodo latente e em pacientes com doena
tardia. Esse fenmeno limita o valor dos ensaios para
IgM especfico no diagnstico da doena em adultos.
10.7 Referncias
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Sfilis 145
Captulo 11
Linfogranuloma venreo (LGV)
11.1 Introduo
O linfogranuloma venreo (LGV) uma das trs doenas
sexualmente transmissveis tropicais clssicas. Ele
causado pela biovariante tpica L de Chlamydia
trachomatis, a qual apresenta as sorovariantes (L1, L2,
L2a, L2b e L3), mais invasivas do que as responsveis
pela infeco clssica nos olhos por tracoma
(sorovariantes A-C) e por uretrite no gonoccica, e
por infeces associadas ao trato genital (sorotipos
D-K). O LGV apresenta uma distribuio mundial,
sendo, porm, mais prevalente em pases tropicais e
subtropicais; por exemplo, endmico em partes do
Leste e do Oeste da frica, ndia, Sudeste da sia,
Amrica do Sul e Caribe. Na maioria dos casos, essas
observaes epidemiolgicas so relacionadas
apresentao clnica clssica de LGV, que se caracteriza
por uma linfadenopatia inguinal, com ou sem leso
primria associada (1). Esses sintomas so mais
comumente referidos em homens que em mulheres.
Em 2003, foram relatadas infeces retais por LGV,
com comprometimento caracterstico do linfonodo e/ou
proctite ou proctocolite, em homens que fazem sexo com
homens (HSH) na Holanda (2). Relatos subsequentes
foram realizados em muitos outros pases europeus,
alm da Amrica do Norte, Austrlia e outros, nos quais
anteriormente se registraram apenas casos espordicos
e importados de LGV (3-5). O nmero de C. trachomatis
no reto pertencentes ou no s biovariantes do LGV
continua desconhecido, devido carncia de triagem e
ao uso disseminado de um teste discriminatrio.
Classicamente, o LGV apresenta uma leso primria
transitria herpetiforme na genitlia externa; porm,
em muitos casos, a leso pode passar despercebida,
manifestar-se como uma uretrite no gonoccica aguda
em homens ou ser completamente assintomtica em
mulheres, como resultado da infeco primria do colo
do tero. Muitos casos necessitam de ateno mdica
quando ocorre infeco dos gnglios linfticos regionais,
como resultado da disperso linftica do organismo
causador. Em homens, o inchao das glndulas inguinais
ou femurais resulta frequentemente na formao
de nguas supurantes em um ou ambos os lados do
ligamento inguinal (o indcio de sulco, que pode ser
observado em uma minoria dos casos de pacientes
com cancro) (1). Em mulheres, a glndula plvica
profunda e a perirretal podem ser comprometidas se as
leses primrias forem encontradas no colo do tero,
e a paciente pode apresentar sintomas relacionados
doena inflamatria plvica (PID, do ingls pelvic
inflammatory disease).
Os HSH podem apresentar uma proctite ou proctocolite
ulcerativa severa com dor no reto, corrimento
sanguinolento, anuscopia nitidamente anormal, febre e
linfadenopatia (6,7 ). Tal como em mulheres, que tambm
podem apresentar essas leses, a falha no tratamento
da doena nesse estgio pode resultar na formao
de abcessos perirretais, estenoses retais, fstulas e
cicatrizes crnicas. Alm dessas complicaes, que
surgem como resultado de mudanas inflamatrias
agudas, as manifestaes crnicas da doena podem
causar o bloqueio da drenagem linftica da genitlia
ou reto, causando edema. O edema linftico severo
denominado de elefantase.
11.2 Testes laboratoriais
At o incio da dcada de 80, o isolamento de C.
trachomatis na cultura de clulas era o principal mtodo
para o diagnstico de infeces clamidiais (ver Captulo
5). Os isolados de LGV foram identificados por crescerem
mais rapidamente em clulas de cultura de tecidos
que os isolados clamidiais no LGV. A partir de meados
da dcada de 90, os testes de amplificao de cidos
nucleicos (NAAT, do ingls nucleic acid amplification test)
tornaram-se os testes de escolha para o diagnstico
de infeces clamidiais. Esses NAAT, disponveis
comercialmente, so significativamente mais sensveis
que os mtodos de diagnstico anteriores (ver Anexo
3). Entretanto, eles no so capazes de discriminar
as cepas de LGV ou no-LGV. Subsequentemente,
foram desenvolvidos ensaios moleculares que podem
diferenciar as cepas com base em uma deleo que
ocorre no gene pmpH somente em isolados de LGV
(8-10). A coleta, o transporte e o armazenamento
apropriados dos espcimes so fundamentais para a
Linfogranuloma venreo (LGV) 147
 alta sensibilidade e especificidade de todos os mtodos
diagnsticos.
Os espcimes escolhidos para cultura e NAAT de LGV
incluem amostras coletadas com hastes diretamente
das leses primrias (quando presentes); amostras da
uretra colhidas com hastes ou o primeiro jato de urina,
em homens; amostras endocervicais em mulheres e
amostras do reto em HSH, tambm coletadas com
hastes. Aspirados obtidos a partir de linfonodos regionais
flutuantes raramente apresentam resultados positivos.
Ao contrrio de outras infeces clamidiais no
invasivas do trato genital, as infeces por LGV tendem
a provocar uma resposta de anticorpos significativa. No
passado, o teste clamidial de fixao de complemento
foi amplamente usado para o diagnstico da infeco
tropical clssica, sendo detectadas titulaes 1:64.
Subsequentemente, o teste de microimunofluorescncia
foi utilizado, sendo detectados ttulos de anticorpos
1:256, com reao cruzada ampla. Deve-se ressaltar
que mulheres com PID e indivduos com infeco
por cepas de LGV no complicada podem apresentar
respostas de anticorpos semelhantes. A importncia da
sorologia no diagnstico de proctite e proctocolite por
LGV continua desconhecida.
11.3 Referncias
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Captulo 12
Cancro mole
12.1 Introduo
O cancro mole causado pela bactria Haemophilus
ducreyi, sendo transmitido exclusivamente por contato
sexual, com a invaso direta do organismo pela pele
saudvel ou desgastada. A doena , aproximadamente,
sete vezes mais comum em homens que em mulheres
e sua transmisso est associada ao nmero elevado
de parceiros sexuais. O cancro mole produz lceras
na genitlia, tipicamente no sulco coronal peniano,
em homens, e na vulva, em mulheres. O cancro mole
perianal pode ocorrer em homens que fazem sexo com
homens com comportamento receptivo e, tambm, em
mulheres que tiveram relaes sexuais com penetrao
anal. O cancro mole pode estar associado linfadenite
inguinal supurativa, principalmente se houve um atraso
na procura pelo servio de sade ou na realizao de
um diagnstico correto. Raramente, o cancro mole pode
ser adquirido no laboratrio por meio de uma inoculao
acidental de H. ducreyi por via digital.
O tempo de inoculao , normalmente, de 4-10 dias.
A lcera genital comea como uma ppula tenra, que
se torna pustulosa e ulcera em dois dias. A lcera
dolorida, irregular, com extremidades no definidas
e, normalmente, no endurecida. Essas so as
caractersticas clssicas que diferenciam o cancro
mole das lceras sifilticas. Entretanto, importante
destacar que a sensibilidade do diagnstico baseado
simplesmente no surgimento clnico de ulceraes
baixa. A base da lcera encontra-se frequentemente
coberta por uma secreo purulenta e necrtica,
sangrando facilmente quando raspada ou limpada.
comum haver mltiplas leses, que podem se fundir
e formar lceras grandes. Tambm costuma ocorrer
adenite inguinal dolorosa unilateral; caso esta no
seja pronta e adequadamente tratada, pode levar
ruptura espontnea dos linfonodos supurados (nguas).
Apresentaes atpicas de cancro mole so comuns
e a doena pode ser facilmente confundida com
outras lceras genitais (UG) de etiologia sexualmente
transmissvel, principalmente o herpes genital. Algumas
lceras genitais podem estar infectadas por mais de
um patgeno causador de UG, mas, atualmente, isso
menos comum devido reduo da prevalncia relativa
de bactrias causadoras de UG.
O patgeno H. ducreyi um bacilo Gram-negativo,
pequeno e imvel. Trata-se de um organismo delicado
e, devido s suas necessidades nutricionais complexas,
necessrio utilizar meio de cultura enriquecido para
o seu isolamento. O crescimento dos isolados de H.
ducreyi pode ser tanto aerbico quanto anaerbico,
sendo considerado timo a 32-33C, em uma atmosfera
saturada de vapor de gua. A maioria das cepas,
principalmente no isolamento primrio, dependente
de dixido de carbono. O H. ducreyi apresenta poucas
caractersticas bioqumicas distintivas: todas as cepas
reduzem o nitrato a nitrito, so positivas tanto para
oxidase quanto para fosfatase alcalina e necessitam de
hemina (fator X) para seu crescimento.
Embora o cancro mole tenha sido considerado muito
comum em algumas partes do mundo, a prevalncia
dessa doena diminuiu drasticamente desde a dcada de
90, devido, em parte, ampliao do acesso a agentes
antimicrobianos, implantao da gesto sindrmica,
melhoria dos cuidados mdicos para os profissionais do
sexo e mudana no comportamento sexual na era da
infeo por HIV.
12.2 Reviso dos procedimentos de
diagnstico
O diagnstico laboratorial de cancro mole baseia-se
tradicionalmente na recuperao de H. ducreyi a
partir da cultura, o que representa um procedimento
tecnicamente exigente, com baixo rendimento fora dos
laboratrios altamente especializados e acostumados a
trabalhar com o patgeno (1). Embora no exista nenhum
teste de amplificao de cidos nucleicos (NAAT,
do ingls nucleic acid amplification test) disponvel
comercialmente para o diagnstico de cancro mole,
vrios NAAT desenvolvidos in-house foram utilizados
para aumentar a sensibilidade do diagnstico (1). Alm
disso, descreveram-se diversas tcnicas fundamentadas
em pesquisa, incluindo o uso da deteco de antgenos
com base em anticorpo monoclonal e sondas de DNA
(1). A microscopia direta apresenta sensibilidade e
especificidade muito baixas, no sendo, portanto, muito
Cancro mole 149
 utilizada como ferramenta de diagnstico para cancro
mole. Os ensaios sorolgicos baseados em pesquisa,
atualmente disponveis, so teis somente para
propsitos soroepidemiolgicos.
12.3 Coleta e transporte de espcimes
Os espcimes para a cultura de H. ducreyi devem ser
obtidos a partir da base da lcera. Limpe a lcera com
uma gaze seca, ou com uma haste, para remover crostas
e detritos superficiais. No necessrio realizar uma
limpeza excessiva, o que pode causar sangramento e
ser doloroso para o paciente. Colete o exsudato da base
com uma haste. O tipo de fibra utilizada na haste no
parece afetar a sensibilidade da cultura. O isolamento
de H. ducreyi a partir do pus da ngua inguinal bem
menos eficiente que a partir do material da lcera genital
e, dessa forma, raramente realizado. Para resultados
ideais, inocule os espcimes imediatamente no meio
para isolamento e os mantenha em um recipiente com
vela, ou em uma estufa com atmosfera mida, a uma
temperatura no superior a 35C, at sua incubao
final. Quando o meio de cultura no estiver disponvel na
clnica mdica, os espcimes podem ser transportados
a 4C em um meio para transporte. Um meio baseado
em tioglicolato com hemina, contendo L-glutamina e
albumina bovina, parece manter a viabilidade de H.
ducreyi por vrios dias a 4C (2).
12.4 Isolamento e identificao de H. ducreyi
A cultura bacteriolgica de H. ducreyi continua sendo
a principal ferramenta para o diagnstico de cancro
mole em clnicas e, por muitos anos, foi o padro ouro
para a avaliao de outros mtodos diagnsticos. Uma
cultura bem-sucedida depende crucialmente do uso
de meio fresco (idealmente, com menos de sete dias)
e da ateno s condies de incubao. Entretanto,
com o surgimento de NAAT mais sensveis, baseados
em pesquisa, sabido que a cultura pode detectar, no
mximo, apenas 75% das infeces por H. ducreyi (3).
As tentativas iniciais de cultura de H. ducreyi utilizaram
sangue de coelho fresco coagulado e aquecido a
55C, sangue humano fresco coagulado e soro
humano inativado por calor; mas esses mtodos
foram alvo frequente de contaminaes recorrentes
por microrganismos (1). O problema da contaminao
150 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
foi subsequentemente contornado pela adio de
vancomicina ao gar de chocolate semislido
concentrao de 3g/mL (4). Utilizando tal meio seletivo,
Hammond et al. registraram o crescimento de H. ducreyi
em sete (44%) de 16 pacientes com o diagnstico clnico
de cancro mole (4). Deve-se ressaltar que o crescimento
de algumas cepas de H. ducreyi pode ser inibido quando
estas so expostas a essa concentrao de vancomicina,
e que tais cepas necessitariam ser isoladas em um meio
de cultura isento de antibitico.
Vrios meios seletivos artificiais foram desenvolvidos e
revisados com detalhes em outro documento (5). Nsanze
et al. demonstraram que o rendimento das culturas
positivas pode ser aumentado utilizando mais de um
tipo de meio de cultura para isolar H. ducreyi, a partir
de material de lcera genital (6). As diferenas nas
necessidades nutricionais entre as cepas de H. ducreyi
podem contribuir parcialmente para essas observaes.
Um meio contendo gar base GC, 1-2% de hemoglobina,
5% de soro fetal bovino com enriquecimento de 10% de
cofatoresvitaminasaminocidos (CVA) e vancomicina
(3g/mL) parece apresentar a maior sensibilidade para
o isolamento de H. ducreyi de espcimes clnicos, com
registro de culturas positivas em at aproximadamente
80% dos casos de cancro mole definidos clinicamente
(Figura 12.1) (5). Entretanto, notou-se que alguns
isolados de H. ducreyi no crescem nesse meio, mas
podem ser isolados a partir de um meio diferente
contendo gar Mueller-Hinton (MH), 5% de sangue de
cavalo achocolatado com enriquecimento de 1% de CVA
e vancomicina (3g/mL) (5). Para auxiliar na otimizao
da cultura de H. ducreyi em clnicas, dois meios podem
ser incorporados simultaneamente em uma nica placa.
Mais recentemente, foi desenvolvido um meio baseado
em carvo que evita a necessidade de adicionar o
oneroso soro fetal bovino, o qual pode representar uma
ferramenta de diagnstico com melhor custo-benefcio
para lugares com limitaes de recursos (Figura
12.2) (7 ). O Anexo 4 lista os protocolos para os meios
apropriados. Para o estabelecimento de lugares para
a cultura de H. ducreyi, recomenda-se o uso de, pelo
menos, dois dos meios mencionados acima e a definio
de suas sensibilidades durante estudos-piloto.
Aps a inoculao, incube as placas de cultura a
32-34C em uma atmosfera saturada de vapor
 Figura 12.1
Crescimento de H. ducreyi em placa de gar chocolate GC enriquecido.

Figura 12.2
Aglomerados de H. ducreyi em um meio baseado em carvo.

de gua, contendo 5% de dixido de carbono, ou,
preferencialmente, em condies microaeroflicas.
Incube as culturas por 48 horas antes da anlise inicial
e as mantenha por cinco dias antes de defini-las como
negativas. As colnias de H. ducreyi podem variar de
tamanho, dependendo do tempo e da temperatura de
incubao, da atmosfera e do meio de crescimento.
As colnias so no mucoides, elevadas, granulares,
apresentam uma cor amarela acinzentada e so
coletadas intactas em aglomerados na superfcie de gar
com uma ala bacteriolgica. As colnias podem ser
tanto translcidas quanto opacas e essa variabilidade
muitas vezes d a impresso de uma cultura misturada,
impura. A colorao de Gram de esfregaos de colnias
mostra cocobacilos em cadeias curtas, aglomerados
ou espirais. Os organismos so pleomrficos em,
aproximadamente, 50% das culturas. As bactrias
individuais parecem apresentar colorao bipolar. Em

Cancro mole 151

 vrios lugares do mundo, quase todos os isolados de
H. ducreyi produzem -lactamase. Essa caracterstica
pode contribuir para uma identificao presuntiva. Para
o trabalho de diagnstico de rotina em reas endmicas,
no existe a necessidade de identificao posterior.
Entretanto, a identificao confirmatria pode ser
necessria para os isolados suspeitos provenientes de
reas no endmicas. Uma combinao de alguns dos
mtodos a seguir pode ser realizada para viabilizar esse
processo: teste de oxidase, reduo de nitrato, teste de
porfirina e deteco de fosfatase alcalina.
Teste de oxidase
A produo de citocromo oxidase pode ser demonstrada
colocando algumas gotas de hidrocloreto de tetrametil-
p-fenilenodiamina em uma tira de papel filtro e
friccionando, com o auxlio de uma ala bacteriolgica,
as vrias colnias crescidas em uma rea impregnada.
Uma mudana de cor do azul para o roxo em um minuto
indica um resultado positivo.
Reduo de nitrato
Prepare uma suspenso bacteriana densa (padro de
McFarland 3, 109 UFC/mL) e transfira 0,04mL para
um tubo pequeno. Adicione 0,04mL de soluo de
nitrato de sdio a 0,5g/L e 0,04mL de tampo fosfato a
0,025mol/L, pH 6,8, e incube em banho-maria a 37C,
por uma hora. Em seguida, adicione 0,06mL de cido
sulfanlico a 8g/L em cido actico a 5mol/L e 0,06mL
de -naftilamina a 5g/L em cido actico a 5mol/L. O
tubo deve ser agitado e, se a cor rosa for observada, o
teste positivo.
Necessidade de hemina (Fator X) o teste de
porfirina
O teste clssico de crescimento com discos ou tiras
impregnadas por hemina no pode ser utilizado para
detectar H. ducreyi. O teste de porfirina o nico modo
vivel para demonstrar a necessidade de hemina.
Faa uma suspenso densa de bactrias (padro de
McFarland 3, 109 UFC/mL) em 0,5mL de uma soluo de
hidrocloreto de cido -aminolevulnico a 2mmol/L em
tampo fosfato a 0,1mil/L, pH 6,9, contendo soluo de
sulfato de magnsio a 0,08mmol/L. Incube em banho-
maria a 37C, por quatro horas. Exponha o substrato
152 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
luz de Wood (comprimento de onda de 360nm), em uma
cmara escura. Uma fluorescncia vermelha indica a
presena de porfirinas, isto , no h necessidade de
hemina. Assim, o H. ducreyi deve fornecer um resultado
negativo e no exibir fluorescncia vermelha.
Deteco de fosfatase alcalina
Faa uma suspenso densa de bactrias (padro de
McFarland 3, 109 UFC/mL) em um tubo contendo 0,5mL
de fosfato dissdico livre de fenol a 0,3g/L em tampo
de Srensen citrato-hidrxido de sdio a 0,01mol/L, pH
5,6, e incube o tubo em banho-maria a 37C, por quatro
horas. Adicione quatro gotas de 2,6-dibromoquinona-
4-clorimida a 5g/L em metanol, agite e deixe o tubo
repousar a temperatura ambiente por 15 minutos.
Adicione 0,3mL de n-butanol, agite e deixe repousar por
cinco minutos. Uma cor de azul a roxo nas camadas de
butanol indica um resultado positivo.
Outras caractersticas de H. ducreyi
Os testes de catalase, indol e urease so negativos. O
H. ducreyi no considerado sacaroltico. Entretanto,
foram registradas reaes positivas para diferentes
carboidratos. O H. ducreyi apresenta uma grande gama
de atividades de aminopeptidases e todos os isolados
testados mostraram atividade com -naftilamida
derivada de L-lisina, L-arginina, L-alanina, L-glicina,
glicilglicina, glicil-L-alanina e L-leucina.
12.5 Deteco de H. ducreyi baseada em
cido nucleico
At o momento da escrita deste documento (junho
de 2012), no existe NAAT para a deteco de H.
ducreyi disponvel comercialmente e aprovado pela
Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados
Unidos da Amrica. Vrios NAAT baseados em
pesquisas foram descritos na literatura e utilizam uma
gama de alvos moleculares diferentes, incluindo o
gene do RNAr 16S de H. ducreyi, a regio ribossmica
espaadora intergnica rrs (16S)-rrl (23S) e o gene
groEL (1). Foi tambm desenvolvida uma reao em
cadeia da polimerase multiplex robusta para a deteco
de patgenos de UG, incluindo o H. ducreyi, que est
sendo utilizada em uma srie de centros de referncia
internacionais (8).
12.6 Tecnologias de sonda de cido nucleico
Foram investigados ensaios de hibridizao DNA-DNA e
DNA-RNA como possveis meios de detectar H. ducreyi
no laboratrio, provando-se que estes apresentam
100% de sensibilidade e 100% de especificidade, mas
sua adequao como ferramenta de diagnstico para
detectar cancro mole ainda deve ser estabelecida (1).
12.7 Microscopia
O exame direto de material clnico em esfregaos com
colorao de Gram pode, ocasionalmente, ser til
para o diagnstico de cancro mole, caso se visualizem
bacilos Gram-negativos pequenos tpicos, agrupados em
correntes dos tipos cardume de peixes, vias frreas
ou impresses digitais. Entretanto, essas aparncias
morfolgicas clssicas so raramente visualizadas
na prtica clnica. Alm disso, a maioria das lceras
genitais abriga uma microbiota polimicrobiana devido
contaminao secundria. A presena de bacilos Gram-
negativos em um esfregao, dessa forma, pode ser
mal interpretada e contribuir para o fraco desempenho
da microscopia como uma ferramenta de diagnstico.
Consequentemente, devido sua baixa sensibilidade e
especificidade, os esfregaos com colorao de Gram
no so recomendados para o diagnstico de cancro
mole.
12.8 Deteco de antgeno de H. ducreyi
Vrios anticorpos monoclonais contra os antgenos
proeminentes de H. ducreyi, incluindo a protena da
membrana externa de 29kDa e o lipo-oligosacardeo,
foram utilizados para detectar a infeco por H.
ducreyi em diversos formatos de diagnstico, incluindo
imunofluorescncia e ensaios imunolgicos Limulus (1).
Esses ensaios baseiam-se em pesquisas, no tendo
sido utilizados como uma ferramenta de diagnstico na
prtica clnica.
12.9 Sorologia
Atualmente, os testes sorolgicos para a deteco
de anticorpos contra H. ducreyi no esto disponveis
comercialmente. As respostas sorolgicas de humanos
e coelhos para infeces por H. ducreyi foram
detectadas mediante uma srie de tecnologias, a
exemplo de imunoensaios enzimticos, precipitao,
aglutinao e o ensaio dot immunobiding (1). Durante
o estgio ulcerativo do cancro mole, desenvolve-se
uma resposta humoral infeco por H. ducreyi;
porm, segundo experincias clnicas e estudos de
inoculao experimental em humanos, provavelmente
no h imunidade adquirida para H. ducreyi. Os testes
sorolgicos oferecem muito pouco em termos de
assistncia a diagnstico, mas seriam uma ferramenta
til para os profissionais que realizam pesquisas
soroepidemiolgicas para infeces de cancro mole
presentes nas diversas comunidades.
12.10 Teste de susceptibilidade
antimicrobiana
Foi observada e descrita em isolados de H. ducreyi uma
alta resistncia mediada por plasmdio a sulfonamidas,
penicilinas, canamicina, estreptomicina, tetraciclina,
cloranfenicol e trimetoprina. Os padres da resistncia
cromossmica mediada por plasmdeo pode variar
muito entre as diversas reas geogrficas. Um grande
nmero de isolados de H. ducreyi exibe resistncia a
vrios agentes antimicrobianos. O crescimento contnuo
da resistncia a drogas entre os patgenos de doenas
sexualmente transmissveis (DST) torna necessria a
vigilncia adequada da susceptibilidade de isolados
clnicos de H. ducreyi em reas nas quais o cancro
mole continua representando um problema clnico
significativo. Entretanto, ainda no h um procedimento
padro para o teste de susceptibilidade antimicrobiana a
esse organismo.
A maioria dos estudos publicados utilizou a tcnica
de diluio em gar para determinar a concentrao
inibitria mnima (CIM). Um dos meios mais adequados
o gar MH enriquecido com hemoglobina a 1%, soro fetal
bovino a 5% e o suplemento IsoVitaleX TM a 1% (Anexo 4).
Alternativamente, o meio MH pode ser substitudo por
gar base GC. A determinao da CIM antimicrobiana
para os isolados de H. ducreyi um procedimento
tecnicamente complicado e delicado, sendo realizado
com sucesso somente em laboratrios de referncia
especializados.
A lista de antibiticos a ser testados deve incluir as
drogas localmente recomendadas para o tratamento
de cancro mole, assim como os agentes teraputicos
alternativos, os antibiticos teis para estudos
Cancro mole 153
 epidemiolgicos de H. ducreyi e, finalmente, novas
drogas desenvolvidas que necessitam de avaliao
microbiolgica. Os antibiticos comumente testados
incluem sulfametoxazol e trimetoprina (usados
isoladamente ou combinados), tetraciclina, cloranfenicol,
eritromicina, canamicina (ou estreptomicina),
ciprofloxacina (ou fleroxacina) e ceftriaxona (ou
cefotaxima).
A preparao de solues-estoque antimicrobianas e as
diluies para seu uso no teste da CIM esto descritas
com detalhes no Captulo 4, seo 4.8.4.2.
Para preparar o meio, dissolva o gar MH desidratado
e a hemoglobina, separadamente, em gua destilada.
O volume de gua utilizado deve ser 16% ou inferior
ao da frmula do meio normal (para permitir o volume
de suplementos e solues antimicrobianas a ser
adicionados posteriormente). Ferva e dispense o MH
e a hemoglobina, separadamente, em recipientes
com volumes apropriados ao nmero de placas a ser
preparadas para cada diluio antimicrobiana, o qual
depender do nmero de cepas a serem testadas.
Autoclave em recipientes bem fechados, deixe esfriar
a uma temperatura de 50-55C em banho-maria e,
ento, misture os dois em um recipiente e adicione soro
fetal bovino a 5%, suplemento para H. ducreyi a 1% e
soluo antimicrobiana a 10%. Misture gentilmente o
meio e verta uma quantidade de aproximadamente 20mL
nas placas, com um dimetro interno de 9cm. Uma
vez que o gar esteja solidificado, as placas devem ser
armazenadas a 4C, por at uma semana, em sacolas
plsticas fechadas.
Para preparar o inculo, ressuspenda em caldo de
triptona de soja (TSB, do ingls trypic soy broth) a cultura
crescida a partir de uma subcultura de 24 horas em gar
MH ou GC enriquecidos (similar ao meio de isolamento,
mas sem a vancomicina), para uma densidade de 108
unidades formadoras de colnias (UFC) por mL. As
colnias de H. ducreyi so normalmente to viscosas
que no possvel obter uma suspenso homognea,
mesmo aps agitar vigorosamente ou mistur-la com
o auxlio de um vrtice. O uso de seringa e uma agulha
25G laranja para quebrar os aglomerados, por meio da
aspirao e liberao da suspenso, pode auxiliar na
obteno de uma suspenso mais homognea, alm
154 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
de ser menos destrutivo para o bacilo. A centrifugao
a baixa velocidade (500g) pode ajudar a sedimentar os
aglomerados grandes. A densidade do sobrenadante
ento comparada a 0,5 no padro de McFarland
(108UFC/mL). Dilua a suspenso em TSB (1:10) para
obter 107UFC/mL e coloque 0,5mL dessa diluio
no poo correspondente em um bloco repicador de
sementes.
Aquea as placas do teste de CIM para a temperatura
ambiente e, se necessrio, seque-as em uma estufa, na
posio invertida, com a tampa semiaberta. Transfira
o inculo bacteriano preparado para as placas-
teste, utilizando um repicador de mltiplos pontos,
a fim de gerar pontos contendo aproximadamente
104UFC. Inocule, primeiro, uma placa-controle sem
antibiticos e, em seguida, as placas contendo os
agentes antimicrobianos, comeando pela de menor
concentrao para cada agente. Finalmente, inocule uma
segunda placa-controle. Deixe secar o inculo, inverta as
placas e incube a 33C, em uma atmosfera saturada em
vapor de gua, contendo dixido de carbono a 5%, por
24 horas.
A CIM a concentrao mais baixa do antibitico, a qual
no permite o crescimento ou o crescimento de apenas
poucas colnias, bem finas e praticamente no visveis.
O crescimento em ambas as placas-controle deve ser
aderente e livre de contaminao. A determinao da
CIM para sulfonamidas um pouco difcil, uma vez
que os seus limites so menos precisos do que para
os outros antibiticos. Uma leitura padro e resultados
reprodutveis so obtidos se a segunda diluio, na
qual se d uma grande reduo no crescimento, for
considerada como a CIM. Pode ser til comparar esse
crescimento com o das placas controle.
12.11 Conservao dos isolados
Para manter a viabilidade dos isolados de H. ducreyi
no laboratrio, estes devem ser subcultivados a cada
quatro dias. As cepas tambm podem ser preservadas
por at quatro semanas, por meio da inoculao em
gar chocolate enriquecido. Para a manuteno durante
perodos de muitos meses, suspenses em leite
desnatado so armazenadas mediante congelamento
a -70C. Para preservao em longo prazo, os isolados
podem ser suspensos em um meio crioprotetor, tais
como soro fetal bovino + dimetilsulfoxida a 10% ou
leite desnatado + glicerol a 20%, e armazenados em
nitrognio lquido.

12.12 Questes mdico-legais

O cancro mole sempre deve ser visto como uma DST,
com exceo de episdio raro de infeco adquirida em
laboratrio.

12.13 Referncias
1. Lewis DA. Diagnostic tests for chancroid. Sexually
Transmitted Infections, 2000, 76(2):137141.

2. Dangor Y, Radebe F, Ballard RC. Transport media

for Haemophilus ducreyi. Sexually Transmitted
Diseases, 1993, 20(1):59.

3. Morse SA et al. Comparison of clinical diagnosis

and standard laboratory and molecular methods for
the diagnosis of genital ulcer disease in Lesotho:
association with human immunodeficiency virus
infection. Journal of Infectious Diseases, 1997,
175(3):583589.

4. Hammond GW et al. Comparison of specimen

collection and laboratory techniques for isolation
of Haemophilus ducreyi. Journal of Clinical
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5. Morse SA. Chancroid and Haemophilus ducreyi.

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6. Nsanze H et al. Comparison of media for the

primary isolation of Haemophilus ducreyi. Sexually
Transmitted Diseases, 1984, 11(1):69.

7. Lockett AE et al. Serum-free media for isolation

of Haemophilus ducreyi. The Lancet, 1991,
338(8762):326.

8. Orle KA et al. Simultaneous PCR detection of

Haemophilus ducreyi, Treponema pallidum, and
herpes simplex virus types 1 and 2 from genital
ulcers. Journal of Clinical Microbiology, 1996,
34(1):4954.

Cancro mole 155

156 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Captulo 13
Donovanose (granuloma
inguinal)
13.1 Introduo
A donovanose, tambm conhecida como granuloma
inguinal, uma infeco crnica envolvendo a pele, as
membranas mucosas e o sistema linftico da genitlia
e rea perianal (1). A ocorrncia de donovanose
geograficamente limitada, por exemplo, ao Brasil,
Caribe, ndia, Papua-Nova Guin e ao sul da frica.
Essa doena, que apresenta baixa infecciosidade,
transmitida entre humanos principalmente por contato
sexual. O tempo de incubao pode ser prolongado,
variando entre 1-12 semanas. A doena comea
como um ndulo subcutneo endurecido, que corri
a pele para formar uma lcera vermelha, hipertrfica
e granulomatosa, com a borda bem definida. A leso
sangra facilmente com o contato. A lcera progride
devagar e pode se tornar dolorosa caso se desenvolva
uma infeco bacteriana secundria. Tal infeco com
outros organismos pode contribuir para a formao de
detritos necrticos na lcera. Novas leses costumam
formar-se por autoinoculao e os linfonodos inguinais
aumentam de tamanho, como resultado de infeco
secundria (pseudonguas). A donovanose pode se
espalhar hematogenicamente para os ossos, juntas e
fgado. Por vezes a disseminao tambm resulta em
leses cutneas em locais extragenitais. Leses genitais
e perianais em vrios estgios podem lembrar leses
formadas por outras condies, como sfilis, cancro
mole, carcinoma e amebase.
A donovanose causada pelas Klebsiella (anteriormente
chamada Calymmatobacterium) granulomatis, bactrias
Gram-negativas (1,5 x 0,7m) que podem ser observadas
no interior de vacolos em grandes clulas histiocticas,
onde so denominadas corpos de Donovan (1,2).
13.2 Reviso do diagnstico laboratorial
O diagnstico laboratorial depende da visualizao dos
corpos de Donovan em esfregaos coloridos obtidos a
partir de leses clnicas ou cortes histolgicos coloridos
de tecidos de bipsia. O organismo somente pode ser
cultivado, com dificuldade, em centros especializados,
utilizando cultura de clula de moncito/Hep2. Ainda no
possvel cultivar o organismo em meio artificial. Foram
descritos na literatura ensaios de amplificao de cido
nucleico in-house, mas, na maioria dos pases, esses
ensaios no esto disponveis para fins de diagnstico
de rotina.
13.3 Coleta de espcime
Antes de preparar o esfregao do material da lcera,
gire gentilmente, por sobre a leso, uma haste com
ponta de algodo, para remover o exsudato resultante
de infeces secundrias e/ou resduos, de forma a
minimizar o sangramento. Uma segunda haste deve
ser utilizada para coletar material da base da lcera,
assegurando uma boa amostragem das bordas da leso,
onde mais provvel que os corpos de Donovan sejam
encontrados. A seguir, role essa haste uniformemente
sobre uma lmina e deixe-a secar ao ar livre antes de
transport-la ao laboratrio. importante ressaltar que
alguns mdicos preferem utilizar uma pina perfuradora
para bipsia e remover um pequeno pedao de tecido, o
qual , ento, esmagado, espalhado em uma lmina e,
em seguida, seco ao ar livre. A preparao de lminas
a partir de material esmagado facilita a interpretao
microscpica e aumenta o valor de diagnstico.
13.4 Microscopia
Foi descrito um mtodo simples e rpido (1 minuto)
de microscopia usando colorao de Giemsa (4). Com
esse mtodo de colorao, a lmina mergulhada
cinco vezes em um fixador, seis vezes em uma soluo
de eosina, seis vezes em uma mistura de corante
tiazdico e, ento, lavada com tampo fosfato, pH 6,8.
Os corantes de Giemsa a 10% ou de Leishman, diludo
de forma semelhante, tambm podem ser empregados
como alternativa, seguidos da fixao do material na
lmina com metanol por 2-3 minutos. Cubra a lmina
com o corante diludo por 10 minutos (corante de
Leishman) ou por at 30 minutos (corante de Giemsa)
e, ento, lave a lmina em um fluxo de gua tamponada
corrente ou de soluo salina de tampo fosfato (pH
7,0-7,2). Em seguida, deixe a lmina secar ao ar livre e,
ento, examine-a em um microscpio de luz, utilizando
leo de imerso (aumento de 1000x). Os corpos de
Donovanose (granuloma inguinal) 157
 Donovan aparecem como coco-bacilos dentro de isoladas, no existem outras tcnicas de cultura in
grandes vacolos (25-90m de dimetro) no citoplasma vitro para o isolamento de K. granulomatis. Entretanto,
de histicitos grandes e, ocasionalmente, em clulas o organismo pode ser cultivado por inoculao dos
plasmticas e leuccitos polinucleares. Os organismos espcimes clnicos no saco vitelino de ovos de galinha
apresentam cores de azul a roxo e, frequentemente, embrionados de cinco dias (10). O organismo
encontram-se circundados por uma cpsula proeminente detectvel aps 72 horas de incubao.
rosa claro a acidfila (Figura 13.1). A bactria tpica
lembra alfinetes de segurana fechados. A contaminao
com outras bactrias frequentemente observada.
Embora a microscopia de esfregaos de lcera seja a
forma convencional de diagnosticar a donovanose, os
corpos de Donovan tambm j foram identificados em
esfregaos de Papanicolau (Pap) utilizados na citologia
cervical de rotina (5).

13.5 Histopatologia Figura 13.1

O exame histopatolgico de uma bipsia pode ser til Esfregao com colorao de Giemsa de material de
no diagnstico diferencial entre donovanose e outras lcera, contendo moncitos de corpos de Donovan
(1000x).
condies. Uma lcera com um infiltrado inflamatrio
mesclado de clulas plasmticas, neutrfilos e
histicitos, com ausncia notvel de linfcitos,
13.7 Amplificao de cido nucleico
sugestiva de donovanose. Retire um pedao de tecido
Foi desenvolvida uma reao em cadeia da polimerase
(3-5mm de espessura) da borda da leso com uma pina
(PCR, do ingls polymerase chain reaction) para
perfuradora para bipsia e coloque-o em um recipiente
diagnstico, baseada em pesquisas, a qual tem como
com soluo salina-formaldedo fixadora. O diagnstico
alvo o gene phoE e incorpora, aps a amplificao, a
pode ser realizado por meio da identificao de corpos
digesto de amplicons com base na enzima de restrio
de Donovan, utilizando o reagente de impregnao de
HaeIII (3). Esse mtodo foi refinado, em seguida, em um
prata de Warthin-Starry (6). As bipsias parafinadas
teste de PCR colorimtrico.
devem ser cortadas em seces de 6m. Aps a
desparafinizao e hidratao com gua destilada, fixe
13.8 Testes sorolgicos
as seces em uma lmina de vidro com glicerol, seque
e trate com soluo cida de nitrato de prata a 43C, Atualmente, no existem testes sorolgicos disponveis
por 30 minutos. Lave com gua quente, enxague em para auxiliar no diagnstico.
gua destilada, desidrate em etanol 95% e clarifique em
xileno.
13.9 Referncias
1. OFarrell N. Donovanosis. Sexually Transmitted
13.6 Cultura Infections, 2002, 78(6):452457.
Aps um relatrio descrevendo a cultura de K.
2. Carter JS et al. Phylogenetic evidence for
granulomatis a partir de fezes, em 1962, mostrou-se,
reclassification of Calymmatobacterium
subsequentemente, ser muito difcil a cultura do
granulomatis as Klebsiella granulomatis comb nov.
organismo com base em espcimes clnicos (1, 7 ).
International Journal of Systematic Bacteriology,
Em 1997, dois grupos reportaram a multiplicao
1999, 49(Pt4):16951700.
bem-sucedida de K. granulomatis utilizando diferentes
sistemas de cultura, isto , um sistema de cocultura 3. Carter JS et al. Diagnostic polymerase chain
de moncitos e uma tcnica modificada de cultura reaction for donovanosis. Clinical Infectious
de clamdia (8, 9). Com exceo dessas publicaes Diseases, 1999, 28(5):11681169.

158 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
4. OFarrell N et al. A rapid stain for the diagnosis of
granuloma inguinale. Genitourinary Medicine, 1990,
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inguinale. Acta Cytologica, 1984, 28(2):126128.

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transmitted genital lesions. Histopathology, 1987,
11(8):819831.

7. Goldberg J. Studies on granuloma inguinale. V.

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granulomatis from the faeces of a patient with
granuloma inguinale. British Journal of Venereal
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8. Kharsany AB et al. Growth and cultural

characteristics of Calymmatobacterium
granulomatisthe aetiological agent of granuloma
inguinale (donovanosis). Journal of Medical
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9. Carter J et al. Culture of the causative organism for

donovanosis (Calymmatobacterium granulomatis) in
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10. Anderson K, Demonbreun WA, Goodpasture EW. An

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cultivated from granuloma inguinale (three cases) in
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11. Carter JS, Kemp DJ. A colorimetric detection

system for Calymmatobacterium granulomatis.
Sexually Transmitted Infections, 2000,
76(2):134136.

Donovanose (granuloma inguinal) 159

160 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Captulo 14 O termo gnero utilizado para os clados de maior
ordem, denominados por meio do alfabeto grego e,
dentro de cada gnero, pequenos clados so designados
Infeces pelo papilomavrus como espcies e recebem um nmero. Por exemplo, o

humano (HPV) gnero papilomavrus contm as espcies -9 e -7,

as quais representam, respectivamente, as duas causas
mais comuns de cncer cervical, ou seja, os gentipos
14.1 Papilomavrus humano (HPV) 16 e 18 do HPV (2). Existem mais de 200 tipos diferentes
Os HPV so vrus pequenos (~55nm de dimetro), do vrus, dos quais, aproximadamente, 100 j tiveram
icosadricos, no envelopados, com um genoma de DNA o genoma completo sequenciado e 40 so conhecidos
de fita dupla circular e enrolado de, aproximadamente, por infectar, especificamente, a mucosa anogenital de
8kb (Figura 14.1). Esses vrus infectam, tipicamente, humanos (HPV mucosotrfico).
a pele e superfcies mucosas de humanos (1). Ao
Os tipos de HPV detectados, frequentemente, no trato
contrrio da maioria dos vrus que infectam pessoas,
anogenital so subdivididos em tipos de baixo risco (LR,
os papilomavrus no podem se propagar por meio
do ingls low-risk) e de alto risco (HR, do ingls high-
de cultura in vitro convencional. Dessa forma, no se
risk), com base no risco relativo para a complicao rara
pode utilizar uma classificao clssica antignica
de neoplasia (3). Os tipos LR de HPV so encontrados,
e de sorotipo para a determinao do tipo viral. Em
tipicamente, em leses intraepiteliais de baixo grau
vez disso, utiliza-se uma abordagem de genotipagem
(leses no pr-cancerosas), assim como em verrugas
para a identificao e classificao desses vrus. Os
anogenitais. Os tipos 6 e 11 do HPV contribuem para,
HPV individuais so identificados quanto ao tipo e ao
aproximadamente, 90% das verrugas genitais (4, 5). Os
gentipo, distinguidos de acordo com sua sequncia
HPV HR so encontrados em leses de baixo e alto graus,
genmica e enumerados na ordem em que so
assim como em cncer de colo do tero e outros locais
descobertos. O gene L1, que codifica o principal
anogenitais (vulva, vagina e nus) (6). Coletivamente, os
componente do capsdeo viral (Figura 14.2), a regio
HPV 16 e 18 so responsveis por, aproximadamente,
mais conservada entre os tipos individuais, sendo
70% de todos os cnceres de colo do tero no mundo
utilizada pela taxonomia para a construo de rvores
(7-11). Com exceo dos cnceres anogenitais, o tipo
filogenticas (Figura 14.3) (2). Os HPV com divergncia
16, principalmente, apresenta um papel causal em
de 2-10% na sequncia de L1 so conhecidos como
alguns cnceres de orofaringe, particularmente aqueles
subtipos, e aqueles com menos de 2%, como variantes.
localizados nas tonsilas (12, 13).
P97

URR
E6
E7

MY11 MY09

E1
L1
HPV

L2 E2
E4
E5

Figura 14.1
Microscopia eletrnica de HPV mostrando as Figura 14.2
partculas virais nas clulas selecionadas de um Organizao gentica dos HPVs(48).
esfregao de Papanicolau (Pap). URR: regio reguladora proximal (do ingls upstream
Fonte: cortesia de Colin Laverty, Sydney, NSM, regulatory region)
Australia, 1978. Fonte: reproduzido com permisso da Organizao
Mundial da Sade (OMS).
Infeces pelo papilomavrus humano (HPV) 161
 Figura 14.3
rvore filogentica contendo as sequncias de L1 de 118 tipos de papilomavrus (2).
Fonte: reproduzido com permisso da Virology.
14.2 Histria natural das infeces genitais por
HPV
A maioria das infeces genitais por HPV so adquiridas
sexualmente, transitrias e lentamente curadas pelo
sistema imune do hospedeiro (14). Raramente, em cerca
de 5-10% dos casos, as infeces por HPV podem se
tornar persistentes. O HPV HR persistente um forte
indicador de risco para o desenvolvimento de pr-cncer,
o qual, por sua vez, apresenta o risco de progredir para
cncer ao longo dos anos, caso no seja tratado (15, 16).
Os cofatores determinados para o desenvolvimento de
infeco persistente e cncer cervical so o tabagismo,
uso prolongado de contraceptivo oral, alta paridade, idade
precoce no primeiro parto e estado imunossupressivo,
como na coinfeco por HIV (17 ). Ainda no se tem
conhecimento sobre se h fatores especficos do
hospedeiro e/ou outros fatores ambientais que determinam
os indivduos destinados a pr-cncer ou neoplasia (18).
A transmisso de HPV genital normalmente ocorre via
contato sexual direto (pele genital com pele genital) com
um indivduo infectado, resultando em taxas estimadas
162 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
de aquisio de HPV ao longo da vida de at 60-80%
(19, 20). A idade mdia da primeira relao sexual em
muitos pases ocidentais, tais como Austrlia, Reino
Unido e Estados Unidos da Amrica, de 16 anos (19,
21). Dessa forma, segue-se que as taxas mais elevadas
de novas infeces por HPV adquiridas so observadas
em mulheres jovens, com o pico etrio logo aps o
incio da atividade sexual e com estimativas de at
75% das infeces por HPV ocorrendo em mulheres
de 15 a 24 anos. Dados recentes sugerem que muitas
novas infeces em mulheres jovens, no infectadas
previamente por HPV, so infeces mltiplas (mltiplos
tipos de HPV detectados) (22).
H menos conhecimento sobre a histria natural da
infeco por HPV em homens. Novamente, as infeces
(peniana, na pele genital e/ou anal) so muito comuns,
ocorrendo logo aps o incio da atividade sexual, com
taxas rpidas de aquisio e cura (23, 24). Alm disso, o
comportamento sexual envolvendo nmeros elevados de
parceiros sexuais aumenta o risco de infeco, enquanto
a circunciso mostra um efeito protetor (24).
14.3 Imunologia do HPV
A resposta imune do hospedeiro ao HPV envolve tanto os
compartimentos humorais como aqueles mediados por
clulas. Em seguida infeco natural, a resposta humoral
de anticorpos especfica, sendo detectada, primeiramente,
em 6-18 meses aps a infeco (14). A resposta fraca e,
aproximadamente, apenas 50-60% dos indivduos positivos
para o teste de DNA do HPV desenvolvem uma resposta de
anticorpos mensurvel (14). Aps a infeco natural, um
indivduo pode permanecer positivo para o teste de DNA do
HPV, apesar do desenvolvimento de anticorpos especficos.
Tais indivduos no esto isentos de desenvolver uma doena
subsequente a partir desse tipo de HPV. A eliminao da
infeco por HPV e a resoluo das leses clnicas, como caractersticas semelhantes a verrugas em laringoscopia/
as verrugas genitais, so caracterizadas por uma resposta
imune celular efetiva (25).
A sorologia do HPV no utilizada para o diagnstico.
A sorovigilncia til para estimar, em uma base
populacional, a idade e prevalncia da exposio em locais
pr-vacina. A sorologia ps-vacinao utilizada como
uma mensurao da efetividade da vacina. A proteo
corresponde deteco de anticorpos neutralizantes,
embora o mecanismo de proteo em si no seja
completamente compreendido. Estudos em animais com
papilomavrus especficos para o hospedeiro descrevem
anticorpos neutralizantes, a partir da infeco primria,
que se mostram protetores, embora sejam, em seguida,
desafiados pelo vrus respectivo. importante ressaltar
que, apesar de a durabilidade dos anticorpos induzidos
por vacinao em triagens humanas ser atualmente
documentada como sendo superior a oito anos, ainda no
se definiu uma correlao imune de proteo (27).
14.4 Manifestaes de doenas
Verrugas anogenitais
As verrugas anogenitais, tambm conhecidas como
condiloma acuminado, so uma massa exoftica benigna,
de crescimento papular ou plano, que podem ocorrer em
qualquer regio da rea anogenital. Elas so extremamente
comuns, principalmente em jovens que iniciam a atividade
sexual, sendo amplamente diagnosticadas nas clnicas.
Raramente, as leses podem causar problemas devido
ao seu tamanho e s obstrues que provocam, mas
acarretam, sobretudo, dificuldades psicossociais ou
relacionadas aparncia. As leses apresentam uma
tendncia a recuar aps o tratamento. Os HPV 6 e 11
causam a maiorias das verrugas anogenitais (85-90%) (5).
Papilomatose respiratria recorrente (PRR)
A PRR uma condio muito rara, caracterizada pelo
crescimento recorrente de estruturas semelhantes a
verrugas (papilomas) no trato respiratrio superior, embora
tambm possa envolver o trato respiratrio inferior,
resultando em morbidade e mortalidade significativas. Os
tipos 6 e 11 do HPV so responsveis, em grande parte,
por essas leses. A laringe a regio mais comumente
afetada, resultando em alteraes na voz. Em crianas
pequenas, pode ocorrer a obstruo de ar. O diagnstico
feito clinicamente por meio da observao de leses
broncoscopia. As leses so benignas, mas podem recorrer
frequentemente aps o tratamento. O surgimento dos
sintomas segue dois padres: a forma juvenil (idade mdia
de dois anos) e a forma tardia, observada em adultos (28).
Leses pr-cancerosas e cnceres
A infeco persistente com HPV oncognicos ou de
gentipos HR est intimamente relacionada a um aumento
de risco de cncer anogenital. Essa tendncia foi melhor
estudada no colo do tero, onde foram primeiramente
definidos os critrios para a identificao citolgica e
histolgica de leses pr-cancerosas de progresso
lenta. A nomenclatura dos tipos mudou ao longo dos anos
e continua a evoluir. Os precursores do cncer foram
denominados de displasias (suave, moderada e severa)
ou neoplasia intraepitelial cervical (NIC 1, 2, 3) e, mais
recentemente, de leses NIC 1-3 de alto grau (HSIL,
do ingls high-grade intraepitelial lesion) ou baixo grau
(LSIL, do ingls low-grade intraepithelial lesion) (29).
A terminologia em outras regies anatmicas segue o
mesmo padro: anal (AIN, do ingls anal intraepithelial
lesion), vulvar (VIN, do ingls vulvar intraepithelial lesion),
vaginal (VaIN, do ingls vaginal intraepithelial lesion) e
peniana (PIN, do ingls penile intraepithelial lesion). Em
cada caso, as leses precursoras (de alto grau ou grau 3)
so assintomticas, de progresso lenta e diagnosticadas
com histologia. A triagem recomendada apenas para as
leses cervicais, embora a abordagem para a triagem anal
esteja sendo avaliada (30). Atualmente, o tratamento s
recomendado para as leses precursoras (de alto grau).
Infeces pelo papilomavrus humano (HPV) 163
 Fortes evidncias laboratoriais e epidemiolgicas
associam o HPV ao cncer cervical, sendo a infeco
por HPV HR persistente considerada um fator causal
necessrio, mas no suficiente, para o cncer cervical.
Na ausncia de infeco por HPV, muito improvvel
que o cncer cervical se desenvolva, e essa ntima
relao a razo pela qual as vacinas visam a preveno
das infeces por HPV oncognicos mais frequentes a
fim de prevenir o cncer, motivo pelo qual o teste de HPV
tambm pode auxiliar na triagem de cncer cervical.
Atualmente, as vacinas para HPV tm como alvo os
tipos 16 e 18 do HPV HR, que contribuem para 70% dos
casos de cncer cervical no mundo (7-11). As evidncias
epidemiolgicas so menos estabelecidas para os outros
cnceres associados ao HPV, mas estes envolvem
infeces em outras regies anogenitais, assim como
orofarngeas (base da lngua e tonsila), resultando em
um nus significativo da doena (Tabela 14.1).

Tabela 14.1: Cnceres atribuveis ao HPV em 2002

Destes, so Ambos os sexos
positivos % de Atribuveis % de
Atribuveis para o HPV 16 Total de Atribuveis todos os ao HPV todos os
Local ao HPV (%) e/ou 18 (%) cnceres ao HPV cnceres 16/18 cnceres
Colo do tero 100 70 492.800 492.800 4,54 344.900 3,18
Pnis 40 63 26.300 10.500 0,10 6.600 0,06
Vulva, vagina 40 80 40.000 16.000 0,15 12.800 0,12
nus 90 92 30.400 27.300 0,25 25.100 0,23
Boca 3 95 274.300 8.200 0,08 7.800 0,07
Orofaringe 12 89 52.100 6.200 0,06 5.500 0,05
Todos os locais 10.862.500 561.100 5,17 402.900 3,71
Fonte: adaptado de Parkin DM. The global burden of infection-associated cancers in the year 2002. International Journal of Cancer, 2006, 118: 3030-3044.

A proporo de cnceres relacionados ao HPV difere
para cada local anatmico e o HPV-16 , principalmente,
proeminente em cnceres no cervicais.
14.5 Procedimentos laboratoriais para a
deteco do HPV
O teste para HPV baseia-se em mtodos moleculares.
Isso ocorre, como mencionado anteriormente, devido
a que os mtodos de cultura convencionais no so
capazes de cultivar o HPV e a sorologia relativamente
insensvel. Os mtodos de teste para a vigilncia
epidemiolgica diferem daqueles aplicados em clnicas.
Os mtodos epidemiolgicos requerem ensaios
especficos, com alta sensibilidade analtica. Uma
vez que os ensaios clnicos utilizam o HPV como um
marcador da doena subjacente, eles so comparveis
aos desfechos da patologia. No h tratamentos para
o HPV em si; os tratamentos so direcionados aos
precursores do cncer associado ao HPV ou outras
leses relacionadas ao vrus. Uma ampla variedade de
ensaios para HPV esto disponveis comercialmente e
tambm so desenvolvidos por laboratrios. O uso em
clnicas necessita que os laboratrios utilizem ensaios
validados por agncias reguladoras para obter indicaes
clnicas especficas ou que os laboratrios procedam
validao do desempenho clnico do ensaio. Uma vez
que os precursores de cncer esto apenas associados
aos HPV HR, no h indicaes clnicas para o teste de
HPV LR. Existem algumas variaes nas quais os tipos
de HPV HR so clinicamente relevantes, e a maioria dos
ensaios incluem (ou realizam a reao cruzada com) os
14 tipos de HPV HR seguintes: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45,
51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68.
14.6 Aplicaes clnicas dos ensaios de
deteco do HPV
As aplicaes clnicas para os ensaios de deteco do
HPV incluem:
Triagem primria, tanto isolada quanto em
combinao com a citologia cervical (Figura 14.4), em
mulheres 30 anos de idade. Estudos longitudinais
mostram que o teste de DNA para HPV apresenta
maior sensibilidade para predizer a prevalncia ou o

164 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
 Normal ASCUS/limtrofe LSIL

HSIL Coilcito

Figura 14.4
Citologia de Papanicolau (Pap) de clulas esfoliadas normais, coilocitose tpica, mas no patognica, da
infeco por HPV, clulas escamosas atpicas de significncia indeterminada, mudanas celulares LSIL e HSIL.

desenvolvimento tardio de displasia; alm disso, o WNL, 200x NIC1, 200x

seu valor preditivo negativo (VPN) extremamente
alto e superior ao da citologia. Dessa forma,
prope-se que os pacientes com resultado negativo
no exame de DNA para HPV em duas ocasies
possam apresentar um intervalo maior de triagem.
Isso torna a combinao de Papanicolau (Pap) e teste
de DNA para HPV custo-efetiva (31-36).
NIC2, 200x NIC3, 200x
A triagem de mulheres com anormalidades citolgicas
mnimas (inconclusiva, equivocada ou limiar), para
discrimin-las daquelas de fato relacionadas ao HPV
e que requerem acompanhamento (37 ).

Terapia ps-ablao para displasia de alto grau e

monitoramento de mulheres com evidncias de
doena persistente/recorrente, e como um teste de
cura (32, 38).
O uso do HPV como uma triagem primria para cncer
cervical est sendo avaliado (39). Atualmente, enquanto
o teste para HPV um excelente preditor negativo da
doena, ele no apresenta a especificidade necessria
para a indicao direta de tratamento. A citologia
cervical uma opo de segundo teste. Outros testes
moleculares esto sendo avaliados, tais como o fator
do hospedeiro p16INK4a (p16), um inibidor quinase
dependente de ciclina. ndices elevados de p16 indicam
a remoo do controle de realimentao negativa
fornecido pelo gene do retinoblastoma, pRB. Quando
protenas as oncognicas E7 do HPV se ligam ao pRB, o
p16 expresso em demasia e seus ndices so elevados,
Figura 14.5
p16 no expressa em tecidos normais (WNL) e
progressivamente expressa com anormalidades
crescentes (NIC1 a NIC3).
Fonte: reproduzido com permisso de Magnus von
Knebel Doeberitz, Departamento de Biologia aplicada a
tumor, Instituto de Patologia, Universidade de Heidelberg,
Heidelberg, Alemanha.
representando a expresso ativa de oncogenes do
HPV (40) (Figura 14.5). Alm disso, em combinao
com a expresso aumentada de outros fatores do
hospedeiro, tais como o Ki67, a expresso em excesso
de p16 est altamente relacionada com infeces virais
transformadoras (Figura 14.6) (41).

Infeces pelo papilomavrus humano (HPV) 165

 14.7 Mtodos de deteco do DNA do HPV
Historicamente, os mtodos utilizados para detectar o
DNA do HPV constituam ensaios de hibridizao direta
de sonda, tais como o dot blot e o southern blot. Esses
mtodos eram trabalhosos, demorados e apresentavam
baixa sensibilidade, sendo necessria uma grande
quantidade de DNA em amostras clnicas. Atualmente,
as aplicaes clnicas se baseiam em ensaios altamente
padronizados, que simplificam o manuseio da amostra
e envolvem alguma forma de amplificao para a
realizao do teste. A Tabela 14.2 mostra os testes
atualmente aprovados pela Administrao de Alimentos
e Drogas dos Estados Unidos da Amrica (FDA, do ingls
United States of America Food and Drug Administration).
O teste de captura hbrida (CH2), desenvolvido pela
Digene (Qiagen), foi amplamente utilizado em estudos
anteriores, tendo sido o primeiro ensaio aprovado
pela FDA. O CH2 um ensaio semiquantitativo com
excelentes comparaes interlaboratoriais e alto VPN
para leses NIC2/3 (42). Alm disso, foi desenvolvida
uma verso de baixo custo para realizao em locais
com poucos recursos, necessitando apenas um
mnimo de equipamentos e treinamento, e de execuo
semelhante de um teste rpido (43).
Embora o teste careHPV tenha sido, por longo tempo,
utilizado apenas em pesquisa, atualmente ele est
disponvel para uso clnico. Sua sensibilidade para
NIC2+ em uma ampla triagem na China foi de 90%,
no sendo significativamente diferente do CH2, com o
qual foi comparado. Dessa forma, o teste considerado
promissor como um mtodo de triagem primria para a
preveno de cncer cervical em regies com recursos
limitados (43). Os resultados no diferenciam os tipos de
HR presentes, mas so indicativos da presena de um ou
mais tipos includos no ensaio.

HSIL persistente HSIL regressivo

Progresso do HSIL

Regresso
% de ncleos positivos para p53 na

Persistncia
metade profunda do epitlio

% de ncleos positivos para protenas

do retinoblastoma na metade profunda
do epitlio

Figura 14.6
Vrios marcadores de fatores de risco viral e do hospedeiro com HSIL. Centro: Grfico de disperso da
deteco da protena do retinoblastoma (pRb) e p53 na metade inferior do epitlio de leses HSIL que
persistem (tringulos vermelhos) ou regridem (crculos azuis abertos) durante o acompanhamento. Esquerda:
HSIL persistente. Direita: HSIL com regresso (41).
Fonte: reproduzido com permisso da American Journal of Surgical Pathology.

166 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Tabela 14.2: Testes de HPV aprovados pela FDA
Testes Fabricante Mtodo Tipos (alvo)
Captura hbrida (CH2) Quiagen (Valencia, CA, EUA) Amplificao de sinal HR 13 (DNA genmico)
Amplificao de sonda (Inva-
Cervista HPV HR Hologic (Bedford, MA, EUA) HR 14 (DNA proprietrio)
der Technology)
Cervista HPV 16/18 HPV16/18
Amplificao do alvo (ampli-
APTIMA HPV GenProbe (So Diego, CA, EUA) ficao mediada por trans- HR 14 (RNA de E6/E7)
crio)
Cobas HPV Roche (Pleasanton, CA, EUA) Amplificao do alvo (PCR) HR 14 (DNA de L1)
FDA: Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados Unidos da Amrica; HPV: papilomavrus humano; HR: tipos de alto risco; PCR: reao em
cadeia da polimerase.

Recentemente, em uma avaliao de vrios ensaios principalmente aqueles arquivados, prefervel o uso
de reao em cadeia da polimerase (PCR, do ingls dos ensaios que detectam amplicons pequenos, tais
polymerase chain reaction) para a triagem primria e como os iniciadores SPF, uma vez que o DNA dever
deteco precoce de leses de alto grau, a sensibilidade estar degradado.
dos ensaios de amplificao do alvo para o diagnstico
Para os passos seguintes em cada um desses
de NIC2+ foi registrada como alta, de aproximadamente
ensaios, o leitor deve se reportar ao manual de HPV da
96% (34, 44). Por exemplo, o teste para HPV COBAS
Organizao Mundial da Sade (OMS), o qual detalha
4800, aprovado recentemente pela FDA, que utiliza uma
cada etapa, incluindo a descrio dos iniciadores,
preparao automatizada de amostra combinada com a
controles apropriados, preveno de contaminao,
tecnologia de PCR em tempo real para detectar o HPV
interpretao de dados, etc. (48).
HR 14 em um nico tubo, foi comparado favoravelmente
CH2, com sensibilidade e especificidade clnicas no
Ensaios de mRNA de HPV
inferiores s desta (44). De forma similar, nos resultados
finais, recentemente publicados, da triagem POpulation- Alm dos ensaios de DNA, outros testes detectam a
Based SCreening study Amsterdam (POBASCAM) uma expresso do mRNA dos oncogenes E6/E7 (49, 50).
triagem controlada, randomizada, de base populacional Os princpios desses ensaios moleculares esto descritos
um ensaio de PCR para L1 (GP5+/6+) levou a uma nos seguintes tpicos (51):
deteco mais precoce de NIC2 clinicamente relevantes
ou piores, corroborando o uso do teste de DNA em Pr-anlise
todas as mulheres de 29 anos de idade ou mais (34).
So essenciais a utilizao dos espcimes adequados
Os ensaios baseados em PCR que apresentam a regio
e o manuseio apropriado de amostras clnicas para
L1 como alvo so conhecidos como ensaios de PCR
a obteno de resultados precisos. Para a deteco
consensos para L1. Os diferentes ensaios utilizam
de HPV, as amostras adequadas incluem aquelas
iniciadores distintos: o MY09/MY11, substitudo
coletadas por hastes, raspagem e bipsia de tecidos.
posteriormente pelos iniciadores PGMY09/11, resulta
O manuseio apropriado das hastes inclui o transporte
em um amplicon de 450pb (45). Outros conjuntos de
seco ou em um meio de transporte para vrus, enquanto
iniciadores descritos incluem o GP5+/6+, produzindo um
que as raspagens e bipsias so coletadas em meio
amplicon de, aproximadamente, 160pb (46), enquanto
de transporte viral. O transporte deve ser realizado
o SPF10 produz um amplicon pequeno, de 65pb (47 ).
em temperatura ambiente em 24 horas ou em at
O sistema PGMY09/11 est disponvel comercialmente
quatro dias a 4C. Os ensaios com a aprovao da FDA
como o teste Linear Array HPV Genotyping Test (Qiagen)
especificam os mtodos de coleta e armazenamento, e
ou o Multiplex HPV Genotyping Kit (Multimetrix,
os resultados no devem ser considerados vlidos caso
Heidelberg). Para os tecidos embebidos em parafina,
haja irregularidades na coleta e armazenamento.

Infeces pelo papilomavrus humano (HPV) 167

 Anlise ensaios atualmente disponveis comercialmente que
Aps a coleta do espcime, deve-se proceder extrao apresentam o DNA ou mRNA como alvo. Os laboratrios
ou liberao do cido nucleico das amostras. Os que buscam providenciar dados para o monitoramento
ensaios aprovados pela FDA especificam os mtodos da resposta vacinao devem ser incentivados a seguir
de processamento ou extrao para cada ensaio. Os as diretrizes que constam no Manual de Laboratrio de
resultados no so considerados vlidos se houver HPV da OMS (ver adiante a seo 14.8 sobre a LabNet
modificaes na realizao do processamento ou de HPV).
extrao. O uso de ensaios comerciais no isenta os
Tabela 14.3 Vrios ensaios para HPV disponveis
laboratrios da necessidade de manter mtodos de
atualmente, com nome, alvo e iniciado
garantia de qualidade (GQ) e controle de qualidade (CQ)
Tipo de ensaio para HPV Regio do HPV alvo
vigentes. A incluso de cepas celulares como controles
(iniciador)
negativos e positivos pode ser til para o monitoramento
Todos os ensaios L1/E1/E6/E7
dos resultados. O processamento de gua em todos
Linear Array (Roche) L1 (PGMY)
os passos do ensaio particularmente crucial para o
monitoramento de resultados falso-positivos, que podem PGMY-RBH L1 (PGMY)
ocorrer por meio da contaminao cruzada de amostras. InnoLiPA (Innogenetics) L1 (SPF10)
CLART (Genomica) L1 (PGMY)
Alguns ensaios incluem um alvo endgeno da clula DNA chip (Biocore) L1
hospedeira, tal como a -globulina, para monitorar a
Microarray (Genetel) L1
presena de DNA passvel de amplificao. Amostras
Ensaios DEIA LiPA L1 (SPF10)
negativas para o alvo endgeno e para o HPV no podem
Microarray (Papillocheck) E1
ser interpretadas. Os ensaios aprovados clinicamente
PCR tipo especfica (GenolD) L1
incluem as diretrizes para o monitoramento e relato
PCR in-house Luminex L1 (PGMY-GP)
de ensaios. Os ensaios desenvolvidos em laboratrios,
in-house, otimamente verificados, podem tambm ser PCR Luminex (Multimetrix) L1 (GP)
utilizados no diagnstico de rotina. Sempre que um ensaio PCR EIA (GenoID) L1
comercialmente aprovado estiver disponvel, as autoridades RealTime para HPV de alto L1
de credenciamento devem recomendar sua utilizao. risco da Abbott
Uma das vantagens desse procedimento que os ensaios Teste para HPV Amplicor L1
comerciais normalmente incluem reagentes com qualidade APTIMA Gen-Probe (TMA) E6/E7
controlada, assim como controles apropriados. NucliSENS EasyQ HPV E6/E7

Garantia da qualidade laboratorial 14.8 Desenvolvimento de uma rede de

Devem ser seguidas as boas prticas microbiolgicas,
incluindo os controles positivo e negativo apropriados.
A participao em painis de proficincia e programas
de GC essencial para determinar o desempenho do
ensaio, devendo-se envidar o mximo esforo para a
realizao de tais programas para cada analito.
Epidemiologia/teste em pesquisa
Vrios ensaios comerciais e in-house so usados
na epidemiologia e pesquisa. Eles variam quanto s
caractersticas de desempenho, como ressaltado por
estudos de proficincia global para a determinao do
tipo de HPV (52). A Tabela 14.3 mostra exemplos de
laboratrios de HPV da OMS, LabNet
Um grupo de especialistas conveniados OMS se
encontrou em Genebra em 2005 e recomendou o
estabelecimento de uma rede global de laboratrios de
HPV, a LabNet, visando contribuir com a melhoria da
qualidade dos servios laboratoriais para a vigilncia
eficiente e com o monitoramento do impacto da
vacinao para HPV, alm de realizar treinamentos
(53-55). Previu-se que a LabNet de HPV aceleraria
a introduo das vacinas para HPV, pelo auxlio
implementao de procedimentos laboratoriais validados
e padres, pelo desenvolvimento de um sistema de
GQ e de teste de proficincia, pelo treinamento de

168 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
funcionrios e pela disponibilizao de uma rede de
vigilncia. A LabNet de HPV da OMS foi criada mediante
um financiamento da Fundao Gates e permaneceu em
operao sob a gide da OMS de 2006 a 2010. Durante
esses quatro anos de operao, a LabNet priorizou as
atividades centrais de desenvolvimento dos padres
internacionais para os ensaios de DNA e sorologia para
HPV, padronizao dos ensaios e desenvolvimento de
um manual laboratorial e um programa de treinamento
enfatizando a GQ e o CQ. A LabNet auxiliou o Instituto
Nacional de Padres e Controle Biolgicos (NIBSC, do
ingls National Institute for Biological Standards and
Control) a desenvolver os padres internacionais do DNA
dos tipos 16 e 18 do HPV e anticorpos do tipo 16, os
quais esto disponveis no catlogo do NIBSC. O Manual
de Laboratrio de HPV da OMS foi publicado em 2009
com base no conhecimento e experincia adquiridos
por meio dos estudos de colaborao internacional,
e est disponvel por meio da OMS (55). O manual
visa auxiliar o estabelecimento do apoio laboratorial
necessrio implementao e monitoramento dos
programas de vacinao para HPV, e tem por foco os
ensaios epidemiolgicos, no os clnicos. Os laboratrios
membros da LabNet de HPV continuam a trabalhar em
conjunto no sentido de manter uma rede de especialistas
em testagem otimizada para HPV, e se renem
anualmente durante a Conferncia Internacional de
Papilomavrus.
Marcadores de progresso
Nem todas as mulheres com infeco persistente por
HPV HR, ou com NIC 3, progridem para cncer cervical,
caso no sejam tratadas. Dessa forma, esto sendo
investigados outros marcadores para atuar como
preditores de progresso, tais como o p16. Esses
marcadores de progresso, juntamente com a deteco
de HPV HR, prometem oferecer um diagnstico mais
preciso de displasias de alto grau (40, 41).
14.9 Concluses
Uma enorme quantidade de informaes sobre HPV e
doenas relacionadas tem sido disponibilizada, incluindo
muitas tecnologias novas para a deteco do HPV.
importante que se utilizem testes apropriados, seja para
aplicaes clnicas ou para propsitos epidemiolgicos.
Alm disso, para garantir uma melhor qualidade dos
resultados, os laboratrios que realizam esses ensaios
devem aderir s prticas de GQ e CQ.
Infeces pelo papilomavrus humano (HPV) 169
 Pontos principais:
Os HPV oncognicos so causas necessrias da maioria dos cnceres cervicais e de uma alta proporo de
outros cnceres anogenitais, incluindo alguns da orofaringe. Os HPV genitais so extremamente comuns;
aproximadamente 80% das pessoas sexualmente ativa so infectadas em algum momento de suas vidas.

A infeco persistente por HPV oncognico um pr-requisito para o desenvolvimento de leses precursoras e
neoplasia subsequente.

O cncer um desfecho raro dessa infeco genital, embora esta seja muito comum.

Os tipos 16 e 18 do HPV causam regularmente 70% dos cnceres cervicais em todo mundo.

A leso precursora para o cncer cervical a neoplasia intraepitelial cervical de grau 3 (NIC 3); os tipos 16 e
18 causam 50% desses casos.

A deteco do HPV baseia-se em tecnologia molecular, uma vez que o vrus no pode ser prontamente
cultivado pelos mtodos de diagnstico virais tradicionais, e a sorologia no sensvel. A triagem primria
de HPV est sendo incorporada triagem de cncer cervical em vrias combinaes com a citologia cervical
tradicional (teste de esfregao Pap).

Os ensaios utilizados clinicamente para a triagem de NIC3 ou cncer so diferentes daqueles utilizados em
estudos epidemiolgicos, tais como a vigilncia antes e aps a implementao de programas de vacinao.
Atualmente, no h indicaes clnicas para a testagem de HPV LR. Testes clnicos exigem uma padronizao
cuidadosa para a coleta, processamento e teste de amostras, com correlao aos desfechos clnicos (e no
analticos).

importante haver alta GC e CQ para a deteco de HPV. A LabNet de HPV da OMS, em colaborao com a
NIBSC, desenvolveu padres internacionais para o DNA de ambos os HPV 16 e 18 e de anticorpos para o HPV
16.

Para os ensaios de deteco de HPV, o cuidado na coleta de amostras clnicas e no transporte para o
laboratrio, assim como para o subsequente manuseio, imprescindvel para a preveno de contaminao e
ensaios falso-positivos.

A deteco de DNA do HPV um excelente preditor negativo (se o HPV HR no for detectado, improvvel
que a doena se manifeste), mas h muitos resultados falso-positivos na predio de doenas. Uma pesquisa
em andamento est investigando a utilidade de certos marcadores de progresso a fim de melhorar a
especificidade para desfechos clnicos importantes.

Com programas de sade adequados para a vacinao contra o HPV, o valor preditivo positivo da citologia
para detectar displasias em alto grau ir diminuir e, no futuro, ser provvel a utilizao de vrios mtodos
moleculares para a deteco do HPV.

170 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
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Infeces pelo papilomavrus humano (HPV) 173
Captulo 15
Infeces pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV)
15.1 Introduo
Os primeiros casos da sndrome da imunodeficincia
adquirida (AIDS, do ingls acquired immunodeficiency
syndrome) foram descritos em 1981 e o vrus causador
da doena, o HIV, foi isolado pela primeira vez em 1983.
Desde ento, o vrus se espalhou pelo mundo, com uma
estimativa de 34 milhes de pessoas vivendo com HIV e
2,7 milhes de novas infeces s em 2010 (1). A frica para a gerao de resposta imune do hospedeiro contra
subsaariana foi a regio mais impactada, com 23,1
milhes de pessoas vivendo com HIV e uma estimativa de
1,9 milhes de novas infeces em 2010. A prevalncia
do HIV alcanou >30% entre adultos em alguns pases.
Apesar do desenvolvimento da terapia antirretroviral e da
expanso da cobertura do tratamento para muitos pases
com recursos limitados, estima-se que para cada pessoa
que inicia o tratamento haja 2-3 novas infeces por
HIV-1. Dessa forma, na ausncia de uma vacina efetiva, o
diagnstico de HIV acessvel, com aconselhamento para
preveno, e o encaminhamento de pessoas infectadas
por HIV para receber cuidados apropriados so estratgias
importantes para desacelerar a propagao da epidemia.
O HIV transmitido principalmente por meio de trocas de
fluidos corporais, que podem ocorrer por via sexual e por
sangue ou produtos sanguneos contaminados. Gestantes
infectadas por HIV tambm podem transmitir o vrus para
a criana durante a gravidez, parto (transmisso perinatal)
ou por meio da amamentao (transmisso ps-natal). A
transmisso do HIV tambm reportada em seguida ao
transplante de rgos, quando se descobre posteriormente
que o doador era HIV positivo. Atualmente, para garantir
a segurana, o sangue, os produtos sanguneos e os
doadores de rgos so testados rotineiramente para a
presena de HIV ou anticorpos para HIV, a fim de eliminar a
possibilidade de transmisso do vrus.
O HIV pertence famlia Retroviridae, subfamlia dos
lentivirus, da qual fazem parte vrus similares tais
como o vrus Maedi-Visna, o vrus da artrite encefalite
caprina, o vrus da anemia infecciosa equina e o vrus
da imunodeficincia em smios. O vrion apresenta,
aproximadamente, 100nm em dimetro, com um capsdeo
cnico que contm duas cpias de RNA genmico (Figura
15.1). A protena do capsdeo, p24, o principal componente
do vrus, sendo coberta por um envelope lipdico contendo
duas glicoprotenas, gp41 e gp120. Essas glicoprotenas de
superfcie so importantes para a ligao s clulas T-CD4,
o primeiro passo para o processo de infeco, assim como
o vrus. O HIV altamente divergente e existem vrios
subtipos ou clados diferentes no mundo. Subtipos distintos
so mais prevalentes nas diferentes regies do planeta.
Alm disso, existem dois tipos principais de HIV, o HIV-1 e
o HIV-2. O HIV-1 subdividido em trs grupos: M (subtipos
A-K), N e O. O HIV-1 o vrus mais comum, dominando a
epidemia, com diversos subtipos e vrus recombinantes.
O HIV-2 ocorre principalmente no Oeste da frica, com
registro de casos isolados em vrios pases no mundo.
Existem algumas diferenas entre os subtipos do HIV-1,
mas, para fins de diagnstico, eles apresentam uma forte
reao cruzada. Assim, os antgenos/protenas derivados
de um nico subtipo so adequados para o diagnstico da
infeco, independentemente dos subtipos prevalentes. Em
virtude da reao cruzada entre HIV-1 e HIV-2, antgenos
especficos adicionais so necessrios para diagnosticar de
forma precisa a infeco por HIV-2.
15.2 Testes de diagnstico
15.2.1 Diagnstico sorolgico da infeco por HIV
O diagnstico sorolgico da infeco por HIV
obtido, rotineiramente, por meio da deteco de
anticorpos para HIV no sangue ou em outros fluidos
corporais. Os anticorpos so induzidos, em mdia, em,
aproximadamente, 4-6 semanas aps a infeco, embora,
em alguns casos, o desenvolvimento de anticorpos
detectveis pode levar at 3-6 meses aps a infeco.
Dessa forma, a infeco por HIV no pode ser excluda
com base em um teste negativo realizado 4-6 semanas
aps a exposio documentada. Durante o perodo inicial
da replicao viral, os anticorpos esto ausentes e o
diagnstico do HIV pode no ser feito de forma precisa,
Infeces pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV) 175
 utilizando testes que se baseiam apenas em anticorpos.
O perodo de janela agudo pode ser reduzido por meio do
uso de mtodos que detectam diretamente um ou mais
componentes (antgeno p24 ou RNA) do HIV. A replicao
viral no corpo induz tanto a resposta imune humoral como a
mediada por clulas, que reduz o nvel de vrus a um ponto
definido. A presena de vrus detectveis na maioria dos
indivduos no tratados continua a estimular a resposta de
clulas B e o nvel de anticorpos permanece alto ao longo
do perodo subsequente, a menos que o paciente esteja
altamente imunocomprometido, como nos estgios tardios
da doena. Assim, a deteco de anticorpos especficos
para HIV um marcador bastante confivel para o
diagnstico da infeco pelo vrus (Figura 15.2).
Existem trs usos principais para o teste de HIV: garantir
a segurana de sangue, de produtos sanguneos ou de
rgos transplantados; realizar vigilncia; e efetuar o
diagnstico de indivduos/pacientes. O exame realizado
para a segurana de sangue, normalmente, usa os
a infeco aguda por HIV antes do desenvolvimento de
anticorpos e, atualmente, so utilizados rotineiramente
para a triagem de sangue e produtos sanguneos em
muitos pases. Embora os ensaios moleculares possam
detectar o cido nucleico viral alguns dias antes que o
antgeno p24 possa ser detectado pelos EIA de quarta
gerao, o custo e a complexidade da deteco de cido
nucleico pode exceder os benefcios, exceto em bancos de
sangue sofisticados.
Embora os EIA sejam ensaios qualitativos, uma reviso
aprofundada dos valores de densidade ptica pode ser de
utilidade. Os ensaios com taxa de sinais/cut-off alta tm
mais probabilidade de resultado positivo para o HIV do que
aqueles com taxa de sinais/cut-off baixa.
gp120
Glicoprotena
de ancoragem
Membrana
gp41
lipdica
Glicoprotena
transmembrana Capsdeo
Matriz

procedimentos de teste mais sensveis e sofisticados para

detectar tanto o anticorpo para HIV quanto o antgeno ou o
RNA do HIV-1, a fim de reduzir o perodo de janela.
Transcriptase
reversa
15.2.1.1 Imunoensaios enzimticos (EIA)
Logo aps a descoberta do HIV, os EIA foram
Figura 15.1
desenvolvidos para o diagnstico da infeco por HIV.
Estrutura e organizao da partcula viral do HIV
Esses EIA detectavam anticorpos especficos para HIV,
um indicador de infeco por HIV, e utilizavam lisados
virais como antgenos. Os ensaios de primeira gerao
foram, mais tarde, substitudos pelos de segunda gerao, Anticorpo
para HIV
que empregam antgenos mais especficos na forma
de peptdeos sintticos ou protenas recombinantes.
Esses ensaios eram mais sensveis e especficos para
1 gerao
detectar anticorpos para HIV. Entretanto, eles ainda 3 gerao 2 gerao
4 gerao
no identificavam respostas precoces de anticorpos na
forma de IgM (imunoglobulina M), devido ao seu formato Infeco Infeco Dias desde a infeco
e desenho. A terceira gerao de EIA utiliza um formato indetectvel Aguda

sanduche, que inclui antgenos marcados com enzima

e so capazes de detectar respostas de IgM precoce,
reduzindo, assim, o perodo de janela. Nos ltimos anos,
novos EIA de quarta gerao foram desenvolvidos para
reduzir ainda mais o perodo de janela, por meio da
combinao da deteco do antgeno viral (p24), alm dos
anticorpos para HIV (Figura 15.2). Os EIA de combinao
antgeno-anticorpo so muito sensveis para detectar
Figura 15.2
Dinmica precoce da replicao viral e
desenvolvimento de anticorpos com marcadores da
infeco por HIV. Mostra-se o tempo aproximado
da deteco dos anticorpos pelos imunoensaios
enzimticos de primeira, segunda, terceira e quarta
geraes.

176 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Dessa forma, o valor preditivo positivo (VPP) de um
ou dois resultados de EIA reativos ser muito maior
se os resultados forem interpretados no contexto do
sinal. Os ensaios com sinal baixo, mesmo com dois
EIA reativos, devem ser testados em seguida com um
teste mais especfico ou por meio de uma amostra de
acompanhamento para a confirmao da infeco.
15.2.1.2 Testes rpidos
Nos ltimos anos, houve uma migrao progressiva
do diagnstico do HIV dos laboratrios para locais no
laboratoriais, como um resultado da disponibilidade
de vrios testes rpidos para HIV. No mundo, mais
de 100 milhes de pessoas foram testadas com
testes rpidos para HIV, apenas em 2011. Os testes
rpidos para HIV apresentam, principalmente, dois
formatos diferentes, os quais incluem dispositivos
para imunoconcentrao e cassetes ou tiras de fluido
lateral (Figura 15.3). Uma vez que os testes rpidos
foram desenvolvidos para detectar anticorpos para HIV
em poucos minutos (1-15 min), quando comparados
aos EIA, que podem levar 2-4 horas, os dispositivos
so otimizados para acelerar a interao antgeno-
anticorpo. Isso requer o uso de altas concentraes de
antgeno e a deteco de complexos antgeno-anticorpo
com reagentes coloridos sensveis, tais como o ouro
coloidal. Os testes rpidos so ideais para fornecer
resultados no mesmo dia em diversas situaes, tais
como a realizao de testes em populaes de difcil Uma avaliao de campo recente desses testes rpidos
acesso, testagem e aconselhamento em domiclio,
testagem por iniciativa do servio, teste em gestantes
e realizao de testagem mvel. Os testes rpidos
para HIV so, frequentemente, utilizados em locais
com baixa demanda de espcimes, para oferecer uma
alternativa de bom custo-efetividade. Eles podem ser
realizados utilizando soro, plasma ou sangue total, com
a vantagem do uso de amostras coletadas por meio
da puno digital. Os testes rpidos so de realizao para assegurar a preciso dos testes rpidos.
simples e podem ser utilizados em ambientes externos
ao laboratrio por trabalhadores ou consultores leigos
treinados, expandindo assim o acesso testagem
para HIV. A Organizao Mundial da Sade (OMS) e
os Centros de Controle e Preveno de Doenas dos
Estados Unidos da Amrica (CDC, do ingls United
States of America Centers for Disease Control and
Prevention) desenvolveram um amplo mdulo de
treinamento que aborda vrios assuntos, incluindo a
qualidade, preciso e segurana (2). Com a ampliao
da oferta de cuidado e tratamento, observa-se um
aumento nos esforos para fornecer aconselhamento
e testagem a milhes de pessoas no mundo, como um
componente importante de preveno.
Devido alta demanda e a um mercado ampliado,
existem mais de 50 tipos kits de testes disponveis em
todo o mundo, nem todos, porm, com caractersticas
de desempenho desejadas. importante garantir que
os testes rpidos sejam fabricados com o maior nvel
de qualidade possvel, de acordo com as boas prticas
de fabricao, e que apresentem caractersticas de
desempenho equivalentes aos mtodos de diagnstico. A
OMS e os CDC possuem programas de qualificao para
avaliar a qualidade dos novos kits de teste rpido (3, 4).
Recentemente, foram desenvolvidos os testes rpidos
de quarta gerao, capazes de diagnosticar a infeco
aguda por HIV mediante a deteco do antgeno p24,
alm dos anticorpos para HIV. A deteco do antgeno
p24 pode reduzir o perodo de janela para poucos dias
e identificar pessoas que se encontram na fase aguda
da infeco. Entretanto, uma vez que a deteco da
infeco aguda um evento raro mesmo em locais com
alta prevalncia/incidncia, um teste de antgeno positivo
deve ser acompanhado pela realizao de exame em
quatro semanas ou mais para garantir a soroconverso.
demonstrou que a sensibilidade e especificidade da
deteco do Ag ainda no aceitvel (5). Alm disso, uma
vez que essa tecnologia nova e as infeces agudas
so raras, seria importante a realizao de avaliaes de
campo adicionais que incluam a confirmao de todas
as potenciais infeces agudas por meio de teste de
cido nucleico. Assim como em qualquer outro teste, as
medidas da garantia de qualidade (GQ) so essenciais
Infeces pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV) 177

negativo
positivo
negativo positivo
(A) (B)
Figura 15.3
Exemplos de teste rpido para HIV, mostrando (A)
dispositivo de imunoconcentrao por fluxo e (B)
dispositivo de fluxo lateral. So mostrados testes
rpidos com resultados positivo e negativo.
Foram desenvolvidos vrios testes rpidos que utilizam
espcimes de fluido oral (FO) coletados por meio de
uma haste. O FO contm 1/500-1/1.000 vezes menos
IgG que os espcimes sanguneos, mas o suficiente
para diagnosticar a infeco por HIV. A maioria dos
anticorpos no FO transferida passivamente a partir
do sangue e no produzida localmente, e contm um
complemento total de IgG do soro, embora com uma
concentrao mais baixa. Os testes de FO podem
simplificar ainda mais o teste para HIV, tornando-os
mais acessveis, enquanto reduzem os riscos biolgicos
associados aos testes que utilizam amostras de
sangue. Atualmente, pelo menos trs kits de testes
rpidos orais esto disponveis comercialmente.
15.2.1.3 Ensaios confirmatrios
Embora os ensaios individuais listados acima sejam
muito sensveis e especficos, resultados falso-positivos
ou falso-negativos podem ocorrer. Os resultados falso-
positivos podem ter consequncias maiores em nvel
individual. Dessa forma, ensaios confirmatrios foram
desenvolvidos para corroborar os resultados positivos
iniciais. Esses ensaios confirmatrios, baseados em
diferentes formatos e princpios, incluem os ensaios de
imunofluorescncia (IFA, do ingls immunofluorescence
assay), western blot (WB) ou imunoensaios em linha
(LIA, do ingls line immunoassay). Os IFA envolvem
o uso de lminas com fixao de clulas infectadas
178 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
por HIV. Os anticorpos para HIV, se presentes, so
detectados por anticorpos secundrios marcados
com fluorescena e observados em microscpio de
fluorescncia. O IFA no mais usado rotineiramente
e foi substitudo por outros mtodos tais como o
WB ou LIA. Os WB e LIA envolvem o uso de tiras
de membrana com protenas especficas para HIV
ou protenas/peptdeos recombinante separados.
Essas tiras so analisadas por espcimes de soro.
Os anticorpos especficos para HIV so detectados
por anticorpos secundrios que so conjugados com
uma enzima, seguidos por um substrato que gera um
produto colorido. A Figura 15.4 mostra o padro tpico
de bandas no WB, indicando a presena de anticorpos
para protenas virais especficas e incluindo um
controle positivo que mostra todos os anticorpos
especficos para protenas virais passveis de
deteco com seu padro caracterstico (Linha P). Os
indivduos com infeces novas/recentes apresentam
anticorpos mais fracos e para menos protenas,
tipicamente a p24 e gp120/160. Conforme a infeco
progride, desenvolvem-se anticorpos para protenas
virais adicionais e estes se tornam mais fortes ao
longo do tempo, como observado nos indivduos
com infeces crnicas. Os LIA so similares ao
ensaio de WB, mas utilizam protenas ou peptdeos
recombinantes purificados, imunologicamente
importantes para o diagnstico. Os WB e LIA so
caros e requerem interpretao para estabelecer um
diagnstico baseado na combinao de anticorpos
para antgenos especficos (para p24 e uma ou mais
protenas do envelope) presentes no sangue. Esses
ensaios detectam somente IgG especfica para HIV.
Dessa forma, eles no podem ser utilizados para
confirmar a presena de IgM especfica para HIV ou
vrus, que so detectados por EIA mais sensveis de
terceira ou quarta gerao, respectivamente. Um
algoritmo de teste que envolve o uso de dois ou mais
EIA ou testes rpidos em um algoritmo seriado ou
paralelo pode fornecer resultados praticamente to
confiveis quanto os ensaios confirmatrios WB ou
LIA, mas a um custo bem menor.
 Recente Crnica
Figura 15.4
Ensaio de western blot confirmatrio e padro de
bandas de anticorpos que podem ser observados
durante infeces recentes (tiras 3-7) e infeces
crnicas (tiras 8-13). P, controle positivo; N, controle
negativo. Vrias protenas virais especficas so
mostradas prximas ao controle positivo.
15.2.2 Deteco do RNA, DNA ou p24 do HIV
O HIV tambm pode ser diagnosticado por meio da
deteco direta do vrus ou componentes virais (antgeno
p24, RNA ou DNA pr-viral). A deteco do vrus por
meio da cultura ou outros mtodos no realizada
rotineiramente, devido baixa sensibilidade quando
comparada aos mtodos imunolgicos e moleculares
padro e complexidade das tcnicas de cultura de
vrus. A deteco do antgeno p24 ou do RNA ou DNA
do HIV desempenha um papel importante quando no
possvel realizar o diagnstico com base em anticorpos,
tais como em crianas expostas no momento perinatal
ou a deteco de infeco aguda em adultos antes
do desenvolvimento de anticorpos para HIV (6-10). A
deteco molecular de cidos nucleicos alvo mais
sensvel que a deteco de p24.
Dependendo do estgio da infeco, o HIV pode
ser encontrado principalmente como DNA pr-viral
em clulas infectadas ou como RNA no sangue
(como um componente de partculas virais livres e
RNA intracelular). Kits comerciais esto disponveis
para detectar o DNA e/ou RNA qualitativamente ou
quantitativamente. Para fins de diagnstico, os ensaios
qualitativos so suficientes e apresentam aplicaes
para a deteco precoce de infeces por HIV em
adultos e crianas. A deteco da infeco aguda por
testes de amplificao de cido nucleico (NAAT, do
ingls nucleic acid amplification tests) tem aplicao
para o aumento da segurana de sangue ou produtos
sanguneos doados e, possivelmente, para populaes
de alto risco. Muitos bancos de sangue em pases
desenvolvidos ou em desenvolvimento utilizam NAAT
rotineiramente como parte de seus algoritmos de
testagem. Os indivduos com infeco aguda apresentam
carga viral elevada e tm alto risco de transmitir
a infeco a seus parceiros. Assim, a deteco de
indivduos com infeco aguda foi promovida como
parte da estratgia de preveno do HIV. Entretanto,
a deteco de casos agudos na maioria dos lugares
de baixo rendimento e alto custo, considerando o curto
perodo de janela (aproximadamente duas semanas).
Outra aplicao importante para os testes moleculares
o diagnstico precoce da infeco por HIV em
crianas com exposio perinatal. Uma vez que todas
as crianas nascidas de mes soropositivas adquiriram
passivamente anticorpos para HIV, os ensaios de rotina
baseados em anticorpos no podem ser utilizados para
confirmar ou excluir a possibilidade de infeco por
HIV. Anticorpos residuais em crianas no infectadas
persistem e podem ser detectados at os 18 meses de
idade. Assim, a deteco da presena ou ausncia de
RNA ou DNA para HIV em crianas com seis meses ou
mais o meio definitivo para diagnosticar a infeco
por HIV em crianas. Para o diagnstico infantil precoce
(DIP) em locais com limitaes de recursos, o sangue
pingado em papis-filtro e seco (mancha de sangue
seco; DBS, do ingls dried blood spot) como um modo
de facilitar a coleta, processamento, transporte e
armazenamento de espcimes de sangue. Com o
foco principal na preveno da transmisso vertical,
os ensaios moleculares para o diagnstico infantil
precoce foram implementados em um grande nmero
de laboratrios. Existem vrios ensaios comerciais
utilizados para o diagnstico de HIV em crianas.
Esses ensaios incluem a extrao manual de cidos
nucleicos ou as mais recentes plataformas moleculares
que oferecem a automao para a extrao de cidos
nucleicos e a deteco qualitativa do RNA e DNA do
Infeces pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV) 179
 HIV-1. A extrao manual de cidos nucleicos requer um
nmero significativo de passos, havendo um potencial de
ocorrncia de erro humano ou contaminao na reao
em cadeia da polimerase (PCR, do ingls polymerase
chain reaction). Com a necessidade de alcanar
maior qualidade, as plataformas foram desenhadas
para minimizar a interveno do usurio e melhorar o
processamento de amostras. A deteco qualitativa
da infeco pelo HIV-1 em crianas foi apontada como
sensvel o suficiente para detectar 500 cpias de DNA/
mL, dependendo da fonte do espcime (plasma, sangue
total ou DBS). O agrupamento de espcimes, o qual
frequentemente realizado para detectar infeces
agudas em adultos, a fim de aumentar a eficincia
e reduzir os custos, no recomendado para DIP.
Infelizmente, os ensaios quantitativos para HIV no
so licenciados em muitos pases para o diagnstico,
mas apenas para o monitoramento da infeco por
HIV. Entretanto, o uso de um ensaio quantitativo de
RNA de HIV em espcimes de plasma antes do incio
do tratamento antirretroviral (ARV) o segundo teste
confirmatrio preferido.
Enquanto a realizao de testes sorolgicos rpidos
de qualidade para HIV se tornaram rotina em locais
perifricos, os testes point-of-care (POC) de PCR,
utilizando DNA, para os quais necessrio apenas
uma infraestrutura laboratorial mnima, est evoluindo
lentamente. Novas modalidades de testes POC, que
podem ser realizadas em locais com recursos limitados,
baseiam-se na amplificao isotrmica, com a deteco
rpida de sequncias-alvo. Alguns ensaios POC utilizam
instrumentos portteis pequenos e, geralmente, realizam
a extrao e amplificao do cido nucleico, amplificao
do sinal e deteco. Um estudo de campo desses testes
ser fundamental para validar a sua solidez e habilidade
de fornecer resultados acurados.
15.2.3 Algoritmos para testagem
Para o diagnstico de HIV, dois ou mais testes so
combinados em um algoritmo para aumentar o VPP
de um teste inicialmente positivo. Na maioria das
situaes, o algoritmo normalmente mais utilizado inclui
o uso de testes em srie ou sequenciais (algoritmo em
srie). Embora um resultado negativo seja geralmente
comunicado ao paciente com base em um nico teste,
180 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
um resultado positivo confirmado em seguida por um
segundo teste diferente. Baseando-se na especificidade
dos testes, e se a prevalncia do HIV for relativamente
alta (>5%) na populao, dois resultados positivos
so utilizados para diagnosticar a infeco. Em uma
populao de baixa prevalncia, um terceiro teste
recomendado antes que um diagnstico positivo para
HIV seja confirmado. O algoritmo em srie lgico e
custo-efetivo e inclui um teste mais sensvel como o
primeiro teste, seguido por um teste mais especfico,
para eliminar resultados falso-positivos. No entanto,
em algumas situaes, so utilizados algoritmos
paralelos, que incluem o uso simultneo de dois testes,
registrando-se o resultado como negativo ou positivo de
acordo com a concordncia dos resultados. No caso de
resultados discrepantes, ou um terceiro teste realizado
ou o paciente testado posteriormente para confirmar
ou excluir a ocorrncia de soroconverso recente. Os
algoritmos em paralelo podem ser mais custo-efetivos
em uma situao de alta prevalncia, grande volume de
pacientes ou na testagem de gestantes em trabalho de
parto. importante selecionar a combinao correta de
testes para assegurar um diagnstico preciso (11).
15.2.4 Espcimes em mancha de sangue seco
(DBS)
Embora a maioria dos ensaios de diagnstico seja
desenvolvida para utilizar sangue processado (espcimes
de soro ou plasma), a coleta de espcimes necessita
de um flebotomista experiente e equipamentos. Alm
disso, o transporte de espcimes lquidos depende de
refrigerao, a qual relativamente onerosa. O DBS
oferece uma alternativa simples e fcil de amostra para a
sorologia e teste molecular para HIV. Os EIA e WB foram
otimizados para trabalhar com espcimes DBS (12). Os
espcimes DBS podem ser coletados, armazenados e
transportados em temperatura ambiente. Normalmente,
realiza-se uma puno de 6mm para diluir os anticorpos
a fim de realizar o teste. Dependendo do ensaio utilizado,
geralmente, necessrio realizar algumas otimizaes
no ensaio para garantir a sensibilidade e especificidade
ideais (13). Com o sistema de ensaios otimizado, o DBS
o espcime ideal para a vigilncia do HIV.
Como descrito anteriormente, o DBS um espcime
conveniente, utilizado rotineiramente para o DIP em
muitos pases. Recentemente, os ensaios foram
otimizados e validados para o monitoramento de carga
viral com espcimes DBS. Aps o tratamento eficiente,
a carga viral plasmtica diminui rapidamente para nveis
abaixo do detectvel, em poucas semanas. Entretanto,
o RNA e o DNA intracelular persistiro e podero ser
detectados em espcimes DBS. Assim, o uso de DBS
para o monitoramento longitudinal de pacientes em
tratamento requer cautela.
15.3 Monitoramento laboratorial clnico da
infeco por HIV
15.3.1 Funo do teste de CD4 no monitoramento
clnico do HIV
A infeco por HIV leva ao desenvolvimento de AIDS,
a qual se caracteriza pela perda de clulas T-CD4,
necessrias ao funcionamento adequado do sistema
imune do indivduo. O teste de CD4 utilizado no
monitoramento clnico de pessoas infectadas por HIV
para determinar, adequadamente, quando iniciar a terapia
antirretroviral (TARV), para monitorar a eficincia do
tratamento com medicamentos antirretrovirais (ARV)
e para determinar quando se deve fornecer profilaxia
para infeces oportunistas. A OMS recomenda a TARV
para adultos e adolescentes infectados por HIV com a
contagem de CD4 <350 clulas/L, independentemente
dos sintomas clnicos (14). Em regies com recursos
limitados, a taxa para o incio da terapia difere de pas
para pas, mas normalmente, varia de 200 para 350
clulas/L. A contagem de CD4 tambm utilizada,
normalmente, como uma ferramenta para monitorar a
progresso da doena e a efetividade da TARV. Quando
um paciente no responde ao tratamento, os dados
de CD4 so utilizados para determinar a mudana
Anti-CD4 Anti-CD3
com com
marcao em marcao em
ouro vermelho
Figura 15.5
Clulas sanguneas brancas com anticorpos anti-CD4 e anti-CD3 marcados.
da terapia de primeira linha para a de segunda linha,
principalmente em pases nos quais o teste de carga
viral no est disponvel. A deciso de quando comear
a TARV crtica em pases com menos recursos, em um
contexto de maiores taxas de mortalidade e incidncia
de infeces oportunistas (15, 16). Quando a contagem
de CD4 diminui, os indivduos HIV-positivos apresentam
maior probabilidade de se infectarem por patgenos
oportunistas. A TARV utilizada quando a contagem
de clulas CD4 atinge um certo limiar para evitar o
desenvolvimento dessas infeces. A contagem de CD4
normal em crianas menores de cinco anos de idade
maior que em adultos e declina ao longo do tempo.
Isso torna difcil o acesso elegibilidade para TARV em
crianas com base na contagem absoluta de CD4. As
porcentagens de CD4 tm sido utilizadas para determinar
quando iniciar a TARV em crianas infectadas por HIV.
15.3.1.1 Princpios do ensaio de CD4
Em geral, a contagem de CD4 se refere determinao
do nmero de clulas T-CD4, tambm chamadas de
linfcitos CD4 ou clulas T auxiliares. Os ensaios de CD4
so utilizados para determinar a concentrao absoluta
de clulas CD4 no sangue total e/ou a porcentagem de
clulas CD4 na populao de linfcitos. A contagem de
CD4 normal situa-se entre 400-1.600 clulas/dL e a
porcentagem normal de CD4, entre 35-55% (17 ).
Os mtodos-padro para a contagem de CD4 utilizam
anticorpos monoclonais marcados para identificar as
molculas de superfcie de clulas sanguneas, tais
como CD4, CD3, CD8 e CD45. As principais clulas
brancas com anticorpos anti-CD4 e CD3 marcados esto
representadas na Figura 15.5.
Moncito Clula B
Infeces pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV) 181
 As clulas sanguneas que expressam as molculas de clulas sanguneas brancas ou linfcitos. Atualmente,
superfcie de interesse so identificadas por citmetros os mtodos de plataforma simples so os preferidos,
de fluxo, os quais detectam a marcao especfica de tendo-se mostrado que estes melhoram a preciso
cada anticorpo monoclonal. Os citmetros de fluxo dos ensaios de CD4 (15). O mtodo de plataforma
tambm diferenciam as clulas sanguneas por meio simples determina a contagem de CD4 em citmetros
da propriedade de difuso da luz pelas clulas. Como de fluxo a partir de amostras de sangue total, com o
um exemplo de teste de CD4, a Figura 15.6 mostra volume determinado precisamente. Os mtodos de
uma anlise citomtrica de fluxo com grficos de plataforma simples baseiam-se tanto em um princpio
disperso de dois parmetros. O primeiro grfico de volumtrico pela contagem de clulas CD4 em uma
disperso identifica a populao de clulas brancas unidade de volume das amostras processadas quanto na
por meio da propriedade de disperso da luz e das comparao da contagem de um nmero conhecido de
molculas de superfcie CD45. O quadro representado microesferas adicionadas amostra processada com a
por R1 identifica a populao de linfcitos, e o R2, a contagem de clulas CD4.
populao de moncitos. O segundo grfico de disperso
A estratgia recomendada para a marcao da rea a ser
verifica apenas as clulas dentro das caixas R1 e R2
estudada para a contagem de CD4 identifica a populao
do primeiro grfico de disperso. As clulas CD4 so
de linfcitos por meio de marcadores CD45 e propriedades
o grupo de clulas na direita superior, verificando-se
de disperso lateral. Tambm existem vrios ensaios
tanto a expresso de CD4 quanto de CD3. As clulas T
de CD4 que utilizam estratgias de marcao de uma
CD8 esto logo abaixo do grupo de CD4, expressando
rea fixa e especfica a ser estudada, que so exclusivas
CD3, mas no CD4. As clulas B so o grupo no canto
desses ensaios. Exemplos destes ensaios incluem o
esquerdo inferior, no expressando CD4 ou CD3. Os
FACSCount CD4 e o Guava Auto CD4/CD4%.
moncitos so o grupo verde de clulas acima das
clulas B, com baixa expresso de CD4 e ausncia
15.3.1.3 Ensaios de CD4
de CD3. O citmetro de fluxo pode contar o nmero
de clulas em cada grupo para ajudar a determinar a A Tabela 15.1 mostra a variedade de tecnologias
contagem de CD4. comercialmente disponveis para o teste de CD4. A
tabela inclui os mtodos manuais para a contagem de
10 4

clulas CD4, que se baseiam na contagem direta por

1000

microscpio, assim como o novo ensaio de CD4 POC, o

Disperso lateral

10 3
800

Pima CD4. Antes da implementao dos ensaios de CD4,

CD4 Cy5

Moncito
10 2

devem-se considerar as polticas internas de cada pas e

600

Clulas T CD4
R2
da OMS quanto ao uso desses testes, no que diz respeito
400

R1
101

infraestrutura e aos profissionais necessrios para sua

200

Clula B
Clulas T CD8
implementao apropriada, assim como ao fornecimento
10 0
0

10 0 101 10 2 10 3 10 4 10 0 101 10 2 10 3 10 4
CD45 PerCP CD3 FITC
de servios de logstica e avaliao e monitoramento
Figura 15.6 da qualidade dos testes (16).
Exemplo de grficos de disperso de citmetro de
fluxo de um ensaio de CD4. 15.3.2 Garantia da qualidade para os testes de CD4
O desenvolvimento de diretrizes para a GQ do teste de
15.3.1.2 Plataformas de CD4 e estratgias CD4 orientou-se pelo avano e experincia tanto nos
A contagem de CD4 era tradicionalmente determinada locais desenvolvidos quanto naqueles com escassez de
utilizando uma tcnica de plataforma dupla com recursos (17-19). importante que os espcimes para
um citmetro de fluxo, fornecendo a porcentagem a contagem de CD4 sejam devidamente identificados;
de clulas CD4 em uma populao de clulas coletados em tubos adequados para sangue; mantidos
sanguneas brancas ou de linfcitos, e um analisador em temperatura ambiente, mas no expostos ao calor
de hematologia, fornecendo a contagem absoluta de extremo; e analisados no perodo de tempo recomendado

182 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
para o ensaio. Estabilizadores de sangue, tais como o inventrio de reagentes e uma cadeia de suprimento
Cyto-chex e o Transfix, foram utilizados para estender o confivel para garantir que no haja atrasos no teste
perodo durante o qual um espcime pode ser analisado, como resultado da falta de reagentes.
principalmente quando necessrio um espcime de
O controle de qualidade (CQ) deve ser realizado
referncia. O espcime deve ser processado seguindo
diariamente, sempre que o teste de CD4 for realizado.
um procedimento-padro escrito. Pipetas calibradas e
Suprimentos de sangue estabilizado podem ser
reagentes devidamente estocados e dentro do prazo de
utilizados como material para o CQ e esto disponveis
validade so importantes para a obteno de resultados
comercialmente (19). Dois nveis de materiais de CQ,
confiveis. Os ensaios de CD4 devem ser realizados por
normal e baixo, devem ser testados como um espcime de
profissionais de laboratrio treinados e qualificados.
paciente. Os resultados de CQ necessitam ser revisados
Todos os resultados obtidos, incluindo os grficos de
diariamente. Alternativamente, controles de esferas
disperso, devem ser revisados quanto preciso,
podem ser utilizados para garantir a preciso da funo de
completude e identificadores corretos. necessrio
contagem dos instrumentos de CD4. Os laboratrios que
que realizar a manuteno diria de equipamentos
realizam o teste CD4 tambm devem ser registrados em
e instrumentos, de acordo com um cronograma. O
um programa de avaliao/GQ externa.
contrato de servios em citmetros de fluxo pode
estender a vida til do instrumento e ajuda a garantir
seu funcionamento apropriado. So necessrios um

Tabela 15.1: Instrumentos e ensaios para CD4

Tipo Instrumentos/ Ensaio Princpios do ensaio
companhias
Sistemas de Epic XL-MCL & PLG CD4 Citometria de fluxo, baseada em
rendimento alto FC500/ Beckman esfera
Coulter Brea, CA, EUA

FACSCalibur & Canto/ Tritest & MultiTest Citometria de fluxo, baseada em

BD Bioscience San esfera
Jose, CA, EUA
Sistemas de FACSCount/BD Reagentes para FACSCount Citometria de fluxo, baseada em
rendimento mdio Bioscience & reagentes para CD4 esfera
a baixo

Guava PCA/ Easy CD4, Citometria de fluxo, volumtrica

Millipore Easy CD4%
Billerica, MA, EUA Auto CD4/CD4%

CyFlow SL_3 & Partec Easy CD4 & CD4% Citometria de fluxo, volumtrica
Counter/ Partec
Gorlitz, Alemanha
Sistemas manuais Beckman Coulter Cyto-Spheres Observao direta de clulas com
Invitrogen esfera
Oslo, Noruega Kit T4 Quant Observao direta de clulas
imunocapturadas
POC Pima Analyzer/ Pima CD4 Imagem digital de clulas duplamente
Alere Technologies marcadas, volumtrica
Jena, Alemanha

POC: teste point-of-care.

Infeces pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV) 183

 15.3.3 Teste de carga viral
Embora o CD4 seja um parmetro importante para a
compreenso do estado clnico do paciente e para iniciar
a TARV, a carga viral uma medida quantitativa de HIV
no sangue, sendo tambm um parmetro importante
utilizado para monitorar a eficcia do tratamento ao
longo do tempo. Existem muitos ensaios de carga
viral (CV) comercialmente disponveis e utilizados,
principalmente, para o manejo da infeco pelo HIV,
em conjunto com a apresentao clnica e outros
testes laboratoriais. A tecnologia de amplificao de
cido nucleico in vitro usada para quantificar as
partculas de HIV no plasma. Os mtodos de PCR
para a transcriptase reversa (RT, do ingls reverse
transcriptase), amplificao baseada nas sequncias de
cido nucleico (NASBA, do ingls nucleic acid sequence-
based amplification) e DNA em cadeia ramificada (bDNA,
do ingls branched DNA) so utilizados para quantificar
o RNA do HIV por PCR, amplificao isotrmica de cido
nucleico e amplificao de sinal, respectivamente. As
tecnologias no fundamentadas em cido nucleico
baseiam-se na deteco de enzimas virais (RT) e
protenas (antgeno p24) como uma medida substituta de
carga viral para HIV. Os ensaios de CV diferem quanto
sensibilidade, amplitude dinmica e capacidade de
detectar e quantificar os diferentes subtipos de HIV.
O plasma humano o tipo de espcime padro para
tecnologia de CV e as restries quanto ao processamento
de plasma, manuteno da refrigerao e armazenamento
de espcime so preocupaes genunas. Entretanto,
o uso de DBS como fonte de espcime promissor
e os locais de cuidado primrio podem coletar DBS e
transport-los aos laboratrios centrais para a realizao
do teste de CV. Atualmente, a testagem centralizada lei
em pases com limitaes, mas o teste POC pode alterar
o cenrio desses locais, para que, no futuro, o teste de CV
seja realizado rotineiramente.
15.3.4 Teste de resistncia a drogas
A resistncia do HIV s drogas da terapia antirretroviral
(HIVDR, do ingls HIV drug resistance) se refere
habilidade do HIV de continuar a se replicar na
presena de medicamentos antirretrovirais (ARV) que,
normalmente, suprimem sua replicao. A HIVDR
causada por mutaes ou mudanas nas regies
importantes do genoma viral de RNA que so alvo dos
184 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
ARV, as quais, por fim, podem levar a mudanas nas
protenas enzimticas essenciais para a replicao viral
e permitir que o HIV se replique na presena de ARV
importantes. Em locais com poucos recursos, os ARV
prescritos mais comumente agem contra as regies
da RT e protease (PR). A evoluo de subpopulaes
de HIV resistentes a drogas pode comprometer
significativamente a habilidade dos ARV de suprimirem a
replicao viral. Uma vez que as cepas virais resistentes
surgem, elas podem persistir indefinidamente, tanto
como vrus circulantes ou integradas ao genoma de
linfcitos T de memria como DNA pr-viral. Essas
linhagens virais resistentes podem no s causar HIVDR
em pacientes que as adquirem, como tambm podem
ser transmitidas a novos indivduos infectados por HIV,
levando ao comprometimento da eficcia da TARV
nesses pacientes. Dois mtodos estabelecidos para o
teste de HIVDR esto disponveis: os testes genotpico
e fenotpico. Ambos so complexos e onerosos. Em
pases ricos, o monitoramento de pacientes em TARV
para a aquisio de HIVDR e deteco da transmisso
de HIVDR em indivduos infectados recentemente por
HIV tornou-se o cuidado padro (17 ). Demonstrou-se
que o teste de HIVDR melhora a sobrevivncia e a resposta
imune, quando utilizado para orientar a tomada de deciso
clnica para pacientes que no responderam a um ou mais
esquemas prvios. Devido limitao e/ou ausncia de
infraestrutura e profissionais treinados e ao seu alto custo,
o teste individual de HIVDR no realizado rotineiramente
em locais com escassez de recursos. A OMS recomenda o
monitoramento e vigilncia da HIVDR em nvel populacional
para prevenir o desenvolvimento e transmisso de HIVDR
em pases com programas de TARV, alm de garantir que
os regimes de TARV selecionados para incluso em guias
nacionais, e os programas que os administram, continuem
eficientes (18-20).
15.3.4.1 Teste de HIVDR genotpico
O teste de HIVDR genotpico avalia as sequncias de
nucleotdeos das quais so deduzidos os aminocidos
das enzimas PR e RT do HIV. As sequncias de
aminocidos das regies da PR e RT do gene pol do HIV
so comparadas quelas da linhagem viral de referncia
do tipo selvagem ou sequncia de referncia consenso
especfica de um subtipo, e qualquer mudana de
aminocido em um cdon especfico registrada. As
mutaes so descritas em um formato-padro baseado selvagens e mutantes presentes em uma quasispecie
na posio numrica de um cdon mutante em uma viral. Alm disso, o teste fenotpico s est disponvel em
sequncia de aminocido da PR ou RT. Por exemplo, uma um nmero limitado de laboratrios, que usam diferentes
mudana de metionina (M) para valina (V) na posio mtodos e podem gerar resultados discordantes.
184 da RT descrita como M184V. A letra esquerda Ainda mais importante, atualmente, o custo do teste
do nmero representa o aminocido naquela posio na fenotpico , pelo menos, trs vezes maior que o do teste
RT de referncia e a letra direita mostra o aminocido genotpico. Devido a essas limitaes, o teste fenotpico
comparvel associado mutao na linhagem de no recomendado para o propsito de vigilncia de
HIV sendo testada. O teste genotpico demonstrou-se rotina da HIVDR na populao.
altamente reprodutvel e sensvel, e fornece a sequncia
gentica completa e precisa do domnio de interesse. 15.3.4.3 Tipos de espcimes para o teste de HIVDR
Estudos indicaram que o teste genotpico pode identificar O plasma o tipo de espcime utilizado rotineiramente
mutaes de HIVDR presentes em cerca de 20% das para o teste genotpico e considerado o padro
quasispcies circulantes. ouro. Os dois testes genotpicos aprovados pela FDA
requerem plasma para a realizao do teste. A OMS
Os testes genotpicos aprovados pela Administrao
tambm recomenda que o plasma seja utilizado para
de Alimentos e Drogas dos Estados Unidos da Amrica
as pesquisas de monitoramento da HIVDR adquirida em
(FDA, do ingls United States of America Food and Drug
pacientes tratados com os ARV de primeira linha por
Administration) disponveis comercialmente, os sistemas
12-15 meses (23). Alm disso, muitos estudos avaliaram
de genotipagem TRUGENE e Viroseq, so desenhados
o uso de DBS para o teste de HIVDR em locais com
e aprovados para a genotipagem do subtipo B do
recursos limitados, o qual foi utilizado com sucesso
HIV-1, que so as linhagens dominantes que circulam
no teste genotpico, em populaes recentemente
na Europa e Amrica do Norte. Embora esses testes
diagnosticadas com HIV e que no foram submetidas a
sejam utilizados para o teste genotpico em subtipos
tratamento antirretroviral, para verificar a transmisso
no-B do HIV-1, suas caractersticas de desempenho
do HIV nos ltimos anos. A OMS tambm recomenda
no foram completamente avaliadas e os resultados
que o DBS seja utilizado para a pesquisa de HIVDR
dos testes podem variar. Laboratrios por todo o mundo
transmitidas em populaes virgens de tratamento
desenvolveram e validaram testes genotpicos que foram
e para o monitoramento de HIVDR adquiridas em
desenhados para a genotipagem dos diversos subtipos
pacientes iniciando a TARV (23-25). Embora haja
do grupo M do HIV-1 e formas recombinantes circulantes
vantagens importantes em utilizar o DBS para o teste de
(CRF, do ingls circulating recombinant forms) (21, 22).
HIVDR, incluindo a facilidade para a coleta de amostra,
transporte e armazenamento sem a necessidade de
15.3.4.2 Teste de HIVDR fenotpico
refrigerao (21, 22, 26-28), existem limitaes para o
Os testes fenotpicos in vitro utilizam as regies da RT
seu uso na coleta de amostras de pacientes tratados
e PR do gene pol do HIV-1 derivados de um indivduo
com ARV de primeira linha, participando de pesquisas
infectado por HIV e incorporam essas regies genmicas
sobre a aquisio de HIVDR nos 12 meses aps o incio
para gerar um vrus recombinante. A susceptibilidade
de TARV (23, 29). Isso se deve principalmente menor
do vrus recombinante , ento, determinada por meio
quantidade de amostra aplicada para a extrao, menor
do teste de susceptibilidade na presena de vrias
carga viral na maioria dos pacientes em tratamento e
concentraes de uma droga relevante. Os resultados
menor sensibilidade do teste de genotipagem na maioria
so expressos como mudanas na susceptibilidade
dos ensaios de genotipagem in-house. Entretanto,
na concentrao inibitria de 50% (IC50) quando
resultados recentes de estudos conduzidos em locais
comparada aos valores de cut-off gerados pelo vrus
com limitaes de recursos, utilizando testes de carga
selvagem de referncia. Existem vrias limitaes no
viral baseados em PCR em tempo real de segunda
teste fenotpico. Notavelmente, o teste fenotpico pode
gerao, revelaram que a quantificao da carga viral
no predizer o desfecho clnico adequadamente se
com DBS em pacientes tratados com ARV de primeira
houver uma mistura de populaes de linhagens virais

Infeces pelo vrus da imunodeficincia humana (HIV) 185

 linha pode ser uma alternativa vivel para a mensurao
da carga viral (30-34). Por meio da combinao de
teste de carga viral baseado em PCR em tempo real de
segunda gerao com ensaios genotpicos in vitro de
menor sensibilidade, o monitoramento de HIVDR em
pacientes em tratamento utilizando DBS, finalmente,
pode se tornar vivel em locais com recursos escassos.
15.3.4.4 Resultados de genotipagem com qualidade
garantida
Assim como em qualquer tcnica molecular, o teste de
HIVDR genotpico passvel de contaminao cruzada,
se o teste no for realizado conforme os procedimentos
e as condies laboratoriais para os quais o mesmo
foi desenvolvido. A fim de padronizar o teste de
HIVDR genotpico e garantir a qualidade dos dados de
genotipagem em locais com limitaes de recursos, a
OMS/ResNet desenvolveu uma estratgia laboratorial
para verificar a resistncia do HIV aos medicamentos
(35). As estratgias do laboratrio de genotipagem,
incluindo os programas de avaliao externa da
qualidade, foram desenvolvidas e implementadas em
todos os laboratrios de resistncia a medicamentos
autorizados pela OMS, e somente estes realizam
testes de genotipagem e geram dados para fins de
monitoramento e vigilncia de HIVDR. A equipe de
resistncia do HIV a medicamentos do Departamento de
HIV/AIDS da OMS, em colaborao com o Laboratrio
de Resistncia a Drogas na Filial Internacional de
Laboratrio, Diviso de HIV/AIDS global, CGH, CDC,
tambm desenvolveu um pacote de treinamento para
laboratrios de HIVDR. Todas essas medidas garantiram
a qualidade de dados de genotipagem.
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188 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Captulo 2

Gesto de qualidade no laboratrio

2.1 Introduo uma infeco em particular ou para a populao a ser

A finalidade de um sistema de qualidade garantir que
todos os laudos emitidos por laboratrios e utilizados
para a gesto de pacientes sejam de alta qualidade. Para
manter um servio de alta qualidade, os laboratrios
devem investir em um programa de melhoria de
qualidade e se credenciarem junto a um organismo
nacional ou internacional idneo, como a Organizao
Internacional de Padronizao (ISO, do ingls
International Organization for Standardization; www.iso.
org). A certificao envolve uma auditoria externa sobre
a capacidade do laboratrio de fornecer um servio de
alta qualidade, por meio da definio de uma prtica
padro, a qual confirmada por uma reviso realizada
por especialistas. Entretanto, isso no inclui a avaliao
do grau de adequao do teste para o diagnstico de
testada (ver Captulo 1).
Para uma compreenso comum partilhada, a Tabela 2.1
define os termos utilizados nesse captulo.
A certificao um procedimento que demanda tempo
e altos custos e no pode ser realizada por muitos
laboratrios, mas todos os laboratrios deveriam
trabalhar no sentido de melhorar qualquer procedimento
que afete a preciso da informao que orienta a gesto
de pacientes. Em vrias partes do mundo, tm sido
desenvolvidos mecanismos para fortalecer os sistemas
laboratoriais por meio da implementao de melhorias
realizadas passo a passo, de acordo com uma lista de
verificao (1-5).

Tabela 2.1: Definio de termos-chave utilizados no captulo de gesto de qualidade

Certificao Auditoria externa dos procedimentos do laboratrio, que contribui para a qualidade do laudo.
Sistema de gesto Estrutura para uma abordagem sistemtica para a gesto da qualidade dos procedimentos
de qualidade (SGQ) laboratoriais.
Garantia de Processo sistemtico para garantir o cumprimento dos requisitos de qualidade para um produto
qualidade (GQ) ou servio.
Documento contendo a descrio detalhada dos procedimentos individuais para cada protocolo
Procedimento
ou teste usado no laboratrio. A finalidade de um POP garantir que as operaes sejam
operacional padro
realizadas corretamente e sempre da mesma forma. Um POP deve estar sempre disponvel no
(POP)
laboratrio.
Avaliao interna Realizada por meio do reenvio e testagem de amostras clnicas annimas selecionadas
da qualidade (AIQ) randomicamente no mesmo laboratrio para garantir a reprodutibilidade dos resultados.
Avaliao externa Processo que permite a introduo de amostras de contedo conhecido, porm no divulgado no
da qualidade (AEQ) procedimento de testes de rotina de um laboratrio, a partir de uma fonte independente.
Controle interno da
Procedimento usado para detectar problemas e falhas em um ou mais reagentes de um teste.
qualidade (CIQ)
Avaliao dos Processo sistemtico e extenso que compara diferentes sistemas projetados para executar
testes funes iguais ou similares.
Validao dos Procedimento usado para examinar todo o processo que est sendo utilizado, a fim de verificar
testes se os resultados esto corretos.
CSPS Controle de substncias prejudiciais sade

Gesto de qualidade no laboratrio 11

 2.2 Gesto de qualidade
O sistema de qualidade deve ser descrito em um
manual de qualidade que apresenta o sistema de gesto
para o laboratrio. Ele serve para notificar a gerncia
e os funcionrios do prprio laboratrio e fornecer
informaes para os clientes dos servios laboratoriais e
para qualquer organismo de certificao.
Organizao e gesto
Uma estrutura organizacional necessria para
o laboratrio, na qual estejam claros os papis
e responsabilidades de cada indivduo. Trata-se
normalmente de uma estrutura hierrquica, dirigida por
um diretor ou pelo chefe do departamento, com chefes
de sees ou unidades, um gerente de laboratrio e uma
gama de cientistas da sade, de diferentes reas. Um
indivduo deve assumir a liderana pela qualidade, o que
pode constituir tanto uma funo especfica como uma
parte integral de um trabalho mais amplo. O manual de
qualidade deve incluir um organograma das funes dos
diferentes indivduos e de suas linhas de gerncia e a
descrio de suas responsabilidades. Cada funcionrio
deve ter a descrio detalhada de seu trabalho, a qual
deve ser revisada anualmente.
Treinamento dos funcionrios e registro
Todos os funcionrios do laboratrio devem ser
devidamente treinados e registrados, quando possvel,
junto a um organismo nacional. Os funcionrios devem
receber treinamento em todos os mtodos que iro
empregar em suas atividades dirias e ser regularmente
avaliados quanto sua competncia. Ser mantido
um registro do treinamento de cada empregado. Estes
tambm devem participar de formao contnua para
ampliar suas experincias e competncias. A auditoria
dos procedimentos laboratoriais parte de um bom
sistema de qualidade e ser um requisito para a
certificao. As responsabilidades individuais devem
ser estabelecidas por meio das seguintes reunies dos
vrios grupos do laboratrio:
As reunies dos gerentes ou funcionrios snior
devem incluir o diretor ou chefe de laboratrio, o
gerente do laboratrio, os chefes de cada seo, o
gerente de GQ, o chefe de segurana do laboratrio
e o assistente pessoal do diretor. Esse grupo deve
12 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
se encontrar regularmente em geral, de seis a oito
vezes por ano para discutir assuntos relevantes,
incluindo finanas, administrao, contratao de
pessoal, equipamentos, AIQ e AEQ, certificao e
quaisquer outras questes levantadas que afetem a
oferta dos servios laboratoriais. Nessas reunies,
devem-se elaborar atas com os pontos de ao a
serem revisados nos encontros seguintes.
As reunies de todos os funcionrios devem incluir
todos os nveis de funcionrios do laboratrio. Esse
grupo deve se encontrar pelo menos oito vezes por
ano para discutir assuntos relevantes, incluindo
finanas, administrao, contratao de pessoal,
segurana, certificao e quaisquer outras questes
levantadas. Nessas reunies, devem-se elaborar
atas com os pontos de ao a serem revisados nos
encontros seguintes.
As reunies de gesto de segurana devem incluir
o diretor ou o chefe do laboratrio, o gerente do
laboratrio, o chefe de segurana do laboratrio,
o vice-chefe de segurana, os chefes das sees,
um representante dos funcionrios e, se disponvel,
um conselheiro de sade e segurana. Esse grupo
deve se encontrar em intervalos de seis meses,
ou conforme apropriado. As atas devem ser
disponibilizadas a todos e afixadas no quadro de
avisos do laboratrio.
As reunies anuais de gerncia tambm devem ser
realizadas e os respectivos relatrios apresentados,
a fim de possibilitar a reviso do desempenho
completo do laboratrio e dos servios prestados aos
consumidores.
Procedimentos operacionais padro
Todos os procedimentos utilizados no laboratrio devem
ser documentados como POP e so fundamentais para
reduzir os erros decorrentes de variaes nos testes.
Devem incluir os principais detalhes dos reagentes
e metodologias, incluindo os controles internos e os
critrios interpretativos. Os POP devem ser escritos
pelos indivduos que executam o mtodo/teste e
autorizados por um funcionrio snior. Necessitam
apresentar referncia cruzada quanto avaliao de
risco e informaes de segurana (CSPS qumico e
biolgico), devendo ser revisados e atualizados. Nenhum
procedimento ser realizado no laboratrio sem que os
POP estejam num lugar apropriado e de fcil acesso
no laboratrio para o uso dirio. Os POP devem ser
revisados regularmente, verificados e autorizados pelo
tcnico snior como parte do SGQ. Em alguns pases, o
POP local pode ser baseado no POP nacional.
A avaliao e validao de testes essencial em
qualquer laboratrio para fornecer uma avaliao
baseada em evidncias sobre a capacidade de
desempenho do teste, antes que este seja incorporado
ao servio oferecido.
A avaliao um processo sistemtico e extensivo,
que compara diferentes sistemas projetados para
executar funes iguais ou similares. Exemplos de
avaliaes na microbiologia incluem a comparao
de diferentes mtodos projetados para detectar o
mesmo marcador/alvo, a comparao de diferentes
meios de cultura para isolar o mesmo organismo ou
a comparao de diferentes equipamentos com a
mesma funo. Os resultados da avaliao devem ser
encaminhados s partes interessadas, por exemplo,
por meio de uma publicao. Quando dois conjuntos
de reagentes (kits) apresentam caractersticas de
desempenho equivalentes, deve-se dar preferncia
quele que seja mais fcil de usar, de menor custo,
mais rpido ou que requeira amostras de mais fcil
obteno.
A validao usada para examinar todo o processo
que est sendo utilizado, a fim de verificar se os
resultados esto corretos. Cada laboratrio deve
validar suas habilidades para alcanar resultados
aceitveis, segundo o mtodo ou sistema em
questo. Para documentar tais habilidades, os
laboratrios devem produzir um arquivo de validao
para cada mtodo ou sistema. O arquivo necessita
incluir uma ampla gama de informaes e envolver
nfases diferentes, conforme o laboratrio esteja
utilizando um sistema comercial ou se desenvolveu
um sistema prprio (in-house). Tipicamente, o
arquivo deve incluir sees como dados de avaliao,
teste em amostras conhecidas, pastas de trabalho,
publicaes relevantes, dados contnuos de controle
de qualidade, POP relevantes, registro de erros e
reclamaes de consumidores.
A inteno da validao fornecer provas
documentais de que um teste para diagnstico
ou a pea de um equipamento est de acordo
com as especificaes do fabricante. Isso
pode envolver resultados de experimentos para
determinar sua preciso, sensibilidade, viabilidade e
reprodutibilidade. A validao pode ser extensiva (por
exemplo, para validar um novo mtodo desenvolvido
internamente pelo laboratrio) ou de mbito limitado
(por exemplo, para validar um mtodo comercial) que
j est em uso e sofreu pequenas modificaes.
Para os mtodos j em uso e que no possuem
uma validao especfica, importante providenciar
provas documentais que justifiquem os motivos para
seu uso. Normalmente, suficiente preparar um
documento baseado em evidncias histricas, como
o resultado de comparaes ou de outros estudos;
cpia de artigos publicados; resultados da AEQ, da
AIQ e do CIQ; etc. Os registros do trabalho podem ser
cruzados com referncias, caso seja apropriado para
o relatrio de validao.
Garantia de qualidade (GQ)
A GQ fundamental para o trabalho do laboratrio, a fim
de manter a qualidade dos servios e garantir que os
resultados sejam tanto precisos quanto reprodutveis,
sendo a preciso o grau de concordncia entre o valor
mdio obtido por uma ampla srie de resultados do teste
e um valor de referncia aceito, e a reprodutibilidade
a habilidade de produzir essencialmente o mesmo
resultado de diagnstico, independentemente das
variaes de operador, lote do teste, laboratrio ou
equipamento auxiliar validado.
Existem dois elementos principais da GQ: avaliao
da qualidade, ambas as AIQ e AEQ; e o controle de
qualidade, o qual engloba a avaliao e a validao
dos testes, CIQ e avaliao e monitoramento dos
equipamentos (Figura 2.1).
Gesto de qualidade no laboratrio 13
 Avaliao da qualidade Controle de qualidade

Avaliao interna Avaliao externa Avaliao e Controle interno Avaliao e

da qualidade da qualidade validao de da qualidade monitoramento
testes de equipamentos

Figura 2.1
Diferentes elementos que contribuem para a garantia de qualidade (GQ)

Controle de qualidade (CQ) anormais. Deve-se estabelecer um novo intervalo para

O CIQ usado para detectar problemas ou falhas em cada lote novo de reagentes do CQ.
um ou mais reagentes de um teste. Por exemplo, para
sistemas de cultura, uma ou mais linhagens de controle Avaliao e monitoramento de equipamentos
conhecidas podem ser usadas para garantir que o meio essencial que todos os laboratrios verifiquem
permite o crescimento do organismo desejado, e, se for regularmente o desempenho dos equipamentos e
um meio seletivo, se este tambm inibe os organismos registrem os dados obtidos (6). Isso pode ser feito por
no desejados. Isso ir detectar a ausncia ou a meio da manuteno de um inventrio de equipamentos,
concentrao inadequada de um fator de crescimento ou revisado de forma regular. O fluxo laminar de segurana
de um agente seletivo. microbiolgica deve ser monitorado e registrado
semanalmente quanto ao fluxo de ar; a temperatura
Para testes moleculares, o CIQ deve incluir o controle
de todas as incubadoras, banhos-maria, geladeiras e
da amostragem, o controle do isolamento do cido
congeladores ser registrada diariamente. Qualquer erro
nucleico, um controle de amplificao, um controle de
deve ser reportado ao gerente do laboratrio.
contaminao e um controle de inibio. Isso ir prevenir
resultados falso-positivos das reaes em cadeia da Avaliao da qualidade
polimerase por meio da deteco da falha de um ou mais
Avaliao interna da qualidade (AIQ)
reagentes, da amplificao, da ciclagem da temperatura
ou inibio da reao. A AIQ realizada pelo reenvio e testagem de amostras
clnicas annimas selecionadas randomicamente no
Para qualquer teste sorolgico, as amostras do CQ
mesmo laboratrio, a fim de garantir a reprodutibilidade
devem ser includas diariamente, alm do CIQ fornecido
dos resultados. Todos os espcimes da AIQ devem
pelo kit e das amostras para o CQ externo, quando
ser submetidos a anlises de rotina, sem receber
disponvel, sendo todas elas testadas da mesma
qualquer tratamento especial. Para que o esquema
forma que o espcime do paciente. O intervalo para
fornea informaes relevantes e teis, a AIQ deve ser
as amostras de CQ para cada laboratrio deve ser
realizada regularmente em todos os tipos de amostras.
estabelecido utilizando-se pelo menos 20 medies ao
As amostras so selecionadas por um funcionrio
longo de um perodo de tempo; os valores de mdia,
treinado, o qual no pode ser a mesma pessoa que
desvio-padro (DP) e coeficiente de variao (CV) so
realizar os testes. As amostras devem ser selecionadas
ento calculados. Os grficos de Levey-Jennings devem
randomicamente para evitar vis, sendo reintroduzidas
ser preparados para cada controle, comparando-se
no sistema do laboratrio da mesma maneira que as
os resultados do CQ de cada corrida. As comparaes
amostras normais.
devem ficar entre dois DP e os resultados no devem
ser relatados se o valor do CQ for maior que trs DP. O nmero de espcimes testados e a frequncia
Esses grficos necessitam ser revisados regularmente dos testes dependem do nmero total de espcimes
para verificar se h quaisquer resultados ou tendncias

14 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

recebidos. Sugere-se que aproximadamente 1% do total
recebido seja retestado mensalmente.
Os resultados devem ser conferidos e comparados
por uma pessoa diferente. Em caso de quaisquer
discrepncias, o teste ser repetido e investigado.
Avaliao externa da qualidade (AEQ)
A AEQ realizada pela distribuio de painis de
proficincia por prestadores de AEQ, como o Servio
Nacional de Avaliao Externa da Qualidade do Reino
Unido (UK NEQAS, do ingls United Kingdom National
External Quality Assessment Service; http://www.
ukneqas.org.uk), o Sistema de Avaliao de Qualidade
Internacional (http://qasidirect.com), a Faculdade de
Patologistas Americanos (http://www.cap.org) e o
Programa de Avaliao da Qualidade RCPA Pty Ltd
da Austrlia (http://www.rcpaqap.com.au), ou, ainda,
por meio de troca de amostras entre laboratrios
de referncia, visando acessar o amplo espectro de
tcnicas e ensaios realizados no laboratrio clnico.
Cientistas devidamente treinados devem realizar a AEQ,
e execut-la, tanto quanto possvel, de acordo com
prticas laboratoriais normais. Uma vez que as amostras
da AEQ so normalmente fceis de serem identificadas,
existe a possibilidade de que estas sejam manejadas
de forma que excede os procedimentos laboratoriais
normais, por exemplo: manipulao por funcionrios
snior, repetio de testes, etc., devendo-se tomar
medidas para evitar que isso ocorra.
A AEQ proporciona vrios benefcios ao laboratrio:
Processamento das amostras:
1. As amostras devem ser reconstitudas, se
necessrio e se possvel. Isso deve ser realizado em
um fluxo laminar de segurana de microbiologia de
nvel 1, uma vez que provvel que os riscos no
sejam conhecidos.
2. O exame ou procedimento requerido deve ser
realizado de acordo com o POP.
3. As amostras residuais devem ser estocadas at
que os resultados sejam conhecidos, a fim de
possibilitar a repetio do teste caso ocorra alguma
discrepncia.
4. Quando o provedor externo receber os resultados,
estes devem ser registrados e o desempenho do
laboratrio deve ser documentado.
5. Quaisquer falhas ou discrepncias devem ser
investigadas por meio da repetio do teste.
6. Os resultados devem ser revisados por um cientista
snior experiente e compartilhados com os
funcionrios do laboratrio, incluindo sucessos e
falhas, para permitir uma discusso completa.
2.3 Indicadores de qualidade
Os laboratrios devem considerar o estabelecimento de
indicadores que reflitam a qualidade de seus resultados.
Metas para tempos de resposta podem ser utilizadas
para tentar reduzir o perodo entre o recebimento da
amostra e a entrega do resultado ao paciente.

Fornece aos funcionrios uma ideia sobre seu

desempenho dentro do laboratrio;

Permite comparar o desempenho entre laboratrios,

nacional e internacionalmente;

Melhora o nvel dos exames;

Identifica possveis problemas;

Demonstra a clientes, colegas e organismos

de certificao que h um compromisso com a
qualidade;

Educa os funcionrios, fornecendo uma melhor

compreenso do impacto de resultados incorretos.

Gesto de qualidade no laboratrio 15

 4. Yao K et al. Improving quality management
O SGQ crucial para melhorar e manter a systems of laboratories in developing countries: an
preciso e reprodutibilidade dos resultados innovative training approach to accelerate laboratory
produzidos pelo laboratrio. accreditation. American Journal of Clinical
Todos os laboratrios devem se esforar para Pathology, 2010, 134(3):401409.
melhorar a qualidade e o trabalho, visando a
5. Westerman LE et al. A quality management systems
certificao.
approach to CD4 testing in resource-poor settings.
A estrutura organizacional e as reunies
American Journal of Clinical Pathology, 2010,
regulares dos funcionrios de diferentes nveis
134(4):556567.
so necessrias para revisar o sistema de
qualidade do laboratrio. 6. Fonjungo PN et al. Laboratory equipment
A avaliao e validao dos testes so maintenance: A critical bottleneck for strengthening
essenciais para fornecer uma base de health systems in sub-Saharan Africa. Journal of
evidncia antes que os testes sejam utilizados Public Health Policy, 2012, 33:3445.
no laboratrio.
A GQ engloba o CQ e a avaliao da qualidade.
Os laboratrios devem usar indicadores
para monitorar a qualidade dos seus testes
laboratoriais.

2.4 Referncias
1. Dobbs T et al. A comprehensive evaluation of the
proficiency testing program for the HIV-1 BED
incidence assay. Journal of Clinical Microbiology,
2011, 49(10):34703473.

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Public Health, 2012, 7(6):648660.

3. Nkengasong JN et al. Laboratory systems and

services are critical in global health: time to end
the neglect? American Journal of Clinical Pathology,
2010, 134(3):368373.

16 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Captulo 3

Micoplasmas genitais

3.1 Introduo em 20-50% (1-4). Por conseguinte, os ureaplasmas e

Micoplasma o nome comum para os membros da
classe Mollicutes. Os micoplasmas so bactrias
muito pequenas de vida livre, com tamanhos variando
normalmente de 0,3 a 0,5 m. Elas no apresentam
uma parede celular rgida, como outras bactrias, o que
torna essas ltimas resistentes penicilina e outros
antibiticos. O M. genitalium, o M. hominis e as duas
espcies de Ureaplasma, U. urealyticum (anteriormente
conhecido como U. urealyticum, biotipo 2) and U. parvum
(anteriormente conhecido como U. urealyticum, biotipo 1)
so encontrados comumente no trato urogenital humano.
importante esclarecer que antes de o U. urealyticum
e o U. parvum serem reconhecidos como espcies
diferentes, ambos eram designados como U. urealyticum,
tornando difcil a interpretao dos resultados de estudos
prvios. A Tabela 3.1 apresenta as doenas associadas a
esses microrganismos.
O M. genitalium encontrado em 1-3% de homens e
mulheres sexualmente ativos, segundo estudos de base
populacional. Os ureaplasmas podem ser encontrados
no colo do tero ou na vagina de 40-80% de mulheres
assintomticas, sexualmente ativas, e o M. hominis
o M. hominis devem ser primariamente considerados
comensais quando detectados no trato genital inferior.
No entanto, esses micoplasmas so reconhecidos como
a causa de doenas extragenitais em pacientes com
deficincia de clulas B (hipo e agamaglobulinemia) e em
prematuros (5).
O M. genitalium teve forte e uniforme associao com a
uretrite no gonoccica (UNG) em mais de 30 estudos,
e foi detectado na uretra de 15-25% dos homens com
UNG sintomtica comparados a 5-10% daqueles que no
apresentavam a doena (1). Em estudos que avaliaram
sua associao com a UNG no clamidial (UNGNC),
essa associao mostrou-se normalmente mais forte,
indicando que o M. genitalium e o C. trachomatis atuam
como causas separadas de UNG. Em vrios estudos,
o M. genitalium foi encontrado em mais de um tero
dos homens com UNGNC (1). Dentre as populaes
clnicas com doenas sexualmente transmissveis (DST),
aproximadamente 90% dos homens infectados por M.
genitalium apresentam sinais microscpicos de uretrite,
e praticamente trs em cada quatro homens infectados
reportam sintomas desse agravo (6, 7 ).

Tabela 3.1: Doenas associadas aos micoplasmas urogenitais

Doenas associadasa
Vaginose Endometrite Nascimento Infertilidade Transmisso
Espcie Uretrite Cervicite bacteriana e/ou PID prematuro (mulheres) do HIV
M. genitalium ++++ +++ +++ +/ + +

M. hominis ++++ +/ +/ ND

Ureaplasmas
(no-diferenciados) +/ +++ ND + +/ ND

U. urealyticum + ND ND ND ND ND ND
U. parvum ND ND ND ND ND ND
ND: no determinado; PID: doena inflamatria plvica (do ingls pelvic inflammatory disease)
a
++++ associao forte, +++ associao na maioria dos estudos, + associao apenas em alguns estudos, +/ resultados conflitantes.

Microplasmas genitais 17
 Vrios estudos clnicos mostraram uma forte correlao
entre o M. genitalium e UNG persistente ou recorrente,
provavelmente devido ao tratamento microbiolgico
de baixa eficcia das tetraciclinas. O M. genitalium
foi erradicado em menos de um tero dos pacientes
infectados aps tratamento com doses-padro de
tetraciclinas (8). O M. genitalium foi encontrado em at
41% dos homens com uretrite persistente ou recorrente
aps tratamento com doxiciclina (9, 10).
Mais recentemente, foi reportada falha no tratamento
com dose nica de 1g de azitromicina em 28% dos
homens positivos para M. genitalium com UNG e, na
maioria dos pacientes, a falha estava correlacionada
com a resistncia aos macroldeos desenvolvida durante
o tratamento com dose nica (11).
Em contraste com a consistncia dos estudos
associando o M. genitalium a UNG, o papel dos
ureaplasmas nessa doena controverso e no h
evidncias que suportem o papel do M. hominis como
causa de uretrite (5). Claramente, a identificao
de ureaplasma em um homem com UNG no indica
necessariamente que o microrganismo a causa da
doena, considerando a alta taxa de colonizao. Esse
o caso mesmo quando a cultura quantitativa aplicada.
Dessa forma, no se conhece a proporo exata de
casos nos quais os ureaplasmas so responsveis pela
doena. A diviso dos ureaplasmas em duas espcies, U.
urealyticum e U. parvum, levou a estudos sugerindo que
o U. urealyticum pode estar associado a UNG em homens
jovens com poucos parceiros (12) ou quando presente
em ttulos altos. Dessa forma, as culturas-padro
que no so capazes de discriminar as duas espcies
parecem ser de valor muito limitado.
O M. genitalium tem sido associado com a cervicite;
porm, essa associao mais fraca que a existente
entre M. genitalium e uretrite masculina, possivelmente
devido s dificuldades e critrios diferentes utilizados
no diagnstico de cervicite em mulheres (1). Entretanto,
em uma srie de estudos, a associao mostrou-se to
forte quanto a de C. trachomatis (7 ). Em estudos nos
quais foram descritos sinais de uretrite em mulheres,
esta foi significantemente associada a infeces por M.
genitalium (1).
O M. genitalium foi detectado no endomtrio de 60%
das mulheres positivas para a infeco no colo do tero,
18 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
e sua presena em bipsias endometriais mostrou-se
fortemente associada a endometrite histolgica, com
doena inflamatria plvica (PID, do ingls pelvic
inflammatory disease) recorrente (13, 14). Cicatrizes
tubrias tm sido indiretamente relacionadas infeco
por M. genitalium, uma vez que uma proporo
significativamente alta de mulheres com infertilidade por
fator tubrio apresentam anticorpos contra a bactria
quando comparadas a mulheres com infertilidade devida
a outras causas.
O M. genitalium foi detectado no fluido sinovial de um
paciente com artrite reativa adquirida sexualmente
(SARA, do ingls sexually acquired reactive arthritis) (16)
e experincias clnicas tm mostrado que a SARA no
incomum aps uma UNG positiva para M. genitalium.
No entanto, no se apresentaram estudos sistemticos
e a identificao de M. genitalium no fluido sinovial no
foi reproduzida. Demonstrou-se tambm que mulheres
infectadas por HIV com elevados ttulos de M. genitalium
eram mais propensas a disseminar o HIV (17 ), mas
apenas recentemente comprovou-se que a infeco por
M. genitalium predispe infeco por HIV (18). No h
indicaes de que o M. hominis ou ureaplasmas possam
desenvolver um papel similar.
O M. genitalium uma causa comum de uretrite
em homens e mulheres, e causa cervicite e
infeco no trato genital superior em mulheres.
O M. hominis e os ureaplasmas so comumente
encontrados em indivduos saudveis. Sua
associao com infeces urogenitais ainda
precisa de provas conclusivas.
3.2 Viso geral dos mtodos disponveis para
o diagnstico de M. genitalium
Para fins prticos, o diagnstico de M. genitalium
limitado ao teste de amplificao de cidos nucleicos
(NAAT, do ingls nucleic acid amplification test),
uma vez que a cultura extremamente lenta (vrios
meses), desafiadora e de baixa sensibilidade (19). At o
momento, nenhum ensaio sorolgico, ensaio de deteco
de antgeno ou testes remotos provaram ser teis para o
diagnstico de infeces urogenitais por M. genitalium.

O NAAT o nico mtodo prtico para o
diagnstico de M. genitalium.
3.3 Condies dos espcimes para coleta,
transporte e armazenamento
A coleta de amostras deve ser realizada de acordo com
o descrito para C. trachomatis (Captulo 5). As hastes e
meios para transporte no devem conter substncias
inibitrias de NAAT. tambm adequado que se use
um sistema de transporte compatvel com o ensaio de
deteco de C. trachomatis, uma vez que a testagem
desse organismo de mxima prioridade. Entretanto,
vale ressaltar que a carga microbiana de M. genitalium
100 vezes menor que a de C. trachomatis (20); assim,
devem-se evitar os sistemas de transporte que diluem
o espcime desnecessariamente. Infelizmente, no h
uma orientao clara quanto ao espcime ideal para a
deteco de M. genitalium, uma vez que os materiais
de coleta, os mtodos de preparao de amostras e
os sistemas de deteco variam entre os estudos. Se
apenas um espcime de cada paciente for testado,
acredita-se que o primeiro jato de urina, para homens, e
hastes com secreo vaginal, para mulheres, contenham
as maiores cargas microbianas.
3.4 Deteco de M. genitalium por NAAT
A deteco por NAAT o nico mtodo vivel para solidez e risco reduzido de contaminao por produtos
a deteco de M. genitalium, mas nenhum dos
ensaios comerciais disponveis obteve a aprovao
da Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados
Unidos da Amrica e, atualmente, a maioria recebeu
avaliaes muito limitadas em publicaes. A grande
parte dos ensaios de reao em cadeia da polimerase
(PCR, do ingls polymerase chain reaction) baseia-se
na deteco do gene da adesina MgPa do M. genitalium
(21). No entanto, algumas partes do gene MgPa so
altamente variveis e iniciadores desenhados para essas
regies no apresentaro um bom desempenho para
espcimes clnicos (21, 22). Embora possa ocorrer o
no pareamento de uma nica base em vrias posies RNAr 16S por clula, levando a um provvel aumento
do iniciador senso em algumas cepas, o ensaio de PCR
em tempo real para MgPa utilizando o sistema TaqMan,
descrito por Jensen et al. (23), tem sido amplamente
utilizado em todo o mundo, gerando bons resultados.
Alm disso, a PCR convencional para MgPa, descrita
como uma das primeiras PCR para M genitalium (24)
ou suas modificaes (25), mostrou-se altamente
reprodutvel e tem a vantagem de que o fragmento
amplificado pode ser sequenciado para um ensaio
de tipagem robusto. O gene do RNAr 16S tambm
pode ser usado como alvo nas PCR do M. genitalium.
Entretanto, devido homologia entre M. genitalium e
M. pneumoniae, o desenho de iniciadores e sondas
especficos e sensveis relativamente difcil.
Para alguns ensaios de PCR para o gene do RNAr 16S,
a deteco de M. genitalium baseia-se na amplificao
com iniciadores universais para Mollicutes (micoplasma
e ureaplasma) e subsequente hibridizao com sondas
especficas para espcie. Embora essa abordagem
permita a deteco de vrias espcies de micoplasma a
partir de uma mesma reao primria de amplificao,
a competio, especialmente com a amplificao do
gene do RNAr 16S de ureaplasma, ir resultar em baixa
sensibilidade para a deteco do DNA de M. genitalium,
que pode ser significativa mesmo quando este
encontrado em baixa quantidade (21, 23).
Vrios testes de PCR em tempo real foram desenvolvidos
para M. genitalium (21). Embora a PCR convencional
otimizada possa apresentar a mesma sensibilidade
que os ensaios em tempo real, esses ltimos so
menos propensos a contaminao. Dessa forma, a
combinao de alta sensibilidade, especificidade,
de PCR, caracterstica desse tipo de ensaio, sugere
que a PCR em tempo real deve ser mantida como o
mtodo principal para o diagnstico de M. genitalium. A
quantificao do DNA de M. genitalium no parece ser
de muito valor para os diagnsticos de rotina.
Como uma alternativa PCR, o ensaio de amplificao
mediada por transcrio (TMA, do ingls transcription-
mediated amplification) para o RNAr 16S tem sido
disponibilizado somente para pesquisa (Gen-Probe,
So Diego, CA, EUA). A vantagem dessa abordagem
a presena de mltiplas cpias de molculas de
na sensibilidade da deteco em comparao com a
sensibilidade dos ensaios de PCR que tm como alvo
genes de cpias nicas. Esse ensaio TMA apresentou-se
como um teste sensvel, especfico e de alto rendimento
para a deteco de M. genitalium, mas pouqussimos
estudos o realizaram para determinar se de fato ele
superior aos outros NAAT (26).
Microplasmas genitais 19
 Na ausncia de um NAAT completamente validado
comercialmente, de mxima importncia que os
laboratrios que realizam o diagnstico de M. genitalium
validem cuidadosamente e assegurem a qualidade
de seus ensaios in-house; ver os Captulos 1 e 2 e o
Anexo 3 sobre NAAT e sua garantia de qualidade e a
validao de NAAT no aprovados. Em geral, a maioria
dos ensaios multiplex exibe certa falta de sensibilidade
no diagnstico de M. genitalium, uma vez que esse
organismo est normalmente presente em nveis muito
baixos, mesmo em pacientes sintomticos (20, 23).
A preparao de amostras e a sensibilidade dos
ensaios devem ser ideais para a testagem do
M. genitalium, uma vez que esse patgeno est
presente em concentraes 100 vezes menores
que a de C. trachomatis. Muitos ensaios
multiplex apresentam uma sensibilidade um
pouco menor que ensaios com um nico alvo.
Os NAAT para o gene MgPa de M. genitalium
devem ser cuidadosamente desenhados para
evitar regies variveis do gene.
Consequentemente, devem ser feitos mximos esforos
para otimizar a preparao das amostras, por meio
do uso de centrifugao em alta velocidade, a fim de
concentrar o espcime e evitar a perda de DNA durante
a extrao.
3.5 Resistncia antimicrobiana e teste de
susceptibilidade do M. genitalium
O teste da susceptibilidade antimicrobiana do M.
genitalium muito complexo, sendo vivel somente
em laboratrios de referncia especializados. A
determinao da concentrao inibitria mnima
(CIM) por diluio em caldo utilizando-se um inculo-
padro empregada como o mtodo de referncia,
mas a determinao da CIM do M. genitalium apenas
pelo crescimento em cultura de clulas tambm j
foi aplicada com sucesso (27 ). A falha no tratamento
de infeces por M. genitalium levou ao aumento
da ateno dirigida resistncia nessa espcie. No
entanto, o M. genitalium cultivvel somente em poucos
laboratrios no mundo, e uma vez que seu crescimento
muito lento para permitir resultados significativos
para o paciente, testes moleculares para as mutaes
20 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
mediadoras de resistncia tm sido utilizados em um
nmero crescente de estudos e, em alguns pases, no
trabalho dirio de clnicas.
Vrios estudos clnicos mostraram que as tetraciclinas
so menos eficazes do que a azitromicina na erradicao
do M. genitalium (8) e, embora a CIM in vitro sugira que
a espcie susceptvel tetraciclina, as experincias
clnicas contradizem esse dado. Nenhum teste molecular
foi aplicado para detectar a resistncia tetraciclina. A
resistncia de macroldeos foi documentada por meio
do isolamento de cepas de M. genitalium de pacientes
apresentando falha teraputica com azitromicina
(28), demonstrando-se que as principais mutaes
mediadoras de resistncia ocorrem na regio V do gene
do RNAr 23S, principalmente a A2058G e A2059G
(numerao de acordo com E. coli), mas uma srie de
outras combinaes foram detectadas em espcimes
de pacientes que no responderam terapia com
azitromicina.
Essas mutaes podem ser detectadas diretamente
em espcimes clnicos por meio do sequenciamento de
produtos de PCR, permitindo a gerao de informao
clnica til na ausncia de cultura. Alguns estudos
demonstraram que o tratamento com dose nica de 1g
de azitromicina leva ao desenvolvimento de resistncia
ou seleo de variantes resistentes pr-existentes
(28, 29), e dados preliminares sugerem que o nvel
comunitrio de resistncia aos macroldeos em M.
genitalium altamente dependente do uso da dose
nica de 1g de azitromicina para o tratamento de
infeces por C. trachomatis. Isso ilustrado pela
baixa prevalncia de resistncia em pases que usam
doxiciclina como droga primria para UNG, e por nveis
de resistncia que chegam a 100% na Groenlndia,
onde a azitromicina usada no tratamento de UNG e
a prevalncia de C. trachomatis extremamente alta
(30). A moxifloxacina demonstrou ser um tratamento de
segunda gerao eficaz (31), mas algumas publicaes
do Japo sugerem que pode desenvolver-se a resistncia
fluoroquinolona relacionada gatifloxacina (32) e que
foram isoladas cepas com resistncia combinada de alto
nvel a quinolonas e macroldeos (J. S. Jensen, dados
no publicados, abril de 2013). Embora tenham sido
encontradas mutaes em regies determinantes de
resistncia a quinolonas, suas correlaes clnicas no
foram estabelecidas.

A resistncia a macroldeos em M.
genitalium muito comum em pacientes que
apresentam falha teraputica azitromicina,
e a moxifloxacina a segunda gerao de
tratamento mais frequentemente utilizada.
A resistncia a macroldeos em M. genitalium,
mediada por mutaes especficas no gene do
RNAr 23S, pode ser detectada por amplificao
por PCR e sequenciamento desse gene a partir
do espcime clnico.
Mutaes em M. genitalium em regies
determinantes de resistncia a quinolonas
foram encontradas em pacientes que falharam
o tratamento com esse grupo de antibiticos,
mas suas correlaes clnicas no foram
estabelecidas.
3.6 Referncias
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Captulo 4

Gonorreia

4.1 Introduo A N. gonorrhoeae infecta apenas humanos, colonizando

superfcies de mucosa, constituindo o agente etiolgico
A gonorreia, causada pela Neisseria gonorrhoeae
das infeces do trato urogenital inferior uretrite
(gonococo), uma doena antiga, transmitida quase
em homens e cervicite em mulheres. A infeco
exclusivamente por contato sexual. Em 2008, de acordo
urogenital assintomtica ocorre em uma minoria dos
com estimativas da Organizao Mundial da Sade
homens, mas mais comum (pelo menos 50%) nas
(OMS), havia, globalmente, 106 milhes de novos
mulheres. A infeco do reto (proctite) e da faringe,
casos entre adultos. Isso coloca a gonorreia como a
comumente assintomtica, pode ocorrer em ambos
mais prevalente doena sexualmente transmissvel
os sexos, dependendo do comportamento sexual, mas
(DST) bacteriana, junto com a infeco por Chlamydia
predominantemente encontrada em homens que
trachomatis (tambm com 106 milhes de novos
fazem sexo com homens (HSH). Se no detectada e
casos) (1). Por conseguinte, a gonorreia, incluindo
no tratada ou tratada de forma imprpria, a infeco
suas complicaes severas, causa morbidade e custos
pode migrar para o trato genital superior e causar uma
econmicos substanciais, e mantm-se, mundialmente,
infeco gonoccica complicada (por exemplo, a doena
como um importante problema de sade pblica.
inflamatria plvica [PID, do ingls pelvic inflammatory
de grande preocupao o fato de essa bactria ter
disease], alm de sequelas relacionadas, como a
desenvolvido resistncia a praticamente todos os
gravidez ectpica e infertilidade) em mulheres, e, em
antibiticos introduzidos para o seu tratamento, e
homens, edema peniano e epididimite. Tambm pode
teme-se que a gonorreia possa se tornar no tratvel em
causar conjuntivite em adultos; porm, mais comumente,
certas circunstncias (2,3).
a infeco dos olhos se apresenta na forma de oftalmia
O gnero Neisseria contm duas principais espcies neonatal em recm-nascidos. A infeco gonoccica
patognicas a humanos, N. gonorrhoeae e N. disseminada (IGD), a qual uma entidade distinta e no
meningitidis, e, aproximadamente, 30 espcies no uma complicao, pode ocorrer em ambos os sexos,
patognicas, tais como N. lactamica, N. sicca, N. mas raramente encontrada. A Tabela 4.1 resume as
cinerea, N. flavescens, N. subflava e N. mucosa. Esses manifestaes clnicas das infeces gonoccicas.
organismos habitam predominantemente o trato
respiratrio superior como comensais, mas podem
ser esporadicamente encontrados no trato urogenital A N. gonorrhoeae causa a DST bacteriana
inferior. Os gonococos so Gram-negativos, aerbicos, globalmente mais comum (em 2008, foi to
capnoflicos (preferem concentraes aumentadas comum quanto a infeco por clamdia), a qual
[3-7%] de dixido de carbono [CO2]), no flagelados, inclui um espectro de doenas em diferentes
no esporulados e constituem cocos produtores de rgos, incluindo o trato urogenital, faringe,
oxidase e catalase, tipicamente dispostos em pares reto e conjuntiva.
(diplococos) com os lados cncavos adjacentes; isto ,
As complicaes e sequelas associadas
em microscopia, eles aparecem com a morfologia tpica
infeco por N. gonorrhoeae no tratada
de um rim ou gro de caf. A N. gonorrhoeae exigente
incluem PID, gravidez ectpica, infertilidade,
e requer meios de cultura complexos e nutricionalmente
edema peniano, epididimite e IGD.
enriquecidos para seu crescimento in vitro.

Gonorreia 23
 4.2 Viso geral dos mtodos de diagnstico
disponveis
A gonorreia frequentemente assintomtica,
especialmente em mulheres, e quando ocorre na
faringe e no reto. Os sintomas, quando presentes,
podem ser inespecficos (ver Tabela 4.1). Portanto,
os procedimentos laboratoriais so necessrios para
diagnstico, deteco de casos e teste para a avaliao
da cura. O diagnstico de gonorreia estabelecido pela
identificao de N. gonorrhoeae em secrees genitais e
extragenitais.
A Tabela 4.2 resume os mtodos recomendados para o
diagnstico da gonorreia, assim como o desempenho e
outras caractersticas desses mtodos.
Um esfregao para microscopia corretamente
preparado com colorao de Gram para identificar
diplococos Gram-negativos intracelulares em leuccitos
polimorfonucleares (LPMN) sensvel (95%) e especfico
(97%) para o diagnstico de gonorreia em homens
sintomticos com corrimento uretral. Em mulheres, no
entanto, o esfregao de secrees cervicais detecta
apenas 40-60% de espcimes com cultura positiva,
o que pode refletir o baixo nmero de gonococos em
mulheres. Resultados falso-positivos podem ocorrer
e a especificidade (80-95%) depende da experincia
do microscopista. O exame microscpico direto no
recomendado para o diagnstico de infeces no
reto ou faringe, devido ao grande nmero de outros
organismos presentes e baixa sensibilidade. A triagem
de indivduos assintomticos por microscopia no
recomendada.
Por muitas dcadas, a cultura de N. gonorrhoeae foi
considerada o padro ouro para o diagnstico tanto
da gonorreia genital quanto extragenital. A cultura,
em circunstncias otimizadas, sensvel, altamente

Tabela 4.1: Manifestaes clnicas de infeces gonoccicasa

Gonorreia descomplicadaa Gonorreia complicadab

Uretra Corrimento purulento, abundante Complicaes Edema peniano
Corrimento claro, escasso masculinas Abscesso nas glndulas de Tyson
Disria Abscesso nas glndulas de Cowper
Colo do tero Orifcio cervical frivel, avermelhado Vesiculite seminal
Corrimento purulento Epididimite
Disria Infertilidade (raro)
Salpingite Complicaes Endometrite
Desconforto abdominal inferior femininas Salpingite
unilateral ou bilateral Abscesso das glndulas de
Reto Secreo purulenta, abundante Bartholin
Dor pungente ou com queimao Linfagite
Tenesmo Abscesso tubo-ovariano
Sangue nas fezes Gravidez ectpica
Infertilidade
Faringe Faringite leve
Ligeira irritao na garganta Infeco Bacteremia
Eritema gonoccica Febre
disseminada Dermatite (leses na pele: macular,
Conjuntiva Secreo purulenta, abundante
(IGD) eritematosa, pustular, necrtica,
Ceratite e ulcerao da crnea;
hemorrgica)
perfurao, extruso do cristalino
Tenossinovite
Cicatriz, opacificao do cristalino
Articulaes; artrite sptica
Cegueira
Endocardite
Meningite
a
Como mencionado acima, a infeco gonoccica pode ser assintomtica, principalmente em mulheres, na faringe e reto.
b
Estudos epidemiolgicos e biolgicos forneceram evidncias fortes de que a gonorreia facilita significativamente a transmisso do HIV.

24 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

especfica, de baixo custo e, o mais importante, permite que permite testar a susceptibilidade antimicrobiana,
o teste de susceptibilidade antimicrobiana. A resistncia crucial manter e, quando necessrio, fortalecer a
antimicrobiana em gonococos um problema severo capacidade de realizar a cultura em todos os pases.
em todo o mundo e, como a cultura o nico mtodo

Tabela 4.2: Testes de diagnstico comuns (junho de 2012) para a deteco de N. gonorrhoeae

Microscopiaa Cultura NAAT

Tipos de espcime
Haste com secreo Sima Sim Sim
endocervical
Haste com secreo No Simb Sim (alguns ensaios)
vaginal
Urina
Feminina No No Simc
Masculina No No Sim
Haste com secreo Sima Sim Sim
uretral
Haste com amostra retal No Sim Nod
Haste com amostra da No Sim Nod
orofaringe
Haste com amostra da Sim Sim Nod
conjuntiva
Desempenho
Sensibilidadee Baixa-altaa Moderada-alta Muito alta
Especificidadee Moderada-altaa Muito alta Moderada-muito alta
Outras consideraes
Custos Baixo Moderado Alto-muito alto
Instrumentao Microscpio Microbiologia de rotina Grande infraestrutura
Rendimento/ Moderado/no Moderado/no Alto/possvel
automatizao
Complexidade tcnica Baixa Moderada Alta
Nvel de infraestrutura Perifrico Perifrico-intermedirio Intermedirio-central
do laboratrio
Mltiplos patgenos de No No C. trachomatis, T. vaginalis e HPV, em
uma mesma amostra algumas plataformas
Outros comentrios Coleta de amostra, trans- Os NAAT apresentam uma sensibilidade
porte e armazenamento superior quando comparados cultura,
rigorosos so cruciais para principalmente para amostras do reto
manter a viabilidade. e faringe. Entretanto, a especificidade
Esse o nico mtodo que pode ser abaixo da ideal, tornando-
permite o teste de suscep- se necessrio o uso de um NAAT
tibilidade antimicrobiana. suplementar confirmatrio.

Gonorreia 25
 HPV: papilomavrus humano; NAAT: teste de amplificao de cidos nucleicos.
a
A microscopia apresenta uma alta sensibilidade e especificidade em homens sintomticos (com uretrite), baixa sensibilidade em homens
assintomticos e em infeces endocervicais, no sendo recomendada para espcimes vaginais, de urina, reto ou faringe.
b
No um espcime ideal, sendo aplicado principalmente em meninas impberes ou mulheres que realizaram histerectomia.
c
A urina no a amostra ideal para a deteco de N. gonorrhoeae em mulheres, devido baixa sensibilidade.
d
No h NAAT licenciado internacionalmente para o uso em amostras extragenitais, mas existem evidncias crescentes de que os NAAT so mais
sensveis para essas regies que a cultura. Recomenda-se que o NAAT positivo para espcimes do reto e da laringe sejam confirmados com um
teste confirmatrio (NAAT utilizando outra sequncia-alvo) para evitar resultados falso-positivos.
e
As estimativas de sensibilidade e especificidade variam amplamente, dependendo das diferentes sensibilidades e especificidades dos ensaios de
uma mesma metodologia, assim como em relao queles usados para comparao (o padro ouro).

Nas duas ltimas dcadas, os testes de amplificao

de cidos nucleicos (NAAT, do ingls nucleic acid A microscopia sensvel e especfica em
amplification test) foram desenvolvidos e introduzidos homens sintomticos com corrimento uretral.
para a deteco especfica do DNA/RNA da N.
A cultura, em circunstncias otimizadas,
gonorrhoeae. Esses testes so geralmente mais sensveis
sensvel, altamente especfica, de baixo
do que a cultura para o diagnstico da gonorreia,
custo e permite o teste de susceptibilidade
especialmente em amostras do reto e faringe (4-6).
antimicrobiana.
No entanto, a Administrao de Alimentos e Drogas
Os NAAT geralmente apresentam sensibilidade
dos Estados Unidos da Amrica (FDA, do ingls United
superior quando comparados cultura,
States of America Food and Drug Administration) ainda
principalmente para amostras do reto e
no aprovou nenhum NAAT comercialmente licenciado
faringe. Entretanto, a especificidade de vrios
para uso em espcimes do reto e faringe. Alm disso,
NAAT para gonococos abaixo da ideal para
a especificidade de vrios NAAT para gonococos
o diagnstico de amostras urogenitais e,
mostrou-se abaixo do ideal para o diagnstico de
em particular, amostras extragenitais, que
amostras urogenitais e, em particular, amostras
resultam em VPP baixos em populaes de
extragenitais, o que resulta em baixo valor preditivo
baixa prevalncia.
positivo, principalmente em populaes de baixa
prevalncia.

At o momento, no h ensaios de imunofluorescncia

direta, imunoensaios enzimticos ou testes
rpidos remotos para a deteco de antgeno
com caractersticas de desempenho apropriadas
(sensibilidade e especificidade) ao diagnstico de
gonorreia descomplicada ou complicada. Alm disso, no
h mtodos comerciais e internacionais aprovados para
a deteco de anticorpos gonoccicos no soro, e esses
mtodos no podem diferenciar infeces atuais de
passadas. Estes no devem, ainda, ser utilizados devido
baixa sensibilidade e especificidade para o diagnstico
de gonorreia descomplicada e complicada em pacientes.
Para um desempenho apropriado de todos os mtodos
de diagnstico, fundamental seguir precisamente os
procedimentos operacionais padro, de acordo com as
recomendaes do fabricante na coleta, transporte e
armazenamento de amostras, assim como na execuo,
incluindo o controle de qualidade (CQ) do ensaio especfico.
4.3 Coleta, transporte e armazenamento de
espcimes
As regies anatmicas apropriadas para a coleta de
espcimes dependem do sexo, idade e comportamento
sexual do indivduo; das manifestaes clnicas; e do
mtodo diagnstico, incluindo suas caractersticas
de desempenho (sensibilidade e especificidade). Em
mulheres, o canal endocervical o local primrio de
coleta para a utilizao em cultura e microscopia; para
o NAAT, colhe-se o material do canal endocervical ou
vagina. Os lugares secundrios incluem a uretra, o reto e
a orofaringe. Em homens heterossexuais, os espcimes
para cultura e microscopia devem ser coletados da
uretra e, para o NAAT, uma amostra de urina. Em HSH
e homens e mulheres com sinais clnicos indicativos e/
ou prtica sexual oral e/ou anal, amostras adicionais
devem ser coletadas do reto e da faringe. Os NAAT

26 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

apresentam maior sensibilidade para essas infeces
do que a cultura e podem aumentar a deteco de
casos (4, 6), embora, como mencionado, no existam
conjuntos de reagentes (kits) comerciais licenciados
para uso nessas reas. Para a cultura, que requer
organismos vivos, a amostra deve ser coletada em
reas com clulas epiteliais colunares ou cuboides e, se
o carvo no puder ser includo no meio de transporte
no nutritivo, devem-se usar preferencialmente hastes
com extremidades de dacron ou rayon, revestidas por
carvo estril. Para os diagnsticos utilizando NAAT,
devem-se seguir detalhadamente as recomendaes do
fabricante quanto coleta, transporte e armazenamento
das amostras. O uso de antisspticos, analgsicos e
lubrificantes durante a coleta do espcime deve ser
evitado, uma vez que estes podem inibir os gonococos.
Toda coleta de espcime deve ser realizada antes do
incio do tratamento antimicrobiano.
Endocrvice: insira 2-3cm de uma haste no orifcio
do colo do tero, girando-a, gentilmente, por 5-10
segundos. Amostras endocervicais no devem ser
coletadas em meninas impberes ou mulheres que
fizeram histerectomia; em vez disso, os espcimes
so colhidos no vestbulo da vagina. Adicionalmente,
amostras de urina tambm devem ser coletadas para o
diagnstico por NAAT.
Uretra: os espcimes so coletados na uretra, no
mnimo uma hora aps o paciente ter urinado. Coleta-se
a secreo diretamente em uma haste. Se no houver
corrimento evidente, a uretra deve ser despida em
direo ao orifcio para extrair o exsudado. Se o
exsudado no for obtido, insira 2-3cm de uma haste fina
na uretra, girando-a, gentilmente, por 5-10 segundos.
Em mulheres, deve-se massagear a uretra contra a
As condies de coleta, transporte e
armazenamento de espcimes pode variar de
acordo com o ensaio de deteco e pode ter
uma influncia significativa na sensibilidade do
teste.
A seleo de espcimes e ensaios de deteco
apropriados crucial para o diagnstico
eficiente.
snfise pbica e usar a mesma tcnica aplicada para
homens. No exame de mulheres, a cultura das duas
amostras, endocervical e da uretra, pode aumentar a
deteco de casos.
Vagina (somente para NAAT): a haste deve ser girada
contra a parede posterior da vagina por cinco segundos.
As hastes com secreo vaginal podem ser obtidas
tanto pelo paciente quanto pelo mdico, com igual
utilidade (7, 8).
Primeiro jato de urina (somente para NAAT): o
paciente no precisa limpar a rea genital. Colete
10-20mL do primeiro jato de urina em um coletor estril,
no mnimo, uma hora depois que o paciente tiver urinado.
Reto: insira 2-3cm de uma haste no reto, girando-a
contra a parede retal por 10 segundos. Se ocorrer
contaminao por fezes, descarte a haste e use
outra para a obteno do espcime. Em pacientes
sintomticos, espcimes anorretais devem ser obtidos
preferencialmente sob viso direta aps a insero de
um protoscpio.
Orofaringe: utilize uma haste para coletar a amostra da
regio da faringe posterior, acima da borda inferior do
palato mole e das criptas tonsilares.
Conjuntiva: recolha a plpebra inferior e mova uma
haste fina ao longo da superfcie da conjuntiva palpebral
inferior em direo ao canto mediano do olho.
4.4 Diagnstico presuntivo: microscopia
4.4.1 Preparao de lminas para colorao
Prepare o esfregao como descrito no Anexo 1
(Microscopia). Fixe o esfregao seco por calor,
utilizando uma placa de aquecimento ou passando
trs vezes a lmina pela chama, mantendo a lamnula
voltada para cima. Evite superaquecer a lmina, uma
vez que isso provoca a distoro das clulas. A lmina
deve estar apenas morna ao ser tocada com a parte de
trs do punho.
Alm de ser simples e rpida, a microscopia aps a
colorao com azul de metileno (Figura 4.1) um mtodo
confivel para o diagnstico de gonorreia em homens
com uretrite purulenta (9). Entretanto, essa tcnica no
permite a diferenciao de cocos Gram-negativos e,
Gonorreia 27
 portanto, apresenta baixa especificidade. A colorao Organismos extracelulares podem ser observados, mas,
de Gram para identificar diplococos Gram-negativos sozinhos, eles so insuficientes para o diagnstico,
intracelulares em LPMN o mtodo de escolha para o embora sejam usados algumas vezes para essa finalidade
diagnstico presuntivo de N. gonorrhoeae (Figura 4.2). quando em combinao com sintomas clnicos.

Figura 4.1 Figura 4.2

Microscopia da colorao de azul de metileno do
exsudado uretral masculino, mostrando diplococos
intracelulares em LPMN (1000x).
Fonte: Reproduzido de Morse SA et al., eds. Atlas
of sexually transmitted diseases and AIDS, 4th ed.
Edinburgh, Saunders/Elsevier, 2010.
Microscopia da colorao de Gram do exsudado
uretral masculino, mostrando diplococos Gram-
negativos intracelulares em LPMN (1000x).
Fonte: Reproduzido de Morse SA et al., eds. Atlas
of sexually transmitted diseases and AIDS, 4th ed.
Edinburgh, Saunders/Elsevier, 2010

Tabela 4.3: Coleta, transporte e armazenamento de amostras

Local Instrumento Procedimento de

anatmico de coleta amostragem Microscopia Cultura NAAT
Endocrvice Haste/plsticoa Use um espculo Gire uma fina Realize inoculao Coloque no
(ou escova vaginal e limpe o camada sobre a imediata em instrumento
endocervical ectocrvice. Insira lmina e deixe-a meio gonoccico de coleta do
ou conjunto 2-3cm de uma secar ao ar livre seletivo e incube fabricante.
de coleta haste e gire-a por (ver Anexo 1). imediatamente. Se a Transporte e
especfico 5-10 segundos. A sensibilidade coleta e inoculao no armazene de
para ensaio de para amostras puderem ser realizadas acordo com
NAAT). endocervicais no mesmo lugar, as instrues
abaixo da ideal. deve-se utilizar meio de de fabricante.
transporte gonoccico Se o meio de
no nutritivo ou transporte no for
nutritivo.b providenciado pelo
Espcimes em meio de fabricante, use
transporte no nutritivo meio de transporte
devem ser inoculados apropriado para
no laboratrio o mais estabilizar o cido
rpido possvel e, no nuclico, por
mximo, em 48 horas exemplo, tubos
(ver tambm seo GeneLock.
4.5).

28 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Tabela 4.3: Coleta, transporte e armazenamento de amostras (continuao)

Local Instrumento Procedimento de

anatmico de coleta amostragem Microscopia Cultura NAAT
Uretra Haste/ Colete a secreo Gire uma fina Para o transporte e Para o transporte
(coletada aps alumnioc diretamente na camada sobre a armazenagem, ver e armazenagem,
1h aps (ou conjunto haste. Insira lmina e deixe-a cultura de amostras ver cultura
ltima urina) de coleta 2-3cm da haste secar ao ar livre endocervicais. de amostras
especfico na uretra e gire-a (ver Anexo 1). endocervicais para
para ensaio de gentilmente por NAAT.
NAAT). 5-10 segundos.
Vagina Haste/plsticoa A amostra pode NA Usada para meninas Para o transporte
(ou conjunto ser obtida por impberes ou mulheres e armazenagem,
de coleta mdicos ou pelo com histerectomia. ver cultura
especfico prprio paciente. Para o transporte e de amostras
para ensaio de Gire a haste contra armazenagem, ver endocervicais para
NAAT). a parede vaginal cultura de amostras NAAT.d
posterior por 5 endocervicais.
segundos.
Urina (coletada Copo para O paciente no NA NA Para o transporte
1 hora aps coleta de urina deve limpar a rea e armazenagem,
ltima urina) estril. genital. Colete o ver cultura
primeiro jato de de amostras
urina (em geral, endocervicais para
menos de 25mL). NAAT.
Reto Haste/plsticoa Insira 2-3 cm da NA Para o transporte e Para o transporte
(ou conjunto haste no reto e armazenagem, ver e armazenagem,
de coleta gire-a contra todas cultura de amostras ver cultura
especfico as paredes retais endocervicais. de amostras
para ensaio de por 10 segundos. endocervicais para
NAAT). NAAT.d
Orofaringe Haste/plsticoa Utilize uma haste NA Para o transporte e Para o transporte
(ou conjunto para coletar a armazenagem, ver e armazenagem,
de coleta amostra da regio cultura de amostras ver cultura
especfico da faringe posterior endocervicais. de amostras
para ensaio de e criptas tonsilares. endocervicais para
NAAT). NAAT.d

Gonorreia 29
 Tabela 4.3: Coleta, transporte e armazenamento de amostras (continuao)

Local Instrumento Procedimento de

anatmico de coleta amostragem Microscopia Cultura NAAT
Conjuntiva Haste/ A secreo Gire uma fina Para o transporte e Para o transporte
alumnioc purulenta deve ser camada sobre a armazenagem, ver e armazenagem,
(ou conjunto removida com uma lmina e deixe-a cultura de amostras ver cultura
de coleta haste. Retraia a secar ao ar livre endocervicais. de amostras
especfico plpebra inferior. (ver Anexo 1). endocervicais para
para ensaio de Mova uma haste ao Principalmente NAAT.d
NAAT). longo da superfcie para neonatos.
da conjuntiva
palpebral inferior.
NA: no se aplica; NAAT: teste de amplificao de cidos nucleicos.
a
Hastes de plstico com extremidades de dacron ou rayon.
b
Deve-se utilizar o meio de transporte para N. gonorrhoeae no nutritivo apropriado, como o Amies ou Stuart (estocar a 4C antes do transporte),
ou o meio de transporte nutritivo (crescimento), como o Jembec, o Transgrow, o Gono-Pak ou o Sistema Intray GC (armazenar a 361C antes do
transporte).
c
Hastes de alumnio com extremidades de dacron ou rayon.
d
Ainda no h NAAT para amostras extragenitais de gonococos aprovado pela Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados Unidos da
Amrica (FDA, do ingls United States of America Food and Drug Administration); no entanto, para espcimes do reto e faringe, NAAT adequados
mostraram-se mais sensveis que a cultura (4-6), os quais podem ser teis caso haja dados de validao.

4.4.2 Procedimento de colorao de Gram 5. Contraste com safranina ou fucsina por um minuto.
1. Cubra o esfregao fixado com cristal de violeta por 6. Lave com gua corrente e seque suavemente com
30 segundos. Lave delicadamente com gua fria da um papel absorvente.
torneira.

2. Inunde a lmina com soluo de iodo por 30
segundos. Lave gentilmente com gua fria da
torneira.
3. Proceda descolorao com acetona, acetona-
etanol ou apenas etanol, at que a cor roxa pare
de ser liberada do esfregao. melhor segurar a
lmina utilizando uma luva, perto da gua corrente.
O tempo para descolorao depender do agente
qumico utilizado e da espessura do esfregao
ser menor (tipicamente alguns segundos) para a
acetona e ir requerer maior tempo (at um minuto)
para o lcool. A descolorao excessiva deve ser
evitada; caso contrrio, a bactria Gram-positiva
aparecer como Gram-negativa. Desconsidere
as pores mais espessas de um esfregao no
uniforme, as quais ainda podem liberar a cor azul.
4. Lave rapidamente em gua corrente para parar a
descolorao e seque o excesso de gua.
4.4.3 Procedimento da colorao de azul de
metileno
1. Cubra o esfregao com azul de metileno por 30-60
segundos.
2. Lave com gua corrente e seque suavemente com
um papel absorvente.
4.4.4 Leitura do esfregao e interpretao
Use um microscpio de luz e um leo de imerso de
boa qualidade, examinando a lmina com uma objetiva
de 100x (ocular de 10x). Os gonococos aparecem como
diplococos Gram-negativos no interior dos LPMN.
Sempre descreva exatamente o que se v no esfregao:
clulas epiteliais, LPMN, morfologia de bactrias e
localizao intracelular e extracelular. Uma lmina deve
ser examinada por no mnimo dois minutos antes que se
conclua que esta no apresenta diplococos intracelulares
Gram-negativos.

30 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

4.4.5 Controle de qualidade (CQ) da microscopia
utilizando-se esfregaos com colorao
de Gram
O CQ deve ser realizado em intervalos regulares,
utilizando-se uma gama de bactrias com diferentes
reaes Gram e/ou espcimes-controle. Isso dever ser
feito sempre que se utilizar um novo lote de reagentes.
A microscopia sensvel e especfica em
homens sintomticos com corrimento uretral.
Entretanto, a microscopia apresenta uma
sensibilidade mais baixa em homens
assintomticos e em infeces endocervicais,
no fornecendo um diagnstico definitivo para
essas infeces.
A microscopia no recomendada para o
diagnstico de infeces no reto e na faringe.
4.5 Cultura e identificao de N. gonorrhoeae
(presuntivo e definitivo)
4.5.1 Transporte e cultura
A cultura continua sendo essencial para o teste de
susceptibilidade antimicrobiana (ver seo 4.8). Os
gonococos so altamente susceptveis s condies
ambientais (temperatura, dessecao, oxidao e
substncias txicas) e o transporte dos espcimes
da clnica para o laboratrio (Tabela 4.3) reduzir a
viabilidade dos organismos. Os espcimes inoculados
diretamente em um meio de cultura seletivo nutritivo (ver
abaixo) no consultrio mdico o mtodo ideal, mas caso
isso no seja vivel, as hastes devem ser inseridas em
um meio de transporte no nutritivo, como o de Stuart
ou Amies (ver Anexo 4) ou inoculadas em um sistema
de transporte nutritivo (crescimento) como o Transgrow
(10, 11), o Jembec (10, 11), o Gono-Pak ou o Sistema
InTray GC. Com a utilizao de um meio de transporte
no nutritivo, a taxa de isolamento aps o transporte
de espcimes na temperatura ambiente (20-25C) de
aproximadamente 100% no intervalo de seis horas e mais
de 90% em 12 horas.
Aps 48 horas, no entanto, o nmero de gonococos
diminui e a recuperao pode no ser mais possvel,
principalmente em espcimes de pacientes
assintomticos que possuem um pequeno nmero
de organismos. Quando se estima que o tempo de
deslocamento ser superior a 48 horas, ideal utilizar
um meio de transporte nutritivo, (crescimento) que
incorpore um meio de cultura e fornea uma atmosfera
com concentrao de CO2 aumentada. O mximo de
sobrevivncia e recuperao de gonococos a partir de
um meio de transporte no nutritivo obtido quando o
inoculado em meio de transporte de Stuart ou Amies
(ver Anexo 4) armazenado em um refrigerador a 2-8C
antes que o mesmo seja transportado para o laboratrio.
Esse meio retarda o crescimento de gonococos,
prevenindo a perda da viabilidade. Em contrapartida,
o mximo de sobrevivncia a partir de um meio de
transporte nutritivo (crescimento) obtido quando os
espcimes so pr-incubados em um meio de transporte
a 361C durante a noite, antes do transporte para o
laboratrio; resultados aceitveis so obtidos se o tempo
de transporte no exceder dois dias (11).
A viabilidade de uma cultura para o diagnstico de
gonorreia depende de uma srie de fatores:
Nmero de lugares de amostragem;
Tcnica e hastes utilizadas para a coleta dos
espcimes;
Condies e durao do transporte;
Composio e qualidade do meio de cultura;
Condies de inoculao e incubao;
Reagentes e tcnicas utilizadas para a identificao
da espcie N. gonorrhoeae.
A prevalncia das cepas gonoccicas susceptveis s
concentraes de antibiticos, normalmente utilizadas
nos meios de cultura seletivos de gar, negligenciada na
maioria dos pases. Sendo assim, recomenda-se que os
meios de cultura seletivos nutritivos, como o de Thayer-
Martin (13), o meio de Thayer-Martin modificado (MTM;
ver Anexo 4) e o gar New York City (14) sejam utilizados
para o diagnstico de rotina de gonorreia. Se os recursos
permitirem, para espcimes urogenitais, tambm ideal
que se utilize uma placa com meio de cultura no seletivo
para cada amostra. Em algumas reas geogrficas, at
Gonorreia 31
 5% dos gonococos podem ser susceptveis a vancomicina (dependendo da cepa gonoccica e do meio de cultura;
usada em meio de cultura com concentrao de 3-4mg/L Figura 4.4). Aps a incubao adicional, as colnias
(15); dessa forma, recomenda-se o uso de suplementos podem atingir 3mm em dimetro e tornarem-se menos
seletivos com a concentrao de vancomicina suaves. Frequentemente, aparece na placa uma mistura
reduzida de 2mg/L ou com lincomicina (1mg/L), que de diferentes tipos de colnias.
menos inibitria para a bactria contaminante que a
vancomicina. Se as amostras do reto e da faringe so
testadas frequentemente, recomenda-se o uso de altos
nveis de concentrao de vancomicina.

4.5.2 Controle de qualidade (CQ) dos meios de

cultura
Cada lote de meio deve ser controlado quanto
esterilidade, habilidade de sustentar o crescimento de
gonococos e capacidade de inibir outros microrganismos
contaminantes. Para a avaliao da habilidade de
crescimento e o CQ de todos os mtodos diagnsticos,
as cepas de referncia de N. gonorrhoeae da OMS de
2008 (16) esto disponveis a partir de fontes da OMS
(ver seo 4.8.3.3). Para o controle da inibio de
microrganismos no gonoccicos, podem-se utilizar as Figura 4.3
Jarro de anaerobiose com vela para a incubao de
cepas de referncia de, por exemplo, Escherichia coli
placas de cultura de N. gonorrhoeae.
(ATCC 25922), Staphylococcus epidermidis (ATCC 12228),
N. sicca (ATCC 9913) e Candida albicans (ATCC 14053).

4.5.3 Inoculao de cultura e incubao

Gire a haste contendo o espcime por, aproximadamente,
um quarto da superfcie da placa, preferencialmente
placas de Petri com um dimetro de 90mm. Use uma
ala bacteriolgica estril para espalhar o inculo na
parte remanescente do meio para garantir o crescimento
isolado de colnias. Alternativamente, o espcime pode
ser inoculado sobre toda a superfcie da placa em um
padro Z e, em seguida, com listras em direo borda;
isso pode gerar colnias mais isoladas. Incubar as placas
inoculadas imediatamente a 361C em uma atmosfera
mida (umidade de aproximadamente 70-80%) contendo
51% de CO2 (jarro de anaerobiose com vela com bola Figura 4.4
de algodo ou toalhas umedecidos [Figura 4.3], jarro Colnias tpicas de N. gonorrhoeae em meios de
com envelopes geradores de CO2 ou incubadores de CO2 cultura gonoccicos de gar seletivos (esquerda:
MTM) e no seletivos (direita: MTM sem antibiticos
com uma vasilha com gua ou outro equipamento para
adicionados), mostrando leve inibio de
aumentar a umidade). Examine as placas aps 18-24
crescimento pelos antibiticos seletivos.
horas e, se negativas, novamente aps 48 horas. Aps
Fonte: Reproduzido de Morse SA et al., eds. Atlas
24 horas de incubao, colnias tpicas podem variar of sexually transmitted diseases and AIDS, 4th ed.
em dimetro, de 0,5-1mm, e, em aparncia, de cinza a Edinburgh, Saunders/Elsevier, 2010.
brancas, transparentes a opacas e convexas a planas

32 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

4.5.4 Identificao presuntiva de N. gonorrhoeae
aps cultura
A identificao presuntiva de colnias com aparncia
de gonococos em um meio seletivo pode ser feita
utilizando-se colorao de Gram (ver seo 4.4.2) e
um teste de oxidase. O teste de oxidase detecta a
presena de citocromo c oxidase; o teste melhor
realizado ao esfregar algumas colnias diretamente
em uma tira de papel-filtro umedecido com o reagente
(soluo aquosa a 1% de tetrametil para-fenilenodiamina
dihidrocloreto), preparado tanto in-house quanto
comercialmente (por exemplo, oxidase BACTIDROP).
Um teste positivo muda a cor de transparente para
roxo em poucos (mximo de 30) segundos (Figura 4.5).
Alternativamente, o teste de oxidase pode ser realizado
colocando uma gota do reagente oxidase em poucas
colnias representativas em um meio de cultura puro.
Deve-se tomar cuidado, uma vez que o reagente
toxico para a bactria e, se apenas poucas colnias
esto presentes, estas devem ser subcultivadas antes
do teste. A observao de diplococos Gram-negativos
com colnias de morfologia tpica em um meio seletivo,
oxidase-positivos, a partir de espcimes genitais,
oferece uma identificao confivel e suficiente de N.
gonorrhoeae para o diagnstico presuntivo e altamente
preditiva de N. gonorrhoeae quando os espcimes so
cultivados em gar seletivo para gonococos, a partir de
amostras de pacientes de alto risco. Em situaes em
que os recursos so limitados, isso suficiente para
que se inicie o tratamento. No entanto, para fornecer
um diagnstico definitivo de gonorreia, necessrio
confirmar a identificao de N. gonorrhoeae por meio da
eliminao de espcies intimamente relacionadas, como
N. meningitis, N. lactamica e N. cinerea, que tambm
podem crescer em meios seletivos para isolamento
primrio de gonococos. Sugere-se sempre confirmar
a identificao de colnias Gram-negativas e oxidase-
positivas de amostras extragenitais, uma vez que h
maior probabilidade de se isolar espcies de Neisseria
em vez de N. gonorrhoeae nesses lugares, principalmente
na faringe. Qualquer isolado gonoccico que ir ser
analisado subsequentemente, por exemplo, por teste de
susceptibilidade antimicrobiana (ver seo 4.8) ou por
determinao de tipos fenotpicos ou genticos, tambm
dever ter sua identificao confirmada.
4.5.5 Controle de qualidade (CQ) dos reagentes
para o teste de oxidase
O CQ deve ser realizado em intervalos regulares e sempre
que se for utilizar um novo lote de reagentes. Podem-se
usar as cepas de referncia oxidase-positivas, como N.
gonorrhoeae (cepa de referncia da OMS de 2008; 16), e
negativas, como S. epidermidis (ATCC 12228) ou E. coli
(ATCC 25922).

Figura 4.5
Colnias roxas oxidase-positivas de N. gonorrhoeae em uma placa de cultura (foto esquerda, placa de gar
direita) e papel-filtro ( direita, tambm mostrando uma reao negativa que permanece amarela), aps
reao com soluo aquosa a 1% de tetrametil para-fenilenodiamina dihidrocloreto.

Gonorreia 33
 4.5.6 Confirmao da identificao de N.
gonorrhoeae aps cultura
Trs abordagens podem ser utilizadas para a
confirmao: o uso de testes bioqumicos que diferenciam
a Neisseria divergente e outras espcies intimamente
relacionadas e que fornecem uma identificao completa
das espcies; o uso de reagentes imunolgicos; ou o
uso de deteco molecular, que especfica para N.
gonorrhoeae, mas que apenas confirma a identidade de
N. gonorrhoeae e no determina a espcie de isolados
de reaes negativas. A escolha entre essas abordagens
depender do nmero de isolados a serem testados, sua Figura 4.6
especialidade e custos. Em laboratrios que identificam Produo de cido a partir da utilizao de
isolados gonoccicos com pouca frequncia, sugere-se carboidrato em meio gar cistena tripticase (ACT).
Os tubos da esquerda para a direita so meios
o uso de conjuntos de reagentes (kits) comerciais
base de ACT sem carboidrato, meio ACT contendo
disponveis para fornecer a identificao completa.
1% de glicose e meio ACT contendo 1% de maltose.
Em laboratrios que identificam muitos isolados, a N. O isolado bacteriano inoculado N. gonorrhoeae.
gonorrhoeae frequentemente confirmada por meio Fonte: Reproduzido de Morse SA et al., eds. Atlas
de reagentes especficos e, ento, se algum deles for of sexually transmitted diseases and AIDS, 4th ed.
inesperadamente negativo, dever ser testado em Edinburgh, Saunders/Elsevier, 2010.
seguida utilizando-se um conjunto bioqumico. Nenhum
teste 100% sensvel ou especfico; portanto, se
essencial que esse teste seja realizado utilizando-se
houver recursos, recomenda-se frequentemente que os
uma cultura pura; pode ser necessria pelo menos
isolados clnicos de N. gonorrhoeae sejam confirmados
uma subcultura, resultando em um maior tempo para a
por meio de uma combinao de testes bioqumicos e
confirmao da identificao em relao aos testes mais
imunolgicos (ou testes moleculares, quando disponveis).
rpidos descritos adiante.
Essa abordagem especialmente recomendada para os
laboratrios de referncia. O teste de utilizao rpida de carboidrato (RCUT,
do ingls rapid carbohydrate utilization test) (18, 19),
4.5.6.1 Testes que diferenciam as espcies de que depende de enzimas pr-formadas e no do seu
Neisseria crescimento, utilizando meio lquido inoculado com
Tradicionalmente, a habilidade de N. gonorrhoeae de colnias puras crescidas em abundncia, tambm
produzir cido a partir da utilizao de glicose, detectada eficiente, produzindo resultados em quatro horas.
pela mudana de cor de um indicador de pH devido ao
A deteco rpida de enzimas pr-formadas tambm
seu pH reduzido, em comparao, por exemplo, com
exige uma cultura pura (a qual deve sempre ser
N. meningitidis, que utiliza, adicionalmente, a maltose,
selecionada a partir de um meio no seletivo), mas
tem sido o principal mtodo de identificao desse
no requer incubao ao longo da noite para o teste
patgeno (Tabela 4.4). O nico padro de utilizao de
e fornece resultados mais rpidos. Para todos esses
carboidratos a deteco por meio de inoculao de
testes, importante seguir precisamente as instrues
culturas puras em gar cistena tripticase (ACT) contendo
do fabricante. Basicamente, esses testes detectam
glicose, maltose e sacarose, respectivamente, em uma
enzimas diferentes da via de aminopeptidase e
concentrao final de 1-2%, seguida por 24 horas de
incluem o Gonochek-II (E-Y Laboratories) (17, 19) e o
incubao (Figura 4.6; 17 ).
teste de enzima pr-formada (PET, do ingls preformed
enzyme test; Key Scientific) para Neisseria (17). O teste
Gonochek-II utilizado para diferenciar as espcies

34 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Tabela 4.4: Utilizao de carboidratos (acar) e atividade enzimtica de diferentes espcies de Neisseria e
outras espcies oxidase-positivas como a Moraxella catarrhalis e Kingella denitrificans

Atividade bioqumica
Saccharose Frutose
Espcies Glicose Maltose Lactose (sacarose) (Levulose) ONPGa GGTb PIPc
N. gonorrhoeae + + ()
N. meningitidis + + + () (+)
N. lactamicad + + + + +
N. polysaccharead + + +/ +
N. cineread (+) +
N. subflavad,e + + +/ +/ +
N. sicca + + + + +
N. mucosa + + + + +
N. flavescens +
M. catarrhalis (+)
K. denitrificans + +
a
ONPG, orto-nitrofenil--galactosidase.
b
GGT, -glutamil-aminopeptidase (transferase).
c
PIP, prolyl aminopeptidase (hidroxiprolina aminopeptidase; HPA, prolina arilamidase; PRO)
N. lactamica normalmente cresce em meios seletivos para gonococos, mas tambm podem aparecer essas outras Neisseria saprfita no
d

patognicas.
e
Incluem os biotipos subflava, flava e perflava, os quais diferem em suas atividades contra sacarose e frutose.
+/-, no consistente para a espcie; + (-), maioria positiva, mas existem linhagens negativas; - (+),maioria negativa mas existem linhagens
positivas.

de Neisseria por meio da deteco de trs enzimas
pr-formadas (Prolyl aminopeptidase [PIP, do ingls
prolyliminopeptidase], -glutamil-aminopeptidase e
-galactosidase).
Uma mudana para a cor azul indica que h hidrlise
do 5-bromo-4-cloro-3-indolil--galactosdeo pela
-galactosidase, que indicativo de N. lactamica.
Uma cor amarela indica a hidrlise de -glutamil-
paranitroanilida por -glutamil-aminopeptidase, que
caracterstico de N. meningitidis. Na ausncia de
mudana de colorao, a tampa primria removida e
substituda pela secundria, que apresenta um corante
diazo (que um revelador de cor) e o tubo invertido.
Se a cor vermelha observada, isso indica a hidrlise
de L-prolina-4- metoxinaftilamida e a presena de
PIP, fornecendo uma identificao presuntiva de N.
gonorrhoeae. Os testes PET para Neisseria funcionam
com um princpio similar, com pequenas variaes. Aps
a incubao a 37C por 30 minutos, a mudana de cor
ocorre de acordo com o descrito para Gonochek-II. Se
no houver colorao aps 30 minutos, uma gota do
reagente do PET adicionada e a cor registrada aps
mais dois minutos.
importante observar que algumas espcies de Neisseria
saprfitas, como N. cinerea, N. polysaccharea e N.
subflava, podem aparecer em meios especializados
para gonococos aps 24-48 horas de incubao; essas
espcies apresentam PIP e, portanto, podem produzir
falso-positivos com o GONOchek-II e os kits de PET
para Neisseria. Falso-negativos tambm podem ocorrer
com isolados de N. gonorrhoeae que no apresentam a
expresso de enzimas prolilaminopeptidase funcionais, e

Gonorreia 35
 existe uma disseminao mundial de clones gonoccicos 4.5.6.2 Controle de qualidade (CQ) para ensaios
PIP-negativos (20). Isolados ocasionais de N. meningitidis bioqumicos de verificao de espcies
colhidos em locais urogenitais no apresentam Cada lote novo de ensaios disponveis comercialmente
-glutamil-aminopeptidase. ou de reagentes in-house deve passar pelo controle de
qualidade, utilizando-se cepas bacterianas de referncia
No se recomenda a verificao de espcies utilizando
apropriadas, como N. gonorrhoeae (cepa de referncia
apenas os testes de enzimas pr-formadas. Entretanto,
da OMS de 2008; 16), N. meningitidis (ATCC BAA-335),
uma combinao da utilizao de carboidratos e
N. lactamica (ATCC 23970), N. sicca (ATCC 9913) e N.
a deteco de enzimas pr-formadas, disponvel
cinerea (ATCC 14685). Alm disso, toda vez que se realiza
comercialmente em kits rpidos, fornece uma
o ensaio de confirmao de espcie, as mesmas cepas
identificao mais confivel.
de referncia devem ser includas como controle.
essencial que se sigam rigorosamente as instrues
Recentemente, a espectrometria de massa (EM) por
dos fabricantes para esses testes. O API NH (bioMerieux)
ionizao e dessoro a laser assistida por matriz
e o RapID NH (Remel) (17) so dois exemplos desses kits
tempo de vo (MALDI-TOF, do ingls matrix-assisted
que, infelizmente, podem ser muito onerosos para lugares
laser desorption ionization time of flight) comeou
com recursos limitados. Ambos contm substratos
a ser introduzida em laboratrios com bons recursos
desidratados em uma srie de cpulas ou poos, que so
para a verificao de espcies da maioria das
preenchidos com uma suspenso de colnias a serem
espcies bacterianas, incluindo as de Neisseria (21). O
identificadas; aps 2-4 horas de incubao a 37C, as
equipamento para esse mtodo sofisticado dispendioso.
reaes de colorao so registradas. Um nmero de
Entretanto, o custo para isolados com espcie verificada
perfil produzido e a identificao obtida por meio da
baixo e o mtodo fcil de ser realizado, alm de muito
comparao com um banco de dados (em papel ou pela
rpido. A EM MALDI-TOF parece distinguir efetivamente
internet). O API NH possui 10 poos (permitindo 13 testes
entre espcies de Neisseria comensais e patognicas,
de identificao), que incluem o teste de -lactamase,
alm de distinguir a N. meningitidis da N. gonorrhoeae.
quatro testes de utilizao de carboidrato e oito testes
No entanto, so necessrias avaliaes adicionais.
bioqumicos para diferentes reaes enzima-substrato
Quando o sistema EM MALDI-TOF utilizado para a
(Figura 4.7). O RapID NH consiste em duas cavidades
verificao de espcies de N. gonorrhoeae, importante
de carboidrato e 11 poos bioqumicos para diferentes
seguir precisamente as instrues do fabricante.
reaes enzima-substrato (ver as principais reaes para
distinguir as espcies de Neisseria na Tabela 4.4).

Figura 4.7
Conjunto de identificao API NH demonstrando o perfil de N. gonorrhoeae.

36 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

4.5.6.3 Testes especficos para N. gonorrhoeae
A confirmao por testes especficos para N. gonorrhoeae
pode ser de base imunolgica ou molecular, sendo
especialmente til em laboratrios que lidam com um
grande nmero de isolados para identificao e que
podem pagar por esses testes relativamente mais
onerosos. Tais ensaios so realizados diretamente em
colnias mediante placas de isolamento seletivas e no
exigem o uso de subculturas puras. Isso significa que um
isolado pode ser identificado pelo menos 24 horas antes
do que os ensaios rpidos de carboidrato ou enzima
substrato.
O teste Phadebact Monoclonal GC (Boule) o conjunto
disponvel comercialmente mais popular (17, 19),
que contm uma mistura de anticorpos monoclonais
direcionados porina principal da membrana externa
PorB (Por). Esses anticorpos so absorvidos, por meio
do seu segmento Fc, pela protena A de Staphylococcus
aureus e, quando misturados com o antgeno gonoccico,
ocorre a aglutinao. O teste requer uma suspenso
leve do organismo a ser testado (aproximadamente uma
densidade de 0,5 de acordo com a escala nefelomtrica
de McFarland; ver Anexo 4) feita no tampo do fabricante
ou em soluo salina tamponada com fosfato (PBS, do
ingls phosphate-buffered saline solution), estril a 0,9%,
que ento fervida por 10 minutos e esfriada antes do
seu uso. A suspenso deve ser fervida imediatamente
aps preparada, uma vez que atrasos resultaro em lise
da bactria e liberao do DNA bacteriano, o que pode
causar auto-aglutinao e dificuldade na leitura do teste.
Uma gota da suspenso misturada por dois minutos
a cada um dos dois reagentes, que permitem, alm da
identificao, a determinao do sorogrupo em WI (IA;
PorB1a) e WII/III (IB; PorB1b) (Figura 4.8). O reagente
de colorao azul, para auxiliar na leitura da reao
de aglutinao. O teste apresenta alta sensibilidade
e especificidade, pois uma mistura de anticorpos
especficos (em vez de um nico anticorpo) a um antgeno
conservado. Falso-negativos no so habituais, mas
podem ocorrer.
O reagente imunofluorescente MicroTrak do teste de
confirmao de cultura de N. gonorrhoeae (Trinity
Biotech) (16, 17) usa um conjunto similar de anticorpos
monoclonais a PorB, mas ligado fluorescena. Um
esfregao fino de quatro ou cinco colnias emulsificado
em gua destilada sobre uma lmina de microscpio,
fixado e coberto com o reagente. Aps a incubao a
37C em uma cmara mida, a lmina lavada, seca, e
ento examinada para verificar a presena de diplococos
verdes fluorescentes sob a objetiva de imerso de 100x,
utilizando um microscpio fluorescente. Esse teste
tambm era altamente sensvel e especfico e podia ser
usado diretamente no meio primrio de isolamento, mas,
infelizmente, teve seu uso recentemente descontinuado.
Figura 4.8
Reao de duas cepas de N. gonorrhoeae (A,
poos 1 e 2, e B, poos 5 e 6) com reagentes de
coaglutinao Phadebact WI (poos 1 e 5) e WII/III
(poos 2 e 6).
Fonte: Reproduzido de Morse SA et al., eds. Atlas
of sexually transmitted diseases and AIDS, 4th ed.
Edinburgh, Saunders/Elsevier, 2010.
O GonoGen II (17, 19) tambm emprega um painel
semelhante de anticorpos, mas, nesse teste, os
anticorpos monoclonais so adsorvidos em uma
suspenso de partculas sol-metlica. Quando a cultura
emulsificada nesse tampo solubilizante, a membrana
externa do organismo removida, liberando os
complexos contendo PorB na soluo. Esses complexos
PorB liberados so, ento, capturados por partculas de
anticorpo/sol-metlicas. A mistura amostra/reagente
filtrada por meio de um aparato de matriz especial; os
complexos anticorpo/sol-metlicos de PorB so retidos
pela matriz, resultando em um ponto vermelho. As
partculas anticorpo/sol-metlicas que no se ligaram ao
PorB iro passar pela matriz fornecendo um resultado
negativo (que varia de branco a rosa-claro).
Gonorreia 37
 4.5.6.4 Controle de qualidade (CQ) de testes
imunolgicos de identificao
Cada lote novo de ensaios disponveis comercialmente
ou de reagentes in-house deve passar pelo controle
de qualidade, utilizando-se cepas de referncia de N.
gonorrhoeae para controles positivos de ambos os
sorogrupos WI (IA, PorB1a; por exemplo, a cepa G de
referncia da OMS de 2008; 16) e WII/III (IB, PorB1b; por
exemplo, a cepa K de referncia da OMS de 2008; 16)
e controles negativos de outras espcies intimamente
relacionadas (por exemplo, N. lactamica, ATCC 23970).
Alm disso, cepas de referncia idnticas devem ser
includas todas as vezes que o mtodo for executado.
A confirmao molecular da identidade do patgeno
pode ser realizada utilizando os NAAT descritos na seo
4.6, o que, todavia, mais provavelmente aplicvel aos
laboratrios de referncia.
A cultura sensvel e altamente especfica em
circunstncias otimizadas, relativamente de
baixo custo e fornece organismos viveis para o
teste de susceptibilidade antimicrobiana.
Devido ao elevado nvel de resistncia
antimicrobiana em gonococos no mundo,
essencial que se mantenha e, em vrios lugares,
que se fortalea a capacidade de realizao de
culturas para permitir a vigilncia da resistncia
antimicrobiana.
Para uma cultura sensvel e especfica,
necessrio otimizar e garantir a qualidade da
coleta, transporte e armazenamento de amostras
e metodologia de cultura.
4.6 Deteco molecular
4.6.1 Introduo e ensaios moleculares
A deteco molecular de sequncias especficas dos
cidos nucleicos (DNA/RNA) de N. gonorrhoeae mais
comumente realizada utilizando-se kits disponveis
comercialmente para a deteco tanto de N. gonorrhoeae
como C. trachomatis no mesmo conjunto, algumas vezes
simultaneamente, o que frequentemente apresenta
pouco ou nenhum custo adicional direto. Os primeiros
38 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
testes moleculares desenvolvidos foram os ensaios
de hibridizao de cidos nucleicos no amplificados
(NAH, do ingls non-amplified nucleic acid hybridization
assays), como o PACE 2 (Gen-Probe) e Captura Hbrida
2 (CH2) CT/NG (Digene Corporation). Os ensaios NAH
baseiam-se na ligao de sondas especficas a cidos
nucleicos complementares e subsequente amplificao
do sinal para detectar a ligao. No entanto, os ensaios
NAH so substancialmente menos sensveis que os
NAAT e no devem ser usados para diagnstico quando
os NAAT estiverem disponveis.
Atualmente, os NAAT so usados principalmente para a
deteco de N. gonorrhoeae. Os NAAT para gonococos
detectam uma regio do DNA ou do RNAr especfica
para N. gonorrhoeae, e essa regio varia entre os
diferentes kits (ver Tabela 4.5). A sequncia-alvo
amplificada utilizando uma variedade de mtodos (Tabela
4.5) para produzir mltiplas cpias, que podem ser
facilmente detectadas. Para informaes bsicas sobre
os ensaios NAH e as diferentes tecnologias para NAAT,
ver Anexo 3 e Captulo 5 (C. trachomatis). Os NAAT
para gonococos so altamente sensveis e especficos
(mas a especificidade varia substancialmente entre os
NAAT) e podem ser usados com espcimes coletados
de forma no invasiva (por exemplo, urina, para homens,
e hastes com secreo vaginal, para mulheres). Isso
permite no apenas um nmero maior de pacientes
atendidos nas clnicas ou postos de cuidados primrios
de sade, mas tambm fornece os pr-requisitos
para uma triagem efetiva. Os NAAT, normalmente,
podem ser realizados em um dia til, fornecendo uma
resposta mais rpida que a cultura (mnimo de 2-3 dias)
e podem ser frequentemente usados em combinao
com a automao, permitindo um alto rendimento.
A sensibilidade dos NAAT frequentemente citada
como sendo maior que a da cultura, o que reflete uma
maior tolerncia a inadequaes nos processos de
coleta, transporte e armazenamento de amostras. As
desvantagens em utilizar os NAAT para a deteco
de N. gonorrhoeae incluem o custo de equipamentos
e reagentes, a atual ausncia de NAAT comercial
licenciado para espcimes extragenitais, a incapacidade
de realizar o teste de susceptibilidade antimicrobiana e
a especificidade abaixo do ideal de alguns ensaios NAAT
(ver sees 4.6.2-4). Apesar dessas desvantagens, o uso
de NAAT apropriados, ademais da cultura (para o teste
de susceptibilidade antimicrobiana), deve ser motivado
mesmo para lugares com poucos recursos. Tal pode ser
facilitado pela criao e apoio de laboratrios regionais
de referncia que forneam servios de diagnstico
utilizando esses mtodos. Os laboratrios regionais de
referncia oferecem muitas vantagens, como o maior
volume de testes realizados, adeso rigorosa a boas
prticas laboratoriais e melhoria na especializao
tcnica. O uso de laboratrios regionais pode reduzir o
custo ao se utilizarem ensaios de maior sensibilidade
e resulta em tempos de resposta equivalentes ou
reduzidos.
Os NAAT geralmente oferecem maior
sensibilidade, especialmente para amostras do
reto e da faringe (embora no sejam licenciados);
so normalmente muito especficos e podem ser
utilizados em amostras coletadas de forma no
invasiva.
Os ensaios moleculares so mais tolerantes a
inadequaes na coleta, transporte e condies de
armazenamento, alm de serem objetivos.
A especificidade de muitos NAAT para gonococos
inferior ideal (ver sees 4.6.2-4), o que
resulta em VPP baixo em populaes de baixa
prevalncia; NAAT suplementares que tenham
como alvo outras sequncias podem ser
necessrios para confirmao.
Se os NAAT aprovados internacionalmente no
podem ser utilizados, altamente recomendado
que a efetividade do NAAT proposto para uso
local seja estritamente validada antes que
o teste seja usado, e que a qualidade seja
garantida contra pelo menos um NAAT aprovado
internacionalmente.
Novos ensaios NAAT esto sendo rapidamente
disponibilizados e no podem ser antecipados nesse
documento. importante que se acesse constantemente
a literatura relevante para a avaliao de alta qualidade
dos novos ensaios, a fim de determinar o que melhor se
enquadra a cada laboratrio.
4.6.2 Tipos de espcimes para NAAT para N.
gonorrhoeae
Diferentes tipos de espcimes podem ser usados nos
NAAT, incluindo os de coleta invasiva, como espcimes
de Papanicolau (Pap) lquidos, hastes com secrees
cervicais e hastes com secrees da uretra (homens);
e no invasivos, como hastes com secrees vaginais
e urina (homens e mulheres). Entretanto, os diferentes
fabricantes produzem NAAT que so licenciados para
tipos de espcimes distintos, sendo, portanto, essencial
verificar as instrues do fabricante ou conduzir uma
extensiva validao de testes in-house. Deve-se notar
que a urina no uma amostra ideal para a deteco de
N. gonorrhoeae em mulheres, devido sua sensibilidade
reduzida (22). essencial que se sigam precisamente
as instrues do fabricante referentes s amostras
aprovadas; coleta, transporte e armazenamento de
amostras; e ao desempenho do NAAT.
No existem NAAT licenciados para uso em amostras
extragenitais (do reto e faringe), mas h fortes evidncias
de que os NAAT so mais sensveis para esses locais
do que a cultura (4-6). A validao de dados existe para
apoiar o seu uso, mas se recomenda que um exame
positivo, em ambos os lugares, seja confirmado por
um teste suplementar (um NAAT com outra sequncia-
alvo) para prevenir resultados falso-positivos (23, 24).
A escolha do NAAT para espcimes da faringe deve ser
feita com cautela para evitar aqueles que apresentam
reao cruzada com espcies comensais de Neisseria ou
N. meningitidis.
4.6.3 Especificidade dos NAAT para N.
gonorrhoeae
Historicamente, h uma preocupao quanto
especificidade do alvo escolhido, uma vez que as
espcies do gnero Neisseria so intimamente
relacionadas geneticamente, e um grande nmero de
Neisseria comensais encontrado na faringe, reto e,
algumas vezes, no trato genital inferior. A identificao
da sequncia-alvo especfica para N. gonorrhoeae tem
sido um desafio, e a reao cruzada com vrias espcies
de Neisseria no gonoccicas foi descrita para alguns
kits, incluindo N. meningitidis, N. cinerea, N. flavescens,
N. lactamica, N. sicca e N. subflava (22-28). A gerao
mais recente de kits atualmente disponveis no mercado
Gonorreia 39
 Tabela 4.5: NAAT aprovados pela Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados Unidos da Amrica (FDA)
para a deteco de N. gonorrhoeae (junho de 2012)
APTIMA Tempo
Probetec GC
Teste Combo 2 Cobas Amplicor Cobas 4800 Probetec ET real CT/
Qx
(AC2) NG
Becton, Becton,
Fabricante Gen-Probe Roche Roche Abbott
Dickinson Dickinson

PivNg
Gene da DNA
Regio (homlogo Pili (regio
metiltransferase
Alvo RNAr 16S Repetida da protena diferente da Opa genes
citosina-
Direta 9 (DR9) inversora de Probetec ET)
especfica
pili)

Amplificao Amplificao
mediada por Reao em por
transcrio cadeia da deslocamento
(TMA, polimerase PCR em de cadeia PCR em
Tecnologia SDA
do ingls (PCR, do ingls tempo real (SDA, do tempo real
transcription- polymerase ingls strand
mediated chain reaction) displacement
amplification amplification)

Sim
Teste
(diferentes
suplementar No No No No No
regies do
disponvel
RNAr 16S)

tem melhorado muito quanto a esse quesito, o qual,
entretanto, ainda permanece como um fator a ser
considerado na seleo de kits apropriados para o tipo
de espcime a ser testado, uma vez que nem todos os
NAAT para gonorreia so iguais nesse ponto (26-28).
4.6.4 Sensibilidade, especificidade e
prevalncia: os efeitos no valor preditivo
positivo (VPP)
A prevalncia de gonorreia na populao a ser testada
deve ser considerada juntamente com a sensibilidade
e especificidade do NAAT a ser usado, uma vez que
isso afetar o VPP do teste e, desse modo, o nmero
de falso-positivos obtidos. Tal demonstrado na Tabela
4.6. Um VPP de >90% (usando um NAAT simples ou um
NAAT de triagem alm de um NAAT suplementar com
alvo diferente) foi sugerido como requisito mnimo ao se
utilizar um NAAT para a deteco de N. gonorrhoeae.
Deve-se notar que, mesmo quando a sensibilidade e a
especificidade de um NAAT acima de 95%, o VPP em
uma populao de tanto 1% quanto 5% ainda , para
a maioria dos NAAT, menor que 90%, enquanto que,
em uma prevalncia de 10%, o VPP da maioria (mas
no todos) dos NAAT maior que 90%. Esse aspecto
particularmente importante para NAAT duplos que
detectam tanto N. gonorrhoeae como C. trachomatis,
porque a prevalncia entre essas duas infeces pode
diferir acentuadamente. Em muitos pases, as infeces
por clamdia so comumente detectadas em uma
prevalncia consideravelmente maior que a da gonorreia
e os algoritmos para testar as duas infeces juntas
talvez no precisem de um teste suplementar para a
deteco de C. trachomatis, mas pode ser necessrio
que os exames positivos para gonorreia sejam testados
por um segundo NAAT (com outra sequncia-alvo) para a
obteno de VPP aceitveis.

40 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

4.6.5. NAAT no aprovados pela Administrao
de Alimentos e Drogas dos Estados
Unidos da Amrica (FDA)
Testes de amplificao de cidos nucleicos in-house que
utilizam como alvo, por exemplo, o gene cppB, gene da
DNA metiltransferase citosina-especfica (DMC), genes
opa e o pseudogene porA, foram descritos (24, 29-32)
e so extensivamente utilizados em alguns pases.
Os de maior xito so aqueles que tm como alvo o
pseudogene porA e os genes opa, tanto separados como
em combinao. O pseudogene porA ausente nas
espcies de Neisseria comensais (sendo o gene porA em
N. meningitidis bastante diferente) e, consequentemente,
esse alvo mostrou-se altamente especfico para N.
gonorrhoeae. Entretanto, muitos pases recentemente
descreveram isolados raros de N. gonorrhoeae contendo
um porA meningoccico no lugar do pseudogene porA
gonoccico, resultando em NAAT com resultados
falso-negativos (33-36). Os NAAT que apresentam
como alvo o gene cppB podem variar em sensibilidade
e especificidade, uma vez que alguns isolados de N.
gonorrhoeae no carregam esse gene; reciprocamente,
algumas cepas de N. meningitidis tambm no o
apresentam e geram reao cruzada. Alm disso, os
NAAT que tm como alvo os genes DMC podem mostrar
reao cruzada com espcies de Neisseria comensais.
Consequentemente, os NAAT para os genes cppB e
DMC no so recomendados. Os NAAT in-house podem
necessitar maior conhecimento tcnico; no entanto,
costumam ter sensibilidade e especificidade altas,
alm de envolver menor custo, podendo constituir uma
opo eficiente, principalmente, para nmeros pequenos
de amostras. Tambm foram desenvolvidos ensaios
de reao em cadeia da polimerase multiplex que
detectam, por exemplo, N. gonorrhoeae, C. trachomatis,
Mycoplasma genitalium, e Trichomonasis vaginalis; no
entanto, esses testes necessitam de maior avaliao
concernente s suas caractersticas de desempenho.
Consequentemente, existem, no mundo, muitos
NAAT disponveis comercialmente ou desenvolvidos
internamente para N. gonorrhoeae sendo utilizados.
Se qualquer NAAT no aprovado pela FDA for utilizado,
processos regulatrios regionais, como os da Unio
Tabela 4.6: Efeitos da prevalncia no valor preditivo
positivo (VPP) de testes simples
Testes A B C
Sensibilidade 97,8% 96,4% 98,0%
Especificidade 99,2% 97,9% 99,7%
Prevalncia de 93% 84% 97%
10%
VPP Prevalncia de 87% 73% 95%
5%
Prevalncia de 55% 35% 77%
1%
Europeia e/ou nacionais, devem fornecer garantias
da qualidade e desempenho do NAAT diagnstico.
altamente recomendado que somente os NAAT
aprovados internacionalmente sejam utilizados.
Se isso no for possvel, essencial que o NAAT
proposto seja rigorosamente validado para as
necessidades locais contra, pelo menos, um NAAT
aprovado internacionalmente, antes de ser utilizado
e subsequentemente usado com controles positivo,
negativo e de inibio adequados, assim como para fins
de participao de um sistema de avaliao externa da
qualidade (AEQ) apropriado.
4.6.6 Controle de qualidade (CQ) e avaliao da
qualidade (AQ) dos NAAT
O controle interno da qualidade (CIQ) deve ser includo
em cada teste rodado. A avaliao interna da qualidade
(AIQ) deve ser realizada regularmente por meio de
novos testes em amostras cujo resultado original seja
velado. O nmero e a frequncia dessas AIQ dependero
do nmero total de testes realizados; um exemplo
de 1-5% do total testado a cada ms. A AIQ pode ser
alcanada por meio do uso de painis de espcimes de
fornecedores de AIQ apropriados, tais como o Servio
Nacional de Avaliao Externa da Qualidade do Reino
Unido (UK NEQAS, do ingls United Kingdom National
External Quality Assessment Service; www.ukneqas.
org.uk), ou o Controle de Qualidade dos Diagnsticos
Moleculares (QCMD, do ingls Quality Control of
Molecular Diagnostics; www.qcmd.org), os quais
entregam espcimes para vrios pases, ou por meio de
trocas mais informais de amostras entre laboratrios.
Gonorreia 41
 4.7 Testes point-of-care (POC) (testes Durante a dcada passada, a susceptibilidade s
rpidos) cefalosporinas de amplo espectro tambm diminuiu em
muitas regies do mundo, e a falha teraputica com
Nenhum teste POC (teste rpido) est disponvel
cefixima foi igualmente observada em vrios pases
para a deteco de antgeno com caractersticas de
(39-44). Recentemente, identificou-se a primeira cepa
desempenho apropriadas, por exemplo, sensibilidade
gonoccica amplamente resistente a drogas (XDR, do
e especificidade; dessa forma, nenhum deles pode
ingls extensively-drug resistant; 2) com ndice elevado
ser recomendado para o diagnstico de gonorreia
de resistncia tambm ceftriaxona (a ltima opo
complicada ou descomplicada. No entanto, alguns testes
disponvel para o tratamento emprico de primeira
POC novos, utilizando tecnologia recente, esto sendo
gerao) (3, 43). Se as cepas resistentes ceftriaxona
desenvolvidos e, com caractersticas de desempenho
se espalharem pelo mundo, a gonorreia no ser mais
apropriadas, seriam extremamente teis para o
tratvel com regimes antimicrobianos simples em
diagnstico rpido no local, por exemplo, em clnicas
algumas circunstncias e, especialmente, em alguns
ou em campo. Em populaes recursos limitados e alta
lugares (2). Consequentemente, o monitoramento local,
prevalncia da infeco, principalmente, a diminuio da
regional e global da susceptibilidade antimicrobiana da
sensibilidade pode ser aceitvel em vista da possibilidade
N. gonorrhoeae crucial. A OMS revisou e reformulou
de testar e tratar enquanto o paciente estiver no local do
o Programa de Vigilncia da Susceptibilidade
atendimento (37, 38). Os testes POC podem tambm ser
Antimicrobiana Gonoccica (GASP; do ingls Gonococcal
utilizados nesses lugares para aumentar a especificidade
Antimicrobial Susceptibility Surveillance Programme)
dos algoritmos de gesto sindrmica, o que reduzir o
Global da OMS. Para mais informaes sobre a
tratamento em excesso e encontrar muitas infeces
vigilncia essencial da resistncia antimicrobiana no
assintomticas, principalmente em mulheres. Para o
mundo e sobre o GASP Global da OMS, ver os Padres
diagnstico de gonorreia em homens, a microscopia
de Vigilncia da OMS para Resistncia Gonoccica
aps a colorao de Gram um tipo de teste POC;
Antimicrobiana, Apndice 4. Em junho de 2012, a OMS
entretanto, esse mtodo no apresenta sensibilidade
tambm divulgou o plano de ao global da OMS para
adequada para mulheres.
o controle da disperso e do impacto da resistncia
antimicrobiana em Neisseria gonorrhoeae (disponvel
Nenhum teste POC com sensibilidade apropriada
em: www.who.int/ reproductivehealth/publications/
est disponvel; dessa forma, nenhum pode ser
rtis/9789241503501/en/).
recomendado para o diagnstico de gonorreia.
O mtodo de diluio em gar recomendado como
Entretanto, alguns testes POC novos, utilizando
o padro ouro para o teste da susceptibilidade
tecnologia avanada, esto sendo desenvolvidos e,
antimicrobiana ou para a determinao da concentrao
com caractersticas de desempenho apropriadas,
mnima inibitria (CMI; em g/mL ou mg/L) de isolados
seriam extremamente teis para o diagnstico
gonoccicos para drogas antimicrobianas. Entretanto,
rpido e tratamento imediato do paciente.
esse mtodo pode ser trabalhoso e menos adequado para
a testagem de susceptibilidade de rotina, principalmente
4.8 Teste de susceptibilidade antimicrobiana
se for realizado em um pequeno nmero de cepas. Dessa
4.8.1 Introduo forma, o mtodo-padro e de qualidade garantida, o
A N. gonorrhoeae desenvolveu resistncia a todos os Etest, intimamente relacionado ao mtodo de diluio
antibiticos prvios de primeira gerao para o seu em gar, comumente utilizado. Uma determinao
tratamento como, por exemplo, penicilina, tetraciclina qualitativa da susceptibilidade antimicrobiana pode
e fluoroquinolonas , deixando apenas as cefalosporinas ser obtida usando um ensaio de disco-difuso.
de amplo espectro, ceftriaxona e cefixima, como os Vrios mtodos de disco-difuso tambm esto em
nicos antibiticos recomendados para o tratamento uso; entretanto, eles exigem uma padronizao bem
de infeces gonoccicas em muitos pases (2). estabelecida e CQ apropriado para atingir um alto nvel
de reprodutibilidade e interpretao correta, a fim de

42 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

refletir adequadamente os valores de CMI dos diferentes
agentes antimicrobianos. Os mtodos de disco-difuso
tm baixo custo, mas apenas so recomendados quando
a determinao da CMI no pode ser realizada, devido
limitao de recursos ou outros motivos. Se o mtodo
de disco-difuso for utilizado, recomenda-se que a
identificao de qualquer resistncia nova, emergente
ou rara seja confirmada pela determinao da CMI. A
produo de -lactamase normalmente determinada
por um teste de cefalosporina cromognica, utilizando
discos ou solues de nitrocefina.
Todos os mtodos para o teste de susceptibilidade
antimicrobiana devem ser realizados a partir de culturas
puras e frescas (18-24 horas) de N. gonorrhoeae,
retiradas de um meio de cultura no seletivo. O isolado
tambm deve ser verificado apropriadamente quanto
espcie e subcultivado pelo menos uma vez. No teste
de susceptibilidade antimicrobiana, importante seguir
precisamente todos os passos do mtodo escolhido,
incluindo a seleo e o uso do meio gar, os reagentes
(p antimicrobiano, tiras para Etest, discos e tampes), a
inoculao, a incubao e a interpretao.
Devido ao elevado nvel de resistncia
antimicrobiana em gonococos no mundo e ao receio
de que a gonorreia possa se tornar no tratvel em
certas circunstncias e, principalmente em alguns
lugares, essencial monitorar a susceptibilidade
antimicrobiana de N. gonorrhoeae.
A determinao da CMI realizada pelo mtodo de
diluio em gar ou Etest.
Uma determinao qualitativa da susceptibilidade
antimicrobiana pode ser obtida usando mtodos de
disco-difuso.
Os mtodos de disco-difuso necessitam de
padronizao e CQ apropriados e, sobretudo,
no medem, mas apenas refletem a CMI. Esses
mtodos s devem ser utilizados quando a
determinao da CMI no pode ser realizada em
razo, por exemplo, de limitaes de recursos.
Em todos os testes de susceptibilidade
antimicrobiana, essencial seguir precisamente
o mtodo escolhido, o qual deve ser devidamente
padronizado, validado e com qualidade garantida.
4.8.2 Escolha dos antibiticos inclusos no teste
de susceptibilidade antimicrobiana
A lista de antibiticos a serem testados deve incluir
drogas recomendadas nacional e regionalmente,
utilizadas para o tratamento de infeces gonoccicas,
bem como as drogas recomendadas pelo programa
local de vigilncia susceptibilidade antimicrobiana. No
entanto, principalmente nos laboratrios de referncia,
antibiticos adicionais podem ser testados, tais como
antibiticos recomendados para tratamento em outros
lugares, antibiticos candidatos para tratamentos futuros
e drogas teis para estudos longitudinais locais de N.
gonorrhoeae.
4.8.3 Determinao da CMI (diluio em gar e
Etest)
4.8.3.1 Meios de gar recomendados
O meio recomendado para a determinao da CMI dos
diferentes antibiticos, usando diluio em gar ou
Etest, para isolados de N. gonorrhoeae, um meio gar
base GC apropriado, a exemplo do meio base GC Difco,
acrescido de um suplemento de crescimento definido a
1%* ou IsovitaleX/Vitox a 1%. Como um exemplo, ver o
meio GCVIT descrito no Anexo 4.
*De acordo com o Instituto de Padres Clnicos e
Laboratoriais (CLSI, do ingls Clinical and Laboratory
Standards Institute; 45): 1,1g de L-cistena; 0,03g de
guanina HCL; 3mg de tiamina HCl; 13mg de cido
para-aminobenzoico (PABA); 0,01g de B12; 0,1g de
cocarboxilase; 0,25g de NAD; 1g de adenina; 10g de
L-glutamina; 100g de glucose e 0,02g de nitrato frrico
(em 1L de H2O). O suplemento de crescimento sem
cistena necessrio para os testes de diluio em gar
com carbapenmicos e clavulanato.
4.8.3.2 Critrios de interpretao
Os critrios de interpretao para susceptibilidade,
susceptibilidade intermediria (reduzida) e resistncia
recomendados mediante a determinao da CMI esto
descritos na Tabela 4.7. Esses critrios so do CLSI (45),
com exceo do critrio para azitromicina (para o qual
o CLSI (45) no postulou nenhum critrio), que pertence
ao Comit Europeu para o Teste a Susceptibilidade
Antimicrobiana (EUCAST, do ingls European Committee
Gonorreia 43
 on Antimicrobial Susceptibility Testing; www.eucast. antimicrobiana para N. gonorrhoeae; em geral,
org). O EUCAST outra organizao que postula critrios seus pontos crticos so levemente inferiores aos
de interpretao para os testes de susceptibilidade recomendados pela CLSI.

Tabela 4.7: Critrios de interpretao da CMI para categorizar a N. gonorrhoeae em categorias de

susceptibilidade de acordo com a CLSI, com exceo do critrio para a azitromicina, da EUCAST

CMI (mg/L)
Antibiticos Susceptibilidade
Susceptvel (S) Resistente (R)
intermediria (I)
Ceftriaxona 0,25 ASDa ASDa

Cefotaxima 0,5 ASDa ASDa

Cefixima 0,25 ASDa ASDa

Cefpodoxima 0,5 ASDa ASDa

Benzilpenicilina 0,06 0,12-1 2

Ciprofloxacina 0,06 0,12-0,5 1

Ofloxacina 0,25 0,5-1 2

Espectinomicina 32 64 128

Azitromicinab 0,25 0,5 1c

CMI: concentrao mnima inibitria.

a
ASD: a ser determinado. Devido ausncia de um nmero adequado de cepas resistentes e correlaes baseadas em evidncia entre a CMI dos
isolados e o resultado do tratamento, os pontos crticos ainda no podem ser determinados.
b
O CLSI (45) ainda no postulou os pontos crticos para a azitromicina e, consequentemente, so fornecidos os pontos crticos do Comit Europeu
para o Teste Susceptibilidade Antimicrobiana (EUCAST, do ingls European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing; www.eucast.org).
c
Nas Amricas do Norte e do Sul, um ponto crtico de resistncia de 2mg/L frequentemente usado, de acordo com a recomendao dos Centros
de Controle e Preveno de Doenas dos Estados Unidos da Amrica (www.cdc.gov/std/GISP2007/).

4.8.3.3 Controle de qualidade (CQ) para a determinao
da CMI (diluio em gar e Etest)
Idealmente, uma seleo apropriada da cepa de
referncia de N. gonorrhoeae da OMS de 2008
(16) deveria ser includa em cada lote de teste de
susceptibilidade, e sempre que um novo lote de
antibitico em p, meio gar ou tiras de Etest so
usados. A CMI de cada antibitico e a cepa de referncia
devem ser documentadas em um grfico de CQ. Para
os valores de CMI aceitveis de diferentes antibiticos
no CQ, ver Tabela 4.8. As cepas de referncia de N.
gonorrhoeae da OMS de 2008 (16) tambm esto
disponveis na Coleo Nacional de Culturas Tipo (NCTC,
do ingls National Collection of Type Cultures; www.
hpacultures.org.uk/collections/nctc.jsp), denominadas
de NCTC 13477-13484, e na Coleo de Culturas da
Universidade de Gotemburgo, Sucia (CCUG; www.
ccug.se), denominadas de CCUG 57595-57602. As
cepas de referncia de N. gonorrhoeae da OMS de
2008 (16) tambm podem ser utilizadas para o CQ em
outros testes laboratoriais fenotpicos e de gentica
para N. gonorrhoeae, bem como nos sistemas de AEQ.
Os Padres de Vigilncia da OMS para Resistncia
Gonoccica Antimicrobiana, Apndice 4, descrevem em
detalhes as aplicaes das cepas de referncia de N.
gonorrhoeae da OMS de 2008 (16) e as instrues para
seu uso. No entanto, no necessrio utilizar todas
as oito cepas de referncia de N. gonorrhoeae da OMS
de 2008 (16) para o CQ no teste de susceptibilidade
antimicrobiana. Muitos locais utilizam principalmente a

44 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

WHO G, WHO K, WHO M, WHO O e a WHO P. O painel
de N. gonorrhoeae da OMS de 2008, o painel original
(cepas A-E) e as cepas de referncia adicionais de N.
gonorrhoeae tambm esto disponveis em fontes da
OMS, tais como o Centro de Colaborao da OMS para
HIV e DST, Sidney, Austrlia, e o Centro de Colaborao
da OMS para Gonorreia e outras DST, rebro, Sucia.
4.8.4 Mtodo de diluio em gar para a
determinao da CMI
4.8.4.1 Introduo
O mtodo de diluio em gar recomendado
como padro ouro para o teste quantitativo de
susceptibilidade antimicrobiana ou determinao da
CMI de isolados gonoccicos a antibiticos. Agentes
antimicrobianos so incorporados em gar base GC

Tabela 4.8: Intervalos aceitveis da CMI, categorizao da susceptibilidade antimicrobiana (modificado da

referncia 16) e algumas caractersticas adicionais de determinao de tipo para as cepas de referncia de
N. gonorrhoeae da OMS de 2008 recomendadas para CQ. Incluem-se os intervalos aceitveis da CMI para N.
gonorrhoeae ATCC 49226 recomendados pela CLSI

Agentes Cepas de referncia da OMS ATCC

antimicrobianos
WHO F WHO G WHO K WHO L WHO M WHO N WHO O WHO P 49226a
(mg/L)
0,125
0,016 0,251,0 1,04,0 1,04,0 4,016,0 4,016,0
Penicilina G 0,064 (S) (I) (R) (R) (R) (R)
>32 (R) 0,5 0,251,0
(I)
0,125 <0,016
<0,016 <0,016 0,251,0 <0,016 <0,016 <0,016 0,004
Cefixima (S) (S) (SR)b
0,5
(S) (S)
0,032
(S) 0,032
(SR)b (S)
0,004 0,032 0,064 0,008 0,002 0,016 0,002
<0,002 0,004
Ceftriaxona (S)
0,016 0,125 0,25 0,032 0,008 0,064 0,008
0,016
(S) (SR)b (SR)b (S) (S) (S) (S)

0,25 0,5 0,5 1,0 0,5 0,251,0 0,5 2,0 1,0

Eritromicina 1,0 (S) 2,0 (I) 2,0 (I) 4,0 (I) 2,0 (I) (S) 2,0 (I) 8,0 (R) 2,0c

0,125 0,125
0,064 0,125 0,25 0,1250,5 0,064 1,0 0,5
Azitromicina 0,25 (S)
0,5
0,5 (S) 1,0 (I) (S) 0,25 (S)
0,5
4,0 (R) 1,0c
(S) (S)
0,002
0,002 0,064 1,04,0 2,08,0 0,004 0,001
Ciprofloxacina 0,008 (S) 0,25 (I)
>32 (R) >32 (R)
(R) (R) 0,016 (S)
0,008
0,008
(S)

1664 832 >1024 832

Espectinomicina (S) (S)
832 (S) 832 (S) 832 (S) 832 (S)
(R) (S)
8,032,0

Produo de
No No No No Sim Sim Sim No No
-lactamase
Sorotipo Arst Arst Bpyust Brpyust Bpyust Arst Boys Bopt

NG-MASTd ST3303 ST621 ST1424 ST1422 ST3304 ST556 ST495 ST3305

PIP-negativoe No Sim No No No Sim No No

Note-se que as CMI exatas mostradas devem ser usadas e interpretadas com cautela, pois foram definidas utilizando-se apenas um mtodo Etest
especfico e, consequentemente, podem diferir ao se utilizarem outros mtodos. Entretanto, os fentipos de resistncia identificados (categorizao
SIR) devem ser consistentes entre os diferentes mtodos.
a
Intervalos aceitveis da CMI (CLSI; 45).
b
SR: susceptibilidade reduzida, pois os isolados com essas CMI apresentam os determinantes primrios para resistncia s cefalosporinas de
amplo espectro.
c
Intervalo estabelecido pelo Laboratrio Nacional de Microbiologia, Canad.
d
Determinao do tipo de sequncias de mltiplos antgenos de N. gonorrhoeae.
e
No produz a enzima prolilaminopeptidase (PIP, do ingls prolyliminopeptidase), o que pode resultar na identificao duvidosa ou falso-negativa
de espcies de N. gonorrhoeae utilizando alguns testes bioqumicos ou de enzima-substrato (17, 20).

Gonorreia 45
 acrescido de suplemento de crescimento definido a 1%
ou IsovitaleX/Vitox a 1% (ver seo 4.8.3.1) em diluies
seriadas duplicadas. Os isolados de N. gonorrhoeae a
serem testados crescem ao longo da noite em meio
gar GC no seletivo, sendo posteriormente suspensos
em caldo Mueller-Hinton (MH) ou soluo salina estril
(ou equivalente). Aproximadamente 104 unidades
formadoras de colnias (UFC) so, ento, inoculadas
na superfcie do meio contendo o antibitico e em
duas placas com meio controle sem antibitico, com
o repicador de Steer, o inoculador mltiplo ou uma
ala calibrada. As placas so finalmente incubadas ao
longo da noite e subsequentemente examinadas quanto
ao seu crescimento. A CMI do agente antimicrobiano
para um isolado a concentrao mais baixa que inibe
seu crescimento. A tcnica de diluio em gar por
pontos crticos uma modificao do mtodo completo
de diluio em gar para a CMI, que um mtodo
similar, mas com meio gar contendo apenas uma ou
duas concentraes de antibiticos, que podem ser
usadas para categorizar os isolados como resistentes
(usando uma placa de gar contendo exatamente a
concentrao do ponto crtico para resistncia) ou com
susceptibilidade intermediria (usando uma placa de
gar contendo exatamente a concentrao do ponto
crtico para susceptibilidade intermediria). A tcnica
de ponto crtico til para triar um grande nmero de
isolados.
4.8.4.2 Preparo de solues antimicrobianas
Os ps ou pastilhas antimicrobianos prprios para
serem dissolvidos devem ser obtidos diretamente de
companhias farmacuticas ou outros fornecedores
validados. Uma vez que a maioria dos antibiticos no
so 100% puros, a concentrao incorporada nas
placas de gar deve basear-se na atividade ou potncia
(droga ativa por mg) do antibitico, como especificado
pelo fabricante. As instrues do fabricante quanto
dissoluo do p antimicrobiano, a data de expirao e
as instrues para armazenamento devem ser seguidas
detalhamente. Os antibiticos so incorporados ao meio
gar em dissolues dobradas, por exemplo, usando um
esquema no qual uma parte da soluo do antibitico
adicionada para nove partes de gar (ver seo 4.8.4.3).
46 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Por exemplo, prepare solues-estoque por meio da
dissoluo de 128mg ou o peso equivalente a 128mg do
ingrediente ativo em uma quantidade mnima do solvente
apropriado (normalmente 5-10mL; siga precisamente
as instrues do fabricante), diluindo-as em seguida
com gua destilada (ou outro solvente recomendado)
para o volume exato de 25mL. Essas solues-estoque
contm o produto antimicrobiano a uma concentrao
de 5120mg/L, que prtica para preparar as solues
com as quais de fato se trabalhar. Caso no haja
contra indicaes pelo fabricante, os solventes listados
na Tabela 4.9 podem ser utilizados para a preparao
das solues-estoque. As solues-estoque podem
ser esterilizadas por membrana de filtrao (filtro
de 0,22m) e armazenadas em alquotas em tubos
devidamente selados a -20C ou, preferencialmente, a
-70C, por at seis meses. Quando descongeladas, as
solues devem ser usadas imediatamente, no devendo
ser congeladas novamente para uso posterior.
Para uso subsequente, prepare uma srie de diluies
dobradas para cada antibitico contendo concentraes
do agente antimicrobiano 10 vezes maior que a
concentrao final a ser obtida no gar. Um exemplo de
esquema padronizado para a preparao de diluies
com as quais se trabalhar mostrado na Tabela 4.10.
O intervalo de concentraes utilizado no teste de
susceptibilidade antimicrobiana deve ser adaptado a
cada antibitico e aos nveis de resistncia local. Para
muitos antibiticos, existe uma grande variao no
padro de susceptibilidade dos isolados gonoccicos
de diferentes pases. Para se diminuir o nmero de
concentraes a serem testadas, necessrio haver
uma aproximao da variao da susceptibilidade local
aos antibiticos testados. Caso seja desconhecida,
essa aproximao pode ser obtida por meio da
determinao dos limites inferior e superior do intervalo
de susceptibilidade desses antibiticos a um pequeno
nmero de isolados. Em geral, mais relevante e
importante conhecer o limite superior dos valores da CMI
do que o inferior.
4.8.4.3 Preparo de placas para o mtodo de diluio
em gar
Para cada antibitico e concentrao de antibitico a ser
testada, prepare um volume de, por exemplo, 89mL de
gar base GC adequado, tais como o meio base Difco estoque as placas invertidas em sacos plsticos selados,
GC (3,6 g de gar base GC e 89mL de gua destilada), a 4C, at que sejam utilizadas. Nessas condies, no
em uma garrafa de vidro, que servir para a preparao h perda significativa da atividade antimicrobiana por at
de quatro placas. Autoclave o meio gar na garrafa e, duas semanas. Entretanto, para penicilina, que menos
ento, deixe esfriar a at uma temperatura de 50C estvel, recomenda-se que as placas sejam usadas em
em banho-maria, antes de adicionar assepticamente uma semana. Da mesma forma, placas com gar sem
suplementos estreis (1mL de suplemento/IsoVitalex/ antibiticos devem ser preparadas para ser utilizadas
Vitox) e 10mL de soluo antimicrobiana pronta para como controle negativo.
ser utilizada, isto , na concentrao a ser testada
(ver Tabela 4.10). Imediatamente, misture de forma 4.8.4.4 Procedimento da determinao da CMI
gentil, invertendo a garrafa trs vezes; remova a tampa utilizando diluio em gar
da garrafa, passe o bocal pela chama e derrame, Preparao do inculo bacteriano: use uma ala ou
aproximadamente, 20-25mL do meio nas placas uma haste estril para coletar a N. gonorrhoeae a partir
(90mm de dimetro) para formar uma camada de de uma cultura pura de 18-24 horas em um meio gar
aproximadamente 3,5-4,5mm. Certifique-se de eliminar no seletivo para gonococos, e prepare uma suspenso
as bolhas, movendo as placas gentilmente ou flambando homogeneizada de clulas (equivalente a 0,5 no padro
rapidamente a superfcie do gar, por exemplo, com o nefelomtrico de McFarland, aproximadamente 108 UFC
auxlio da chama de um bico de Bunsen. Uma vez que por mL) em 1mL de caldo MH ou soluo salina estril
o gar esteja solidificado em temperatura ambiente, (a soluo deve ser usada em no mximo 15 minutos).
Dilua em 1:10 a suspenso em caldo MH ou soluo
Tabela 4.9: Solventes usados na preparao de
salina estril para obter 107UFC/mL. Cuidadosamente,
solues antimicrobianas para a determinao da
CMI, utilizando o mtodo de diluio em gara transfira 0,5mL de cada suspenso para o repicador
correspondente ou para o poo do inoculador mltiplo.
Antibitico Solvente
Inoculao de placas: as placas de gar devem secar
Ceftriaxona gua destilada antes da inoculao, isto , devem ser colocadas em
uma incubadora na posio invertida com a tampa
Cefixima Tampo fosfato a 0,1mol/L aberta. O repicador ou o inoculador mltiplo deve
Benzilpenicilina gua destilada transferir aproximadamente 1-2L de cada suspenso
para a superfcie do gar em reas circulares com
Ciprofloxacina gua ou HCL a 0,1mol/L dimetros de 5-7mm, resultando em um inculo
Etanol a 95% ou cido actico bacteriano final de aproximadamente 104 UFC por local.
Azitromicina glacialb Ao testar um pequeno nmero de isolados, pode-se
Etanol a 95% ou cido actico
Eritromicina utilizar uma ala plstica estril de 1L. Inocule
glacialb
primeiramente uma placa de controle negativo (no
Espectinomicina gua destilada
contendo antibitico), seguindo com a srie de placas
Gentamicina gua destilada contendo concentraes diferentes de antibitico,
comeando com a de menor concentrao de cada
Canamicina gua destilada
antibitico.
Tetraciclina gua destilada
Finalmente, inocule uma segunda placa de controle
Cloranfenicol Etanol a 95% negativo para garantir que no houve contaminao
a
Se o solvente ou o mtodo para a dissoluo do antibitico em p
durante a inoculao. As cepas de referncia de N.
fornecido pelo fabricante, siga precisamente as instrues includas. gonorrhoeae da OMS de 2008 (16) so recomendadas
b
Para o cido actico glacial, use gua destilada para a metade do como CQ (ver Tabela 4.8). Deixe o inculo secar e incube
volume e adicionar o cido actico glacial gota a gota, at que este se
dissolva; no exceder 2,5L/mL. as placas invertidas por 20-24 horas a 361C em uma
atmosfera enriquecida com CO2 a 51% com umidade

Gonorreia 47
 Tabela 4.10: Preparo de diluies dos agentes antimicrobianos para a determinao da CMI, utilizando o
mtodo de diluio em gar

Soluo antimicrobiana Concentrao da Concentrao

Volume
diluio com a final na diluio
Passo Concentrao Volume de gua =
Fonte + qual se trabalhar de 1:10 em gar
(mg/L) (mL) destilada
(mg/L) (mg/L)
1 5120 Estoque 1
2 5120 Estoque 1 1 2560 256
3 5120 Estoque 1 3 1280 128
4 5120 Estoque 1 7 640 64
5 640 Passo 4 1 1 320 32
6 640 Passo 4 1 3 160 16
7 640 Passo 4 1 7 80 8
8 80 Passo 7 1 1 40 4
9 80 Passo 7 1 3 20 2
10 80 Passo 7 1 7 10 1
11 10 Passo 10 1 1 5 0,5
12 10 Passo 10 1 3 2,5 0,25
13 10 Passo 10 1 7 1,25 0,125
14 1,25 Passo 13 1 1 0,625 0,06
15 1,25 Passo 13 1 3 0,3125 0,03
16 1,25 Passo 13 1 7 0,156 0,016
17 0,156 Passo 16 1 1 0,08 0,008
18 0,156 Passo 16 1 3 0,04 0,004
19 0,156 Passo 16 1 7 0,02 0,002

Figura 4.9
Resultados da determinao da CMI para N. gonorrhoeae usando o mtodo de diluio em gar. O meio
contendo 0,5mg/L de penicilina (placa esquerda) mostra a inibio de vrias cepas gonoccicas, enquanto
todas as cepas crescem satisfatoriamente no meio controle (placa a direita).

48 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

alta (70-80%). Esterilize os alfinetes e poos: envolva-os
em papel alumnio e os autoclave, colocando-os em
forno quente a 160C por duas horas ou mergulhando-os
em etanol a 70%; em seguida, passe-os pela chama.
Leitura dos resultados: os resultados das cepas
de referncia da OMS de 2008 (ver Tabela 4.8 para
valores aceitveis da CMI de diferentes antibiticos) e
as placas de controle negativo (deve haver crescimento
puro e aderente de gonococos em ambas as placas)
devem ser revisados e aprovados antes de se ler os
outros resultados. Se no forem aprovados, verificar os
possveis problemas e repetir o teste. Para os isolados
testados, registre a CMI como a menor concentrao
de agente antimicrobiano que inibe completamente o
crescimento.
Interpretao de resultados: interprete os
resultados para os isolados testados em categorias de
susceptibilidade (ver Tabela 4.7).
4.8.5 Mtodo Etest para a determinao da CMI
4.8.5.1 Introduo
O Etest uma tcnica quantitativa para a determinao
da CMI de agentes antimicrobianos contra
microrganismos. O Etest utiliza tiras plsticas calibradas
com uma escala de CMI em g/mL (mg/L) e um
cdigo para identificar o agente antimicrobiano. Um
gradiente de concentrao pr-definido de antibiticos
imobilizado na outra superfcie da tira. Uma vez aplicado
na superfcie de uma placa de gar, o antibitico se
difunde no meio. A N. gonorrhoeae inoculada no meio
(antes da adio da tira) mostrar uma zona elptica
de inibio de crescimento aps incubao ao longo
da noite, se susceptvel ao teste antimicrobiano. A CMI
dever ser lida como uma interseco da elipse e da
escala gradiente marcada na tira. As instrues do
fabricante devero ser seguidas cuidadosamente quanto
ao armazenamento das tiras, desempenho e leitura dos
resultados do Etest.
4.8.5.2 Procedimento de determinao da CMI usando
Etest
1. Seque (retire a umidade visvel, mas no enxugue
em excesso) o nmero de placas de gar GCVIT (ver
Anexo 4) necessrias.
2. Deixe que as tiras do Etest alcancem a temperatura
ambiente por aproximadamente 30 minutos. Um
pacote de Etest aberto dever ser armazenado em
um recipiente hermtico com dessecante.
3. Use uma ala ou uma haste estril para coletar
a N. gonorrhoeae a partir de uma cultura pura
de 18-24 horas em um meio gar no seletivo
para gonococos e prepare uma suspenso
homogeneizada de clulas (0,5 no padro
nefelomtrico de McFarland, aproximadamente 108
UFC por mL) em 1mL de soluo salina estril ou
PBS (a suspenso deve ser usada em no mximo 15
minutos). No use um caldo nutritivo para preparar
a suspenso.
4. Mergulhe uma haste estril na suspenso e remova
o excesso de fluido, pressionando e girando a haste
contra a parede do tubo.
5. Passe a haste por toda a superfcie do gar da
placa com GCVIT, uniformemente, em trs direes
(Figura 4.10) para produzir uma camada aderente.
6. Recoloque a tampa da placa e deixe a superfcie de
gar secar por aproximadamente 10 minutos.
7. Pressione o aplicador do Etest em uma tira do Etest
para colet-la (ou use uma pina estril), coloque-a
na superfcie do gar e empurre o pisto para baixo
para soltar a tira.
8. Confira se a tira est em completo contato
com o gar e remova possveis bolses de ar,
cuidadosamente, com o auxlio de uma ala da
menor para a maior concentrao do antibitico.
9. Coloque no mximo quatro tiras de Etest por placa
de 140-150mm e uma tira por placa de 90mm.
10. Uma vez aplicada no gar, a tira de Etest no deve
ser removida (o antibitico prontamente liberado).
11. Incube, imediatamente, as placas invertidas por
20-24 horas a 361C em uma atmosfera mida
(70-80%) rica em CO2 a 51% (incubador de CO2
ou, caso este no esteja disponvel, um jarro de
anaerobiose com vela com umidade adicional).
Gonorreia 49
 1. Pincele a cultura de cima
para baixo com um trao nico
sobre toda a superfcie de gar.
Figura 4.10
Pincelagem da placa de cultura para Etest.
2. Gire a placa 90 e pincele de 3. Gire a placa 45 e pincele,
cima para baixo com um trao novamente, de cima para baixo
nico sobre toda a superfcie com um trao nico sobre toda
de gar. a superfcie de gar.

4.8.5.3 Leitura e interpretao dos resultados do Etest

aps incubao
1. Os resultados das cepas de referncia da OMS de
2008 (ver Tabela 4.8 para as CMI aceitveis dos
diferentes antibiticos), quando includas como
CQ, devem ser revisados e aprovados antes que
os outros resultados sejam lidos. Se no forem
aprovados, verificar os possveis problemas e
repetir o teste. Para os isolados testados, leia as
placas apenas se observar crescimento suficiente e
se a elipse de inibio for claramente visvel. Caso
contrrio, o teste dever ser repetido com maior
crescimento.
Figura 4.11
2. Leia a CMI exata onde a elipse (zona) intercepta a Resultado da determinao da CMI em N.
escala de CMI na tira do Etest (Figura 4.11). Se a gonorrhoeae usando o Etest. A CMI da penicilina G
elipse de inibio intercepta a tira do Etest entre (PG) determinada no ponto em que a elipse cruza a
dois valores de CMI, o valor mais alto deve ser tira (0,094mg/L).
considerado. Sempre leia o ponto final da completa
inibio de todo o crescimento, incluindo nvoas, 4.8.6 Mtodo de disco-difuso
microcolnias e macrocolnias isoladas.
4.8.6.1 Introduo
3. O crescimento ao longo de toda a tira implica a
Os ensaios de disco-difuso so tcnicas qualitativas
ausncia de inibio, isto , a CMI maior que (>)
para categorizar os isolados como susceptveis,
a maior concentrao da tira. Se a elipse de inibio
susceptveis intermedirios (ou susceptibilidade
est abaixo da tira e no a intercepta, a CMI
reduzida) ou resistentes para os diferentes antibiticos.
menor que (<) a concentrao mais baixa da tira.
Consequentemente, esses mtodos no determinam a
4. Interprete os resultados para os isolados testados CMI exata dos antibiticos contra os microrganismos;
em uma categoria de susceptibilidade (ver Tabela entretanto, eles devem refletir a CMI. Os mtodos de
4.7). disco-difuso usam discos disponveis comercialmente,
impregnados com uma concentrao conhecida de

50 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

antibitico. O agente antimicrobiano no disco se difunde
sobre a superfcie de gar inoculada com o isolado
bacteriano e produz um gradiente de concentrao que
maior prximo ao disco e diminui proporcionalmente
ao se distanciar do disco. Aps a incubao, a zona
de inibio visvel, a qual deve ser medida e,
subsequentemente, interpretada em uma categoria
de susceptibilidade. Vrios mtodos de disco-difuso
so usados internacionalmente; entretanto, todos
exigem uma padronizao rigorosa e CQ apropriado
para obter um alto nvel de reprodutibilidade e reflexo
suficiente da CMI dos antibiticos analisados. A principal
diferena entre eles a potncia dos discos (contedo
de antibitico) e o gar utilizado, o que resulta em
diferentes pontos crticos para a categorizao da
susceptibilidade. Os mtodos de disco-difuso do
CLSI (45) e da Sociedade Britnica para Quimioterapia
Antimicrobiana (BSAC, do ingls British Society for
Antimicrobial Chemotherapy; www.bsac.org.uk) so
usados e recomendados em vrias regies (46). Este
manual da OMS descreve o mtodo do teste de disco-
difuso de sensibilidade dicotmica calibrada (SDC) (47,
48). O mtodo SDC usado para o teste e vigilncia
da susceptibilidade antimicrobiana gonoccica, por
exemplo, na OMS do Pacfico Ocidental ou do Sudeste da
sia. NOTA: o meio gar, o procedimento e os critrios
de interpretao do mtodo SDC difere dos outros
mtodos de disco-difuso. Se esses mtodos forem
utilizados, necessrio que suas instrues sejam
estritamente seguidas.
4.8.6.2 Meio gar recomendado para o mtodo SDC
O meio de teste utilizado no mtodo SDC para isolados
de N. gonorrhoeae o gar-chocolate, incluindo o gar
base Columbia (o da Oxoid adequado; outras marcas
comerciais devem ser avaliadas quanto qualidade) com
8% de sangue de cavalo achocolatado a 70C por 30
minutos (ver Anexo 4). Outros meios no foram validados
e no devem ser utilizados sem uma avaliao estrita e
provveis ajustes dos critrios interpretativos.

Tabela 4.11: Critrios interpretativos para categorizar a N. gonorrhoeae em categorias de susceptibilidade

utilizando o mtodo SDC; o halo de inibio deve ser medido em mm, e no o dimetro da zona

Contedo do Categorias de susceptibilidade

Antibitico
disco Susceptibilidade
Resistncia Susceptibilidade
reduzida
Benzilpenicilina 0,5UI <3mm 3-9mm 9mm

Azitromicina 15g <8mm - 8mm

Teste de ciprofloxacinaa

- cido nalidxico 30g 0mm 0mm >6mm

- Ciprofloxacina 1g 6mm >6mm >6mm

Teste de ceftriaxonab

- Ceftriaxona 0,5g ASDc 5-9mm >9mm

- Cefpodoxima 10g ASDc 12mm >12mm

Espectinomicina 100g <6mm - 6mm

a
Para testar a susceptibilidade de fluoroquinolonas (ciprofloxacina), ambos os discos com cido nalidxico e ciprofloxacina devem ser utilizados e
interpretados simultaneamente.
b
Para testar a susceptibilidade de ceftriaxonas, ambos os discos com ceftriaxona e cefpodoxima devem ser utilizados e interpretados
simultaneamente.
c
ASD: a ser determinado. Devido ausncia de um nmero adequado de cepas resistentes e correlaes baseadas em evidncias entre as CMI dos
isolados e o resultado do tratamento, os pontos crticos ainda no podem ser determinados. Os isolados com susceptibilidade reduzida/resistncia
ceftriaxona devem ser confirmados pelo teste de CMI (diluio em gar ou Etest) pelo laboratrio local ou, idealmente, em um Laboratrio de
Referncia da OMS.

Gonorreia 51
 4.8.6.3 Critrios interpretativos para o mtodo SDC secar). Se s estiverem disponveis colnias
A Tabela 4.11 descreve os critrios interpretativos para pequenas (<1mm), talvez seja necessrio coletar
susceptibilidade, susceptibilidade reduzida e resistncia, 3-5 colnias antes que o material esteja visvel na
recomendados para o uso do mtodo SDC (48). ponta do arame.

3. Prepare uma suspenso em 2,5mL de soluo

4.8.6.4 Controle de Qualidade (CQ) do mtodo SDC
As cepas de referncia de N. gonorrhoeae WHO C, WHO
K e WHO P (se a azitromicina for examinada) devem ser
includas em cada srie de testes de susceptibilidade
antimicrobiana e sempre que um novo lote de meio
gar ou discos for utilizado. O halo de inibio para
cada antibitico e a cepa de referncia devem ser
documentados em um grfico de CQ. Para os raios
anulares aceitos no CQ, ver Tabela 4.12.
4.8.6.5 Procedimento do mtodo SDC
1. Seque (retire a umidade visvel, mas no enxugue
em excesso) o nmero de placas de gar chocolate
(ver Anexo 4) necessrias. Seque as placas
invertidas, com as tampas removidas, a 361C,
por uma hora.
2. Selecione a maioria das colnias de N. gonorrhoeae
(com pelo menos 1-2mm de dimetro, crescidas
ao longo da noite) em meio gar no seletivo para
gonococos com uma ala de plstico (1L) ou fio de
nicromo reto (aps pass-lo pela chama e deix-lo
salina estril (aproximadamente 107 UFC por mL),
girando o arame pelo menos 10 vezes com a ponta
em contato com o fundo do tubo de teste. Confirme
que o material se desprendeu da ponta, misture
o inculo pelo menos 10 vezes utilizando uma
pipeta de Pasteur estril e verifique se a soluo
est homognea. Um inculo muito denso causar
uma pequena diminuio nos tamanhos da zona.
Um inculo pouco denso causar um aumento
considervel nos tamanhos da zona.
4. Use a mesma pipeta para transferir toda a
suspenso para a superfcie da placa de gar
chocolate j seca.
5. Distribua o inculo, balanando a suspenso, at
que esta cubra toda a superfcie do gar.
6. Remova o excesso de inculo com uma pipeta de
Pasteur estril.
7. Deixe a placa secar por aproximadamente 10-15
minutos, temperatura ambiente (as placas no

Borda do crescimento aderente

Halo de
inibio

Borda do disco

Figura 4.12
O halo de inibio (mm) a menor distncia medida da borda do disco para a borda do crescimento aderente.
A borda do crescimento aderente corresponde normalmente borda mais acentuada da zona de inibio.
Fonte: Reproduzido do Teste de Susceptibilidade Antibitica SDC (http://web.med.unsw.edu.au/cdstest/).

52 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

 devem ser deixadas no lugar por mais de 15 ou um jarro de anaerobiose com vela com umidade
minutos aps o inculo estar seco). adicional.

8. Aplique os discos de antibitico (mantido
temperatura ambiente) placa inoculada usando
uma pina estril ou um distribuidor de disco.
Podem-se aplicar at seis discos em uma
placa de 90mm. Os discos devem ser aplicados
uniformemente e no devem ser removidos aps o
contato inicial com o gar.
9. Incube as placas por 18 horas a 361C em
uma atmosfera rica em CO2 a 51% (70-80% de
umidade). Pode-se utilizar uma incubadora de CO2
10. Mea o halo de inibio com uma rgua de
plstico calibrada em mm ou com compassos
de calibre vernier (Figura 4.12) Os resultados das
cepas de referncia da OMS, usadas como CQ,
devem ser lidos e aprovados antes que se leiam
os outros resultados (ver Tabela 4.12). Se no
forem aprovados, devem-se verificar os possveis
problemas e repetir o teste.
11. Interprete os tamanhos da zona em categorias de
susceptibilidade (ver Tabela 4.11).

Tabela 4.12: Antibiticos, potncia dos discos e raio de inibio anular aceitvel para as cepas de referncia
de N. gonorrhoeae da OMS, recomendados para o controle de qualidade (CQ)

Cepa/antibitico Potncia do disco Halo de inibio (mm)

N. gonorrhoeae ACM 5239 (WHO C)
Azitromicina 15g 8,9-12,5
Benzilpenicilina 0,5UI 2,1-4,1
Cefpodoxima 10g 10,9-14,5
Ceftriaxona 0,5g 8,2-11,0
Ciprofloxacina 1g 12,7-16,3
cido nalidxico 30g 11,3-14,5
Espectinomicina 100g 6,9-8,9
N. gonorrhoeae WHO K
Cefpodoxima 10g 7,6-11,1
Ceftriaxona 0,5g 7,3-9,3
N. gonorrhoeae WHO P
Azitromicina 15g 3,8-7,4

4.8.7 Deteco de resistncia penicilina detectar a -lactamase em gonococos. Quando o anel

mediada por plasmdeo
A N. gonorrhoeae pode carregar plasmdeos produtores
de uma enzima (-lactamase [penicilinase]) que inativa
penicilinas tais como a benzilpenicilina, penicilina,
ampicilina e amoxicilina. Vrios mtodos qualitativos
foram utilizados para detectar a produo de
-lactamase por microrganismos.
O mtodo da cefalosporina cromognica simples,
sensvel, especfico e amplamente utilizado para
-lactmico da cefalosporina cromognica, a nitrocefina,
hidrolisado pela -lactamase, ocorre uma mudana
de colorao do amarelo para o vermelho. O teste est
comercialmente disponvel em vrios formatos, e a
nitrocefina liofilizada tambm pode ser adquirida para
uso em testes in-house (49). Tambm existem outros
mtodos menos padronizados e de qualidade garantida
para detectar a -lactamase, tais como o mtodo
acidomtrico e o teste Iodomtrico.

Gonorreia 53
 4.8.7.1 Mtodo do disco de nitrocefina
1. Hidrate, em gua destilada, o disco de nitrocefina
em uma lmina de vidro ou em uma placa vazia
limpa.
2. Selecione vrias colnias da cultura pura de
gonococos crescida ao longo da noite com uma ala
estril e risque na superfcie do disco.
3. Uma reao positiva normalmente produz cor
vermelha em um minuto. Entretanto, reaes
positivas fracas podem demorar um pouco mais
para revelar a cor, mas isso muito raro. Um
resultado negativo no mostrar mudana de cor
(continuar amarelo).
4.8.7.2 Mtodo de soluo de nitrocefina
O mtodo de soluo de nitrocefina realizado tanto ao
gotejar o reagente diretamente nas colnias crescendo
em meio seletivo ou no seletivo, como por meio da
inoculao da soluo em uma lmina de vidro/papel-
filtro com colnias.
Pode-se utilizar soluo de nitrocefina disponvel
comercialmente ou preparada in-house utilizando o p
de nitrocefina.
Teste direto na placa:
1. Adicione uma gota da soluo de nitrocefina
diretamente nas colnias de gonococos puras
isoladas no meio gar. As placas de diluio em
gar ou Etest podem ser utilizadas aps a leitura da
CMI dos antibiticos examinados.
2. Uma mudana de cor na soluo de nitrocefina do
amarelo para o vermelho em um minuto indica um
resultado positivo. No entanto, reaes muito raras,
fracamente positivas, podem demorar um pouco
mais para serem reveladas. Um resultado negativo
no mostrar mudana de colorao (continuar
amarelo) (Figura 4.13).
Teste na lmina/papel-filtro:
1. Adicione uma gota da soluo de nitrocefina em
uma lmina de vidro limpa/papel-filtro.

Figura 4.13
Atividade da -lactamase em N. gonorrhoeae determinada em placa de cultura com cefalosporina
cromognica, nitrocefina. O meio da esquerda demonstra uma reao positiva (vermelho) e o meio da direita
demonstra uma reao negativa (permanece amarelo).

54 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

2. Selecione vrias colnias da cultura pura de
gonococos crescida ao longo da noite com uma ala
estril e a emulsifique na gota de nitrocefina.
3. Uma mudana de cor do amarelo para o vermelho
em um minuto indica um resultado positivo.
Reaes muito raras, fracamente positivas, podem
demorar um pouco mais para serem reveladas.
Um resultado negativo no mostrar mudana de
colorao (continuar amarelo).
4.8.7.3 Mtodo acidomtrico
Coloque uma tira de papel-filtro em uma placa de
Petri limpa e vazia. Sature o papel com soluo
de penicilina (tampo fosfato a 0,05mol/L, pH 8,0;
prpura de bromocresol e benzilpenicilina sem tampo
a 50g/L [armazenado congelado]). Com uma ala
bacteriolgica, espalhe 10-20 colnias em uma rea
de aproximadamente 5mm do papel-filtro. Incube o
papel-filtro inoculado temperatura ambiente por 30
minutos com a placa de Petri tampada. A atividade da
-lactamase resultar em mudana de cor do azul para o
amarelo, normalmente visvel em menos de 10 minutos.
4.8.7.4 Teste iodomtrico
Prepare uma mistura de penicilina-iodo fresca,
adicionando 1,1mL de soluo de iodo (1,5mg de
potssio iodado e 0,3g de iodo em 100mL de tampo
fosfato a 0,1mol/L, pH 6,4, estocada em garrafa fum a
4C) para um recipiente contendo 0,15mL de soluo de
benzilpenicilina (1 milho de Unidades Internacionais por
mL, estocada a -20C). A mistura de reagente deve ser
usada em uma hora. Uma ala contendo o organismo
em teste removida das colnias crescidas em placa
de gar e emulsificada em uma gota da mistura iodo-
penicilina em uma placa de vidro. Uma gota de soluo
de amido (4g/L em gua destilada, autoclavada e
estocada a 4C) adicionada, acrescentando uma cor
roxa escura mistura. Um resultado negativo indicado
quando essa cor permanece por cinco minutos. Uma
mudana de cor para transparente em cinco minutos
(normalmente em um minuto) indica um teste positivo.
4.9 Preservao dos isolados de N.
gonorrhoeae
Para manter a viabilidade das cepas de N. gonorrhoeae
em meio gar gonoccico, necessrio a subcultura
a, pelo menos, cada 48 horas. Consequentemente,
mtodos efetivos para a preservao em longo prazo das
cepas gonoccicas so essenciais.
4.9.1 Conservao em rampas de gar chocolate
(50, 51)
Armazenamento por at nove meses (as cepas so
mantidas viveis durante o transporte por at cinco dias):
Uma cultura pura crescida ao longo da noite em
meio gar gonoccico inoculada em uma rampa
com 3mL de gar chocolate em uma garrafa Bijou
de policarbonato com tampa de rosca (volume de
5mL; deve-se usar garrafa plstica) e incubada com
a tampa de rosca frouxa por no mnimo 24 horas
a 361C em atmosfera rica em CO2 a 51% ou
at que o crescimento visvel esteja presente na
superfcie do gar. Utiliza-se ento parafina lquida
estril para preencher completamente a rampa
de gar; a tampa de rosca apertada e a garrafa
Bijou estocada a 37C. Quando os gonococos so
necessrios para teste, uma ala bacteriolgica
estril inserida atravs da cobertura de parafina
para remover algumas N. gonorrhoeae crescidas,
sendo ento inoculada em um meio de cultura
seletivo para gonococos. Aps incubao, por
48 horas a 361C em atmosfera rica em CO2 a
51%, as colnias gonoccicas so prontamente
discernveis e podem ser subcultivadas para exame
apropriado (glbulos de parafina tambm estaro
presentes, mas podem ser facilmente distinguidos
das colnias gonoccicas). A rampa original coberta
de parafina pode voltar a ser armazenada para uso
futuro.
Gonorreia 55
 4.9.2 Conservao por congelamento ou
liofilizao
Armazenamento por at 1-3 meses:
Todas as colnias crescidas em uma placa de
cultura pura em meio gar para gonococos podem
ser inoculadas em um pequeno recipiente contendo
0,5mL de caldo nutritivo estril (por exemplo, caldo
nutritivo, caldo triptona de soja, caldo de infuso de
crebro-corao) com glicerol a 15-20%, suspenso
com pipeta estril e imediatamente congelado
a -20-25C. No indicado o armazenamento
prolongado a essa temperatura, uma vez que os
gonococos perdero a viabilidade.
Armazenamento em longo prazo:
Todas as colnias crescidas em uma placa de
cultura pura em meio gar para gonococos podem
ser inoculadas em um pequeno recipiente contendo
0,5-1mL de caldo nutritivo crioprotetor estril com
glicerol a 15-20%, suspensas com pipeta estril e
imediatamente congeladas a -70C.
Todas as colnias crescidas em uma placa de cultura
pura em meio gar para gonococos podem ser
inoculadas em um pequeno criorecipiente contendo
meio crioprotetor estril (por exemplo, caldo nutritivo
com glicerol a 15-20%), suspensas com pipeta e
imediatamente congeladas em nitrognio lquido.
Todas as colnias crescidas em uma placa de
cultura pura em meio gar para gonococos podem
ser inoculadas em um pequeno recipiente contendo
aproximadamente 0,5-1,0mL de fluido Microbank
estril com cryobeads (disponveis comercialmente),
suspensas por meio da inverso do recipiente
por cinco vezes. Subsequentemente, remove-se
o mximo de lquido possvel e o recipiente
imediatamente congelado a -70C.
Todas as colnias crescidas em uma placa de cultura
pura em meio gar para gonococos podem ser
inoculadas em um caldo nutritivo estril (por exemplo,
caldo nutritivo, caldo triptona de soja, caldo de
infuso de crebro-corao) com glicerol a 15-20%
(alternativamente, se nenhum caldo nutritivo estiver
56 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
disponvel, pode-se utilizar leite desnatado estril) e
preservadas por liofilizao.
4.10 Recuperao de isolados de N.
gonorrhoeae congelados
Remova do congelador ou nitrognio lquido o criotubo
contendo o isolado e no o deixe descongelar. Utilizando
a ponta de uma pipeta Pasteur estril, remova
gentilmente uma pequena amostra de suspenso
bacteriana congelada (ou uma criobead) e a transfira
para um meio gar de cultura para gonococos. Use uma
ala para riscar o inculo de colnias simples isoladas
e incube a placa de cultura por 24 horas a 361C, em
atmosfera rica em CO2 a 51%. Retorne imediatamente
o criotubo ao congelador.
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Gonorreia 59
60 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Captulo 5
Infeces por clamdia
5.1 Introduo
A Clamydia trachomatis, agente etiolgico da clamdia,
causa morbidade e custos econmicos substanciais
no mundo. Em 2008, a Organizao Mundial da
Sade (OMS) estimou a ocorrncia de 106 milhes
de novos casos de clamdia urogenital entre adultos,
mundialmente. Isso coloca a clamdia como a mais
prevalente doena sexualmente transmissvel (DST)
bacteriana, junto com a gonorreia (tambm com 106
milhes de novos casos).
A C. trachomatis classifica-se em trs biovariantes, cada
uma contendo vrios sorotipos e gentipos (dependendo
do mtodo utilizado para classificao). As biovariantes
so definidas com base no tipo de infeco, localizao
comum da infeco (tropismo por tecido) e virulncia
relativa da doena (Tabela 5.1), dividindo-se entre
aquelas que causam tracoma (a maior causa de cegueira
evitvel em todo o mundo, endmica em muitos pases
em desenvolvimento), as que causam infeces genitais
(a DST bacteriana mais frequente no mundo) e as que
causam linfogranuloma venreo (LGV, uma doena de
lcera genital que afeta os tecidos linfoides) (ver Captulo
11).
A biovariante ocular consiste dos sorotipos A-C, os quais
so encontrados predominantemente em infeces na
conjuntiva. O tropismo por esse tecido no absoluto,
uma vez que esses organismos, especialmente o
sorotipo B, tambm podem ser isolados de infeces
genitais, mas a frequncia dessas ocorrncias rara.
A biovariante predominante consiste dos sorotipos
D-K, os quais so transmitidos sexualmente e infectam
o epitlio genital, causando uretrite em homens e
cervicite (e uretrite) em mulheres (Tabela 5.2). Infeces
urogenitais assintomticas ocorrem em at 50% dos
homens e at 90% das mulheres. Se no for detectada
e tratada, a infeco pode ascender para o trato genital
superior, causando epididimite em homens e doena
plvica inflamatria (PID, do ingls pelvic inflammatory
disease) e sequelas relacionadas (gravidez ectpica,
infertilidade por fator tubrio) em mulheres. Esses
sorotipos tambm podem ser isolados a partir de
infeces oculares em recm-nascidos, adquiridos
durante a passagem por um canal de parto infectado,
mas no so amplamente responsveis por tracoma. Os
recm-nascidos ainda podem desenvolver pneumonia
por clamdia, devido exposio a esses sorotipos
durante o parto vaginal (no confundir com infeco por
C. pneumoniae).
Finalmente, a biovariante LGV, que consiste dos
sorotipos L1-L3, tambm uma biovariante transmitida
sexualmente, mas com preferncia tecidual por clulas
linfoides e com uma progresso da doena mais
agressiva. As infeces por LGV so consequentemente
mais invasivas e mais propensas a causar infeces
sistmicas que as outras biovariantes. A LGV endmica
em muitas regies em desenvolvimento no mundo. Alm
disso, desde 2003, surtos de proctites e proctocolites
por LGV foram documentados entre homens que fazem
sexo com homens (HSH) na Europa e Amrica do Norte,
onde, previamente, apenas se observavam casos
espordicos dessas infeces (ver Captulo 11).
A C. trachomatis causa a DST bacteriana
mundialmente mais comum, a qual inclui um
espectro de doenas encontradas em diversos
tecidos (isto , genital, ocular, linftico e bronquial).
Resultados negativos associados a infeces
por C. trachomatis no tratadas incluem PID,
gravidez ectpica, infertilidade por fator tubrio,
epididimites, prostatites, dentre outros.
5.2 Reviso dos mtodos de diagnstico
disponveis
Embora a clamdia seja altamente prevalente, o
conhecimento sobre essa infeco era bastante limitado
nos servios de sade pblica antes da dcada de 80,
devido a limitaes nos mtodos de diagnstico. As
tcnicas de diagnstico precoce desenvolveram-se mais
no mbito dos esforos para deter o tracoma do que
para conter a prpria DST. A sorologia foi utilizada para
distinguir infeces agudas
Infeces por clamdia 61
 Tabela 5.1: Caractersticas e infeces associadas a diferentes sorotipos de C. trachomatis
Tropismo por tecido/
Sorotipo Caractersticas Infeco
biovariante
Cegueira endmica
A-C (incl. Ba) No invasivo Clulas epiteliais/tracoma
causada por tracoma
Urogenital, conjuntivite,
D-K (incl. Da, Ia, Ja) No invasivo Clulas epiteliais/tracoma
pneumonia neonatal
L1, L2, L3
Invasivo Clulas linfticas/LGV LGV
(incl. L2a, L2b)
LGV: linfogranuloma venreo

Tabela 5.2: Manifestaes clnicas da infeco por C. trachomatis

Infeco genital Primria Sequelas
Mulheres Cervicite, corrimento purulento Doena inflamatria plvica, gravidez
abundante, colo do tero resistente ectpica, salpingite, infertilidade por
a altas temperaturas, disria, dor fator tubrio
plvica, sensibilidade a movimentos
cervicais
Homens Corrimento uretral, disria, dor Epididimite, prostatite
testicular
Infeces no genitais Primria Sequelas
Reto Corrimento, dor retal, sangue nas Proctite
fezes
Orofaringe Faringite, leve dor de garganta
Linfonodos Inflamao linftica
Ocular Conjuntivite Cicatrizes, cegueira por tracoma
Pneumonia neonatal Pneumonia
Nota: estudos forneceram evidncias de que as infeces por C. trachomatis podem facilitar a transmisso do HIV; entretanto, o odds ratio
relativamente baixo.

de crnicas, mas esta no apresenta sensibilidade
e especificidade suficientes para o diagnstico
de infeces agudas, nem para obter estimativas
populacionais de exposio ao longo da vida. A
cultura foi padronizada na dcada de 70, tornando o
isolamento do organismo uma importante ferramenta
de diagnstico. No entanto, a necessidade de manter a
viabilidade do espcime, que exige condies rigorosas
de transporte e armazenamento, limitou a disponibilidade
desse teste apenas aos mdicos que trabalham em
laboratrios mais desenvolvidos. Ensaios de deteco de
antgeno, ensaios de imunofluorescncia direta (EID) e o
ensaio imunossorvente ligado enzima (ELISA, do ingls
enzyme-linked immunosorbent assay) de fase slida
foram desenvolvidos no incio da dcada de 80, tornando
o diagnstico de clamdia mais acessvel. Conforme mais
testes ELISA foram sendo desenvolvidos, vrios ensaios
point-of-care (POC), rpidos, tornaram-se disponveis.
Os EID, ELISA e POC apresentavam baixa sensibilidade
quando comparados cultura, e especificidade inferior
ideal. Entretanto, a rapidez para a liberao do resultado
e as necessidades menos restritivas para o transporte do
espcime tornaram esses ensaios uma opo atraente,
especialmente em lugares de alta prevalncia.
Outro grande avano no diagnstico de clamdia foi
a utilizao de sequncias de cido nucleico no lugar
de antgenos como alvos de deteco. A sensibilidade
dos ensaios de hibridizao de cidos nucleicos no
amplificados (NAH, do ingls non-amplified nucleic

62 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

acid hybridization assays) inicialmente desenvolvidos
foi similar da cultura, mas novamente houve
questionamentos quanto sua especificidade. A
incluso de Neisseria gonorrhoeae no mbito do teste
tornou esse ensaio extremamente atraente. Os testes
de amplificao de cidos nucleicos (NAAT, do ingls
nucleic acid amplification test) foram desenvolvidos
em seguida. Os NAAT usam mtodos enzimticos para
amplificar exponencialmente o DNA ou RNA alvo em
bilhes de cpias. O produto amplificado detectado
por diversos meios, o que confere a cada ensaio
caractersticas nicas de desempenho. Similares ao
teste NAH, os NAAT combinaram a testagem de clamdia
e gonorreia a partir de uma mesma amostra. Devido
s caractersticas superiores de desempenho, como,
por exemplo, sensibilidade, especificidade, variedade
dos tipos de espcimes, automao e independncia
para manter a viabilidade do organismo, os NAAT so
fortemente recomendados para o diagnstico e triagem
de infeces por clamdia. Para informaes adicionais
sobre as caractersticas de desempenho dos diferentes
mtodos para o diagnstico de clamdia, ver a pgina da
internet sobre clamdia, www.chlamydiae.com.
Questes associadas avaliao dos ensaios e
variedade dos desempenhos (1,2) ressaltam a
necessidade da verificao de ensaios e da estrita
garantia de qualidade (GQ) em cada laboratrio, no
apenas antes da adoo de um mtodo, mas tambm
de forma regular. Para maiores informaes sobre
esse tpico, ver Captulo 2 e Anexo 3. Para obter as
caractersticas de desempenho adequadas a todos os
mtodos de diagnstico, crucial seguir precisamente
as recomendaes do fabricante no concernente
coleta, ao transporte e ao armazenamento das amostras,
bem como aquelas relativas ao desempenho de ensaios
especficos, incluindo os controles de qualidade.
As tecnologias para o diagnstico de clamdia
continuam avanando e apresentam melhor
sensibilidade.
Devido s caractersticas de desempenho
superiores, os NAAT so fortemente recomendados
para o diagnstico e triagem de infeces por
clamdia. Entretanto, a escolha do teste depende
dos recursos disponveis e da infraestrutura do
laboratrio.
5.3 Coleta, transporte e condies de
armazenamento de espcimes
A coleta, o transporte e as condies de armazenamento
de espcimes (Tabela 5.3) dependem, em muitos
casos, do tipo do ensaio. Essa seo ir apresentar
algumas diretrizes gerais, mas os detalhes relacionados
a qualquer ensaio de diagnstico especfico devem
ser seguidos de acordo com as instrues de uso
apropriadas.
As regies anatmicas de amostragem iro variar
dependendo da apresentao e histrico clnico do
paciente e da sensibilidade do ensaio. Para a cultura, que
requer organismos vivos, a amostra deve ser coletada
a partir de lugares com clulas epiteliais colunares ou
cuboides, as quais tm maior probabilidade de estar
ativamente infectadas. Dessa forma, nas mulheres,
devem-se coletar as amostras do orifcio endocervical
e, nos homens, do epitlio uretral. Esse ltimo, quando
necessrio, tambm pode servir como local de coleta de
amostras em mulheres. A coleta em ambos os locais,
na testagem de mulheres, aumentar a identificao de
casos.
As amostras endocervicais devem ser obtidas por meio
da insero de 2-3cm do aparato de coleta no orifcio,
seguida de um giro de 360 completos. As amostras
endocervicais no devem ser coletadas em meninas
pr-pberes; em vez disso, os espcimes devem ser
colhidos no vestbulo da vagina, obtendo-se tambm
uma amostra de urina. As amostras da uretra so
coletadas por meio da insero de 2-3cm de uma
haste na uretra, seguida de giro completo para obter o
material celular. A coleta inadequada tem sido descrita
como um problema comum, que afeta negativamente a
sensibilidade da cultura.
Embora outros ensaios, diferentes da cultura e dos
NAAT, no necessitem de organismos viveis, a
sensibilidade limitada desses ensaios requer a coleta de
uma quantidade suficiente de organismos para que se
obtenha um resultado positivo. Alm disso, os mtodos
de deteco de antgeno geralmente necessitam de
organismos intactos. Assim, as mesmas restries de
amostragem necessrias para a cultura geralmente se
aplicam a esses mtodos de diagnstico. Alguns ELISA
foram aprovados para uso em amostras de urina de
Infeces por clamdia 63
 homens, uma vez que esse mtodo de amostragem lava
os organismos da uretra. Se o volume do primeiro jato de
urina for cuidadosamente controlado (em geral, menos
de 25mL), e o paciente no tiver urinado durante a hora
anterior, provvel que a carga do microrganismo esteja
suficientemente concentrada para que seja detectvel
por esses ensaios. Isso no verdadeiro para a urina
de mulheres, uma vez que a ocorrncia de infeces
na uretra menos comum e a urina no contempla
amostras do tecido cervical.
Os NAAT apresentam a vantagem de depender de
cidos nucleicos que no necessitam de organismos
intactos ou viveis. Como resultado, esses ensaios
aumentaram nossa capacidade de coletar amostras
menos invasivas, que requerem ambientes clnicos.
Os NAAT so altamente sensveis quando se utilizam
amostras colhidas pelo prprio paciente (por exemplo,
hastes contendo secrees vaginais ou urina masculina).
Os NAAT tambm so teis para o teste de resduos
de citologia em meio lquido, permitindo a triagem em
mulheres por meio do teste de Papanicolau (Pap). As
hastes contendo secreo vaginal podem ser obtidas
pelo prprio paciente ou pelo mdico, com o mesmo
grau de validade (3, 4). Insira a haste na vagina e gire-a
para que sejam coletadas amostras de todas as paredes
vaginais.
Em alguns casos, dependendo dos sinais clnicos e
prticas sexuais, necessrio coletar amostras no
genitais. A cultura pode identificar infeces no reto
e na orofaringe, mas a sensibilidade nesses casos
relativamente baixa, devido microbiota contaminante.
No entanto, os NAAT apresentam alta sensibilidade para
essas infeces, embora nenhum fabricante se refira
a esse tipo de amostra. O uso de NAAT em amostras
extragenitais de homens que fazem sexo com homens
aumenta substancialmente a identificao de casos
(5-8). As amostras do reto podem ser coletadas tanto
pelo prprio paciente como pelo mdico, por meio da
insero de uma haste com extremidades de dacron
no reto at um limite confortvel (2-3cm), seguida de
um giro de 360. No mais necessrio visualizar o
reto para a coleta adequada da amostra, em razo
do aumento de sensibilidade dos ensaios NAAT. Para
qualquer indivduo que reporte a prtica de relao anal
receptiva, aconselha-se testar uma amostra do reto. A
coleta de amostra pelo paciente para o uso em NAAT
pode aumentar a captao da triagem e reduzir o tempo
dos trmites clnicos (9, 10). As amostras da orofaringe
so colhidas a partir da faringe posterior e das criptas
tonsilares. Essas amostras devem ser coletadas ao se
identificarem infeces transmitidas durante o sexo oral.
preciso tambm obter uma amostra da nasofaringe
em caso de recm-nascidos com suspeita de terem
contrado pneumonia clamidial durante o parto. Esse
tipo de amostra ser utilizado para cultura ou EID, no
tendo sido ainda avaliado rigorosamente por outros
sistemas. No entanto, devido carga bacteriana baixa,
os NAAT tendem a ser mais eficazes e, portanto,
necessrio realizar mais pesquisas nessas reas. Uma
haste deve ser inserida pela narina at que se possam
coletar amostras da parede da faringe. Amostras da
conjuntiva devem ser colhidas por meio da retrao da
plpebra inferior, passando-se uma haste ao longo da
superfcie da conjuntiva palpebral inferior em direo ao
canto mediano do olho. Em caso de suspeita de LGV, ver
Captulo 11.
Dada a necessidade de uma avaliao rigorosa antes
que um teste de diagnstico seja aprovado pela
Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados
Unidos da Amrica (FDA, do ingls United States of
America Food and Drug Administration), a qual inclui
triagens clnicas em mltiplos locais e comparao
com os padres apropriados, o desempenho do ensaio
aprovado pela FDA bem documentado. Dessa forma,
utilizamos esse nvel de avaliao como o padro para a
determinao de ensaios de alta qualidade. A Tabela 5.4
resume as caractersticas de desempenho dos diferentes
testes diagnsticos aprovados para a deteco de C.
trachomatis.
As condies de coleta, transporte e
armazenamento de espcimes variam de acordo
com o ensaio de deteco e podem influenciar
significativamente a sensibilidade do teste.
A seleo do espcime apropriado e do ensaio de
deteco crucial para um diagnstico efetivo.

64 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Tabela 5.3: Coleta, transporte e armazenamento de amostras
Local Aparato de Procedimento de NAAT Cultura EID POC
coleta amostragem
Endocrvice Haste/ Use uma haste Coloque a Coloque a Passe a Coloque a
plsticoa, de limpeza amostra no amostra amostra pela amostra no
escova ou para remover o aparato de diretamente lmina (uma tampo de
vassoura excesso de muco coleta do em meio de fina camada) extrao do
para citologia antes da coleta fabricante transporte e deixe-a kit e siga as
em meio da amostra. O ou use meio apropriado secar ao ar instrues do
lquido uso de vassoura lquido para para clamdia livre. manual.
para a coleta s citologia. (por exemplo,
vlido para NAAT. Armazene e tampo SPG
Insira 2-3cm transporte a com inibidores
do aparato de amostra de antimicrobianos).
coleta no orifcio acordo com Mantenha a
endocervical as instrues amostra a 4C
e gire 360. A do manual. para inoculaes
coleta de clulas em 24h ou a
endocervicais -70C para
essencial para o armazenamentos
procedimento de mais longos.
EID.
Uretra Haste/ Insira 2-3cm da Coloque a Coloque a Passe a Coloque a
alumniob haste na uretra amostra no amostra amostra pela amostra no
e gire 360. A aparato de diretamente lmina (uma tampo de
coleta de clulas coleta do em meio de fina camada) extrao do
epiteliais cuboides fabricante. transporte e deixe-a kit e siga as
essencial para Armazene e apropriado secar ao ar instrues do
o EID. transporte a para clamdia livre. manual.
amostra de (por exemplo,
acordo com tampo SPG
as instrues com inibidores
do manual. antimicrobianos).
Mantenha a
amostra a 4C
para inoculaes
em 24h ou a
-70C para
armazenamentos
mais longos.

Infeces por clamdia 65

 Tabela 5.3: Coleta, transporte e armazenamento de amostras (continuao)
Local Aparato Procedimento NAAT Cultura EID POC
de coleta de amostragem
Urina Copo O paciente no Coloque a NA NA NA
estril para deve limpar a amostra no
coleta de rea genital. aparato de coleta
urina Obter o primeiro do fabricante.
jato (em geral, Armazene e
menos de 25mL). transporte a
amostra de acordo
com as instrues
do manual.

Vagina Haste/ As amostras Coloque a NA NA Siga as

plsticoa podem ser amostra no instrues
obtidas pelo aparato de coleta do
mdico ou pelos do fabricante. manualc.
pacientes. Gire a Armazene e
haste para que transporte a
esta entre em amostra de acordo
contato com toda com as instrues
a parede vaginal. do manual. Vrios
ensaios toleram
esfregaos secos
recebidos sem
meio.
Reto Haste/ Insira 2-3cm da Atualmente, Coloque a amostra Passe a NA
plsticoa haste no reto e nenhum fabricante diretamente em amostra
gire 360. faz referncia meio de transporte pela
a esse tipo de apropriado para lmina
amostrad. Trate-a clamdia (por (uma fina
como uma amostra exemplo, tampo camada)
endocervical. As SPG com inibidores e deixe-a
amostras podem antimicrobianos). secar ao
ser enviadas sem Mantenha a ar livre.
o meio, caso o amostra a 4C
ensaio utilizado para inoculaes
aceite esse tipo em 24h ou a
de amostragem -70C para
para espcimes armazenamentos
endocervicais. mais longos.

66 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Tabela 5.3: Coleta, transporte e armazenamento de amostras (continuao)
Local Aparato Procedimento NAAT Cultura EID POC
de coleta de amostragem
Orofaringe Haste/ Passe a haste na Atualmente, nenhum Coloque a amostra Passe a NA
plsticoa faringe posterior fabricante faz diretamente em amostra pela
e nas criptas referncia a esse meio de transporte lmina (uma
tonsilares. tipo de amostrad. apropriado para fina camada)
Trate-a como clamdia (por e deixe-a
uma amostra exemplo, tampo secar ao ar
endocervical. As SPG com inibidores livre.
amostras podem antimicrobianos).
ser enviadas sem o
meio, caso o ensaio
utilizado aceite esse
tipo de amostragem
para espcimes
endocervicais.
Nasofaringe Haste/ Passe a haste na NA Coloque a amostra NA NA
(para alumniob nasofaringe ou diretamente em
casos de colete o aspirado meio de transporte
suspeita de traqueobronqueal. apropriado para
pneumonia clamdia (por
neonatal) exemplo, tampo
SPG com inibidores
antimicrobianos).
Mantenha a
amostra a 4C para
inoculaes em 24h
ou a -70C para
armazenamentos
mais longos.
Conjuntiva Haste/ Passe a haste NA Coloque a amostra Passe a NA
alumniob na superfcie diretamente em amostra pela
da conjuntiva meio de transporte lmina (uma
palpebral inferior. apropriado para fina camada)
clamdia (por e deixe-a
exemplo, tampo secar ao ar
SPG com inibidores livre.
antimicrobianos).
Mantenha a
amostra a 4C para
inoculaes em 24h
ou a -70C para
armazenamentos
mais longos.

Infeces por clamdia 67

 EID: ensaio de imunofluorescncia direta; NA: no se aplica; NAAT: teste de amplificao de cidos nucleicos; POC: teste point-of-care; SPG:
sacarose-fosfato-glutamato.
a
Hastes de plstico com extremidades de dacron ou de rayon.
b
Hastes de alumnio com extremidades de dacron ou de rayon.
c
Somente alguns testes POC esto licenciados para espcimes vaginais.
d
Os dados indicam que os NAAT apropriados apresentam um bom desempenho para esse tipo de amostra, mas nenhum fabricante se refere a
espcimes extragenitais.

Tabela 5.4: Testes diagnsticos avaliados* (at junho de 2012) para a deteco de C. trachomatis
NAAT Cultura EID POC
Tipos de espcimes
Hastes com amostra Sim Sim Sim Sim
endocervical
Meio lquido para Sim (alguns testes) No No No
citologia
Hastes com amostras
vaginais

Obtidas pelo Sim (alguns testes) No No Sim (alguns testes)

paciente

Coletadas pelo Sim (alguns testes) No No Sim (alguns testes)

mdico
Urina
Mulheres Sim No No No
Homens Sim No No No
Hastes com amostras Sim Sim Sim Sim
da uretra de homens
Hastes com amostras Noa Simb Simb No
do reto
Hastes com amostras Noa Simb Simb No
da orofaringe
Hastes com amostras Noa Sim Sim No
da conjuntiva
Desempenho
Sensibilidadec Muito alta Moderada-alta Baixa-moderada Baixa-moderada
Especificidade Muito alta Muito alta Moderada Muito alta
Outras consideraes
Custo Muito alto Moderado Baixo Baixo
Transporte e Em temperatura 4C por 24h Temperatura NA
armazenamento ambiente por at ambiente
-70C aps 24h
60 dias (checar o
manual)
Instrumentao Grande presena de Microbiologia de Microscpio de Pequena-nenhuma
instrumentao rotina/virologia fluorescncia
Rendimento/ Alto/sim Baixo/no Baixo/no Baixo/no
automatizao

68 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Tabela 5.4: Testes de diagnstico avaliados* (at junho de 2012) para a deteco de C. trachomatis (continuao)
NAAT Cultura EID POC
Outras consideraes
Complexidade tcnica Alta Alta Moderada (habilidade Baixa
em microscopia)
Nvel de Referncia Referncia Central Local
infraestrutura do
laboratrio
Mltiplos patgenos N. gonorrhoeae, No No No
de uma mesma Trichomonas
amostra vaginalis e HPV em
algumas plataformas
Outros comentrios Devido s O rigor na coleta Altamente As infeces
caractersticas e no transporte recomendado para identificadas
de desempenho essencial a identificao podem ser tratadas
superiores, para manter a imediata de antes que o
os NAAT so viabilidade do infeces na paciente deixe a
altamente teste essa a conjuntiva. clnica.
recomendados maior barreira
para o diagnstico nesse ensaio para
e triagem. a sensibilidade.
Requer adeso O potencial para
estrita aos obter isolados
protocolos devido viveis til em
ao potencial de testes adicionais,
contaminao do como o de
laboratrio. determinao de
Alguns exigem gentipos e o teste
grandes lotes, o de susceptibilidade
que pode aumentar a antibiticos.
o tempo de retorno
do resultado.
EID: ensaio de imunofluorescncia direta; HPV: papilomavrus humano; NAAT: teste de amplificao de cidos nucleicos; POC: teste point-of-care.
* Avaliado pela Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados Unidos da Amrica.
a
Os dados indicam que os NAAT apropriados apresentam um bom desempenho para esse tipo de amostra, mas nenhum fabricante se refere a
espcimes extragenitais.
b
Comparada aos NAAT modernos, a sensibilidade da cultura e do EID tende a ser ainda menor para esse tipo de espcime.
c
A estimativa das sensibilidades varia muito, dependendo das diferentes sensibilidades dos ensaios de uma mesma metodologia, bem como
dos ensaios utilizados para comparao (o padro ouro). Os NAAT so superiores a qualquer outra classe de testes quanto sensibilidade e
apresentam excelente especificidade.
Fonte: Adaptado de Unemo M, Papp JR. Infections caused by Chlamydia trachomatis. In: Morse SA et al., eds. Atlas of sexually transmitted diseases
and AIDS, 4th ed. Edinburgh, Saunders/Elsevier, 2010:4063.

Infeces por clamdia 69

 5.4 Teste de amplificao de cido nucleico
(NAAT)
A deteco molecular de sequncias especficas
de cidos nucleicos e a subsequente validao e
comercializao desses ensaios trouxe grandes
melhorias para a deteco laboratorial de C. trachomatis.
Testes NAH, como o PACE 2 e o PACE 2C da Gen-Probe
(Gen-Probe, EUA), que se baseiam na ligao de sondas
de cidos nucleicos complementares especficas
e subsequente amplificao do sinal para detectar
a ligao, foram os primeiros a ser desenvolvidos.
Esses testes so aproximadamente 10-15% menos
sensveis que os NAAT e no devem ser utilizados se os
NAAT estiverem disponveis e forem economicamente
acessveis. Os NAAT apresentam caractersticas de
desempenho superiores quando comparados a qualquer
outro tipo de teste para a deteco de infeces por
clamdia (11-14) e, dessa forma, so o tipo de ensaio
recomendado pelos Centros de Controle e Preveno
de Doenas dos Estados Unidos da Amrica (CDC,
do ingls Centers for Disease Control and Prevention),
alm de outros organismos regulatrios e assessores,
para o diagnstico tanto de infeces genitais como
extragenitais e para a triagem de infeces por clamdia
(15). O teste confirmatrio de amostras positivas
para C. trachomatis no mais recomendado. Os
NAAT validados e eficientes apresentam uma srie de
vantagens que independem do fabricante. Eles so
claramente os ensaios disponveis mais sensveis, o
que tambm permite o agrupamento de amostras em
lugares com limitaes de recursos; eles no necessitam
que a viabilidade do organismo seja mantida; a maioria
dos ensaios disponveis comercialmente pode testar
tanto a clamdia quanto a gonorreia; e esses ensaios
apresentam uma gama mais ampla de tipos de amostras
teis, que incluem coletas menos invasivas de urina ou
de amostras vaginais, alm das amostras endocervicais
e uretrais previamente requeridas. Ademais, esses
ensaios so bem adequados para a automatizao, o que
resulta no aumento da padronizao e na GQ na extrao
e na deteco, bem como no aumento significativo
do rendimento. Entretanto, os ensaios NAAT tambm
compartilham algumas dificuldades. As tecnologias de
amplificao exigem uma instrumentao substancial e
no so apropriadas para muitos laboratrios localizados
70 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
em pases com poucos recursos. Esses ensaios tambm
so susceptveis contaminao do ambiente, devido
amplificao exponencial das sequncias-alvo. Qualquer
atividade que envolva um tubo aberto de amostra
amplificada uma fonte em potencial para a formao
de aerossol e contaminao do ambiente. Uma vez que
as instalaes laboratoriais e os equipamentos (por
exemplo, pipetas) se contaminam, sua recuperao pode
ser extremamente difcil.
Outra questo envolve o potencial de resultados falso-
negativos. O processo de extrao de cido nucleico
fundamental para o procedimento, mas difcil
de ser garantido para cada amostra. A amplificao
requer concentraes precisas de sal, nucleotdeos
e enzimas para ocorrer de forma eficiente, o que
exige grande preciso no uso da pipeta. A enzima que
promove a amplificao tambm pode ser sensvel a
componentes de sangue, muco e urina. Dessa forma,
um resultado negativo pode, na verdade, refletir uma
ausncia do cido nucleico-alvo, em virtude da coleta
ou extrao inadequadas da amostra ou deficincia
na amplificao, ao invs de uma efetiva ausncia de
sequncia-alvo. A proporo de amostras inibitrias
pode variar dependendo da metodologia do teste e,
conforme os mtodos utilizados, pode chegar a 7,5%
em certas populaes (16). Entretanto, o desempenho
desses testes ainda altamente prefervel ao da cultura,
que pode fornecer resultados falso-negativos devido
perda da viabilidade dos organismos, e ao de outros
mtodos diferentes da cultura cuja sensibilidade
menor (ou no mximo igual) desta e que tambm
apresentam especificidade abaixo do ideal. Dessa forma,
embora haja a necessidade de cuidados laboratoriais
apropriados, as vantagens dos NAAT prevalecem
substancialmente em relao s desvantagens. O uso
dos NAAT deve ser incentivado mesmo em lugares
com limitaes de recursos, por meio da criao de
laboratrios de referncia regionais que possam fornecer
os servios de diagnstico utilizando esses mtodos.
Os laboratrios de referncia regionais oferecem
muitas vantagens, que resultam de grandes volumes de
testes, adeso rigorosa s boas prticas laboratoriais e
melhoria na especializao tcnica. O uso de laboratrios
regionais pode implicar reduo de custos na utilizao
de ensaios de alta sensibilidade. Apesar da necessidade
de enviar amostras para uma instituio regional, o
tempo para o retorno do resultado pode ser equivalente
ou at menor, considerando-se o grande volume de
testagem e o uso de automatizao de alto rendimento.
Por essas razes, os laboratrios que no podem custear
a realizao dos ensaios NAAT mais sensveis devem
considerar a utilizao dos servios de um laboratrio
de referncia regional ao invs de utilizar ferramentas de
diagnstico menos sensveis.
Atualmente, quatro companhias possuem NAAT
aprovados pela FDA e disponveis comercialmente
para a deteco de C. trachomatis. Os ensaios
comercializados por esses fabricantes esto descritos
a seguir. Todos os NAAT aprovados e comercialmente
disponveis detectam o LGV como positivo para C.
trachomatis, sem, entretanto, distinguir os resultados
como positivos L1-L3. Para essa finalidade, necessria
a determinao do gentipo (ver Captulo 11).
importante notar que, no mundo, h muitos outros
NAAT para C. trachomatis disponveis comercialmente
ou desenvolvidos internamente por laboratrios (17,
18). Se NAAT no aprovados pela FDA forem utilizados,
processos regulatrios regionais (como os da Unio
Europeia [UE]) e/ou nacionais devem fornecer garantias
da qualidade e desempenho do NAAT para diagnstico. O
uso de NAAT aprovados internacionalmente altamente
indicado. Se isso no for possvel, recomenda-se
que o NAAT proposto pela instituio local tenha sua
eficincia rigorosamente validada e sua qualidade
assegurada em relao a, pelo menos, um NAAT
aprovado internacionalmente antes de sua utilizao
e, subsequentemente, que o teste seja usado com os
devidos controles positivos, negativos e de inibio. A
participao em sistemas idneos de avaliao externa
da qualidade tambm fortemente recomendada (ver
Captulo 2 e Anexo 3). Para informaes bsicas sobre
as diferentes tecnologias de NAAT, ver Anexo 3.
Tecnologias moleculares oferecem a melhor
sensibilidade, com excelente especificidade.
Ensaios moleculares reduzem a necessidade de
condies estritas de transporte e armazenamento
e eliminam anlises subjetivas (por exemplo,
microscopia).
Se NAAT aprovados internacionalmente no
puderem ser utilizados, altamente recomendado
que o NAAT proposto pela instituio local tenha
sua eficincia estritamente validada e a sua
qualidade assegurada em relao a pelo menos,
um NAAT aprovado internacionalmente, antes de
sua utilizao.
Novos ensaios esto sendo rapidamente
disponibilizados e no podem ser previstos neste
documento. importante o acesso contnuo
literatura para a realizao de avaliaes de alta
qualidade dos novos ensaios, a fim de determinar o
que melhor se adequa a cada laboratrio.
5.4.1 Ensaios moleculares da Abbott
Os ensaios RealTime CT/NG e somente CT, da Abbott,
so realizados pelo sistema automatizado m2000
(Abbott Molecular, EUA). Esse ensaio substituiu o
aprovado pela FDA, LCx, o qual foi um dos primeiros
NAAT disponveis comercialmente. O ensaio da reao
em cadeia da polimerase (PCR, do ingls polymerase
chain reaction) RealTime utiliza o m2000sp, um
instrumento automatizado de preparao de amostra,
que extrai o DNA utilizando um sistema de captura
baseado em partcula magntica. Em seguida extrao,
o instrumento m2000p carrega a mistura principal
de reagentes (master mix) na placa de PCR, adiciona
as amostras purificadas e, ento, est pronto para a
amplificao em tempo real e deteco no m2000rt (19).
Esse termociclador em tempo real detecta a amplificao
pela fluorescncia emitida quando sondas se ligam
especificamente a sequncias-alvo amplificadas durante
cada ciclo de amplificao. O ensaio passa a incluir dois
alvos, isto , duas sequncias no plasmdeo crptico
(7-10 cpias por organismo) para C. trachomatis, a
fim de garantir a deteco da nova variante sueca
de C. trachomatis (nvCT), a qual causou milhares de
resultados falso-negativos na Sucia e em alguns outros
Infeces por clamdia 71
 pases nrdicos que utilizaram NAAT disponibilizados,
na poca, pela Roche e pela Abbott (20-22). O sistema
pode detectar mltiplos sinais, que permitem ao ensaio
identificar clamdia, gonorreia e um controle interno no
competitivo para medir potenciais inibies em cada
amostra. A sequncia de controle interno baseada no
DNA de planta, adicionado durante a extrao de DNA,
para fornecer uma medida da eficincia dessa extrao
e possveis inibies da PCR. Esse o nico ensaio que
fornece uma indicao precisa do sucesso do isolamento
do DNA. O sistema capaz de processar 96 amostras
por corrida, incluindo trs controles, permitindo que
186 amostras e seis controles sejam testados em
aproximadamente oito horas.
As amostras aprovadas incluem urina e hastes com
secrees vaginais, endocervicais e uretrais. As
amostras so coletadas utilizando o kit multi-Collect
fornecido pelo fabricante e so mantidas estveis a
2-30C por at 14 dias antes de serem testadas. O
kit compreende um dispositivo de coleta nico para
todos os tipos de amostra que podem ser processadas
simultaneamente no sistema m2000. A alta estabilidade
das hastes contendo amostras e da urina a temperatura
ambiente torna esse ensaio atraente para os
estabelecimentos de sade pblica que enviam amostras
para o laboratrio de referncia.
O ensaio RealTime CT/NG apresenta sensibilidade
analtica excelente, sendo comparvel at ao ensaio
APTIMA Combo 2 (23). O processo de purificao de
DNA desenhado para remover possveis inibidores,
enquanto o controle interno fornece um alerta em caso
de inibio. O desenho do processo tambm prev a
remoo de fluorforos que ocorrem naturalmente e
que podem interferir no desempenho do teste. O uso da
tecnologia de deteco de fluorescncia homognea com
iniciadores de PCR especficos combina amplificao
e deteco em um sistema fechado de nico passo.
A natureza fechada do sistema reduz a possibilidade
de contaminao cruzada e o uso do controle
negativo fornece ao usurio um mtodo rpido para a
identificao de contaminao do ambiente.
72 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
5.4.2 Ensaio de diagnstico da Becton,
Dickinson (BD)
O ensaio da BD para clamdia e gonorreia aprovado
pela FDA, o ProbeTec ET (Becton, Dickinson and
Company, EUA), foi o primeiro ensaio em tempo real
disponvel comercialmente. Esse teste usa amplificao
por deslocamento de cadeia (SDA, do ingls strand
displacement amplification) isotrmico para amplificar e
detectar as sequncias-alvo, simultaneamente, a 52,5C.
A amplificao de uma sequncia do plasmdeo crptico
de clamdia ocorre em uma placa selada com um leitor
de transferncia de energia fluorescente. Esse esquema
foi desenhado para minimizar possveis contaminaes
ambientais cruzadas, uma vez que as amostras
amplificadas nunca so abertas.
As amostras aprovadas para o teste ProbeTec incluem
urina e hastes com secreo endocervical e amostra
da uretra. Mais uma vez, as evidncias sugerem que
hastes com secrees vaginais so um tipo de amostra
til, e esto sendo realizados estudos para investigar o
desempenho do ensaio com outros tipos de amostras.
As amostras em hastes so coletadas utilizando-se o
kit fornecido pelo fabricante e permanecem estveis
a temperatura ambiente por at seis dias antes da
realizao do teste. O primeiro jato de urina estvel por
at 24 horas a 4C. Se um conservante for adicionado
amostra, a estabilidade da urina estendida para dois
dias a temperatura ambiente ou 4-6 dias a 4C.
Esse ensaio pode detectar tanto clamdia quanto
gonorreia e permite um timo controle externo de
amplificao (14). A escolha do teste solicitado
especfica em relao fita (isto , cada fita de oito
amostras deve ser testada para a mesma combinao de
organismos) de clamdia ou gonorreia.
No entanto, o uso do controle de amplificao
especfico em relao placa, de modo que, ao se
realizar uma opo, esta ser aplicada a todas as
amostras da placa. O teste apresenta-se no formato de
96 poos, com poos diferentes para cada sequncia-
alvo. Dessa forma, se for solicitado o teste para clamdia
e gonorreia e o controle de amplificao, para cada um
desses sero utilizados os poos de trs colunas e um
total de 32 amostras e controles podero ser testados
em uma placa. Alternativamente, se s for pedido o teste
para clamdia, um total de 96 amostras podero ser As amostras aprovadas incluem urina; hastes com
analisadas em uma placa. secrees vaginais, endocervicais e uretrais; e amostras
coletadas com meio lquido para citologia (12, 26).
Uma vez que o ensaio foi desenhado para ser um
As amostras coletadas por hastes utilizam o meio de
sistema fechado, no foram includos mtodos
transporte fornecido pelo fabricante e so estveis por
enzimticos para degradar contaminantes de
at 60 dias a temperatura ambiente, o que as torna
amplificaes anteriores. Infelizmente, ocorreram vrios
ideais para o transporte a laboratrios distantes. O
episdios de contaminao do ambiente a partir da
primeiro jato de urina estvel por at 24 horas aps
amostra bruta. Esses eventos podem implicar semanas
a coleta e, uma vez colocado no meio do fabricante,
para a completa limpeza e recuperao do ambiente, o
permanece estvel a temperatura ambiente por at
que muitas vezes resulta em atrasos dispendiosos e na
30 dias. O teste APTIMA Combo 2 tambm detecta
necessidade de relocao para uma rea nunca exposta
N. gonorrhoeae (RNAr 16S) e, no total, podem ser
previamente ao ensaio. Os laboratrios que utilizam
analisadas aproximadamente 500 amostras durante
esse ensaio devem aderir rigorosamente a um plano
um perodo de oito horas, utilizando um sistema
de monitoramento ambiental para detectar eventos de
automatizado (o sistema TIGRIS). A popularidade desse
contaminao em tempo hbil. Um ensaio de segunda
ensaio est aumentando rapidamente em muitos
gerao que parece ser mais resistente a esse tipo de
pases devido sua alta sensibilidade, especificidade,
contaminao est sendo avaliado.
estabilidade estendida da amostra e automatizao do
A BD tambm desenvolveu um ensaio de ltima gerao processo.
aprovado pela FDA, o ProbeTec ET CTQx/GCQX no
Uma vez que as amostras continuam seladas aps
Sistema Viper com XTR (Viper). Esse ensaio totalmente
a amplificao, espera-se que a possibilidade de
automatizado e pode gerar 278 resultados em uma nica
contaminao cruzada do ambiente seja muito baixa.
jornada de trabalho de oito horas. Ele usa uma qumica
Entretanto, o monitoramento ambiental altamente
em dupla, que inclui uma deteco de amplificao
recomendado na ausncia de uma medida de controle
pareada com cada reao de deteco de clamdia
enzimtica, ou de outra natureza, da degradao
ou gonorreia. O sistema altamente resistente e tem
do produto amplificado. O fabricante recomenda
excelentes caractersticas cronolgicas de andamento
a adeso rigorosa a procedimentos de limpeza e
(24).
descontaminao. A reprodutibilidade deve ser
monitorada. Alm disso, para uma especificidade
5.4.3 Ensaio de diagnstico da Gen-Probe
ideal, esto disponveis ensaios confirmatrios que
O ensaio APTIMA Combo 2 (Gen-Probe, EUA), aprovado detectam o RNAr 16S especfico de C. trachomatis e o
pela FDA, baseado no princpio de captura do RNAr- RNAr 16S especfico de N. gonorrhoeae (APTIMA GC;
alvo (com a inteno de reduzir ou eliminar a inibio outra sequncia de RNAr 16S comparada utilizada
da amplificao), isto , no isolamento das sequncias no APTIMA Combo 2). Esses ensaios so ideais para a
de RNAr-alvo utilizando oligonucleotdeos de captura e confirmao de resultados positivos, assim como para a
esferas magnticas com DNA, seguido pela amplificao repetio de testes (26).
utilizando a tecnologia de amplificao mediada por
transcrio (TMA, do ingls transcription-mediated 5.4.4 Ensaio de diagnstico da Roche
amplification) de uma sequncia do RNAr 23S de C.
O ensaio Cobas Amplicor CT/NG (Roche Diagnostics,
trachomatis. A amplificao detectada por meio da
EUA), tambm aprovado pela FDA, utiliza a tecnologia de
cintica da emisso de luz por sondas de DNA marcadas
PCR para amplificar as sequncias de DNA-alvo, fazendo
e complementares regio-alvo. Os dados confirmando
uso de pares de iniciadores biotinilados especficos
a ausncia de inibio por esse ensaio foram obtidos
em relao a um organismo. Na clamdia, o alvo est
principalmente por meio do uso de amostras negativas
localizado no plasmdeo crptico. Seguindo um processo
de pacientes, misturadas com cepas laboratoriais de C.
de amplificao intermediado por trs temperaturas,
trachomatis (25).

Infeces por clamdia 73

 os produtos so hibridizados em esferas magnticas
cobertas por sondas com sequncias especficas
para cada espcie, localizadas nas sequncias dos
iniciadores. O processo de deteco baseado em
interaes entre biotina e avidina. Um equipamento
Cobas pode testar aproximadamente 96 amostras,
incluindo espcimes e controles, em um perodo de
oito horas. As amostras so coletadas em um meio
de transporte disponvel comercialmente. A urina e as
amostras em hastes so estveis a 4C por at sete
dias. Os tipos de espcimes aprovados incluem hastes
com amostras endocervicais e uretrais, meio lquido
para citologia e o primeiro jato de urina, embora a
urina de mulheres no deva ser utilizada para o teste
de gonorreia. Demonstrou-se que hastes contendo
secreo vaginal geraram resultados aceitveis por essa
plataforma (27, 28).
Esse ensaio inclui uma medida de inibio baseada
em uma sequncia de DNA irrelevante, adicionada
previamente em cada tubo de reao. Isso tem como
objetivo fornecer evidncias de que um resultado
negativo seja realmente negativo, e no meramente
influenciado por contedos na amostra. O ensaio
tambm utiliza, na mistura de amplificao, uma
enzima (uracil-N-glicosilase) que degrada sequncias
previamente amplificadas com base na presena de
dUTP no lugar de dTTP no produto amplificado. Isso
fornece ao usurio uma rede de segurana para evitar
pequenos espirros e formao de aerossol, o que ocorre
frequentemente ao se manusear um grande nmero de
amostras, alm de aumentar a reprodutibilidade dos
resultados.
O Cobas TaqMan CT v2.0, com a marca CE na Europa,
um ensaio de segunda gerao fabricado pela Roche.
Essa plataforma usa PCR em tempo real e pode ser
acoplada a um sistema de processamento automtico
para minimizar o tempo de manuseio por tcnicos. O
ensaio pode ser utilizado apenas para clamdia, sem
estar associado ao teste de gonorreia. O ensaio de ltima
gerao da Roche (Cobas 4800 CT/NG), que tambm
pode detectar N. gonorrhoeae, j foi aprovado pela FDA.
Esse ensaio usa a tecnologia de PCR em tempo real em
uma plataforma totalmente automatizada. Os iniciadores
74 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
utilizados tanto no Cobas TaqMan CT v2.0 como no
Cobas 4800 CT/NG j foram redesenhados e incluem
dois alvos para clamdia, a fim de garantir a deteco da
cepa sueca nvCT (20-22). O segundo alvo no se localiza
no plasmdeo, mas em regies conservadas do gene
ompA que codifica a principal protena da membrana
externa (MOMP). As caractersticas de desempenho se
enquadram no observado para outros NAAT. Esse ensaio
fornece um controle de amplificao e um processo de
preveno de contaminao cruzada juntamente com
um sistema totalmente automatizado, que pode testar
at 278 amostras em um turno de oito horas. O ensaio
funciona bem tanto em amostras invasivas quanto
em amostras vaginais para mulheres e em urina para
homens, e ainda est sob avaliao para meios lquidos
de citologia.
5.4.5 Outros ensaios NAAT
Os ensaios descritos anteriormente baseiam-se na
informao disponvel poca de preparo deste
manual. Atualmente, vrios outros NAAT esto em
desenvolvimento e avaliao e, devido rpida mudana
nesse campo de atuao, pode-se esperar a divulgao
de novos testes. Os laboratrios devem revisar a
literatura conforme a descrio desses novos mtodos
for disponibilizada. Alm disso, em muitos lugares,
os ensaios aprovados pela FDA no so prontamente
liberados ou no podem ser executados devido
necessidade de instrumentao especializada ou altos
custos. Em consequncia, os ensaios comercialmente
disponveis que no foram revisados pela FDA e aqueles
desenvolvidos in-house so utilizados como mtodos
que oferecem maior sensibilidade comparados a outras
classes de deteco (por exemplo, EID ou ELISA). Se um
NAAT no aprovado pela FDA for utilizado, processos
regulatrios regionais (como os da UE) e/ou nacionais
devem garantir a qualidade e desempenho do NAAT
diagnstico (17, 18). Nesses casos, tambm essencial
que os laboratrios se mobilizem para a validao
rigorosa do desempenho desses ensaios NAAT antes
do seu uso para o fornecimento de resultados aos
pacientes; ver tambm o Captulo 2 e o Anexo 3 sobre
NAAT e sua validao e GQ.
5.5 Mtodos de deteco no baseados em
cidos nucleicos
5.5.1 Ensaio de imunofluorescncia direta (EID)
O EID utiliza um anticorpo monoclonal marcado com
fluorescncia que permite a visualizao microscpica
de corpos elementares de C. trachomatis em esfregaos
celulares coletados da conjuntiva, uretra e endocrvice.
Este continua sendo o nico tipo de teste que apresenta
a capacidade de avaliar diretamente a qualidade do
espcime; entretanto, o EID possui sensibilidade abaixo
da ideal, mesmo em relao cultura.
Dois ensaios de anticorpos com fluorescncia direta, o
MicroTrak de colorao direta (Trinity Biotech, Irlanda) e
o Pathfinder de colorao direta (BioRad Laboratories,
EUA) esto disponveis para a colorao de esfregaos
a partir de amostras coletadas da uretra, endocrvice,
reto, orofaringe e conjuntiva para a visualizao de
corpos elementares de clamdia. O ensaio MicroTrak
utiliza um anticorpo monoclonal marcado com
fluorescena especfico para a MOMP de C. trachomatis e
no apresenta reao cruzada com C. pneumoniae.
Em contrapartida, o reagente Pathfinder usa um
anticorpo policlonal especfico para o lipopolissacardeo
(LPS) que mais amplamente reativo e colore tanto C.
pneumoniae quanto C. trachomatis. O uso mais comum
de EID a colorao de esfregaos de amostras da
conjuntiva, principalmente em recm-nascidos de
pases desenvolvidos. Os EID oferecem as vantagens
de rpido retorno de resultado, alta especificidade
e deteco de organismos no viveis. Alm disso,
nenhum outro ensaio comercial apresenta uma clusula
regulamentar para amostras da conjuntiva ou permite
avaliar diretamente a qualidade do espcime. Entretanto,
os EID possuem sensibilidade substancialmente mais
baixa que a dos NAAT, so de execuo trabalhosa
no se mostrando adequados para altas demandas
de diagnstico e necessitam de microscopistas
especializados. Os resultados negativos devem
ser interpretados com cuidado em razo do baixo
desempenho desses testes, o que pode resultar na no
deteco de infeces.
5.5.2 Testes point-of-care (POC)
Os testes ELISA apresentam baixa sensibilidade
e especificidade inferior ideal (especialmente os
ELISA que detectam LPS) quando comparados aos
NAAT, o que pode requerer um teste confirmatrio de
resultados positivos. Os resultados negativos devem ser
interpretados com cautela devido ao baixo desempenho
do teste, que pode resultar na no deteco de
infeces. Por causa das limitaes apresentadas pelos
ELISA, estes no devem ser utilizados quando qualquer
outra opo de teste estiver disponvel.
No entanto, diferentemente dos ELISA, os testes
point-of-care (POC) (testes rpidos), que utilizam a
tecnologia ELISA, apresentam vantagens que tornam
seu uso conveniente para determinados lugares.
Vrios testes POC, comumente baseados no fluxo
lateral e captura de antgenos por membrana em tiras
imunocromatogrficas (TIC), foram desenvolvidos
para diagnosticar infeces por C. trachomatis. Muitos
desses testes foram criados e comercializados,
mas no passaram por uma avaliao apropriada e
detalhada. Entretanto, quando comparados aos NAAT,
os testes rpidos apresentam claramente sensibilidade
insuficiente e s devem ser utilizados quando no houver
estruturas laboratoriais adequadas. O Anexo 2 discute
os princpios dos testes POC. Mesmo com a baixa
sensibilidade dos testes POC, em lugares com limitaes
de recursos e com populaes de alta prevalncia, a
queda da sensibilidade pode ser aceitvel em troca da
possibilidade de testar e tratar enquanto o paciente
ainda est no local da testagem.
Em um estudo de anlise de decises, realizado por
Gift et al., quando a taxa de retorno do paciente para
tratamento foi de 65% ou menos, o diagnstico rpido
por POC proporcionou um aumento no nmero de
pacientes tratados, ainda que tenham sido identificadas
menos infeces (30). Os testes POC podem tambm ser
utilizados nesses locais para aumentar a especificidade
dos algoritmos de gerenciamento sindrmico, o que
ir reduzir o tratamento excessivo e triar infeces
assintomticas.
Os testes rpidos POC oferecem maior oportunidade
de alcanar populaes que no tm acesso a clnicas
e fornecer-lhes tratamento imediato. Em algumas
Infeces por clamdia 75
 situaes, o impacto dessa ampliao no tratamento
pode compensar a menor sensibilidade desses testes
quando comparados aos NAAT.
Os testes rpidos POC oferecem maior
oportunidade de alcanar populaes que no
tm acesso a clnicas e fornecer-lhes tratamento
imediato. Em algumas situaes, o impacto dessa
ampliao no tratamento pode compensar a menor
sensibilidade desses testes quando comparados
aos NAAT.
5.6 Metodologias a serem utilizadas apenas
nos laboratrios de referncia
5.6.1 Cultura
At o incio dos anos 80, o mtodo principal e padro
ouro para o diagnstico de infeces por C. trachomatis
era a inoculao associada centrifugao dos
espcimes clnicos em clulas viveis susceptveis
de culturas de tecidos, seguida da demonstrao de
incluses clamidiais caractersticas aps incubao. Em
resumo, o espcime coletado utilizando hastes com
extremidades de dacron ou citoescovas e colocado em
um meio de transporte, como, por exemplo, tampo
sacarose-fosfato-glutamato (SPG) (ver Anexo 4),
contendo soro fetal bovino e antibiticos tais como
vancomicina, gentamicina e nistatina, para inibir
o crescimento de outra bactria ou fungo. Embora
atualmente esse mtodo deva ser reservado para uso
em laboratrios de referncia, importante manter a
habilidade de obter isolados extrados de pacientes, e
isso requer o uso de cultura de tecidos.
5.6.1.1 Cultura de C. trachomatis em linhagens de
clulas McCoy
Diviso de frascos
Verifique se o meio foi esterilizado antes de sua
utilizao.
Verifique visualmente as monocamadas quanto
aderncia e ausncia de contaminao
microbiana.
Proceda utilizando uma tcnica estril,
trabalhando em uma capela de conteno de
76 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
risco biolgico. Aspire o meio do frasco aderente
usando uma pipeta estril e um frasco a vcuo.
Lave a monocamada com 10mL de soluo
glicose-potssio-sdio-fosfato (GKNP) (ver Anexo
4) e aspire.
Adicione 4mL de tripsina e incube as clulas a
temperatura ambiente at que a monocamada se
desprenda do frasco (em aproximadamente 3-7
minutos). Bata levemente nas laterais do frasco
para remover as clulas.
Adicione 4mL do meio de Dulbecco modificado
por Iscove (IMDM-VGA, do ingls Iscoves
modified Dulbecco medium) (ver Anexo 4) para
inativar a tripsina e agite vigorosamente. Use o
lquido para lavar qualquer clula remanescente
na parede do frasco.
Adicione 1mL da suspenso de clulas para cada
frasco novo de 175cm2 e complete com o meio
IMDM-VGA para um volume final de 75mL. Ao
utilizar frascos de 75cm2, adicione 0,5mL de
clulas e complete com meio para um volume
final de 35mL.
Incube os frascos a 37C por 48-96 horas, com
as tampas bem fechadas.
Cultivo em placas de microtitulao e tubos de ensaio
Siga os passos 1-6 descritos acima.
Cada placa necessita de 15mL de suspenso
celular diluda. Calcule o volume total necessrio
com base no nmero de placas desejado.
Exemplo: 10 placas requerem 150mL de
IMDM-VGA. Cada tubo de ensaio necessita de
1mL de meio de Eagle modificado (MEM-VG, do
ingls Modified Eagles Medium) (Ver Anexo 4).
Calcule o volume total necessrio com base no
nmero de tubos de ensaio desejados.
Para cada 50mL de IMDM-VGA das placas de
microtitulao, adicione 1mL de suspenso
celular do frasco tripsinizado. Exemplo: 150mL
de IMDM-VGA necessita de 3mL de clulas. Para
cada 100mL de IMDM-VGA dos tubos de ensaio,
adicione 1mL das clulas.
 Coloque a suspenso de clulas diludas em
um hemacitmetro. Conte cinco quadrados (os
quatro cantos e o meio); a mdia do nmero de
clulas por quadrado multiplicado por 105 para
fornecer o nmero de clulas por mililitro. As
placas de microtitulao necessitam de 1-1,4 x
10 6 clulas/mL (10-14 clulas por quadrado); os
tubos de ensaio requerem 7-10 x 105 clulas/
mL para que sejam aderentes em 48 horas. Se
o nmero de clulas contadas estiver fora do
intervalo, ajuste a concentrao adicionando
IMDM-VGA ou mais clulas ao frasco, como for
mais apropriado. Conte novamente e ajuste at
que se atinja a concentrao correta.
Adicione 200L em cada poo. Sele as placas
com a pelcula de vedao. Adicione 1mL em
cada tubo de ensaio e tampe bem. Incube a 37C
at que as placas sejam utilizadas (48-96 horas).
Inoculao em placas de microtitulao
Inoculao em tubos de ensaio
Confira a aderncia da monocamada de clulas
McCoy. As clulas devem estar encostadas umas
nas outras e levemente amontoadas. O meio
deve estar transparente.
Os espcimes a seguir devem ser testados no
formato de microtitulao: cervicais, uretrais,
vaginais, do reto, da orofaringe e da conjuntiva.
Agite vigorosamente (em vrtice) as amostras por
cinco segundos e ento, se possvel, sonifique
por 20 segundos. Durante a sonificao, deve-se
utilizar proteo nos ouvidos e olhos.
Os espcimes que exibirem ampla contaminao
bacteriana (por exemplo, meio de transporte
turvo ou mudana de pH no meio) podem causar
toxicidade cultura de tecido. Esses espcimes
devem ser testados das seguintes formas: sem
estarem diludos; diludos a 1:2; e diludos a 1:10
(em SPG).
Trabalhe em uma capela de conteno de risco
biolgico, colocando metade de cada espcime
no criotubo com o mesmo nmero do espcime.
Aspire as placas contendo as monocamadas
aderidas.
Adicione 100L de cada espcime e imerja na
monocamada celular. Cada espcime deve ser
inoculado em trs monocamadas consecutivas.
Aps completar a inoculao em cada placa,
adicione 200L de IMDM-VGA em cada poo.
Sele as placas com a pelcula de vedao e
centrifugue a 1.400g por uma hora a 30C.
Incube a 37C por 48 horas.
Armazene os espcimes a -70C at que
os resultados estejam disponveis. Todos os
espcimes positivos so armazenados por mais
de duas semanas.
Remova o meio das placas. Fixe as
monocamadas cobrindo-as com metanol por 10
minutos. Remova o metanol.
Somente os espcimes excepcionais so
cultivados em tubos de ensaio. Alguns exemplos
incluem bipsias endometriais ou tubrias e
tecidos linfticos.
Confira a aderncia das clulas McCoy nos
tubos; as clulas devem estar encostadas umas
nas outras e levemente alongadas. O meio deve
estar transparente.
Agite vigorosamente (em vrtice) os espcimes
por cinco segundos e ento sonifique-os por 20
segundos. Durante a sonificao deve-se utilizar
proteo nos ouvidos e olhos.
Os espcimes que exibirem ampla contaminao
bacteriana (por exemplo, meio de transporte
turvo ou mudana de pH no meio) podem causar
toxicidade cultura de tecido. Esses espcimes
devem ser testados das seguintes formas: sem
estarem diludos; diludos a 1:2; e diludos a 1:10
(em SPG).
Trabalhando na capela, etiquete e aspire trs
tubos de ensaio por espcime. Adicione 0,2mL
Infeces por clamdia 77
 de espcime a cada tubo. Acrescente 1mL de
IMDM-VGA.
Centrifugue a 2.500g por uma hora a 30C.
Incube a 37C por 72 horas.
Armazene todos os espcimes a -70C at que
os resultados estejam disponveis. Todos os
espcimes positivos so armazenados por tempo
indeterminado.
Aspire o meio de um tubo por espcime e fixe-o
cobrindo a monocamada com metanol por 10
minutos.
Marque com anticorpos fluorescentes.
Siga as instrues do manual para o anticorpo
anticlamdia especfico utilizado. Em geral:
Adicione o antissoro monocamada fixada
(aps a remoo do metanol). Cada poo de
microtitulao recebe 40L utilizando-se uma
micropipeta multicanal.
Incube a temperatura ambiente por 30 minutos.
Lave gentilmente trs vezes com soluo
salina tamponada com fosfato (PBS, do ingls
phosphate-buffered saline solution) (ver Anexo 4).
As lamnulas redondas de 13mm so removidas
dos tubos de ensaio e, utilizando-se fluido de
montagem, colocadas em lminas de vidro com
lamnulas de 22x50mm. Mantenha as culturas
marcadas no escuro at que sejam lidas. As
culturas devem ser lidas no mesmo dia em que
forem marcadas.
Na maioria dos laboratrios, a cultura no mais
adequada como teste de diagnstico, uma vez que
apresenta menor sensibilidade que os NAAT, implica
tempo de retorno do resultado significativamente
longo, demanda o uso de amostras invasivas, requer
condies de manipulao mais restritivas para
preservar a viabilidade de C. trachomatis, tecnicamente
complexa e no possui uma metodologia padronizada
internacionalmente e de qualidade garantida. A cultura
hoje requisitada predominantemente para uso em
casos mdico-legais, devido suposio de 100% de
78 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
especificidade (mas pode ocorrer contaminao cruzada
entre amostras), e para o teste de cura, que solicitado
em menos de 14 dias aps o tratamento. Na verdade,
a especificidade dos NAAT tanta que esses ensaios
tambm deveriam ser aceitos para os casos mdico-
legais; mas a confiana na cultura reflete a lentido
das mudanas nos padres legais. O teste de cura
raramente realizado, dada a eficincia dos tratamentos
de dose nica disponveis. No entanto, alguns estudos
recentes indicaram uma eficcia de erradicao abaixo
do ideal para o uso de 1g de azitromicina. Se realizado,
o teste normalmente executado em mais de duas
ou trs semanas aps o tratamento em cada local. Na
maioria dos casos, os ensaios de NAAT so apropriados
para essa finalidade, uma vez que a perda de DNA da
infeco inicial j deve estar completa nesse momento.
Entretanto, o tempo ideal para a realizao do teste de
cura pode diferir para os NAAT baseados em RNA.
Dessa forma, a menos que os isolados dos organismos
sejam requeridos para fins de pesquisa, no h uma
justificativa vlida para o uso da cultura como um
mtodo de diagnstico de rotina. Isso consistente com
as recomendaes das diretrizes laboratoriais atuais
para doenas sexualmente transmissveis dos CDC (15).
Os isolados recuperados nos locais em que a cultura
ainda realizada deveriam ser preservados em um
repositrio de espcimes para estudos epidemiolgicos.
Esses estudos podem incluir a investigao da
susceptibilidade antimicrobiana (ver adiante) e a
determinao de gentipos. Esta ltima pode ser
realizada mediante tcnicas moleculares e no necessita
o uso de organismos viveis (31-33). Assim, os
repositrios de amostras positivas para NAAT tambm
devem ser mantidos nas diferentes regies do mundo.
 A cultura apresenta uma sensibilidade abaixo da
ideal quando comparada aos NAAT disponveis
comercialmente e aprovados internacionalmente, e
no pode ser recomendada para diagnstico se um
NAAT apropriado estiver disponvel e for acessvel
economicamente.
A capacidade da realizao de cultura deve ser
mantida em alguns laboratrios de referncia,
e o repositrio de isolados deve ser conservado
para possveis estudos genticos e/ou fenotpicos
futuros.
5.6.2 Teste de susceptibilidade antimicrobiana
No h evidncias inequvocas da emergncia de
resistncia adquirida homotpica (fenotpica e genotpica)
e estvel aos antibiticos recomendados em isolados
clnicos de C. trachomatis, embora registros de casos
tenham sugerido a resistncia bacteriana como
causa de falhas teraputicas. Alm disso, o teste
de susceptibilidade antimicrobiana in vitro para C.
trachomatis nunca foi realizado rotineiramente; no h
uma metodologia aceita universalmente, padronizada,
reprodutvel e com qualidade garantida; e tambm no
foi realizada uma correlao baseada em evidncias
entre a atividade in vitro e a eficincia in vivo (desfechos
de tratamentos clnicos) (34).
O teste de susceptibilidade antimicrobiana para C.
trachomatis envolve grande demanda de mo de
obra, requer experincia em cultura de tecidos e s
vivel em laboratrios de referncia. Entretanto,
no se deve excluir a possibilidade de uma futura
emergncia e propagao da resistncia antimicrobiana
clinicamente relevante em C. trachomatis. Isso enfatiza
a necessidade de uma avaliao adequada dos atuais
mtodos de teste de susceptibilidade antimicrobiana e
do desenvolvimento de um mtodo efetivo, padronizado,
objetivo e de qualidade garantida, assim como uma
correlao apropriada entre a atividade in vitro e o
resultado do tratamento. Esse mtodo pode ser til no
futuro para o monitoramento de possveis resistncias
antimicrobianas, estudos de tratamentos clnicos e
acesso atividade in vitro de novos antibiticos. Na
ocorrncia de eventos de propagao de resistncia
antimicrobiana clinicamente relevante em C. trachomatis,
os repositrios de isolados sero de utilidade para a
avaliao retrospectiva em instituies de pesquisa.
5.6.3 Sorologia
Os mtodos sorolgicos para o diagnstico das infees
por clamdia esto entre as tecnologias mais modernas
disponveis. Esses mtodos identificam e, em alguns
casos, titulam o nvel da resposta do anticorpo aos
antgenos da clamdia. Enquanto o primeiro ensaio,
fixao complementar e microimunofluorescncia
(MIF) dependiam de organismos inteiros, os ensaios
subsequentes foram desenvolvidos para apresentar
respostas especficas a protenas individuais ou classes
de anticorpos. A sorologia pode ajudar o diagnstico e/
ou a triagem de infeces complicadas de C. trachomatis
(artrite reativa, PID, gravidez ectpica, infertilidade
por fator tubrio); diagnosticar pneumonia neonatal e
infeces de LGV (ver Captulo 11); e pode ainda ser
til em pesquisa e estudos epidemiolgicos, como, por
exemplo, para o histrico cumulativo de exposies
de uma populao amostral a infeces por clamdia.
Entretanto, importante que os resultados sorolgicos
sejam sempre interpretados com cautela e no fora de
contexto.
Em uma infeco primria aguda por clamdia,
podem-se detectar IgM especficas, assim como IgG
e IgA. No entanto, muitas vezes a resposta sistmica
de anticorpo retardada ou no mensurvel aps
infeco urogenital descomplicada. Em contrapartida,
nveis altos de anticorpos contra C. trachomatis podem
persistir muito tempo aps a eliminao da infeco.
Consequentemente, devido baixa sensibilidade e
especificidade, a mensurao de anticorpos contra
clamdia de pouco valor para o diagnstico de
infeces agudas por C. trachomatis e no deve
ser usada para o diagnstico de rotina de infeces
descomplicadas por C. trachomatis.
Infeces por clamdia 79
 No utilize a sorologia para o diagnstico de
infeces urogenitais descomplicadas por C.
trachomatis.
Somente use a sorologia como uma possvel ajuda
para o diagnstico e/ou triagem de infeces
complicadas por C. trachomatis, pneumonia
neonatal e infeces de LGV, assim como em
estudos epidemiolgicos.
5.7 Referncias
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82 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Captulo 6
Tricomonase
6.1 Introduo
O Trichomonas vaginalis o agente etiolgico da
doena sexualmente transmissvel (DST) no viral
mais prevalente em todo o mundo. Em 2008, a
Organizao Mundial da Sade estimou a ocorrncia
de 276,4 milhes de novos casos de T. vaginalis
mundialmente entre adultos com 15-49 anos. Isso
representa, substancialmente, mais casos de DST do
que os causados por Chlamydia tracomatis e Neisseria
gonorrhoeae juntas (1). Apesar da alta prevalncia de
infeces causadas por T. vaginalis, os esforos para
o controle das DST tm, historicamente, subestimado
esse patgeno. Embora T. vaginalis possa causar
um corrimento vaginal anormal (tricomonase) em
mulheres e ser responsvel por at 10-12% dos
casos de uretrites no gonoccicas em homens (2), a
infeco pode ser assintomtica em pelo menos 50%
das mulheres e 70-80% dos homens (3). Assim, o
diagnstico laboratorial essencial para complementar
as estratgias de gesto sindrmica para o tratamento
dessa infeco.
O T. vaginalis um protozorio mvel, ovoide, em
formato de pera e flagelado (10-20m de comprimento).
Os organismos apresentam quatro flagelos anteriores
livres e um quinto flagelo imerso em uma membrana
ondulada que se estende anteriormente at cerca de dois
teros da clula. Esse flagelo impele o protozorio com
movimentos irregulares.
A epidemiologia de infeces por T. vaginalis difere
em dois importantes aspectos de outras infeces que
causam corrimento vaginal. Primeiro, a faixa etria
em que a infeco incide distinta daquela na qual
ocorre a infeco por clamdia ou gonorreia. Nessas
ltimas, em menor medida no que se refere infeco
gonoccica, o pico de prevalncia ocorre em mulheres
com 15-25 anos, enquanto que as infeces por T.
vaginalis apresentam o seu pico substancialmente
mais tarde na vida (entre 40-50 anos de idade). Essa
diferena na distribuio relevante para orientar
os programas de controle de DST e definir os alvos
apropriados para a triagem. A distribuio especfica da
infeco em homens por idade ainda no foi estudada
adequadamente.
A segunda diferena que, embora o T. vaginalis
dependa da transmisso sexual para mover-se de
hospedeiro para hospedeiro, a distribuio das infeces
diagnosticadas em laboratrio altamente desigual
entre homens e mulheres, com uma razo de sexos de
at 4:1 (6-8). Essa distribuio demonstrada pelas
taxas de infeco de parceiros masculinos de mulheres
infectadas, que varia de 22% a 72% (9), e dos poucos
estudos realizados simultaneamente em homens e
mulheres. Isso ocorre provavelmente pelo fato de a
infeo em homens ser mais transitria, pelo curto
perodo em que a deteco do organismo possvel e
pela ausncia de triagem e diagnstico em homens. O
T. vaginalis adere membrana mucosa associada ao
epitlio escamoso, mas no invade a mucosa. Devido
ao ambiente da uretra masculina, menos provvel que
o organismo se mantenha nesse local do que no meio
vaginal. Existem dados limitados sobre a patognese
da infeco por T. vaginalis em homens (8). Em homens
e mulheres, o organismo normalmente promove uma
resposta inflamatria robusta, que resulta no corrimento
tpico da doena j instalada. Ver Tabela 6.1 para a
descrio das manifestaes clnicas da infeco por T.
vaginalis.
O diagnstico de tricomonase baseado no odor,
qualidade e quantidade de corrimento vaginal, no
pH vaginal e na possvel presena de friabilidade
cervical. Normalmente, o pH vaginal >6.0, o corrimento
exacerbado ou branco espumoso e a friabilidade
cervical pontuada (colo do tero com aspecto de
morango) so sugestivos de infeco por T. vaginalis.
Entretanto, a ausncia desses sinais clnicos no
suficiente para eliminar a possibilidade de infeco,
principalmente devido ao fato de esta ser assintomtica
em aproximadamente 50% das mulheres e 70-80%
dos homens (5,6). Consequentemente, os mtodos
laboratoriais so necessrios para aumentar a
sensibilidade e a especificidade do diagnstico.
Tricomonase 83
 Tabela 6.1: Manifestaes clnicas da infeco por Trichomonas vaginalis
Infeco genital Primria
Mulheres Corrimento exacerbado, purulento ou
espumoso branco a amarelo; disria;
dor plvica; prurido
Homens Corrimento uretral, disria, dor no
testculo
A resposta inflamatria da tricomonase em mulheres
e da uretrite causada por T. vaginalis em homens
significativa e aumenta substancialmente o risco
de transmisso e infeco por HIV, como tambm a
probabilidade de desfechos negativos da gravidez.
Em homens, o tratamento de uretrite causada por
T. vaginalis resulta em uma diminuio de 0,5-2
log da carga viral do HIV no lquido seminal (10, 11).
Resultados similares foram observados em mulheres
que receberam tratamento para o corrimento vaginal
(12, 13). Uma vez que a carga viral no compartimento
genital um dos principais fatores de risco para
a transmisso para um parceiro no infectado, o
diagnstico apropriado e o tratamento das infeces
por T .vaginalis devem ser prioridade na sade pblica
como estratgia de enfrentamento ao HIV. Da mesma
forma, dados disponveis h muitos anos indicam que
a presena de corrimento resultante de DST aumenta
o risco de infeco por HIV. Estudos realizados na
frica subsaariana estimaram que o aumento do risco
de soroconverso em mulheres com tricomonase
de 1,5-3,0 vezes (9). Esses estudos foram conduzidos
em populaes de mulheres em alto risco para HIV
(profissionais do sexo) e em populaes mais gerais
(mulheres atendidas em clnicas de planejamento
familiar). Anlises de sobrevivncia realizadas durante
longos ensaios clnicos estimaram um aumento de
duas vezes quanto ao risco relativo de infeco por
HIV por mulheres com tricomonase durante um
perodo de 30 meses (14). Por outro lado, mulheres
com HIV apresentaram um aumento de 2,1 vezes no
risco de adquirir trichomonas durante os 30 meses
de acompanhamento (14). Isso indica um aumento de
risco de transmisso do HIV a parceiros no infectados.
Dado o maior risco de transmisso do HIV, semelhante
ao observado para gonorreia, e taxas de prevalncia
84 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Sequelas
Desfechos negativos da gravidez,
aumento do risco de transmisso e
infeco por HIV
Possvel epididimite e prostatite
aproximadamente trs vezes maiores em relao a
esta ltima, o diagnstico apropriado e o tratamento da
infeco por T. vaginalis merece maior priorizao.
As infeces por T. vaginalis so as DST no virais
mais comuns, as quais aumentam o risco de
transmisso e infeco por HIV, alm de elevar a
probabilidade de desfechos negativos da gravidez.
6.2 Reviso dos mtodos de diagnstico
disponveis
Existem quatro classes principais de ensaios de
diagnstico laboratorial: microscopia de preparao
a fresco, deteco de antgenos, cultura e testes de
amplificao de cidos nucleicos (NAAT, do ingls
nucleic acid amplification test). A microscopia de
preparao a fresco pode ser realizada em clnicas e
em combinao com testes para vaginose bacteriana.
Esse um mtodo de diagnstico de primeira linha
ideal, isto , quando realizado e interpretado de forma
adequada, fornece um diagnstico definitivo com alta
especificidade. Entretanto, preciso usar de cautela ao
descartar a possibilidade de infeco com base somente
na microscopia negativa, devido a trs razes. Primeiro,
os tricomonaddeos so sensveis a temperaturas altas
e perdem sua mobilidade em at 10 minutos aps a
coleta da amostra. Uma vez que a mobilidade uma
marca caracterstica, sua perda pode resultar em
resultados falso-negativos. Segundo, o tamanho dos
tricomonaddeos similar ao das clulas brancas do
sangue (linfcitos ou pequenos granulcitos neutrfilos),
que esto comumente presentes como resultado do
processo inflamatrio. Assim, os tricomonaddeos podem
ser confundidos com esses tipos de clulas. Finalmente,
em muitas mulheres e na maioria dos homens, a carga
do organismo pode ser inferior ao limite de deteco da
microscopia. Alm das amostras vaginais, a microscopia lugares a ser utilizados e antes da implementao para o
pode ser realizada em secrees uretrais ou sedimentos diagnstico de rotina nos laboratrios.
urinrios de homens, mas essa tcnica apresenta baixa
Uma srie de mtodos foram descritos para a deteco
sensibilidade, provavelmente tambm devido baixa
de anticorpos contra T. vaginalis. No entanto, os
carga de organismos (15).
testes de anticorpos apresentam baixa sensibilidade
Os testes point-of-care (POC) de deteco de antgeno e especificidade inferior ideal para a deteco de
esto atualmente disponveis em muitos lugares. Esses infeces por T. vaginalis, e no devem ser utilizados
so aprovados apenas para amostras vaginais. A ltima para o diagnstico de rotina de tricomonases.
gerao desses testes, por exemplo, o Teste Rpido
A Tabela 6.3 resume as caractersticas de desempenho
para Trichomonas OSOM (Genzyme Diagnostics, EUA),
dos testes de diagnstico disponveis para a deteco
apresenta uma sensibilidade maior quando comparado
de T. vaginalis. Para o desempenho apropriado de
microscopia (16, 17 ) e pode fornecer resultados
todos os mtodos de diagnstico, essencial seguir
em aproximadamente 30 minutos, isto , enquanto o
precisamente os procedimentos operacionais-padro
paciente espera. Assim como em outros ensaios POC,
e recomendaes dos fabricantes quanto coleta,
a oportunidade de tratar as infeces imediatamente
transporte e armazenamento das amostras, assim
uma vantagem desse teste em relao queles que
como o desempenho do ensaio especfico, incluindo os
necessitam de encaminhamento a um laboratrio
controles de qualidade.
central.
Os testes POC apropriados e a cultura apresentam
As culturas laboratoriais foram utilizadas por muitos
maior sensibilidade que a microscopia.
anos e, na ltima dcada, kits de cultura disponveis
comercialmente, tais como o sistema de cultura InPouch Os NAAT apropriados e validados apresentam
TV (BioMed Diagnostics, EUA), tornaram-se acessveis. sensibilidade superior a outros mtodos de
Amostras vaginais, da uretra e de sedimentos urinrios diagnstico.
de homens so espcimes licenciados para a cultura
(ver Tabela 6.2). Esse mtodo exige at 5-7 dias aps a 6.3 Condies de coleta, transporte e
coleta e a determinao de resultados positivos requer armazenamento de espcimes (ver
a avaliao por microscopia. Entretanto, a cultura Tabela 6.2)
aumenta a sensibilidade para alm daquela observada na
Mulheres
microscopia de preparao a fresco (15, 17 ).
As amostras vaginais so ideais para a deteco de T.
Finalmente, os NAAT esto disponveis para a deteco
vaginalis. A coleta de amostra do frnice posterior deve
do DNA ou RNA especfico de T. vaginalis. Em programas
ser realizada por meio de uma haste de plstico com
que empregam os NAAT para clamdia e gonorreia,
extremidades de dacron ou rayon. As hastes de madeira
a incluso do teste para T. vaginalis pode ser uma
com extremidades de algodo so aceitveis para
estratgia razovel. At a escrita do presente manual,
microscopia ou inoculao de culturas, mas no so
a Administrao de Alimentos e Drogas dos Estados
recomendadas para POC ou NAAT. Dessa forma, para
Unidos da Amrica (FDA, do ingls United States of
evitar confuses, mais prtico evitar o uso de hastes
America Food and Drug Administration) aprovou apenas
com extremidades de algodo. Os mdicos devem
um ensaio, mas outros ensaios esto sob avaliao
coletar as amostras antes da insero do espculo
e j podem estar disponveis em alguns lugares. A
durante os exames plvicos, ou o prprio paciente pode
sensibilidade e a especificidade do ensaio aprovado
obter a amostra. necessrio orientar os pacientes
pela FDA (APTIMA TV, Gen-Probe, EUA) so muito
para que estes entendam como coletar sua prpria
altas (5, 16, 18). As caractersticas de desempenho de
amostra. O fornecimento de instrues adequadas um
outros NAAT devem ser avaliadas rigorosamente, de
fator determinante para a concordncia do paciente em
preferncia em relao ao teste aprovado pela FDA, nos
coletar sua prpria amostra. As amostras residuais

Tricomonase 85
 vaginal, cervical ou de urina coletadas para o teste de
clamdia/gonorreia podem ser utilizadas para o NAAT de
T. vaginalis.
Homens
Secrees da uretra podem ser coletadas utilizando-se
uma haste de alumnio com extremidade de dacron
ou rayon. Essas amostras podem ser usadas para a
microscopia de preparao a fresco, para a cultura
ou para o NAAT. O primeiro jato de urina pode ser
centrifugado para a obteno do sedimento apropriado
para a cultura. A urina no centrifugada adequada para
o NAAT.

Tabela 6.2: Coleta, transporte e armazenamento de amostras

Local Aparato Procedimento de Microscopia POC Cultura NAAT
de coleta amostragem
Vaginal Haste/ Colete a amostra Dilua a Coloque a Coloque a Coloque a
(coletado plsticoa do frnice amostra em amostra no amostra amostra no
pelo mdico) posterior antes 0,5mL de tampo de diretamente em aparato de
da insero do soluo salina extrao do meio de cultura coleta do
espculo. e aplique kit e siga as (por exemplo, fabricante.
uma gota da instrues meio de Diamond Pode ser
soluo na do manual. ou InPouch).b enviada seca
lmina com Incube a 37C. ao laboratrio.
lamnula. Armazene e
transporte de
acordo com as
instrues do
manual.
Vaginal Haste/ Gire a haste 360, Entregue a Entregue a Entregue a Coloque a
(coletado plsticoa tocando todas as amostra ao amostra ao amostra ao amostra no
pelo paciente) paredes vaginais. fornecedor fornecedor fornecedor para aparato de
para a diluio para a inoculao em coleta do
e preparao que seja meio de cultura. fabricante.
da lmina. processada Pode ser
como enviada seca
descrito ao laboratrio.
acima. Armazene e
transporte de
acordo com as
instrues do
manual.

86 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Tabela 6.2: Coleta, transporte e armazenamento de amostras (continuao)
Local Aparato Procedimento de Microscopia POC Cultura NAAT
de coleta amostragem
Uretra Haste/ Colete secrees Dilua a NA Coloque a Coloque a
(apenas em alumnioc da uretra >1 hora amostra em amostra amostra no
homens aps a ltima 0,5mL de diretamente em aparato de
sintomticos) urina. soluo salina meio de cultura coleta do
e aplique (por exemplo, fabricante.
uma gota da meio de Diamond Armazene e
soluo na ou InPouch).b transporte de
lmina com Incube a 37C. acordo com as
lamnula. instrues do
manual.
Urina Copo O paciente no Centrifugue NA Centrifugue Coloque a
estril deve limpar a rea a amostra a amostra a amostra no
para genital. Obter a a 500g por 500g por cinco aparato de
coleta de primeira parte do cinco minutos. minutos. Coloque coleta do
urina jato de urina (em Coloque o o sedimento fabricante.
geral, menos que sedimento em um meio Armazene e
25mL), >1 hora em 0,5 de cultura (por transporte de
aps a ltima de soluo exemplo, meio acordo com as
urina. salina. Aplique de Diamond ou instrues do
uma gota da InPouch).b Incube manual.
soluo na a 37C.
lmina com
lamnula.

NA: no se aplica; NAAT: teste de amplificao de cidos nucleicos; POC: testes point-of-care.
a
Hastes de plstico com extremidades de dacron ou rayon.
b
Para lugares que no tm acesso a meio de cultura, as hastes podem ser colocadas em tubos contendo meio Amies, sendo armazenadas a 4C e
transportadas ao laboratrio central em at 24 horas.
c
Haste de alumnio com extremidades de dacron ou rayon.

Tricomonase 87
 Tabela 6.3: Caractersticas de desempenho dos testes de diagnstico para a deteco de T. vaginalis
Microscopia POC Cultura NAAT
Tipos de espcime
Haste com amostra No No No Sim
endocervical
Meio lquido para citologia No No No Sim
Haste com amostra vaginal

Obtida pelo paciente Sim Sim Sim Sim

Coletada pelo mdico Sim Sim Sim Sim
Urina

Feminina No No No Sim
Masculina Sim No Sim Sim
Haste com amostra uretral Sim No Sim Sim
masculina
Desempenho
Sensibilidade Baixa Altaa Moderada-alta Muito alta
Especificidade Muito alta Muito alta Muito alta Muito alta
Outras consideraes
Custo Baixo Moderado Moderado Alto
Transporte e NA NA Ambiente Ambiente
armazenamento
Instrumentao Microscpio Nenhuma Estufa, microscpio Grande infraestrutura
Rendimento/automatizao Baixo/no Baixo/no Baixo/no Alto/possvel
Complexidade tcnica Moderada Baixa Moderada (experincia Alta
(experincia em em microscopia)
microscopia)
Nvel de infraestrutura do Perifrica Perifrica Intermedirio-central Central
laboratrio
Outros comentrios Resultados As infeces necessrio necessria a
falso-negativos identificadas um mximo de adeso estrita aos
so mais podem ser ateno para uma protocolos, devido
provveis que tratadas microscopia precisa. possibilidade
resultados antes que de contaminao
Com a probabilidade
negativos o paciente laboratorial.
de obter isolados
reais. Assim, o deixe a
viveis, til para Alguns exigem
contexto clnico clnica.
testes adicionais, grandes lotes, o
essencial.
como a determinao que pode atrasar o
de gentipos e o teste tempo de entrega
de susceptibilidade de resultados.
antimicrobiana.

NA: no se aplica; NAAT: teste de amplificao de cidos nucleicos; POC: teste point-of-care.
a
Refere-se ao teste rpido para trichomonas OSOM (Genzyme Diagnostics, EUA).

88 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

6.4 Mtodos de diagnstico
6.4.1 Microscopia
Imediatamente aps a coleta, as amostras so diludas
em 0,5mL de soluo salina estril a temperatura
ambiente, e uma lmina deve ser preparada com uma
gota da amostra em soluo salina e uma lamnula. A
lmina deve ser analisada com um aumento de 100x,
em at 10 minutos aps a coleta, para visualizar os
tricomonaddeos mveis. A confirmao da morfologia
em formato de pra, incluindo a visualizao do
flagelo, deve ser realizada utilizando um aumento
de 400x (Figura 6.1). As clulas no mveis no
podem ser diagnosticadas como tricomonaddeos e,
consequentemente, importante que a microscopia
seja realizada imediatamente, uma vez que os
organismos perdem rapidamente sua mobilidade (19). A
sensibilidade da microscopia limitada (apenas 40-65%
para mulheres em alguns lugares, e ainda menos
para amostras de homens) (6, 15, 16) e os resultados
negativos devem ser interpretados com cautela.
Em alguns lugares, a microscopia constitui o diagnstico
e triagem de primeira linha e as amostras negativas so
encaminhadas a um laboratrio central para maiores
avaliaes, principalmente as de indivduos sintomticos.
Entretanto, quando a mobilidade do organismo,
estritamente exigida, e a morfologia so identificadas,
a especificidade da microscopia excelente e todos
os pacientes com microscopia positiva devem ser
considerados infectados.
A microscopia necessita ser realizada e interpretada em
at 10 minutos para obter bons resultados e uma maior
sensibilidade em mulheres sintomticas.
Figura 6.1
Trichomonas vaginalis em microscopia de
preparao a fresco.
A microscopia deve ser realizada e interpretada em
at 10 minutos para obter bons resultados e uma
maior sensibilidade em mulheres sintomticas.
6.4.2 Testes point-of-care (POC) com deteco
de antgenos
Vrios ensaios de deteco de antgenos foram
desenvolvidos para a identificao de T. vaginalis (16,
17, 20). As exigncias de equipamentos e os custos dos
reagentes variam, assim como o desempenho do ensaio.
Vrios desses ensaios so direcionados apenas para o
uso em mulheres sintomticas, tornando-os menos teis
que as outras opes. A ltima gerao desses testes,
como, por exemplo, o Teste Rpido para Trichomonas
OSOM (Genzyme Diagnostics, EUA) apresenta maior
sensibilidade quando comparado microscopia (16,
17 ). Os procedimentos iro variar de acordo com
o fabricante, e as instrues do manual devem ser
seguidas precisamente para cada ensaio.
Os testes POC apropriados apresentam sensibilidade
substancialmente maior que a microscopia e fornecem
resultados rpidos com um mnimo de experincia
tcnica.
Os testes POC apropriados apresentam
sensibilidade substancialmente maior que a
microscopia e fornecem resultados rpidos com
um mnimo de experincia tcnica.
6.4.3 Cultura
Por muitos anos, a cultura foi fundamental para
o diagnstico de T. vaginalis. O T. vaginalis um
organismo anaerbico, que cresce muito devagar
em condies aerbicas. Atualmente, a cultura
normalmente realizada utilizando-se o meio de Diamond
modificado ou o sistema de cultura InPouch TV (BioMed
Diagnostics, EUA) (Figura 6.2). As culturas devem ser
incubadas por at 5-7 dias. importante ressaltar que o
T. vaginalis deve crescer no fundo do tubo de cultura e,
consequentemente, os tubos necessitam ser incubados
em uma posio vertical. Alm disso, o meio de cultura
deve ser pr-reduzido e os tubos de cultura levemente
abertos antes de serem colocados no recipiente
anaerbico para incubao a 37C.
Tricomonase 89
 O meio de Diamond original (21, 22) (ver Anexo 4) foi
subsequentemente modificado de acordo com Fouts
e Kraus, isto , com a substituio da estreptomicina
por netilmicina (22, 23). O meio modificado melhora a
sensibilidade em aproximadamente 75% em relao
aos NAAT. No entanto, a cultura de T. vaginalis tambm
apresenta desvantagens. A sensibilidade da cultura
baixa se comparada aos resultados obtidos por NAAT
(principalmente para homens), alm de constituir um
procedimento que demanda muito tempo e requer que
os pacientes voltem para buscar os resultados. Outros
meios de cultura tambm foram descritos (22, 24-26)
(ver Anexo 4). As amostras coletadas por hastes devem
ser diludas, ou os sedimentos de urina inoculados,
diretamente no meio de cultura na clnica. Nos lugares
que no tm acesso a meio de cultura, devido ao prazo
de validade curto ou outras razes, as hastes podem ser
colocadas em tubos contendo meio Amies, armazenadas
a 4C e transportadas ao laboratrio central em at 24
horas. As culturas devem ser misturadas gentilmente,
coletando-se uma gota do fundo do tubo (onde h maior
concentrao de tricomonaddeos) para microscopia de
preparao a fresco, diariamente, por at sete dias. Se
no for possvel realizar o exame todos os dias, o exame
realizado aps 3-4 dias e novamente no stimo dia ir
detectar quase todos os espcimes positivos.
Em meados dos anos 90, um sistema de cultura
tornou-se comercialmente disponvel, ampliando o uso
de cultura para diagnstico (22, 27-30). O sistema para
cultura InPouch TV utiliza uma bolsa com duas cmaras
independentes (Figura 6.2). As amostras coletadas
por hastes so diludas, ou os sedimentos de urina so
inoculados, no meio no primeiro compartimento. O meio
ento forado para o segundo compartimento e a bolsa
selada. As bolsas so transportadas ao laboratrio
para incubao a 37C por at cinco dias. O sistema
de bolsa pode ser concludo mais rapidamente que a
cultura tradicional, j que, a cada vez, todo o volume
avaliado. As bolsas seladas esto prontas para ser
colocadas no microscpio, utilizando um aumento de
100x. Suportes para essas bolsas, que se encaixam nos
grampos que seguram as lminas, j esto disponveis e
devem ser utilizados para auxiliar na movimentao da
bolsa durante a anlise de microscopia. Toda a cultura
avaliada por meio de uma varredura cuidadosa de ponta
90 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
a ponta. importante ressaltar que a espessura da bolsa
requer que todos os planos de foco sejam avaliados;
isso exige a movimentao do topo para o fundo e de
um lado para o outro. As lminas devem ser avaliadas
diariamente at o quinto dia. Se nenhum trichomonas for
identificado at o dia 5, a cultura considerada negativa.
A cultura tem sensibilidade similar dos testes POC
apropriados, mas tambm pode ser utilizada para
realizar exames em homens.
Figura 6.2
Sistema de cultura InPouch TV.
6.4.4 Testes de amplificao de cidos
nucleicos (NAAT)
Os NAAT oferecem a maior flexibilidade quanto aos
mtodos de coleta de amostras e apresentam a maior
sensibilidade dentre todos os mtodos de diagnstico
disponveis. Amostras genitais residuais utilizadas para
o diagnstico de clamdia e gonorreia por meio de NAAT
so adequadas para a deteco dos cidos nucleicos de
T. vaginalis. Os laboratrios que realizam rotineiramente
NAAT para clamdia e gonorreia devem considerar testes
para tricomonase. Apesar da diferena na faixa etria
de maior prevalncia, em muitos locais, a prevalncia
da infeco por T. vaginalis na populao suficiente
para que haja uma preocupao em inclu-la no painel
de testes das causas de corrimento. A descrio de
ensaios desenvolvidos em laboratrios que utilizam
muitas das plataformas de NAAT acessveis atualmente
para clamdia e gonorreia esto disponveis (6, 15,
31-42). Todos esses ensaios envolvem o isolamento do
cido nucleico, a amplificao das sequncias-alvo e a
deteco do material amplificado. Apesar da excelente
sensibilidade e especificidade, esses ensaios podem
ser afetados pela contaminao ambiental e, dessa
forma, justifica-se a adeso estrita s boas prticas
laboratoriais. tambm altamente recomendado que
a efetividade do NAAT para T. vaginalis proposto para
os estabelecimentos locais, antes de ser utilizado no
diagnstico, seja estritamente validado em relao a,
pelo menos, um NAAT certificado internacionalmente,
de preferncia o aprovado pela FDA, o APTIMA TV
(ver adiante), e, subsequentemente, utilizado com um
sistema adequado de garantia de qualidade (ver Captulo
2 e Anexo 3).
Como mencionado acima, um ensaio (APTIMA TV,
Gen-Probe, EUA) foi aprovado pela FDA. Esse teste
altamente sensvel e especfico (16, 18, 43, 44) e pode
ser realizado em uma plataforma semiautomtica ou
totalmente automatizada. O ensaio, como todos os NAAT,
exige ateno especial aos procedimentos de manuseio
de lquidos, para minimizar os eventos de contaminao.
A infraestrutura de equipamentos e os requisitos de
energia para o teste so ambos substanciais. Esse
ensaio deve ser restrito aos laboratrios de referncia
com alta capacidade tcnica.
Os NAAT eficientes e validados apresentam
sensibilidade muito alta e so especialmente teis
em locais onde os testes para clamdia/gonorreia
so realizados utilizando NAAT.
O diagnstico por NAAT exige equipamento
especializado, reagentes e experincia tcnica.
6.5 Resistncia antimicrobiana
Foram descritos isolados de T. vaginalis com
susceptibilidade diminuda e resistncia a metronidazol
(em geral, o tratamento de primeira linha) e tinidazol
(geralmente, a terapia de segunda linha), mas
essas ocorrem raramente (45, 46). Entretanto, em
alguns locais, foi identificado um ligeiro nvel de
resistncia em 2-5% dos casos de tricomonase em
mulheres. A origem da resistncia antimicrobiana
no clara, mas muitas das cepas resistentes de T.
vaginalis parecem ser aerotolerantes. Os organismos
facultativos so geralmente resistentes a metronidazol.
Entretanto, os dados de resistncia so escassos
e estudos adicionais nessa rea so necessrios
para determinar os mecanismos, a prevalncia e a
epidemiologia dessa resistncia. Contudo, uma vez que
a maioria dos organismos so susceptveis, o teste de
susceptibilidade antimicrobiana (47, 48) no realizado
rotineiramente. No entanto, alguns laboratrios de
referncia precisam manter a capacidade de realizar o
teste de susceptibilidade antimicrobiana em isolados
de T. vaginalis, principalmente quando houver falha na
terapia com metronidazol. Os pacientes que retornam
continuamente com sintomas devem ser avaliados
quanto a possveis comportamentos de exposio e a
adeso aos regimes de tratamento.
Os mdicos devem estar cientes de que a
resistncia antimicrobiana tem sido descrita e
considerar esse dado em relao a pessoas com
sintomas continuados.
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94 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Captulo 7
Vaginose bacteriana
7.1 Introduo
A vaginose bacteriana (VB) a causa mais comum de
corrimento vaginal entre mulheres na idade reprodutiva.
Embora no seja considerada uma doena sexualmente
transmissvel, a atividade sexual um fator para sua
aquisio (1). Isso foi demonstrado pelo aumento de
sua incidncia em relao ao aumento no nmero de
parceiros recentes e ao longo da vida, e em relao a
ter um novo parceiro sexual. A identificao de vaginose
bacteriana tambm em mulheres virgens se ope
ideia da transmisso sexual exclusiva. A condio
provavelmente muito mais relacionada a alteraes na
microbiota vaginal (devido a mecanismos at o momento
desconhecidos e a fatores do hospedeiro), causando
um aumento no pH local, o que resulta na reduo de
lactobacilos produtores de perxido de hidrognio. Os
lactobacilos ajudam a manter a acidez do pH de vaginas
saudveis e a inibir outros microrganismos anaerbicos.
Normalmente, vaginas saudveis apresentam altas
concentraes de lactobacilos. Na VB, a populao de
lactobacilos muito reduzida, enquanto as populaes
de vrios anaerbios e de Gardnerella vaginalis so
aumentadas. Os anaerbios envolvidos na VB incluem
Mobiluncus spp., Prevotella spp., Bacteroides spp.,
Peptostreptococcus, Fusobacterium, Eubacterium
spp., Mycoplasma hominis e Ureaplasma urealyticum.
Com as atuais tcnicas independentes de cultura,
um maior nmero de organismos foram identificados
como parte da microbiota encontrada em mulheres
com VB, incluindo Atopobium vaginae (2). Muitas
das bactrias associadas a VB so encontradas em
mulheres saudveis, embora em menor nmero.
Assim, o diagnstico laboratorial de VB repleto de
dificuldades, com vrios mtodos descritos na literatura.
O isolamento e identificao de organismos individuais
como a G. vaginalis frequentemente proposto, mas no
adequado para o diagnstico clnico de VB (3), alm de
poder levar ao excesso de tratamentos. O diagnstico
melhor realizado usando tanto os critrios clnicos de
Amsel (4) ou por meio da avaliao (5) ou pontuao (6)
de bactrias em um esfregao vaginal com colorao de
Gram.
A VB a causa mais comum de corrimento vaginal
e est relacionada a mudanas na microbiota, com
a reduo da populao de lactobacilos da vagina
e um crescimento acentuado de anaerbios e G.
vaginalis.
7.2 Diagnstico
A VB uma manifestao clnica caracterizada pelo
aumento da quantidade de corrimento vaginal ftido. O
diagnstico baseia-se na presena de pelo menos trs
dos quatro critrios seguintes (critrios de Amsel) (4):
Corrimento branco ou cinzento, homogneo e viscoso;
Fluido vaginal com pH >4,5;
Liberao de odor de amina, semelhante a peixe, do
fluido vaginal quando misturado a soluo a 10% de
hidrxido de potssio (KOH);
Clulas indicadoras visveis em anlise no
microscpio.
Corrimento. A avaliao desse sinal clnico subjetiva.
O corrimento em mulheres com VB normalmente no
muito maior do que o observado em mulheres saudveis.
Alm disso, a aplicao de duchas vaginais pode reduzir
a quantidade de corrimento.
pH vaginal. O pH do fluido vaginal deve ser mensurado
utilizando-se tiras de papel indicador de pH no intervalo
adequado (3,8 a 6,0), tais como o papel com intervalo
estreito de Whatman. Um espcime dos frnices laterais
e posterior da vagina coletado com uma haste, a qual
, ento, colocada diretamente sobre a tira de papel.
Alternativamente, o papel de pH pode ser tocado com
a ponta do espculo aps este ser retirado da vagina
(Figura 7.1). O contato com o muco cervical deve ser
evitado, uma vez que este apresenta pH >7,0. Uma
vagina madura normal apresenta um pH cido de 4,0. Na
VB, o pH geralmente elevado a >4,5.
Vaginose bacteriana 95

Figura 7.1
Teste do pH do fluido vaginal, comparado a uma
escala padronizada de cores.
O teste do pH vaginal apresenta a maior sensibilidade
das quatro caractersticas, mas a menor especificidade.
Tambm se observa um pH elevado se o fluido vaginal
estiver contaminado por sangue menstrual, muco
cervical ou smen e em mulheres com infeco por T.
vaginalis.
Odor. Mulheres com VB normalmente reclamam de
um odor desagradvel na vagina. Esse odor devido
liberao de amina, produzida pela descarboxilao dos
aminocidos lisina (para cadaverina) e arginina (para
putrescina) por bactrias anaerbicas. Quando o KOH
adicionado ao fluido vaginal, essas aminas se tornam
A. Clulas indicadoras em preparao a fresco de
amostra vaginal (400x).
Figura 7.2
Microscopia de esfregaos vaginais
96 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
imediatamente volteis, produzindo um odor tpico
de peixe. Coloque uma gota de fluido vaginal em uma
lmina de vidro e adicione uma gota de KOH a 10%.
Segure a lmina prximo ao nariz para detectar o cheiro
de amina. Aps uma reao positiva, o espcime se
tornar rapidamente inodoro devido rpida e completa
volatizao das aminas. Em algumas partes do mundo, o
KOH no est disponvel devido sua natureza custica
e, ento, se forem realizados apenas trs dos quatro
critrios, perde-se a sensibilidade destes.
Clulas indicadoras. Misture uma gota do fluido
vaginal com uma gota de soluo salina em uma lmina
de vidro. Coloque uma lamnula sobre a suspenso
e examine microscopicamente a lmina com um
aumento de 400x. As clulas indicadoras so clulas
epiteliais escamosas cobertas com vrios organismos
cocobacilares granulares pequenos, gerando um aspecto
pontilhado, granular. As bordas dessas clulas epiteliais
no so claramente definidas, devido ao grande nmero
de bactrias presentes e aparente desintegrao
celular (Figuras 7.2A e 7.2B). Na maioria dos pacientes
com VB, ser visualizada uma mistura de clulas
epiteliais vaginais normais esfoliadas e 20% ou mais de
clulas indicadoras. As bactrias aderidas s clulas so
G. vaginalis misturadas com anaerbios.
B. Clulas indicadoras em esfregao vaginal com
colorao de Gram.
 Grau I (microbiota normal): somente ou
predominantemente morfotipos de lactobacilos (Figura 7.4)

7.3 Critrios de Ison-Hay

Esse mtodo avalia as propores relativas dos
diferentes morfotipos bacterianos e os classifica como
descrito a seguir:

Grau I (microbiota normal): somente ou

predominantemente morfotipos de lactobacilos (Figura
Figura 7.3 7.4)
Colorao de Gram de esfregao vaginal normal
mostrando os lactobacilos (1000x).
Figura 7.4
Fonte: Reproduzido com permisso da Associao
Grau I
Britnica para Sade Sexual e HIV (BASHH, do ingls
British Association for Sexual Health and HIV).
Grau II (microbiota intermediria): reduo dos
morfotipos de lactobacilos, com morfotipos bacterianos
A VB reconhecida em um esfregao vaginal
misturados (Figura 7.5).
com colorao de Gram. As lminas podem ser
examinadas na clnica, quando houver infraestrutura,
ou armazenadas para ser examinadas no laboratrio,
visando verificaes posteriores independentes.
Podem ser observados no esfregao diversos graus de
microbiota vaginal, variando de normal (Figura 7.3) a
morfotipos de VB intermediria. Em um esfregao de
uma mulher com VB, os lactobacilos esto ausentes
ou tm seu nmero muito reduzido, e so substitudos
por uma microbiota misturada. Dois mtodos so
comumente utilizados para a anlise dos esfregaos:
os critrios de Ison-Hay (5), que verificam a microbiota Figura 7.5
e so mais adequados para o uso na prtica clnica Grau II
de rotina; e a pontuao de Nugent (6), que classifica
as bactrias individualmente e fornece uma anlise Grau III (VB): morfotipos bacterianos misturados com
quantitativa particularmente til para propsitos de poucos ou nenhum morfotipo de lactobacilos (Figura 7.6).
pesquisa, mas oferece poucas vantagens no uso clnico.
A variabilidade intrnseca gerada pelos observadores foi
descrita como sendo a mesma para ambos os critrios
de Nugent e Ison-Hay (7 ).

7.3 Critrios de Ison-Hay

Esse mtodo avalia as propores relativas dos
diferentes morfotipos bacterianos e os classifica como
descrito a seguir:

Figura 7.6
Grau III

Vaginose bacteriana 97
 Dois graus adicionais no sistema Ison-Hay so:
Grau 0: clulas epiteliais sem bactrias visveis (Figura
7.7).
Figura 7.7
Grau 0
Grau IV: clulas epiteliais cobertas somente com cocos
Gram-positivos (Figura 7.8).
Figura 7.8
Grau IV
Fonte: Figuras 7.4-7.8 reproduzidas com permisso da
Associao Britnica para Sade Sexual e HIV (BASHH,
do ingls British Association for Sexual Health and HIV).
Ambos os graus 0 e IV so encontrados em mulheres
saudveis. O grau 0 ocorre principalmente aps
tratamento antimicrobiano intravaginal e o grau IV
encontrado em menor nmero em mulheres que
so colonizadas longitudinalmente com cocos Gram-
positivos, normalmente streptococos, com lactobacilos
reduzidos ou ausentes.
98 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
7.4 Pontuao de Nugent
Esse mtodo baseado na pontuao de tipos
individuais de organismos. Uma pontuao de 0 a 10
resulta de uma combinao ponderada de: grandes
bastonetes Gram-positivos (lactobacilos), pequenos
bastonetes Gram-negativos ou variveis (G. vaginales ou
outros anaerbios) e bastonetes curvos Gram-negativos
ou variveis (Mobiluncus spp.). Cada um desses
trs grupos so avaliados quantitativamente em um
esfregao segundo uma pontuao de 0-4, da seguinte
forma:
0 = nenhum morfotipo por campo de viso
1+ = menos que um morfotipo por campo de viso
2+ = um a quatro morfotipos por campo de viso
3+ = cinco a 30 morfotipos por campo de viso
4+ = mais que 30 morfotipos por campo de viso
A abundncia de morfotipos de lactobacilos em um
esfregao considerada normal. Assim, as pontuaes
de lactobacilos so inversamente relacionadas aos seus
nmeros. A quantidade 4+ para lactobacilos pontua 0;
3+, pontua 1, e assim por diante. Mobiluncus recebem
menor peso; dessa forma, organismos classificados
como 1+ e 2+ pontuam 1 e organismos 3+ e 4+
pontuam 2.
Um diagnstico de VB severa pontua 10 (4 pela
ausncia de morfotipos de lactobacilos, 4 por morfotipos
de Gardnerella 4+ e 2 por morfotipo de Mobiluncus 4+).
Um esfregao Gram vaginal normal pontua 0 (0 para
morfotipos de lactobacilos 4+, 0 para morfotipos de
Gardnerella 0 e 0 por morfotipo de Mobiluncus 0).
Na pontuao de Nugent, uma pontuao total de 7 a 10
(a soma das pontuaes de classificao dos trs grupos
descritos acima) indicativa de VB; uma pontuao de 4
a 6, de microbiota intermediria; e uma pontuao de 0
a 3, de microbiotas normais.
7.5 Outros testes para VB
A microscopia de esfregaos vaginais com colorao de
Gram, atualmente, continua sendo o mtodo laboratorial
preferido para o diagnstico de VB. Uma srie de outros
testes foram descritos, que podem ser teis caso no
haja microscpios disponveis. Isso inclui:
1. Affirm VP III (8) Usa hibridizao de DNA para
detectar nveis altos de Gardnerella.
2. BV Blue (9) Teste point-of-care disponvel
comercialmente. Mede a sialidase, uma enzima que
produz algumas das aminas liberadas durante a VB.
Comparado com os critrios de Nugent e Amsel,
apresenta uma especificidade de 95% e 91%,
respectivamente, e uma sensibilidade de 88%.
3. FemExam (10) Consiste em dois cartes com
indicadores que medem o pH vaginal, aminas e
atividade enzimtica. Os indicadores do carto
do FemExam medem o pH maior ou igual a
4,7 e aminas com concentrao maior que
0,5mmol. O carto 2 mede a atividade da prolina
aminopeptidase. Comparado com a pontuao de
Nugent, o carto 1 do FemExam apresenta uma
sensibilidade e uma especificidade de 71,4% e
72,8%, respectivamente; e o carto 2, sensibilidade
e especificidade de 70% e 81%, respectivamente.
Os mtodos moleculares foram usados recentemente
para detectar bactrias tambm no identificadas
anteriormente na VB e apresentam o potencial de
fornecer um diagnstico para VB sensvel e especfico
(11, 12).
O diagnstico pode ser realizado utilizando-se os
critrios de Amsel por meio da demonstrao da
presena de pelo menos trs dos quatro critrios
seguintes: corrimento vaginal branco a cinzento,
homogneo e viscoso, pH>4,5, odor de amina e
presena de clulas indicadoras.
A cultura de organismos associados a VB no tem
valor para diagnstico.
Onde houver infraestrutura, a colorao de Gram
do corrimento vaginal, mostrando os graus da
microbiota vaginal de normal a VB, pode ter os
morfotipos pontuados de acordo com os critrios
de Ison-Hay e Nugent para o diagnstico de BV.
7.6 Referncias
1. Bradshaw CS et al. High recurrence rates of
bacterial vaginosis over the course of 12 months
after oral metronidazole therapy and factors
associated with recurrence. Journal of Infectious
Diseases, 2006, 193(11):14781486.
2. Tabrizi SN et al. Prevalence of Gardnerella vaginalis
and Atopobium vaginae in virginal women. Sexually
Transmitted Diseases, 2006, 33(11):663665.
3. Krohn MA, Hillier SL, Eschenbach DA. Comparison
of methods for diagnosing bacterial vaginosis
among pregnant women. Journal of Clinical
Microbiology, 1989, 27(6):12661271.
4. Amsel R et al. Non specific vaginitis. Diagnostic
criteria and microbial and epidemiologic
associations. American Journal of Medicine, 1983,
74(1):1422.
5. Ison CA, Hay PE. Validation of a simplified grading
of Gram stained vaginal smears for use in
genitourinary medicine clinics. Sexually Transmitted
Infections, 2002, 78(6):413415.
6. Nugent RP, Krohn MA, Hillier SL. Reliability of
diagnosing bacterial vaginosis is improved by a
standardized method of Gram stain interpretation.
Journal of Clinical Microbiology, 1991,
29(2):297301.
7. Forsum U et al. An international study of the
interobserver variation between interpretations of
vaginal smear criteria of bacterial vaginosis. APMIS,
2002, 110(11):811818.
8. Gazi H et al. Use of DNA hybridization test for
diagnosing bacterial vaginosis in women with
symptoms suggestive of infection. APMIS, 2006,
114(11):784787.
9. Bradshaw CS et al. Evaluation of a point-of-care
test, BVBlue, and clinical and laboratory criteria for
diagnosis of bacterial vaginosis. Journal of Clinical
Microbiology, 2005, 43(3):13041308.
10. West B et al. Evaluation of a new rapid diagnostic kit
(FemExam) for bacterial vaginosis in patients with
vaginal discharge syndrome in the Gambia. Sexually
Transmitted Diseases, 2003, 30(6):483489.
Vaginose bacteriana 99
 11. Fredricks DN et al. Targeted PCR for detection
of vaginal bacteria associated with bacterial
vaginosis. Journal of Clinical Microbiology, 2007,
45(10):32703276.

12. Shipitsyna E et al. Composition of the vaginal

microbiota in women of reproductive agesensitive
and specific genetic diagnosis of bacterial vaginosis
is possible? PLoS ONE, 2013, 8(4):e60670.

100 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Captulo 8
Candidase
8.1 Introduo
A candidase vulvo-vaginal (CVV) causada pelo fungo
Candida albicans (1) em aproximadamente 85% dos
casos, sendo a C. glabrata responsvel pelos 15%
restantes (2). Outras espcies, tais como C. krusei e C.
tropicalis, raramente causam vaginites (3). As Candida
spp. so geralmente de origem endgena e podem ser
isoladas a partir do trato genital de at 25% de mulheres
saudveis assintomticas em idade reprodutiva. Para
as Candida spp. colonizarem a vagina, elas devem
primeiro aderir s clulas epiteliais vaginais, onde
crescem, proliferam-se e germinam antes de finalmente
causarem os sintomas de inflamao. Normalmente,
so necessrias alteraes no ambiente vaginal antes
que o organismo possa induzir os efeitos patolgicos.
Provavelmente, a microbiota natural a defesa mais
importante contra a colonizao e a inflamao. O
mecanismo pelo qual a cndida induz a inflamao
ainda no foi determinado, mas fatores importantes de
predisposio colonizao e inflamao incluem:
Alteraes nos nveis dos hormnios reprodutivos
associados a perodos pr-menstruais, gravidez e
contraceptivos orais;
Uso de antibiticos;
Diabetes mellitus;
Imunossupresso.
A candidase normalmente de origem endgena
e no se transmite sexualmente. A CVV crnica ou
recorrente ocorre em um pequeno nmero de mulheres,
causando sintomas persistentes, e pode estar associada
aos fatores de risco descritos acima (4, 5). Produtos
qumicos, alergias locais e hipersensibilidade tardia
tambm podem contribuir para a induo de vaginite
sintomtica ou vulvite.
Em homens, a importncia de Candida spp. no
clara, embora o agente possa ser transmitido entre
parceiros sexuais, causando balanite ou balanopostite
e, raramente, uretrite. Tipicamente, os homens
desenvolvem uma resposta alrgica ao antgeno
da cndida, embora a infeco repentina possa ser
observada mais frequentemente em pacientes com os
fatores de risco mencionados acima (6).
8.2 Diagnstico
O diagnstico de CVV normalmente estabelecido por
meio da combinao entre as manifestaes clnicas
e anlise microscpica de preparao a fresco. Os
sintomas clssicos e os sinais de CVV incluem prurido
vaginal, corrimento branco e coalhado sem odor (queijo
cottage), sensao de queimao na vulva, disria e
eritema dos lbios e vulva. Entretanto, os sintomas e
sinais so frequentemente mais ambguos. A deteco
do brotamento de clulas de levedura por meio de
microscopia de preparao a fresco ou com hidrxido
de potssio (KOH) pode ser realizada em laboratrios
ou clnicas e apresenta um valor preditivo muito alto
para o diagnstico de CVV. Embora essa combinao
seja geralmente usada, frequentemente razovel
oferecer terapia a mulheres com sinais clssicos de
CVV, com base em um diagnstico clnico presuntivo,
sem uma confirmao adicional por microscopia. O uso
de esfregaos com colorao de Gram e a deteco
do brotamento de clulas de levedura e pseudo-hifas
preferido em alguns centros para a determinao de
candidase.
Em mulheres com corrimento vaginal anormal, e na
ausncia de um microscpio, a deteco de um pH <4,5
um bom indicador de CVV e pode ajudar a diferenci-la
de uma vaginose bacteriana ou tricomonase, as quais
tipicamente produzem um pH >4,5. Um papel de pH
com intervalo estreito (Whatman) um mtodo de baixo
custo, sensvel e simples de usar e est disponvel na
maioria dos lugares.
A cultura atualmente o mtodo mais sensvel para
a deteco de Candida spp., mas deve ser usada
com cautela, uma vez que Candida spp. tambm so
encontradas em mulheres sem CVV. Dessa forma,
a cultura s deve ser considerada em caso de CVV
clinicamente suspeita, mas com microscopia negativa
(embora, nesse caso, o tratamento presuntivo possa
ser aplicado, resultando em menor custo financeiro) ou
Candidase 101
 quando o teste de susceptibilidade antimicrobiana for
requisitado.

A deteco molecular de Candida spp. utilizando

a reao em cadeia da polimerase (PCR, do ingls
polymerase chain reaction) foi descrita, mas no oferece
vantagens em relao aos testes disponveis atualmente,
uma vez que a alta sensibilidade demonstrada pela PCR
ir detectar leveduras de Candida spp. em mulheres
sem CVV e resultar em diagnsticos excessivos e Figura 8.1A
tratamentos desnecessrios. Preparao de hidrxido de potssio (KOH) de
secreo vaginal, mostrando o brotamento de
8.3 Coleta de espcimes leveduras e pseudo-hifas (400x).

Obtenha uma amostra de secreo da parede lateral

da vagina com uma haste (o tipo de fibra no
importante). Em pacientes com corrimento vaginal leve e
comprometimento excessivo da vulva e lbios, melhor
que seja coletado um espcime da mucosa irritada. A
microscopia direta pode ser realizada imediatamente
na clnica, ou ento o espcime pode ser transportado
para o laboratrio. O uso de um meio de transporte
como o de Amies no necessrio para a finalidade de
identificao de leveduras, mas prefervel manter a
viabilidade e mobilidade no caso dos tricomonaddeos. Figura 8.1B
Preparao a fresco de leveduras sem pseudo-hifas.
Em homens com balanite, use uma haste umedecida
Fonte (A e B): reproduzidas com permisso da
previamente em soluo salina para coletar a amostra da Associao Britnica para Sade Sexual e HIV (BASHH,
glande do pnis. do ingls British Association for Sexual Health and HIV).

8.4 Microscopia direta

Coloque o espcime em uma lmina de vidro e, se
necessrio, dependendo da sua fluidez, misture-o
com uma gota de soluo salina. Cubra a preparao
com uma lamnula e examine ao microscpio com um
aumento de 400x no apenas para detectar leveduras,
mas tambm para verificar a presena de trichomonas
e clulas identificadoras. As leveduras so clulas
arredondadas a ovais, com 4m de dimetro, mostrando
um brotamento tpico (blastocondia) (Figuras 8.1A
Figura 8.2A
e 8.1B). A adio de KOH a 10% para a preparao Esfregao de secreo vaginal com colorao de
aumenta levemente a sensibilidade de deteco de Gram mostrando as leveduras Gram-positivas e
leveduras, tornando o reconhecimento de miclias pseudo-hifas (1000x).
(pseudo-hifas) muito mais fcil. As leveduras podem
ser reconhecidas facilmente em um esfregao com
colorao de Gram, uma vez que so clulas Gram-
positivas (Figuras 8.2A e 8.2B).

102 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana

Figura 8.2B
Brotamento de leveduras sem pseudo-hifas.
Fonte (A e B): reproduzidas com permisso da
Associao Britnica para Sade Sexual e HIV (BASHH,
do ingls British Association for Sexual Health and HIV).
8.5 Cultura
O gar dextrose Sabouraud com cloranfenicol um
excelente meio de crescimento para o isolamento de
Candida spp. Aps a inoculao do espcime clnico, as
placas so incubadas a 36C por dois dias. As colnias
de clulas de levedura so opacas e com colorao de
branca a creme. A nica identificao importante para
o diagnstico de rotina a diferenciao de bactrias. A
microscopia pode ser utilizada para confirmar a presena
de clulas de levedura.
No necessria a identificao adicional de levedura
para o diagnstico de rotina de CVV descomplicada.
Entretanto, o teste de tubo de germinao representa
um mtodo simples para a identificao presuntiva de C.
albicans. Uma colnia emulsificada em 0,5mL de soro
bovino ou de cavalo e incubada a 36C por quatro horas.
A C. albicans mostrar filamentos de hifa laterais curtos
sem nenhuma constrio. Uma identificao completa de
levedura em nvel de espcie pode ser obtida por meio
de mtodos auxanogrficos para a assimilao de nitrato
e carboidrato, ou mediante testes de fermentao de
carboidrato. Kits para a identificao de leveduras, em
nvel de espcie, esto disponveis comercialmente.
O diagnstico de candidase estabelecido
pela combinao de caractersticas clnicas e
microscopia de uma amostra de um espcime
apropriado.
A cultura de secreo vaginal deve ser considerada
para casos de microscopia negativa, na presena
de sintomas clnicos.
O teste de susceptibilidade antimicrobiana de
Candida spp. ocasionalmente justificado e deve
ser realizado em centros especializados.
8.6 Referncias
1. Sobel JD. Vulvovaginal candidosis. The Lancet,
2007, 369(9577):19611971.
2. Sobel JD. Vulvovaginitis due to Candida glabrata.
An emerging problem. Mycoses, 1998, 41(Suppl
2):1822.
3. Horowitz BJ, Giaquinta D, Ito S. Evolving pathogens
in vulvovaginal candidiasis: implications for patient
care. Journal of Clinical Pharmacology, 1992,
32(3):248255.
4. Morton RS, Rashid S. Candidal vaginitis: natural
history, predisposing factors and prevention.
Proceedings of the Royal Society of Medicine, 1997,
70(Suppl 4):36.
5. Sobel JD. Pathogenesis and treatment of recurrent
vulvovaginal candidiasis. Clinical Infectious
Diseases, 1992, 14(Suppl 1):S148S153.
6. Marrazzo J, Hillier S, Sobel J. Vaginal infections. In:
Morse SA et al., eds. Atlas of sexually transmitted
diseases and AIDS, 4th ed. Edinburgh, Saunders/
Elsevier, 2010:7693.
Candidase 103
104 Diagnstico laboratorial de doenas sexualmente transmissveis, incluindo o vrus da imunodeficincia humana
Captulo 9 na borda circundante e na camada drmica subjacente.
Entretanto, apenas 10-30% das infeces novas so
sintomticas (Figura 9.1).
Infeces pelo vrus do herpes Aps a recuperao da infeco inicial, o vrus
simples (HSV) permanece latente no gnglio sensorial por toda a
vida do hospedeiro.