STRUKTURA LIGNOCELULOZNIH SIROVINA

Razumevanje prirode lignocelulozne biomase, a posebno njenog hemijskog sastava je

osnovni preduslov za razvijanje efiksanih tehnologija za njen predtretman. Termin
lignocelulozna biomasa se odnosi na ostatak materijala koji potie od viih biljaka, etinara i
liara. Primarne komponente lignoceluloze ine ugljovodonine komponente celuloza i
hemiceluloza, zajedno sa heterogenim polimerom ligninom, koji je dominantno fenolne prirode.

Celuloza

Celuloza je polimer disaharida celobioze (4ODglukoprianozilDglukoze) vezanih

meusobno 1,4glikozidnim vezama, kao to je predstavljeno na Slici1.

Slika 1. Struktura polimernog lanca celuloze

Mnoge osobine celuloze zavise od stepena polimerizacije (degree of polymerization, DP),

tj. od broja glukoznih jedinica koje ine jedan polimerni molekul ili lanac. Uobiajena vrednost
DP se kree izmeu 800 i 10000 jedinica, ali ove vrednosti mogu da budu i znatno nie od 300-
1700 kod celuloze iz pulpe drveta, pa ak do 17000 jedinica. Priroda -1,4 glikozidne veze
izmeu molekula glukoze dozvoljava reorganizovanje polimernih lanaca celuloze. Polimer
glukoznih jedinica sadri ravnomermo distribuirane hidroksilne grupe sa gornje i donje strane
molekula i njihova orijentacija dovodi do formiranja vodoninih veza izmeu polimernih lanaca
Slika 2.

1
 Slika 2. Povezivanje polimernih lanaca celuloze vodoninim vezama

Celuloza moe biti kristalne ili nekristalne strukture. Povezivanje nekoliko polimernih
lanaca vodi formaciji mikrovlakana, ijom agregacijom nastaju vlakna koja formiraju kristalne
regione, ali sadre i amorfne regione (Slika 3.).

Slika 3. Formiranje strukture celuloze (preuzeto iz Harmsen et al., 2010)

Celuloza je relativno higroskopni material koji apsorbuje 8-14% vode na normalnom,

atmosferskom pritisku. Pored toga, nerastvorna je u vodi, ali ima sposobnost bubrenja. Celuloza
je takoe nerastvorna i u razblaenim kiselinama na niskoj temperaturi, dok na visokim
temperaturama postoji dovoljno energije za raskidanje vodoninih veza, koje odravaju kristalnu
strukturu celuloze. Celuloza je takoe rastvorna u koncentrovanim kiselinama, dok u alkalnim

2
uslovima jako bubri, a manje frakcije sa DP manjim od 200 jedinica, dobro se rastvaraju (Krassig
and Schurz, 2002).

Hemiceluloza
Termin hemiceluloza je zajedniki termin koji se koristi za polisaharide ija struktura
varira, u zavisnosti od izvora iz kojeg potiu. Najee to su arabino-kslilani, gluko-manani,
galaktani i ostala jedinjenja ugljovodonine strukture. Najei tip polisahardnih polimera
hemicelulozne je ksilan, koji ukljuuje 14 tip glikozidnih veza izmeu ksilopiranoznih jedinica
sa -(4-O)-metil-D-glukopiranoznom jedinicom vezanom za hidroksilnu grupu na C6 atomu
Slika 4.

Slika 4. Prikaz hemiceluloznog polimernog lanca supstituisanog acetilnim grupama i

glukuronskim jedinicama

Hemiceluloza predstavlja razgranat polimer ije su osnovne saharidne jedinice

sastavljene najee od 5 C atoma npr. pentoza ksiloza, ali su u odreenoj meri prisutne i
heksoze: dominantno glukoza i izvesna koliina galaktoze i manoze. Hemicelulozu karakterie
odsustvo kristalne strukture, kako usled razgranatosti polimernih lanaca, tako i zbog prisustva
acetil grupa vezanih za polimerni lanac (Harmsen et al, 2010). Hemiceluloza ekstrahovana iz
biljaka poseduje stepen polimerizacije koji ne prevazilazi 200 monosaharidnih jedinica, dok je
uobiajena vrednost oko 150. Hemiceluloza je nerastvorna u vodi na niskoj temperaturi, dok
prisustvo kiselina znaajno poveava rastvorljivost; za hidrolitiki proces potrebna je nia
temperatura nego kod celuloze (Harmsen et al, 2010).

3
Lignin
Lignin je prirodni amorfni polimer veoma sloene grae. Osnovne gradivne jedinice su
fenipropanske strukture, od kojih se najee javljaju p-kumaril alkohol, koniferil alkoholi i
sinapil alkool, ija struktura je prikazana na Slici 5. Poznavanje strukture i sastava lignina je
veoma vano omoguava jer odgovarajui odabir metoda za predtretman.

CH2OH CH2OH CH2OH

OMe MeO OMe

OH OH OH

1 2 3

Slika 5. Struktura tri osnovne gradivne jedinice koje ine strukturu lignina: 1) p-kumaril alkohol
2) koniferil alkohol; 3) sinapil alkohol;

Alkoholi predstavljaju prekursore tri reprezentativne jedinice koje se oznaavaju kao

H(p-hidroksifenil), G (guaiacil) i S (siringil), koje su preko fenolne i etilenske grupe
polimerizovane u trodimenzionalnu mreu.
Odnos S i G jedinica vana je karakteristika strukture lignina i varira kod razliitih
drvenih materijala, kao posledica razliite starosti, klimatskih uslova i suplemanata tokom rasta.
Brojne karakterizacione tehnike se koriste za odreivanje S i G odnosa, kao to su infracrvena
spektroskopija sa primenom Furijeve transformacije (FTIR), nuklearna magnetna rezonanca
(NMR), piroliza u kombinaciji sa gasno-masenom spektrometrijom (Py-GC-MS) (Timilsena,
2012).
Lignin koji potie iz etinara sastoji se dominantno od koniferil alkohola (vie od 90%),
dok ostatak ine uglavnom jedinice p-kumaril alkohola. Sa druge strane, lignin liara sainjen je
od jedinica koniferil i sinapil alkohola u razliitim odnosima (Harmsen et al, 2010). Pored
osnovnih gradivnih alkoholnih jedinica, zastupljeno je grananje polimernih lanaca i vezivanje

4
drugih, slinih molekula (Lin and Lin, 2002). Lignin se u drvetu ponaa kao nerastvorni matriks
koji igra vanu ulogu u izdrljivosti i razvoju elije, jer utie na transport vode, hranljivih
materija i metabolizam biljaka. Deluje kao vezivno tkivo izmeu biljnih elija, doprinosei
stvaranju kompozitnog materijala koji ima izuzetnu otpornost na udar, kompresiju i savijanje.
Rastvarai u kojima se lignin relativno dobro rastvara su niskomolekularni alkoholi, dioksani,
aceton, piridin i dimetil-sulfoksid. Pored toga, uoeno je da na povienoj temperaturi dolazi do
termikog omekavanja lignina, to ubrzava reakcije kisele ili alkalne depolimerizacije (Harmsen
et al, 2010).

Lignoceluloza
Sadraj celuloze, hemiceluloze i lignina u lignocelulozi varira u zavisnosti od vrste i raznolikosti
biomase, klimatskih uslova, plodnosti zemljita. U proseku, poljoprivredni ostaci kao to su npr.
kukurzuna stona hrana, penina ili pirinana slama, sadre oko 40% celuloze, 30%
hemiceluloze i oko 15% lignina, obraunato u odnosu na suvu materiju. Pored navedenih
osnovnih komponenti, voda je takoe prisutna, kao i zanemarljiva koliina proteina, minerala i
drugih jedinjenja koja ne doprinose znaajno strukturi biljnog materijala (Zhao et al, 2012). Na
Slici 6a prikazana je agregacija primarnih komponenti lignocelulozne materije, dok je na Slici 6b
prikazan trodimenzionalni model strukture (Harmsen et al, 2010).

b)

a)
Hemiceluloza

Lignin
Celuloza Pektin Lignin

Celulozno vlakno
obloeno hemicelulozom
Slika 6. a) Primarne komponente prisutne u biocelulozi (preuzeto iz Silveira et al., 2015);
b)trodimenzionalni model strukture lignocelulozne materije (preuzeto sa www.nrel.gov)

5
 Unutar lignocelulozne strukture (Slika 6a), celuloza zadrava kristalnu vlaknastu
strukturu i pojavljuje se kao osnovna, dominantna komponenta, koja ini jezgro kompleksa.
Hemiceluloza je pozicionirana izmeu mikro- i makro-fibrila celuloze, dok lignin predstavlja
strukturni matriks u koji su integrisane celuloza i hemiceluloza. Na trodimenzionalnom prikazu
modela lignocelulozne uoavaju se materije elijskog zida, u kojem dominiraju celulozna
vlakna, zajedno sa hemiceluloznom amorfnom strukturom, utkani u ligninski porozni matriks
(Harmsen et al, 2010).

Hemijske interakcije lignoceluloznih komponenti

Osnovni konstituenti celuloza, hemiceluloza i lignin, povezani su putem etarskih,

estarskih, ugljeninih i vodoninih veza, koje predstavljaju etiri osnovne hemijske interakcije
unutar lignocelulozne materije. Ukoliko su interakcije zastupljene izmeu istih konstituenata
(npr. celuloza-celuloza) onda se nazivaju intrapolimerske, dok su one koje se ostvariju izmeu
razliitih konstituenata (npr. celuloza-hemiceluloza) poznate kao interplimerske interakcije ili
veze (Harmsen et al, 2010).

Intrapolimerske interakcije

Unutar ligninskog polimera javljaju se etarske i ugljenik-ugljenik interakcije. Etarske

veze su najzastupljenija interakcija izmeu monomernih jedinica lignina u udelu oko 70% u
odnosu na sve monomerske interakcije unutar ligninske strukture. Etarske veze ostvaruju se
izmeu dve aril grupe, dve alil grupe ili alil i aril grupa monomera. Ugljenik ugljenik veze
imaju 30 % udela u vezivanju monomerskih jedinica. Ostvaruju se izmeu ugljenikovih atoma
dva monomera, a mogue je formiranje C-C veza izmeu dve aril grupe, dve alil grupe ili jedne
aril i jedne alil grupe.
Polimer celuloze je formiran povezivanjem glukoznih jedinica -1,4-glikozidnom vezom.
Ova veza moe da se podvede pod etarski tip interakcije, budui da se veza izmeu C atoma dve
glukozne jedinice ostvaruje preko atoma kiseonika. Sa druge strane, vodonina veza je
odgovorna za kristalnu strukturu celuloze, a formira se izmeu hidroksilnih grupa dva polimerna
celulozna lanca.

6
 Unutar hemicelulozne strukture, takoe dominiraju glikozidne veze zastupljene izmeu
ugljovodoninih monomera, koje se mogu smatrati etarskim. Za razliku od celuloze, kod
hemiceluloze nisu zastupljene vodonine veze, ali je prisutna odreena koliina karboksilnih
grupa u obliku estara ili u obliku karboksilnih soli (Harmsen et al, 2010).

Interpolimerske interakcije
Veze koje su zastupljene izmeu tri osnovna konstituenta ligninske strukture su predstavljene u
Tabeli 1.
Tabela 1. Interpolimerske veze koje se ostvaruju izmeu razliitih konstituenata lignoceluloze
Vrsta interakcije (hemijska veza) Konstituenti izmeu kojih
se interakcija ostvaruje
Etarska veza Celuloza - lignin
Hemiceluloza - lignin
Estarska veza Hemiceluloza - lignin
Vodonina veza Celuloza hemiceluloza
Hemiceluloza Lignin

Pored osnovnih interpolimerskih interakcija, navedenih u Tabeli 1, utvreno je i

postojanje etarske veze izmeu lignina i polisaharidnih jedinica, iako jo uvek nije u potpunosti
jasno mesto gde se etarska veza formira prilikom interakcije lignin-celuloza i lignin-
hemiceluloza. Sa druge strane, vodonine veze jesu prisutne u interakciji celuloza-hemiceluloza,
ali je jaina ovih veza slabija nego kod onih koje povezuju celulozne polimerne lance, pre svega
usled nedostatka eksternih primarnih alkoholnih grupa piranoznog penoznog prstena (Faulon et
al., 1994; Harmsen et al, 2010).

Faktori koji utiu na konverziju lignocelulozne biomase

Razliiti fiziki i hemijski faktori utiu na konverziju lignocelulozne biomase, odnosno

celuloze, kao osnovne komponente od koje se u procesu biokonverzije dobija etanol (Kumar et
al, 2008).
Od fizikih faktora, velikog uticaja imaju kiselost sredine (pH) i temperatura. Uticaj pH
je prouavan upotrebom plesni Aspergillus niger i utvreno je da je pH=5,5 optimalan, odnosno
predstavlja kiselost sredine pri kojoj se postie maksimalna efikasnost enzima. Sa druge strane,
pH opseg od 5,5 6,5 je optimalan za produkciju enzima glukozidaza iz Penicillium rubrum. Sa

7
druge strane, neki mikroorganizmi (Humicola fuscoatra, Neurospora crass) postiu makslimalnu
vrednost produkcije enzima u neutralnoj sredini (Kumar et al., 2008).
Temperatura ima velikog uticaja u procesu biokonverzije lignoceluloznog materijala.
Idealni uslovi bi podrazumevali primenu takvog temperaturnog opsega pri kojem istovremeno
dolazi i do maksimalnog rasta mikroorganizama, kao i do maksimalne produkcije celulaznih
enzima. Meutim, temperatura pri kojoj je produkcija enzima i njihova aktivnost maksimalna i
ona koja je idealna za rast mikroorganizama, esto se razlikuju. Tako na primer 5065 C se
koristi za ispitivanje aktivnosti celulaznih enzima razliitih mikroorganizama, kao to su
Thielavia terrestris-255, Mycelieopthora fergussi-246C, Aspergillus wentii, Penicillum rubrum,
Aspergillus niger, Aspergillus ornatus i Neurospora crassa, dok je temperatura njihovog rasta
2530 C. Slino tome, za prirodni soj bakterija Penicillium purpurogenum, Pleurotus Xorida
i Pleurotus cornucopiae temperatura maksimalnog rasta iznosi 28C, dok maksimalnu efikasnost
celulazne aktivnosti se ostvaruje na 50 C (Steiner et al., 1998; Kumar et al., 2008). Takoe,
uoeno je da postoji odreena povezanost izmeu temperature i adsorpcije enzima. Pozitivna
veza izmeu adsorpcije i saharifikacije celuloznog supstrata je uoena na temperaturi 60C;
ispod ove temperature adsorpciona aktivnost smanjuje, najverovatnije jer usled denaturacije
proteina dolazi do gubitka enzimske aktivnosti (Van-Wyk 1997; Kumar et al., 2008). Neke
termofilne plesni, dostiu maksimalan rast na 4550 C, uz proizvodnju celulaza sa
maksimumom aktivnosti na 5078 C (Wojtczak et al., 1987; Kumar et al., 2008).
Znaajni hemijski faktori koji utiu na konverziju celuloze su izvori ugljenika, azota i
fosfora, fenolna jedinjenja i eeri. Mnogi razliiti supstrati koji vode poreklo bilo od
industrijskog ili poljoprivrednog otpada predstavljaju izvor ugljenika u procesu dobijanja
biogoriva. Brojni celulozni materijali poput: pulpe, tampanog papira, otpadnog papira, penine
slame, karboksimetil-celuloze, kukuruza, pamuka, lia i sl. korieni su kao supstrati u
proizvodnji celulaznih enzima. Istraivanja su pokazala da poveanje produkcije celulaza raste sa
poveanjem koncentracije supstrata od 12% kod Asperillus niger plesni, ali dalje poveanje
koncentracije supstrata rezultira smanjenjem produkcije enzima, najverovatnije usled
ogranienog prisustva kiseonika ili potronje nutritijenata. Nedavna istraivanja ukazuju da su
celulaze enzimi ija se produkcija indukuje prisustvom supstrata koji predstavljaju izvor
ugljenika. Celobioza u koncentraciji od 2,95mM pokazuje efektivan indukcioni uticaj na sintezu
celulaza u Nectria catalinensis i Bacillus sp.; biosinteza ksilanaza je takoe indukoavana

8
dodatkom ksiloze ili celobioze u medium kulture tokom rasta (Pardo i Forchiassin, 1999; Paul i
Verma, 1990; Kumar et al., 2008).
Jedinjenja kao to su amonijum-sulfat, ammonijum-nitrat, amonijum-fero-sulfat,
amonijum-hlorid i natrijum-nitrat su izuavani kao potencijalni izvori azota, koji predstavlja
biogeni element, neophodan za rast i razvoj mnogih mikroorganizama. Prisustvo navedenih soli
vodi poveanoj produkciji enzima: koncentracija amonijum-sulfata od 0,5 g/l dovodi do
maksimalne produkcije celulaza (1994) koristei Aspergillus niger (Singh et al, 1991; Kumar et
al., 2008).
Fosfor je esencijalni element kada se radi o rastu i metabolizmu mnogih plesni i
predstavlja vaan konstituent fosfolipida ukljuenih u formiranje elijske membrane
mikroorganizama. Pored toga, njegova uloga je i u vezivanju nukleotida, formiranju
intermedijernih jedinjenja, enzima i koenzima koji su kljuni za metabolizam ugljenih hidrata,
kao i za mnoge druge oksidativne reakcije i intracelularne procese (Singh et al, 1991; Kumar et
al., 2008). Razliita fosforna jedinjenja predstavljaju znaajne izvore ovog elementa. Uticaj
fosfornih soli, kao to su natrijum dihidrogen-fosfat, tetranatrijum-pirofosfat, natrijum--
glicerofosfat i dikalijumhidrogen-fosfat je izuavan na produkciju celulaza, pri emu je utvreno
da je kalijum dihidrogen-fosfat predstavlja najpovoljniji izvor fosfora (Kumar et al., 2008).
Neka fenolna jedinjenja (taninska kiselina, maleinska kiselina, salicilna kiselina) imaju
sposobnost indukcije lakaza i celulaza, dok neka imaju izraen inhibitorni efekat (Kumar et al.,
2008).

Ogranienja u procesu konverzije lignoceluloze

Proces prevoenja lignocelulozne biomase u etanol ima nekoliko ogranienja, od kojih je

najznaajnija kristalininost celuloze. Difrakacionom analizom X-zraka utvreno je postojanje
nekoliko kristalnih formi celuloze. Celuloza kristalne grae pokazuje visoku rezistentnost prema
mikrobiolokoj, odnosno enzimskoj degradaciji, dok je amorfna celuloza mnogo podloniji
supstrat. Brzina enzimske hidrolize celuloze je takoe u direktnoj korelaciji sa stepenom
kristalininosti. Enzimi celulaze vrlo lako razgrauju dostupne amorfne regione celuloze, ali
nisu u mogunosti da napadnu manje dostupnu, kristalnu regiju (Alvira et al, 2010).

9
RAZLOZI I CILJEVI PREDTRETMANA

Usled rigidne i kompaktne strukture elijskih zidova, lignocelulozna biomasa je

rezistentna prema biodegradaciji. Rezistentnost biomase je uglavnom posledica hemijskog
sastava konstituenata, koji svojim povezivanjem formiraju prostornu mreu koja ima ulogu
zatitnog zida Slika 7.

Slika 7. A) elijski zid biljaka; B) otporni matriks elijskog zida koji se degradujeti za dalju
konverziju polimerne lignocelulozne biomase u fermentabilne prekusore; C) osloboeni
konstituenti lignocelulozne materije; (preuzeto iz Tan et al., 2016)

Generalno, faktori koji doprinose rezistentnosti lignoceluloze prema biolokoj i hemijskoj

degradaciji ukljuuju: strukturu i sadraj lignina, acetilovane hemiceluloze, lignin-
ugljovodonine komplekse, prisustvo pektina, specifinu povrina celuloze koja je direktno
povezana sa veliinom i zapreminom pora i veliinom estica, kao i kristalinost i stepen
polimerizacije celuloze. Usled toga, razliite metode predtretmana su razvijene sa ciljem da se
uklone rezistentne barijere i povea enzimska degradacija celuloze u hidrolitikom procesu
(Zhao et al., 2012; Hu i Ragauskas, 2012). Poznavanje hemijskog sastava i fizikih karakteristika
komponenti koje ine rezistentnost lignoceluloze prema enzimskoj degradaciji bi u velikoj meri
pomogli u unapreenju postojeih tehnologija koje se primenjuju u predtratmanu lignocelulozne
materije.
Lignin deluje kao fizika barijera koja spreava pristup enzima ugljohidratnoj frakciji
lignoceluloze. Iako je deteljan mehanizam kojim bi se objasnila njegova zatitna uloga u
elijskom zidu nejasan, veruje se da hemijska povezanost lignina i ugljenih hidrata, kao i sama
struktura lignina imaju znaajnu ulogu. Pored toga, tokom enzimske hidrolize, enzimi imaju

10
tendenciju ireverzibilnog vezivanja za lignin putem hidrofobnih interakcija, to prouzrokuje
gubitak enzimske aktivnosti i dovodi do gubitka enzima, usled ega koliina primenjenih enzima
u hidrolitikom procesu raste (Hu i Ragauskas, 2012).
Hemiceluloza obavija mikrovlakna celuloze, te slino kao i lignin, ima veliku ulogu u
fizikoj barijeri koja ograniava pristup enzima celuloznoj materiji, a njeno uklanjanje kiselom
hidrolizom ili vodenom parom u toku pretretmana poveava enzimsku efikasnost. Hemiceluloza
iz biomase ima odreenu koliinu acetilovanih grupa, u zavisnosti od izvora lignocelulozne
biomase. Smatra se da acetilovane grupe imaju visokog udela u rezistentnosti elijskog zida
prema enzimskoj hidrolizi jer predstavljaju sternu smetnju tokom enzimskog napada.
Hemicelulozni razgranati polimeri kao to su ksiloglukan, homoksilan i manan formiraju
vodonine veze sa povrinom celuloznog vlakna, dok neke druge hemiceluloze preko bonih
lanaca ostvaruju kovalnentne, tj. fenil-glikozidne veze sa ligninom (najverovatnije preko
ugljenohidratnih jedinica uronske kiseline ili arabinoze). Hidroliza hemiceluloza dovodi do
raskidanja navedenih veza i otvaranja strukture biljne elije, to dalje omoguava pristup enzima
celuloznom supstratu (Zhao et al., 2012; Hu i Ragauskas, 2012).
Efekat kristalininosti celuloze predstavlja znaajan ometajui faktor u procesu
konverzije u glukozu. Stepen kristalininosti se izraava indeksom kristalininosti (CrI), ije
izraunavanje se bazira na rezultatima dobijenih metodom difrakcije X-zraka. Brzina enzimske
reakcije prilikom hidrolize celuloze je manja, ukoliko se radi o supstratu celuloze veeg indeksa
kristalininosti, a enzimska hidroliza amorfne celuloze je najbra. Stepen polimerizacije
celuloze takoe ima znaajnu ulogu u enzimskoj hidrolizi, a naroito u inicijalnoj fazi. Na
poetku hidrolizacionog procesa, endocelulazni enzimi dovode do raskidanja (14) veza
izmeu glukozidnih jedinica pri emu se stepen polimerizacije smanjuje jer nastaju novi, krai
polimerni ili oligomerni lanci iji krajevi su sada dostupni drugim enzimima (egzocelulazama) u
daljem procesu hidrolize (Zhao et al., 2012; Hu i Ragauskas, 2012).
Od fizikih parametara koji doprinose rezistentnosti lignocelulozne materije prema
enzimskoj aktivnosti od znaaja su :
- specifina povrina supstrata je u jednostavnoj korelaciji sa enzimskom efikasnou;
vea specifina povrina omoguava bolju dostupnost, a jedan od glavnih ciljeva
predtretmana je poveanje dostupne povrine za dalji enzimski napad.

11
 - veliina estica je direktno povezana sa specifinom povrinom; smanjenje veliine
estica lignoceluloznog materijala dovodi do poveanja povrine dostupne enzimima.
- poroznost biljnog materijala u odnosu na veliinu enzima esto je glavno ogranienje u
mikrobiolokoj hidrolizi lignocelulozne biomase. Ukoliko je unutranja zapremina pora
mnogo vea od eksterne povrine, moe da doe do zadravanja enzima unutar pora.
Poveanje porozosti u procesima predtretmana znaajno poveava efikasnost enzimske
hidrolize.
- uticaj debljine elijskog zida ogleda se u barijeri koju predstavlja vosak u procesu
penetracije enzima; stabljike i drvenasta tkiva po svojoj prirodi onemoguavaju
prodiranje tenosti (Alvira et al, 2010).

Izbor i cilj predtretmana

Postoje brojni faktori koji treba da budu razmatrani pre nego to se donese odluka o vrsti
predtretmana koji e biti upotrebljen u procesu lignocelulozne konverzije. Znaajno je uzeti u
obzir da ulaganje u kapitalne i energetske investicije bude nisko, ali i da se postigne efikasnost i
primenjivost procesa na irok opseg polaznog lignoceluloznog materijala. Izbor predtretmana
zavisi od fizikih i hemijskih karakteristika biomase usled kojih dolazi do njene rezistentnosti
(Ravindran i Jaiswal,2015). Predtretman treba da bude izabran tako da optimizuje lignoceluloznu
biomasu za narede tehnoloke korake u procesu dobijanja bioetanola.
Ciljevi predtretmana mogu biti sumirani na sledei nain:
- transformacija polazne biomase, tako da ugljovodonine komponente celuloza i
hemiceluloza postanu dostupne enzimima u narednom koraku hidrolizi, to dalje vodi
maksimalnom prinosu heksoza i pentoza;
- dobijanje lignina koji moe da se koristi kao gorivo;
- minimalizacija produkcije jedinjenja koja nastaju degradacijom eera i ostalih
komponenti, kao i inhibitornih jedinjenja kao to su furfurali
- omoguavanje upotreba lignoceluloznog materijala koji potie iz razliitih izvora;
- izbegavanje skupih procesa mlevenja i usitnjavanja polazne biomase;
- omoguavanje upotrebe jeftinih hemikalija i minimiziranje upotrebe pare;
- obezbeivanje niskih energetskih zahteva i smanjenje ulaganja u postrojenja koja se ovim
procesima bave.

12
 Katalizatori koji se koriste u predtretmanu treba da budu jeftini i da postoji mogunost
njihove ponovne upotrebe. U samom procesu predtretmana koristi se dodatak agenasa ili energije
kako bi se formirali supstrati koji su reaktivniji od polazne lignocelulozne materije, uz
generisanje i rastvornih oligo- i mono-saharida (Moiser et al., 2005). Procesi koji se sprovode u
cilju predtretmana su zahtevni i predstavljaju dodatni izdatak u celokupnom procesu, te je
njihova optimizacija veoma znaajna.

13
PREDTRETMANI

Predtretman je krucijalni korak u biohemijskoj konverziji lignocelulozne biomase u eljena

biogoriva, ija je glavna svrha degradacija polazne sirovine uz osobanje ugljovodoninih
komponenti iz matriksa elijskog zida, tako da postanu visoko dostupne daljoj enzimskoj
aktivnosti u procesima hidrolize i fermentacije, kako je shematski prikazano na Slici 8.
Predtretman je najskuplji procesni korak u ukupnoj konverziji biomaterijala, te je potpuno
osnovan zahtev koji se odnosi na njegovu efikasnost.

Slika 8. Shematski prikaz efekata predtretmana lignocelulozne biomase (preuzeto iz

Balat et al., 2011)

Na osnovu prirode procesa koji se tokom predtretmana izvode, metode predtretmana

delimo na fizike, hemijske, fiziko-hemijske i bioloke. U Tabeli 2 predstavljena je podela
navedenih metoda, zajedno sa mehanizmima promena koje se tokom sprovoenja odvijaju na
lignoceluloznom materijalu.

14
Tabela 2. Metode predtretmana i transformacije lignocelulozne biomase koje prethode procesu
enzimske hidrolize
Transformacije lignocelulozne
Metod Proces
biomase
-kuglino mlevenje -poveaje dostupne slobodne
-koloidno mlevenje povrine i smanjenje veliine pora
-vibro energetsko mlevenje -smanjenje kristalininosti i stepena
-hidrotermalni predtretman depolimerizacije celuloze
-primena pare pod visokim pritiskom -delimina hidroliza hemiceluloze
Fiziki -ekstruzija - delimina depolimerizacija lignina
-ekspanzija
-piroliza
-ozraivanje gama zracima
-ozraivanje snopom bombardujuih elektrona
-mikrotalasno ozraivanje
Eksplozije pod dejstvom: - delignifikacija
-pare - smanjenje kristalininosti i stepena
-amonijum vlakana polimerizacije celuloze
-ugljen-dioksida (CO2) -delimina ili kompletna hidroliza
-sumor-dioksida (SO2) hemiceluloze
Alkalni predtretman:
-natrijum hidroksidom (NaOH)
-amonijakom (NH3)
-amonijum-sulfitom
Predtretmani gasovima:
-hlor-dioksidom
-azot-dioksidom
Predtretmni kiselinama:
-sumpornom
Fiziko-hemijski -hlorovodoniom
Hemijski -sumpor-dioksidom
-fosfornom
Predtretmani oksidacionim agensima:
-vodonik-peroksidom
-wet oksidacija
- ozonom
Predtretmani celuloznim rastvaraima:
-Cadoxen
-CMCS
Tena ekstrakcija lignina tokom predtretmana:
-etanol-voda
benzen-voda
-etilenglikol
-butanol-voda
-bubreim agensima
Dejstvom mikroorganizama: -delignifikacija
Bioloki -aktinomiceta -smanjenje stepena polimerizacije
-plesni hemiceluloze i celuloze

15
Fiziki predtretmani

U fizike predtretmane ubrajamo mehanike procese, ekstruziju, ultrazvuni predtretman i

ozraivanje.

Mehaniki procesi tokom predtretmana lignocelulozne materije

Tokom mehanikih procesa koji se izvode tokom predtretmana dolazi do smanjenja veliine
estica lignoceluloznog materijala, sa ciljem poveanja slobodne povrine i radi
pojednostavljivanja izvoenja narednih tehnolokih procesa. Mehaniki predtretman je ekoloki,
jer ne ukljuuje primenu zagaujuih agenasa, kao ni produkciju inhibitornih jedinjenja. Tokom
mehanikog predtretmana primejuju se postupci rasparavanja, drobljenja i mlevenja, koji se
izvode se do postizanja eljene veliine estica potrebne za naredne procesne korake. Efikasnost
mehanikog predtretmana zavisi od dostupne opreme za njegovo izvoenje, a predstavlja
energetski zahtevan proces iji trokovi su povezani sa prirodom polaznog lignoceluloznog
materijala i finalnom veliinom estica koja treba da bude dostignuta (Bhikhu i Gaurav, 2015).

Ekstruzija
Ekstruzija je noviji metod gde lignocelulozni materijal prolazi kroz ekstruder i podvrgava se
dejstvu toplote, uz meanje i strienje. Navedeni procesi rezultiraju fizikim i hemijskim
modfiikacijama polaznog materijala. Ovo je iroko primenjivani tretman jer se postiu takve
modifikacije koje bi se dobile i primenom razliith hemikalija, visokih pritisaka ili temperatura.
Ekstruzija se uglavnom koristi kod materijala kao to su penica, sojino zrno, trava i stabljika
kukuruza (Bhikhu i Gaurav, 2015).

Piroliza
Piroliza predstavlja termalnu konverziju lignoceluloznog materijala. Samplevena
lignoceluloza se tretira ne temperaturi vioj od 300C, pri emu dolazi do rapidne dekompozicije
celuloze, uz produkciju gasova i vrstog ostatka (Balat, 2011).

Ozraivanje
Tokom procesa ozraivanja, biomasa i biovlakna su izloena visoko-energetskoj radijaciji
kao to su mikrotalasi, gama zraci i snop elektrona. Proces radiolize se definie kao upotreba
gama zraka koji se dobijaju od izotopa kobalta 60Co ili cezijuma 137
Ce, ili kao upotreba snopa

16
elektrona koji se proizvode u elektronskom izvoru. Visoka energija radijacije utie na
karakteristike celulozne biomase ukljuujui razvijanje specifine povrine, smanjenje stepena
polimerizacije, smanjenje kristalininosti celuloze, hidrolizu hemiceluloze i deliminu
depolimerizaciju lignina. Uoeno je da se tokom ozraivanja odvija dekompozicija
oligosaharida. Efekat ozraivanja zavisi od vrste primenjene radijacije, kao i od prisustva lignina,
kristalininosti i gustine polaznog materijala. Glavni nedostatak predstavlja primena metode u
industrijskim postrojenjima usled izuzetno visoke cene (Kassim et al., 2016, Bhikhu i Gaurav,
2015).

Ozraivanje gama zracima

Gama zraci predstavljaju visoko energetsko zraenje koje lako prodire kroz mnoge
materijala. Primena ove tehnologije prilikom tretmana biomase i biovlakana je privukla posebnu
panju, jer se pokazalo da efikasno doprinosi smanjenju intra i intermolekulskog ureenja
celuloze, usled raskidanja intermolekulskih vodoninih veza. U ovom procesu, gama zraci
generisani u izvoru, prolaze u u biomasu, koja se pod dejstvom radijacije raspada na manje
molekule uz formiranje dugoiveih i kratkoiveih radikala. Tokom procesa nastaju fragmmenti
niskog stepena polimerizacije (Kassim et al., 2016).

Ozraivanje elektronskim snopom

Ozraivanje elektronskim snopom se efikasno koristi u predtretmanu biomase. Za
komercijalne upotrebe, najvanija karakteristika procesa je sam akcelerator. Industrijski
akceleratori elektrona su klasifikovani prema njihovim opsezima energija i podeljeni u one niske
energije (80-300 keV), srednje (300keV 5 MeV) i visoke energije (iznad 5MeV). Sam postupak
se sastoji u izlaganju biomase snopu elektorona visoke energije koji se nakon emisije iz izvora
elektrona ubrzavaju u akcelertoru (Slika 9).

17
 Slika 9. Postavka eksperimenta predtretmana biomase ozraivanjem snopom elektrona
(Kassim et al., 2016).

Emitovani elektroni visoke energije putuju kroz biomasu uz razmenu energije sa

materijalom, to vodi nizu hemijskih i termalnih reakcija, koje ukljuuju depolimerizaciju
celuloze uz oksidaciju do karboksilnih grupa, raskidanje vodoninih veza izmeu celuloznih
polimernih lanaca i stvaranje amorfne celuloze, koja predstavlja lako dostupan supstrat za
enzimsku hidrolizu (Kassim et al., 2016).

Mikrotalasno ozraivanje
Mikrotalasi su elektromagnetno zraenje iji opseg frekfencije je 0,3300 GHz, dok se u
industrijske svrhe najee upotrebljavaju oni ija frekfencija lei izmeu 0,9 - 2,45 GHz. Ovo
zraenje penetrira u nemetalne, staklene i plastine materijale. Mikrotalasi mogu uticati na
materijal termalno i netermalno. Termalno (Slika 10), dolazi do zagrevanja materijala putem
interakcije molekula materijala sa elektromagnetnim poljem mikrotalasne energije; netermalno -
mikrotalasi interaguju sa polarnim molekulima i jonima unutar materijala to dovodi do fizikih i
hemijskih promena.

18
 Slika 10. Konvencionalni i mikrotalasni termalni mehanizmi biomolekula (preuzeto iz
(Kassim et al., 2016).
Predtretman mikrotalasima moe biti izvden uz primenu ostalih metoda koji se primenjuju
tokom predtretmana:
a) Efikasna je primena mehanikog predtretmana, koji ima ulogu da smanji veliinu estica
biomase i povea specifinu povrinu, kako bi se nakon toga primenio mikrotalasni metod.
b) Kombinovajem mikrotalasnog i hemijskog metoda koji ukljuuje reakcije ili kisele ili
alkalne katalize. U ovom procesu alkalije se koriste kako bi se omoguilo bubrenje strukture
biomase i uklonile ligninske komponente. Primena kisele katalize e dovesti do konverzije
hemiceluloze i celuloze u monomerne eere.
c) Kombinacija mikrotalasnog modela i eksplozija pod dejstvom pare odvija se na visokom
pritisku i temperaturi, to drastino utie na degradaciju lignoceluloznog materijala i
omoguavanje boljeg pristupa hidrolitikih enzima degradujenoj celulozi i hemicelulozi
(Kassim et al., 2016).

Ultrasonikacija
Ultrazvuno ozraivanje se iroko primenjuje u procesu predtretmana biomase i biovlakana.
Proces moe da se izvodi ili upotrebom ultrasonikatora ili ultrazvunog kupatila, pri emu
ultrazvuni talasi koji se generiu imaju frekfenciju u oblasti 20-1000 kHz. Indukovani talasi
omoguavaju stvaranje regiona sa razliitim pritiscima u medijumu. Ultrazvuni predtretman
izvodi se nad raznovrsnim lignoceluloznim materijalom, a u nekim sluajevima na niskoj
temperaturi i priscima, kombinovan sa procesom kisele hidrolize (Kassim et al., 2016).

19
 Ovaj metod se koristi prilikom tretmana mulja dobijenog iz postrojenja za preiavanje
otpadnih voda koje sadre biljni materijal. Eksperimenti koji su izvedeni u prisustvu
ultrazvunog tretmana nad istom celulozom ukazuju da nakon tretmana, brzina enzimski
katalizovane reakcije se duplo poveava. Iako mehanizam dejstva ultrazvunih talasa jo nije u
potpunosti razjanjen, pretpostavka je da tokom tretmana dolazi do raskidanja vodoninih veza
izmeu polimernih lanaca celuloze, jer je energija primenjenih talasa znatno vea od one koja je
potrebna za raskidanje vodoninih veza (Bhikhu i Gaurav, 2015).

Hemijski predtretmani

Hemjski predtretmani ukljuuju upotrebu razliitih hemijskih agenasa koji e dovesti do

degradacije biomase, ukljuujui i struktrnu alteraciju lignina, bubrenje i deliminu
dekristalizaciju celuloze, kao i delimino rastvaranje hemiceluloze. Na osnovu hemijskog
procesa koji se vri prilikom dodatka odreenih reagenasa, hemijske predtretmane delimo na:
alkalne, kisele, oksidativne i organosolv predtretmane.

Alkalni predtretmani

Alkalni predtretman je izuzeto delotvoran u procesu delignifikacije biomase, kao i u procesu

porasta digestibilnosti celuloze. Tokom procesa ne dolazi do degradacije eera i nastajanja
inhibitornih proizvoda u znatnoj meri, a sam proces pokazuje visoku efikasnost kada
lignocelulozna materija vodi poreklo od drvenih materjala. Meutim, njegovo dejstvo na
celulozu i hemicelulozu je manje nego kada se primenjuje predtretman u koji su ukljuene
kiseline ili hidrotermalni proces. Alkalnim procesom uklanjaju se uronska kiselina i acetil grupe
prisutne u hemicelulozi i poveava se dostupnost celuloznog i hemiceluloznog materijala prema
enzimima. U toku alkalnog predtretmana, dolazi do hidrolize estarskih veza, te se ova vrsta veze
raskida i izmeu ksilana i hemiceluloznog ostatka, pri emu nastaju pojedinane komponente
(Bhikhu i Gaurav, 2015).
NaOH je u irokoj upotebi za predtretman lignoceluloznog materijala. Primenjuje se
najee na ambijentalnoj temperaturi, kako u obliku koncentrovanih, tako i u obliku razblaenih
rastvora. Razblaeni NaOH dovodi do raskidanja veza izmeu lignina i ugljenih hidrata, to
poveava slobodnu povrinu i degraduje strukturu lignina, smanjuje stepen polimerizacije i
20
kristalininost celuloze. Koncentrovan rastvor NaOH poveava stepen delignifikacije,
digestibilnost biomase prema enzimima i smanjuje sadraj lignina. Naroito pozitivni rezultati su
uoeni kada se kombinuje alkalni tretman NaOH i drugih agenasa, npr. persiretne kiseline, uree
ili vodonik-peroksida. ( Bhikhu i Gaurav, 2015).
Primena kalcijum hidroksida ima odreene prednosti: sa njim je lako i bezbedno rukovati,
predstavlja jeftinu i dostupnu hemikaliju, lako se reciklira u postupku taloenja kao CaCO 3 i
mogua je ponovna upotreba u procesu. Kada se Ca(OH) 2 koristi u predtretmanu lignoceluloze,
dolazi do uklanjanja acetil grupa iz hemiceluloze i poveanja digestibilnosti celuloze. Proces
delignifikacije moe da se postigne uz dodatak kiseonika. U poreenju sa NaOH, upotreba
Ca(OH)2 je jeftinija i nosi manje rizika u smislu bezbednosti izvoenja predtretmana (Bhikhu i
Gaurav, 2015).
Predtretman sa kalijum-hidroksidom se primenjuje pre svega radi smanjenja sadraja lignina
u polaznoj biomasi. Ovim postupkom lignin se uklanja u odreenoj meri, a struktura polazne
sirovine se menja i postaje pristupanija enzimskoj hidrolizi (Bhikhu i Gaurav, 2015)..

Predtretman sa amonijakom

Polazni biomaterijal se tretira amonijakom na odreenoj temperaturi. Ovaj proces smanjuje

sadraj lignina, dovodi do dekristalizacije celuloze, kao i do uklanjanja hemiceluloze. Tretman
moe biti primenjen u tri razliite forme:
a) Ammonia Recycle Percolation metod (ARP) se izvodi vodenim rastvorom amonijaka,
pri emu se biomasa nalazi u reaktoru u obliku kolone. Amonoliza dovodi do destrukcije
lignina i hidrolize hemiceluloze, raskidanja vodoninih veza u celulozi i do smanjenja
njene kristalininosti. Tena frakcija se koristi da bi se odvojili lignin i eeri, a amonijak
se reciklira i ponovo uvodi u proces. vrsta faza slui za ekstrakciju zaostalih eera.
b) Soaking in Aqueous Ammonia (SAA) proces se izvodi na niskoj temperaturi, pri emu
se efikasno uklanja lignin i minimizuju se njegove interakcije sa hemicelulozom, dolazi
do poveavanja slobodne povrine i veliina pora, te celulozni supstrat postaje dostupniji
za enzimsku degradaciju.
c) Ammonia Fiber Explosion (AFEX) u ovom proesu biomasa se tretira na temperaturi
od 60-100C u uslovima povienog pritiska u kratkom vremenskom periodu, to dovodi
do bubrenja lignoceluloze, degradacije hemicelulozne strukture i dekristalizacije

21
 celuloze. Ovaj proces nema velikog uticaja na lignin, ali je glavna prednost AFEX
postupka to to velika koliina amonijaka moe biti reciklirana i ponovo uvedena u
proces ( Bhikhu i Gaurav, 2015; Zheng et al., 2009).

Predtretmani kiselinama

Predtretmni koji se izvode u prisustvu kiselina kao katalizatora imaju za cilj poveanje
hemicelulozne rastvorljivosti i njeno frakcionisanje, kako bi istovremeno dolo do oslobaanja
celuloze iz lignoceluloznog kompleksnog matriksa. Tretman kiselinama generalno moe biti
podeljen u dve grupe: tretman razblaenim ili koncentrovanim kiselinama. U procesu
predtretmana biomase kada kao eljeni proizvod treba na kraju da nastane etanol, primena
razblaenih kiselina tokom tretmana ima prednost, pre svega usled nastajanja manje koliine
inhibitornih jedinjenja, ali i usled manjeg korozivnog oteenja opreme do kojeg u velikoj meri
dolazi kada se koriste koncentrovani rastvori kiselina. U navedenim tretmanima koriste se
razliite mineralne kiseline, kao to su: H 2SO4, HCl, H3PO3 i HNO3, a na izbor kiseline primarno
utie vrsta lignoceluloznog materijala i njeno poreklo (Bhikhu i Gaurav, 2015; Zheng et al.,
2009).
Tretman razblaenim rastvorom kiselina je jeftin i efikasan, a primenjuje se na viim
temperaturama 120-210 C i povienom pritisku, kako bi se ostvario visok prinos tokom
saharifikacije. Uobiajeno se koriste 0,2 2,5% -tni rastvori kiselina. Razblaena HNO 3
ostvaruje najvei prinos glukoze, ali se dobijaju bi-produkti tokom tretmana koji ne mogu biti
lako uklonjeni ispiranjem. Razblaena H3PO4 se upotrebljava kada se radi o lignoceluloznom
materijalu koji vodi poreklo od bambusa ili kukuruza, na temperaturi od 170 C, pri emu se
ostvaruje visok nivo slobodnih eera. Mogua je primena i kombinovanog tretmana uz
istovremenu upotrebu H2SO4 i H3PO4, pri emu se na supstratu od ostataka uljanih palmi
ostvaruje visok prinos ksiloze (Zhang et al., 2012). Iako daju dobar prinos hemiceluloznih
eera, slabe kiseline se uglavnom ne koriste, usled nastajanja degradacionih proizvoda
furfuralskog tipa, ije je inhibitorno dejstvo tokom fermentacionog procesa poznato.
Glavna karakteristika predtretmana koncentrovanim rastvorima kiselina ogleda se u tome to
su dobri hidrolitiki agensi za celulozu, a omoguavaju fleksibilnost prilikom upotrebe
raznorodnog lignoceluloznog materijala, uz visok prinos monomernih eera. Koriste se 65-86%-
tni rastvori H2SO4, 85%-tni rastvori H3PO4 ili 41%-tni rastvori HCl. Nakon izvrenog

22
predtretmana, vri se razblaivanje dejonizovanom vodom, kako bi se nastavio proces
saharifikacije na umerenoj temperaturi 70-121C. H3PO4 pokazuje visoku efikasnost i na niskoj
temperaturi rastvara celulozu, pri emu ne dolazi do formirnja inhibitornih jedinjenja u veoj
meri (Bhikhu i Gaurav, 2015; Zheng et al., 2009). Glavni nedostatak primene koncentrovanih
kiselina tokom predtretmana je nastajanje razliitih inhibitora, kao to su furfurali, karboksilne
kiseline, ali i oni koji vode poreklo od lignina razliita fenolna jedinjenja (Taherzadeh et al.,
1999). Kao drugi veliki nedostatak istie se snano korozivno dejstvo kiselina na reaktore i
poveanje trokova u procesu regeneracije kiselina.

Oksidativni predtretmani

Razliiti oksidacioni agensi kao to je vodonik-peroksid (H 2O2), ozon, kiseonik ili vazduh se
koriste za predtretman lignoceluloznog materijala, pri emu dolazi do rekcije sa aromatinim
prstenom unutar ligninske strukture i konverzije ligninskog polimera u niz jedinjenja karboksilne
strukture. Nakon ovog procesa mora biti izvedena neutralizacija, kako bi se onemoguilo
inhibitorno dejstvo karboksilnih jedinjenja na mikroorganizme u fermentacionom procesu.
Oksidacioni reagensi takoe utiu i na hemiceluloznu frakciju, inei je dostupnom u procesu
enzimske hidrolize.
Ukoliko se tokom predtretmana koristi vodonik-peroksid - H2O2 uobiajena je upotreba 2%
-tnog rastvora, na 30 C, to vodi rastvaranju oko 50% lignina i razgradnji najveeg dela
hemiceluloze, uz prinos od 95% kada se radi o fermentabilnim eerima.
Ozonoliza se izvodi na sobnoj temperaturi i atmosferskom pritisku, a kao lignocelulozna
sirovina se koristi penina slama, stabljike pamuka, otpaci eerne trske (Kumar et al., 2009).
Ozon predstavlja jako oksidaciono sredstvo, ija upotreba vodi delignifikaciji uz nastajanje
oksidovanih formi aromatinih jedinjenja, uz visok prinos od 90% eera (Barros et al., 2013).
Wet ili oksidacija mokrim putem (WO) predstavlja alternativnu predtretmanu u kojem se
koristi eksplozija pare; WO predtretman za proces delignifikacije upotrebljava vazduh ili
kiseonik zajedno sa vodom, na visokoj temperaturi i pritisku. Na industrijskom nivou, ova smea
se koristi za tretiranje otpada koji je visoko optereen suspendovanom ili rastvorenom
organskom materijom. Na temperaturi od 185 C i pritisku od 5 bar u toku 15 minuta, dobija se
viskok prinos celuloze, koji je praen efikasnom delignifikacijom (Beccari et al., 2001).

23
 WO je relativno skup proces jer zahteva primenu visokog pritiska i prisustvo hemikalija kao
to je Na2CO3 ili Na2SO3. U modifikovanom procesu trokovi mogu biti delimino umanjeni
upotrebom vazduha umesto istog kiseonika; optimizovan proces je efikasno primenjen u
predtretmanu piljevine shea drveta, pri emu je ostvaren visok prinos eera (Bhikhu i Gaurav,
2015).
Organosolv predtretman
Organosolv predtretman podrazumeva ekstrakciju ligninske komponente upotrebom vodenih
ili organskih rastvaraa. Koriste se razliiti rastvarai kao to su metanl, etanol, aceton, glicerol i
sl. U organosolv procesu dolazi do rastvaranja hemiceluloze i degradacije lignina do vode,
ugljen-dioksida i razliitih karboksilnih kiselina. Rastvarai se meaju sa vodom tako da se
dobije 20-60% rastvor organske komponente i dodaju polaznoj lignoceluloznoj sirovini, a zatim
se takva reakciona smea zgreva na 100-250 C; primena nie temperature je mogua ali uz
dodatak kiselina koje imaju ulogu da ubrzaju proces hidrolize. Dodatkom kiseline proces postaje
efikasniji to se ogleda u porastu delignifikacije i viem prinosu ksiloze (Zhao et al., 2009).
Tokom organosolv predtretmana, glavni mehanizam ukljuuje rastvaranje lignina organskim
rastvaraima, a zatim njegovu reprecipitaciju dodatkom tzv. antisolventa (voda pomeana sa
kiselinom). Efekat koji se postie je odvajanje lignina iz lignocelulozne biomase, rastvorljivost
hemiceluloze, poveanje poroznosti i specifine povrine unutar lignoceluloze. Nakon
ekstrakcije vre se procesi filtracije, ispiranja i precipitacije lignina, kao je shematski prikazano
na Slici 11.

Slika 11. Shema procesnih koraka tokom organosolv procesa (preuzeto iz Pan et al., 2006)

24
 Tokom organosolv tretmana nastaje visoko digestibilni celulozni supstrat, bez obzira o kojoj
vrsti lignoceluloznog materijala se radi, a dolazi i do smanjenog adsorpcionog procesa enzima,
to se ogleda u vioj koncentraciji enzima. Meutim, proces ima nekoliko nedostataka: trokovi
izvoenja procesa su visoki usled primene visoke temperature i pritiska, usled primene kiselina
postoji problem zagaenja ivotne sredine, dolazi do korozije opreme i nastajanja inhibitornih
jedinjenja. Nakon izvrenog predtretmana potreban je proces dodatnog ispiranja, a primena
visoko isparljivih organskih rastvaraa oteava postupak njihovog reciklirnja (Bhikhu i Gaurav,
2015).

Predtretman u sistemu vodonik-peroksid-siretna kiselina (Hidrogen-peroxide-acetic acid

HPAC)
HPAc predtretman je efikasan u primeni nad raznovrsnom lignoceluloznom biomasom.
Kada se koriste hemijski agenski kao to je H 2O2 i CH3COOH dolazi do intenzivnog uklanjanja
lignina, bez upotrebe visokih temepratura ili jakih kiselina. Metod moe biti upotrebljen i
ukoliko je istovremeno prisutna lignoceluloza iz razliith izvora. Metod se bazira se na
jednostavnoj proceduri koja obuhvata meanje H2O2 i CH3COOH u cilju dobijanja reagensa.
Prsustvo ovih hemijskih agenasa istovremeno dovodi do raskidanja vodoninih veza unutar
celuloze, kao i do raskidanja veza izmeu fenolnih jedinica koje ine lignin. Posledica raskidanja
navedenih veza je degradacija prirodnih polimera celuloze i lignina, to istovremeno predstavlja
glavnu prednost navedenog metoda, dok se kao mana HPAC istie zaostatak hemiceluloze (Wi et
al., 2015).

Fiziko-hemijski predtretmani

Jedan od esto primenjivanih predtretmana podrazumeva eksploziju pare, a izvodi se tako

to se biomasa zasiti vodenom parom na pritisku od 6.948.3 bara i temperaturi 160260 C, te
se nakon izvesnog vremena (vreme varira od nekoliko sekundi do nekoliko minuta) pritisak
snano otpusti do atmosferskog, to dovodi do eksplozivne dekompresije biomase. Ovaj proces
pomae u uklanjanju hemiceluloze i u redistribuciji lignina. Na proces utiu razliiti faktori kao
to je veliina estica biomase, sadraj vlage, temperatura i vreme. Pored toga, dodatak

25
mineralnih kiselina (H2SO4) ili uvoenje CO2 tokom eksplozije poboljava efikasnost
predtretmana, smanjuje vreme izvoenja procesa, kao i zahtev za visokom temperatrurom.
Prednost ovog tretmana ogleda se pre svega u smanjenoj konzumaciji energije (Bhaumik i
Dhepe, 2016).
Mikrotalasno-hemijski predtretman moe biti termalni i netermalni. Unutar
lignoceluloznog materijala koji je tretiran ovom tehnikom, dolazi do selektivnog zagrevanja
polarnih komponenti, pri emu biomasa prestaje da bude rezistentne grae i strukture. Biomasa
se prvo potapa u vodeni rastvor razliitih hemijskih agenasa da bi se poveao prinos eera.
NaOH je efikasniji u poreenju sa Na 2CO3 i Ca(OH)2 u tretmanu biomase sa visokim sadrajem
trave. Mikrotalasni tretman zajedno sa kiselinama efikasno dovodi do degradacije hemiceluloze,
a mikrotalasi se mogu kombinovati i sa oksidativnim agensima poput vodonik-peroksida.
Prednost mikrotalasnog tretmana je produkcija manje koliine inhibitornih jedinjenja i smanjenje
efektivnih trokova (Bhaumik i Dhepe, 2016).
Jonske tenosti su soli koje su sastavljene od velikih organskih katjona i malih
neorganskih anjona. Na sobnoj temperaturi su tenosti i imaju sledee karakteristike:
nezapaljivost, termalna stabilnost, hemijska stabilnost, irok temperaturni opseg u kojem se
nalaze u tenom stanju, dobre solventske karakteristike, primenjivost kod irokog opsega
lignocelulozne biomase (Bhaumik i Dhepe, 2016). Shematski prikaz predtretmana jonskim
tenostima je predstavljen na Slici 12.

Slika 12. Shematski prikaz predtretmana lignoceluloznog materijala jonskim tenostima

(preuzeto iz Singh et al., 2009)

26
 Jonske tenosti konvertuju lignocelulozni materijal u fermentabilne eere kako bi se
poboljao proces enzimske hidrolize, pri emu se istovremeno sistem transformie iz
heterogenog u homogeni - rastvaranjem u rastvarau.
Mehanizam dejstva jonskih tenosti na degradaciju elijskih zidova biomase je
predstavljen na Slici 13. elijski zidovi biomase su hijerarhijske grae i sastoje se od agregata
celuloznih vlakana koji su utkani u matriks hemiceluloze i lignina. Tokom poetka predtretmana
jonskim tenostima, joni penetriraju u sekundarni elijski zid, sainjen od lignina i celuloze, te
raskidaju intenzivnu mreu vodoninih veza izmeu celuloze, to rezultira bubrenjem
sekundarnog elijskog zida. Tokom reakcionog vremena, process bubrenja se poveava i dolazi
do rastvaranja komponenata elijskog zida u interakciji sa jonskim tenostima. Posledica toga je
nastavak bubrenja sekundarnog elijskog zida i rapidno otputanje komponenti u jonsku tenost.
U navedenim koracima, najsporiji je proces bubrenja i ovaj korak odreuje brzinu celokupnog
predtretmana.

Slika 13. Prikaz degradacije elijskog zida biljnog materijala u prisustvu jonskih tenosti:
a) prirodan izgled elijskog zida pre tretmana; b) poetak penetracije jonskih tenosti i
raskidanje vodininih veza izmeu ugljenih hidrata; c) tokom reakcije, kada bubrenje dostigne
odgovarajui nivo, dolazi do rastvaranja konstituenata elijskog zida (lignin, hemiceluloze i
celuloze) d) elijski zid nastavlja da bubri; e) nastavlja se oslobaanje konstituenata;
f) konstituenti su kompletno rastvoreni u jonskim tenostima (preuzeto iz Zhan et al., 2014).

27
 Primena jonskih tenosti omoguava odvajanje lignina i poveanje dostupnosti celuloze,
a velika prednost je injenica da ne dolazi do formiranja inhibitornih jedinjenja. Jonske tenosti
koriene su kako bi se izvrio predtretman lignoceluloznog materijala koji sadri ostatke
eerne trske, drveta, penine slame. Meutim, kada se koriste jonske tenosti mora se sagledati
uticaj ovih agenasa na toksinost prema enzimima i mikroorganizmima koji e biti korieni u
procesu fermentacije (Zhao et al., 2010; Bhaumik i Dhepe, 2016).
Predtretman tenom vrelom vodom (Liquid Hot Water - LHW) je hidrotermalni metod
koji koristi vrelu vodu na visokom pritisku u vremenskom periodu od nekoliko sekundi do
nekoliko minuta. Tretman ne zahteva upotrebu katalizatora ili hemikalija na visokoj temperaturi.
Dejstvom LHW metoda dolazi do promena u strukturi lignoceluloznog materijala, to se ogleda
u rastvaranju hemiceluloza, ali efekat koji tretman ostvaruje na celulozu i lignin nije veliki.
Lignin je delimino depolimerizovan i rastvoren, ali voda ne ostvaruje efikasno dejstvo na
njegovu strukturu, te ne dolazi do kompletne delignifikacije. LHW metod uklanja 80%
hemiceluloze i na taj nain poboljava digestibilnost celuloze. Prednosti LHW metoda su niski
trokovi primene, odsustvo katalizatora, niski korozioni efekti na opremu, niska cena opreme,
smanjena produkcija inhibitora koji vode poreklo od lignina. Najznaajnija ogranienja
predstavljaju: upotreba velike koliine vode, visoki energetski zahtevi, neprimenjivost metoda na
komercijalnom nivou (Bhaumik i Dhepe, 2016).
Sulfitni predtretman je dosta primenjivan u tretmanu biomase koja sadri drvo, a ogleda
se u primeni natrijum-sulfita (Na2SO3) ili natrijum-hidrogensulfita (NaHSO3) iji dodatak je
praen mahanikim postupkom smanjenja veliine estica. Efikasnost ovog tretmana zavisi od
rastvorljivosti hemiceluloze, depolimerizacije celuloze, delimine delignifikacije, delimine
sulfonizacije lignina, poveanja povrine kroz proces mlevenja. Sulfonizacija se postie u
prisustvu isparljivih organskih rastvaraa, npr. etanola. Glavna prednost sulfitnog predtretmana je
produkcija manje koliine inhibitornih jedinjenja, visok prinos eera, efikasno uklajanje lignina,
dok nedostatke predstavlja velika upotreba vode u procesu ispiranja, visoka cena samog
postupka koji ukljuuje i regeneraciju korienih hemikalija (Bhaumik i Dhepe, 2016).
Superkritini fluidi su jedinjenja u formi gasova, ali kada su komprimovani na
temperaturi nioj od kritine, imaju gustinu tenosti. Ovo je veoma efikasan predtretman kada se
radi o uklanjanju lignina i poveanju digestibilnosti supstrata. Predtretman superkritinim CO 2
podrazumeva modifikovanu parnu eksploziju u kojoj se koristi CO 2 umesto vazduha. Odreena

28
koliina biomase se nakvasi, a zatim se pod pritiskom uvede CO 2. Nakon odreenog vremena
pritisak naglo otpusti to dovodi do frakcionisanja lignoceluloznog supstrata. Superkritini CO 2
difunduje i u kristalnu strukturu celuloze, a prilikom eksplozije dolazi do degradacije elijskih
zidova. Uklanjanje lignina moe biti dodatno poboljano dodatkom etanola u procesu
ekstrakcije. Mnogo fluida kao to su voda, CO 2 i amonijak su u irokoj upotrebi. CO 2 je
netoksian, nezapaljiv, ne predstavlja opasnost po okolinu, jeftin je i dostupan. Tokom
degradacije lignina dolazi do formiranja karboksilnih kiselina u vodenom rastvoru, to vodi
hidrolizi polimera. Primena CO2 eksplozije u ovom predtretmanu nije skup metod, a vodi
formiranju manjih koliina inhibitora u poreenju sa ostalim vidovima predtretmana. Takoe,
utvreno je da je mogue izvoditi enzimsku hidrolizu nakon predtretmana u kojem se koristi CO 2
eksplozija. Glavna mana upotrebe kritinih fluida predstavlja primena visokog pritiska tokom
tretmana (Ravindran i Jaiswal, 2015, Bhaumik i Dhepe, 2016).
Integrisani hidroksi radikali sa predtretmanom vrelom vodom (Integrated hydroxyl
radicals and hot water pre-treatment IHRWT) je metod za predtretman u kojem se pored vrele
vode koriste i hidroki-radikali koji imaju sposobnost cepanja vodoninih veza u celulozi,
hemicelulozi i ligninu. Hidroksi radikali mogu biti generisani in vivo Fentnovom reakcijom u
kojoj se meaju H2O2 i FeSO4 u niskim koncentracijama. Biomasa se najpre izloi vreloj vodi na
100C u periodu od 30 minuta, to dovodi do uruavanja kompleksne polimerne strukture
celuloze i lignina u lignocelulozi (Ravindran i Jaiswal, 2015).

Bioloki predtretmani

Tokom biolokog predtretmana koriste se bioloki agensi kako bi se ostvario proces

delignifikacije lignoceluloznog materijala i kako bi ugljovodonine komponente postale
dostupne za dalje dejstvo enzima tokom hidrolize. Za razliku od fizikih i hemijskih metoda koji
se koriste prilikom predtretmana, bioloki ne ukljuuju primenu visoke temperature i pritiska, ne
zahtevaju upotrebu hemijskih agenasa kao to su kiseline, baze ili drugi reagensi, energetski
zahtevi procesa nisu visoki, kao ni trokovi koji su vezani za kapitalnu opremu. Takoe, tokom
procesa ne dolazi do degradacije eera niti do stvaranja inhibitornih jedinjenja. Meutim, kao
glavni nedostatak primene biolokih metoda prilikom predstretmana jeste sporost procesa koji
moe da traje od nekoliko dana do nekoliko nedelja, gubitak enzima tokom procesa, teko
uspostavljanje kontrole, kao i injenica da je esto neophodno kombinovati dodatne metode

29
predtretmana, kako bi se obezbedio visok prinos fermentabilnih eera. Procedure tokom
biolokog procesa mogu se klasifikovati na osnovu upotrebe mikroorganizama na: mikrobioloki
konzorcijum, tretmane gljivama i enzimske tretmane (Ravindran i Jaiswal, 2015).

Mikrobioloki konzorcijum
Ovaj predtretman zasniva se na ideji meanja, odnosno udruivanja mikrobiolokih
kultura u procsu tretmana lignocelulozne materije, jer primena jedne mikrobioloke kulture nije
efikasna u svim procesima predtretmana koji dovode do eljenih efekata (delignifikacija
materijala, smanjenje kristalininosti i stepena polimerizacije celuloze, visok prinos eera i sl.).
Na ovaj nain, polazna biomasa se degraduje kooperativnim dejstvom svih mikroorganizama
koji u procesu uestvuju i u prirodnim uslovima. Prirodno zastupljeni mikroorganizmi proizvode
enzime pod ijim se dejstvom digestira lignocelulozni materijal, te nastaju supstrati koji su
jednostavniji za dalju konverziju. Lactobacillaceae se pojavljuje kao dominantna vrsta u
mikrobiolokom konzorcijumu, a koja fermentira biomasu ve u procesu njenog skladitenja.
Iako je sposobnost prema degradaciji lignina je praktino odsutna, uticaj mikrobiolokog
konzorcijuma dovodi do poveavanja prinosa fermentabilnih eera izdvojenih iz supstrata.
Usled navedenog, degradacija tokom skladitenja doprinosi krajnjoj degradaciji lignocelulozne
materije, ali ne moe se razmatrati kao samostalni proces u predtretmanu (Ravindran i Jaiswal,
2015).

Predtretman gljivama
Delignifikacija biomase uz upotrebu gljivinih mikroorganizama je metod koji privlai
panju istraivaa. Gljive bele trulei su mala grupa bazidomiceta, koje ive na drvetu i pokazuju
aktivnost kada se radi od cepanju veza i demineralizaciji lignina; najee se radi vrstama:
Phanerochaetechrysosporium, Phanerochaetecarnosa, Ganodermalucidum, leurotusostreatus,
Pleurotuspulmonarius, Phanerochaetechrysosporium i Trametes sp. Navedeni proces se odvija
upotrebom oksidativnog enzimskog sistema, koji se sastoji od tri glavna enzima: lignin
peroksidaze, mangan peroksidaze i lakaze. Ovi enzimi vre napad na fenolne prstenove u ligninu.
Pored toga, postoji i hidrolitiki sistem koji degraduje celulozu i hemicelulozu do fermentabilnih
eera (Vicua, 2000; Ravindran i Jaiswal, 2015). Gljive braon trulei su druga klasa
lignocelulozno degradabilnih gljiva koje koriste enzime za degradaciju celuloze i hemiceluloze,

30
ali je njihov uticaj na degradaciju lignina minimalan, te postoji pristup da lignin moe biti
naknadno uklonjen neenzimskim putem, odnosno upotrebom hidroksil radikala (Jensen et al.,
2001, Ravindran i Jaiswal, 2015).

Enzimski predtretman
Dok se u prethodno opisanim mikrobiolokim predtretmanima koriste odreeni
mikroorganizmi koji vre produkciju enzima, prilikom enzimskog predtretmana direktno se
dodaju isti enzimi, izolovani iz istog mikroorganizma. Lakaza, mangan peroksidaza i versatil
peroksidaza su enzimi koji se uobiajeno koriste u tretiranju lignoceluloznog supstrata. Lakaze
su fenoloksidaze koje sadre jone bakra i kataliu oksidaciju fenola, anilina i aromatinih tiola.
Uklanjanje fenola dalje dovodi do poboljanja mikrobiolokog rasta, poboljanja fermentacione
sposobnosti i smanjuje vreme mikrobioloke aktivnosti (Oliva-Taravilla et al., 2015). Mangan-
peroksidaza je drugi enzim koji se izoluje iz gljiva bele trulei i koji je specifian prema drvenim
supstratima koji sadre mangan. Ovaj enzim sadri hem komponentu koja se koristi u
katalitikom ciklusu i koja je jedinstveno selektivna prema oksidaciji Mn 2+ do Mn3+ jona, uz
istovremenu redukciju hidrogen peroksida do vode. Mn3+ dovodi do raskidanja veza unutar
lignina, a visoko je reaktivan i prema fenolima, aromatinim jedinjenjima nefenolne strukture i
nezasienm masnim kiselinama (Brown i Chang, 2014; Ravindran i Jaiswal, 2015).

Kombinovane metode tokom predtretmana

Svaki od prethodno opisanih metoda koji se koriste u predtretmanu lignoceluloznog

materijala ima svoje prednosti i nedostatke. Kombinacija metoda predtretmana ima za krajnji cilj
efikasniju delignifikaciju lignoceluloznog materijala, poboljanje prinosa fermentabilnih eera,
smanjenje prinosa inhibitornih jedinjenja, poveanu produkciju bioetanola, kao i smanjivanje
trokova celokupnog procesa. U ove svrhe koriste se sledee kombinacije predtretmana: alkalni
predtretman kombinuje se sa tretmanom razblaenim kiselinama ili jonskim fluidima ili
mikrotalasnim ozraivanjem; predtretmana eksplozijom pare sa koristi se u kombinaciji sa
razblaenim kiselinama ili eksplozijom superkritinog CO2 ; predtretmana razblaenim
kiselinama sa moe da prethodi mikrotalasnomm ozraivanju. Primenjive su i kombinacije

31
biolokih predtretmana sa organosolv tretmanom, razblaenim kiselinama ili eksplozijom pare
(Mood et al., 2013; Bhagwat et al., 2015).

32
 EFEKTI PREDTRETMANA

U prethodnom poglavlju opisani su razliite tehnologije i metode koje se koriste u

procesu predtretmana tokom konverzije lignoceluloznog biomaterijala u biogorivo etanol.
Detaljan prikaz efekata koji se ostvaruju primenom metoda predtretmana, zajedno sa
prednostima i nedostacima je predstavljen u Tabeli 3.
Tabela 3. Pregled efekata postignutih primenom razliitih metoda predtretmana (Maurya et al., 2015).
Metod
Efekat metoda i prednost Nedostatak
predtretmana
Mlevenje Smanjuje se kristalinnost celuloze i stepen polimerizacije; Energetski zahtevan postupak
smanjuje se veliina estica, poveava specifina povrina i
poroznost supstrata.
Eksplozija pare Dovodi do transformisanja lignina, poveava se Dolazi do generisanja toksinih jedinjenja; ne
rastvorljivost hemiceluloze, ostvaruje se visko prinos ostvaruje se potpuna degradacija hemiceluloze
glukoze, jeftin postupak.
Tena vrela voda Nije potreban mehaniki postupak kako bi se usitnila Energetski zahtevan proces, uz upotrebu velike
biomasa; ne upotrebljavaju se hemikalije; nije potrebna koliine vode; formiraju se toksina jedinjenja:
primena opreme koja je otporna na koroziju;
AFEX Nije potreban mehaniki postupak kako bi se usitnila Postupkom se ne ostvaruje efikasnost kod
biomasa, poveava se dostupna povrina za enzimski napad, biomase sa visokim sadrajem lignina, skup
formira se mala koliina inhibitornih jedinjenja. metod, upotreba velike koliine amonijaka.
CO2 eksplozija Poveava se povrina supstrata dostupna za dalji enzimski Potrebna je primena veoma visokih pritisaka.
napad, relativno jeftin i dostupan postupak, ne formiraju se
inhibitorna jedinjenja, jednostavna reciklaa nakon
ekstrakcije, ekoloki prihvatljiv.
Mokra oksidacija Postie se visok stepen rastvorne hemiceluloze i lignina, ne Visoka cena kiseonika i alkalnog katalizatora.
dolazi do formiranja inhibitornih jedinjenja
Koncentrovane Visok prinos glukoze, primenjuje se ambijentalna Visoka cena kiselina i potreba da se vri
kiseline temperatura. regeneracija kiselina, upotreba opreme koja je
otporna prema koroziji, upotreba mineralnih
kiselina u postupku koje su toksine i opasne za
ivotnu sredinu, nastajanje inhibitornih
jedinjenja.
Razblaene Dobijanje viske koncentracije eera, inhibitorna jedinjenja Niska koncentracija redukujuih eera,
kiseline se formiraju, ali u niskim koncentracijama. nastajanje degradacionih proizvoda
Alkalije Stepen polimerizacije i kristalininost celuloze se smanjuje, Skup postupak.
degraduje se ligninska struktura.
Ozonoliza Efikasno se uklanja lignin, ne proizvode se toksina Visoka cena ozona, koriste se velike koliine
jedinjenja, postupak se izvodi na sobnoj temperaturi i ozona.
atmosferskom pritisku
Organosolv Dovodi do hidrolize hemiceluloze i lignina Potrebna je upotreba rastvaraa, kao i njihovo
regenerisanje tokom postupka, skup metod.
Bioloki Niska upotreba energije, visoka efikasnost u procesu Veoma spor proces, neefikasan za komercijalnu
predtretmani delignifikacije, smanjuje se stepen polimerizacije i primenu.
kristalininosti celuloze, ostvaruje se delimina hidroliza
hemiceluloze, nije potrebna upotreba hemikalija, blagi
reakcioni uslovi.

33
 U ovom momentu, ne postoji jedan, sveobuhvatan metod koji bi mogao da se koristi
prilikom predtretmana, a koji bi omoguio 100% - tnu iskoristivost biomase tokom prevoenja u
eere, jer se uvek javlja odreeni gubitak biomase koji dalje dovodi do smanjenih finalnih
prinosa etanola.
U svim procesima, glavni cilj jeste oslobaanje od prisustva lignina koji u
hidrolizacionom procesu deluje kao inhibitor tokom enzimske degradacije celuloze i
hemiceluloze do fermentabilnih eera.
Iako predtretman koji koristi kombinaciju dva ili vie predtretmanskih metoda daje
obeavajue rezultate, jo uvek postoji potreba za istraivanjem i pronalaenjem novih ili
unapreenjem ve postojeih metoda.

34
REFERENCE PREDTRETMAN

P.F.H. Harmsen, W.J.J. Huijgen, L.M. Bermdez Lpez, R.R.C. Bakker. Literature Review of
Physical and Chemical Pretreatment Processes for Lignocellulosic Biomass. Energy Research
Center of the Netherland. ECN report No ECN-E--10-013 Wageningen, 2010, Netherland.

Lin, S.Y. and I.S. Lin (2002): Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Sixth edition,
Wein-heim, Germany, Wiley-VCH.

Krassig, H. and J. Schurz (2002): Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Sixth edition,
Weinheim, Germany, Wiley-VCH.

Faulon, J., G.A. Carlson, et al. (1994): A three-dimensional model for lignocellulose from
gymno-spermous wood. Organic Geochemistry 21: 1169-1179.

R.Kumar, S. Singh, O.V. Singh, Bioconversion of lignocellulosic biomass: biochemical and

molecular perspectives. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. (2008) 35:377391

Steiner J, Saccha C, Enzyaguirre J (1993) Culture condition for enhanced cellulose production
by a native strain of Penicillium purpurogenum. World J Microbiol Biotechnol 10:280 284.

Van-Wyk JPH (1997) Cellulose adsorptiondesorption and cellulose sacchariWcation during

enzymatic hydrolysis of cellulose material. Biotech Lett 19:775778

Wojtczak G, Breuil C, Yamuda J, Saddler JN (1987) A comparision of the thermostability of

cellulose from various thermophilic fungi. Appl Miocrobiol Biotechnol 27:8287

Singh A, Abidi AB, Darmwal NS, Agrawal AK (1991) Influency of nutritional factors on
cellulose production from natural cellulosic residues by Aspergillus niger AS101. Agri Biol Res
7:1927

Menon K, Rao KK, Pushalkar S (1994) Production of -glucosidase by Penicillium rubrum O

stall. Indian J Exp Biol 32:706 709.

Pardo AG, Forchiassin F (1999) InXuence of temperature and pH on cellulase activity and
stability in Nectria catalinensis. Rev Argent Microbiol 31:3135.

Paul J, Verma A (1990) InXuence of sugars on endoglucanase and -xylanase of a bacillus strain.
Biotech Lett 22:6164.

X. Zhao, L. Zhang , D. Liu, Biomass recalcitrance. Part I: the chemical compositions and
physical structures affecting the enzymatic hydrolysis of lignocellulose. Biofuels Bioproducts
and Biorefining, 2012.

35
F.Hu, A. Ragauskas, Pretreatment and Lignocellulosic Chemistry. Bioenerg. Res. (2012)
5:10431066.

Hwei-Ting Tan, Kendall R. Corbin and Geoffrey B. Fincher. Emerging Technologies for the
Production of Renewable Liquid Transport Fuels from Biomass Sources Enriched in Plant Cell
Walls. Advanced Lignocellulosic Biofuel Production. 2016

P. Alvira, E. Toms-Pej, M. Ballesteros, M.J. Negro. Pretreatment technologies for an efficient

bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis: A review. Bioresource Technology
101 (2010) 48514861

M. Bhikhu,S. Gaurav, Lignocellulosic Material An Alternative Future Fuel Source

International Journal of Novel Research in Life Sciences, Vol. 2, Issue 4, pp: (69-79), 2015.

Y. Zheng, Z. Pan, R. Zhang.2009. Overview of biomass pretreatment for cellulosic ethanol

production. Int J Agric & Biol Eng Vol. 2 , No.3, p. 51.

Barros Rda R, Paredes Rde S, Endo T, Bon EP, Lee SH. Association of wet disk milling and
ozonolysis as pretreatment for enzymatic saccharification of sugarcane bagasse and straw.
Bioresour Technol. 2013; 136:288294.

Beccari, M.; Majone, M.; Papini, M.P.; Torrisi, L. Enhancement of anaerobic treatability of olive
oil mill effluents by addition of Ca (OH)2 and bentonite without intermediate solid/liquid
separation. Water Sci. Technol. 2001, 43, 275-282.

P. Bhaumik, P.L.Dhepe, 2016. Conversion of Biomass into Sugars RSC Green Chemistry No.
44, Chapter in: Biomass Sugars for Non-Fuel Applications. Eds. D. Murzin i O. Simakova.

Zhu et al , Comparative study of SPORL and dilute-acid pretreatments of spruce for cellulosic
ethanol production, Bioresource Technology, vol. 101, no. 9, pp. 31063114, 2010.

R.Ravindran, A.K. Jaiswal, 2015. A Comprehensive Review on Pre-treatment Strategy for

Lignocellulosic Food Industry Waste: Challenges and Opportunities, Bioresource Technology
(2015), doi: http://dx.doi.org/10.1016/j.biortech.2015.07.106

M. Balat. Production of bioethanol from lignocellulosic materials via the biochemical

pathway: A review. Energy Conversion and Management 52 (2011) 858875

Vicua, R. 2000. Ligninolysis. Mol. Biotechnol. 14(2), 173-176.

Jensen, K.A., Houtman, C.J., Ryan, Z.C., Hammel, K.E. 2001. Pathways for Extracellular Fenton
Chemistry in the Brown Rot Basidiomycete Gloeophyllum trabeum. Appl. Environ.
Microbiol. 67(6), 2705-2711.

36
Oliva-Taravilla, A., Moreno, A.D., Demuez, M., Ibarra, D., Toms-Pej, E., Gonzlez-
Fernndez, C., Ballesteros, M. 2015. Unraveling the effects of laccase treatment on
enzymatic hydrolysis of steam-exploded wheat straw. Bioresour. Technol. 175(0), 209-
215.

Brown, M. E., & Chang, M. C. (2014). Exploring bacterial lignin degradation. Curr. opin. in
chem. biol., 19, 1-7.

S.H.Mood, A.H. Golfeshan, M.Tabatabaei,G.S. Jouzani, G.H. Najafi, M. Gholami, M.Ardjmand,

Lignocellulosic biomass to bioethanol,a comprehensive review with a focus on pretreatment.
Renewable and Sustainable Energy Reviews 27 (2013) 7793.

S.Bhagwat, S. Ratnaparkh,A. Kumar. Biomass Pre-treatment Methods and Their Economic

Viability for Efficient Production of Biofuel. British Biotechnology Journal 8(2): 1-17, 2015,

Y. P.Timilsena. Effect of different pretreatment methods in combination with the organosolv

delignification process and enzymatic hydrolysability of three feedstocks in correlation with
lignin structure. PhD Thesis, May 2012, Asian Institute of Technology School of Environment,
Resources and Development, Thailand

X.Zhan, J. Ma, Z.Ji,G.H.Yang,X. Zhou,F. Xu, Using Confocal Raman Microscopy to Real-Time
Monitor Poplar Cell Wall Swelling and Dissolution During Ionic Liquid Pretreatment,
Microscopy Research and Technique 77:609618 (2014).

S.G.Wi, E.J. Cho, D.S. Lee, S. J. Lee, Y. J.Lee, H.J. Bae, Lignocellulose conversion for biofuel:
a new pretreatment greatly improves downstream biocatalytic hydrolysis of various
lignocellulosic materials, Biotechnol Biofuels (2015) 8:228.

D. P. Maury, A. Singla, S. Negi, An overview of key pretreatment processes for biological

conversion of lignocellulosic biomass to bioethanol. Biotech (2015) 5:597609

F.Hu, A. Ragauskas, Pretreatment and Lignocellulosic Chemistry. Bioenerg. Res. (2012) 5:1043
1066.

M.H.L.Silveira, A.R.C. Morais,A.M. da Costa Lopes,D.N.Olekszyszen,R. Bogel-ukasik, J.

Andreaus,L. P. Ramos. Current Pretreatment Technologies for the Development of Cellulosic
Ethanol and Biorefineries. ChemSusChem 2015, 8, 3366 3390

M.A.Kassim, H.P.S A. Khalil, N.A. Serri, M. H. M. Kassim, M.I.Syakir, N.A.S. Aprila, R.

Dungani, 2016.Chapter 13: Irradiation Pretreatment of Tropical Biomass and Biofiber for
Biofuel Production, in "Radiation Effects in Materials", Ed. W. A. Monteiro.

Pan, X. et al., Bioconversion of hybrid poplar to ethanol and co-products using an organosolv
fractionation process:optimization of process yelds. Biotechnol. Bioeng., 94, 851, 2006.

37
Singh et al., 2009, Bitechnol. Bioeng. 104, 68-75

38