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R$ 5,00 ano III nmero 17 novembro/dezembro de 2000

BIOTECNOLOGIA/KL3

REPETE FOTOLITO

2 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento


BIOTECNOLOGIA/KL3

REPETE FOTOLITO

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 3


Expedio Humboldt 2000
Entrevista concedida a
ENTREVISTA Lucas Tadeu Ferreira
Fotos: Juan Pratginests

Pesquisa cientfica na Amaznia do Caribe ao Atlntico

Partindo da experincia
acumulada pelos viajantes naturalistas
que percorreram a grande floresta
Amaznica nos sculos XVIII e XIX,
39 cientistas da Universidade de
Braslia UnB, da Universidad Simon
Bolvar, da Venezuela, e de outras
instituies de pesquisas brasileiras
realizaram ampla coleta de material e
informaes para o desenvolvimento
de pesquisas de ponta, contribuindo
assim, para o avano do conhecimen-
to cientfico no sculo XXI.
Defendendo os direitos dos
povos indgenas e da floresta, e
combatendo a biopirataria, os cientis-
Professor Csar na tas que participaram dessa expedio
biblioteca do barco percorreram aproximadamente 10.000
km em busca de novos conhecimen-
tos a partir dos achados amaznicos.
Assim, espera-se que os resultados da expedio proporcionem contribui-
es importantes para vrias reas do conhecimento humano, uma forma
inteligente que a comunidade cientfica encontrou para se vincular aos
problemas amaznicos contemporneos e, principalmente, na busca de
solues.
Para falar um pouco dessa aventura Humboldt 2000, o professor de
microbiologia da Universidade de Braslia - UnB -, Csar Martins de S, que
foi um dos principais coordenadores da Expedio, concedeu esta entrevis-
ta a Lucas Tadeu Ferreira para a revista BIOTECNOLOGIA Cincia &
Desenvolvimento.
O professor Csar Martins graduado em biologia e mestre em
biologia molecular pela UnB. Fez doutorado em Paris, no Instituto Jacques
Monod da Universidade de Paris VII. Voltou ao Brasil em 1989; foi contra-
tado e professor do Departamento de Biologia Celular da UnB. Recente-
mente fez Ps-Doutoramento em San Diego, Califrnia, na rea de biologia
molecular de cncer.

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BC&D - Quais foram os princi- escolha e quantos
pais objetivos da Expedio Hum- pesquisadores bra-
boldt -Amaznia 2000? sileiros e venezue-
lanos integraram a
Csar Martins Primeiramente, gos- expedio Hum-
taria de explicar um pouco o porqu boldt 2000 Ama-
da escolha do nome Humboldt para znia?
nossa Expedio. Alexander Von
Humboldt, de origem alem, foi um Csar Martins A
dos maiores cientistas de sua poca. escolha privilegiou
Em meados de 1799, juntamente cientistas brasileiros.
com seu amigo botnico, o francs Ns comeamos a Equipe trabalhando na
Aim Bonpland, chegou Amrica desenhar a expedio h dois anos biblioteca do barco
Latina, no delta do rio Orinoco, na e como amos fazer um percurso
Venezuela. Os dois cientistas tinham dentro da Venezuela, que a parte
como objetivo estudar a Amaznia do rio Orinoco, fizemos contato
atravs de seus rios. Acreditavam com professores da Universidade
que, subindo o rio Orinoco e pas- Simon Bolvar, em Caracas. Nessa
sando pelo canal do Cassiquiare, parte, a expedio ficou sendo bina-
que liga a bacia do Orinoco bacia cional. Participaram quatro profes-
do Rio Negro, poderiam chegar a sores venezuelanos, que foram es-
Belm, no Brasil. O problema que colhidos por eles mesmos. Essa equi-
Humboldt, quando chegou fron-
teira do Brasil, foi impedido de en-
trar no pas. Naquela poca, o Brasil ...seguramente, tm achados
era colnia portuguesa e ele ficou
biolgicos que pela primeira vez
uns dois meses na fronteira aguar-
dando um visto de entrada. Acabou sero descritos e identificados.
sendo impedido, pois os portugue- Encontramos, por exemplo, um
ses pensaram que ele era um espio microrganismo luminescente.
espanhol. Dessa forma, a Amaznia
Brasileira deixou de ser estudada
Bioluminescncia tem sido
pelo grande sbio. Assim, a nossa muito utilizada em biologia,
expedio, homenageando Humbol- medicina e agricultura como Flor de guaran
dt, faz um resgate histrico: - duzen- rastreadores moleculares
tos anos depois, fizemos o mesmo
percurso que ele fez na Venezuela e, geraes que esto vindo conhece-
principalmente, o percurso que ele pe deixou a expedio na fronteira ram um pouco da Amaznia. Parti-
no fez, no Brasil, que era chegar a com o Brasil. Do nosso lado adota- ciparam 39 cientistas ao longo de
Belm atravs dos rios. Tendo como mos alguns critrios de seleo: pri- toda a expedio. Nem todos pude-
patrono Humboldt, a expedio meiro, os cientistas deveriam ter ram ficar os 65 dias corridos. En-
obrigatoriamente deveria ser uma disponibilidade de longos perodos quanto um grupo viajava, outros
expedio cientfica multidisciplinar, de tempo, j que a expedio durou iam entrando e saindo em diferentes
pois Humboldt era um cientista uni- 65 dias. Segundo, esses pesquisado- percursos.
versal: gegrafo, astrnomo e com res deveriam ter um certo conheci-
grande conhecimento em muitas ou- mento do que era uma navegao e BC&D - Quais os principais tre-
tras reas da cincia. Nossa expedi- convivncia dentro de um barco chos percorridos na Amaznia
o teve como objetivo principal com espao reduzido. Terceiro, o brasileira e venezuelana?
contribuir para o desenvolvimento critrio cientifico, que a escolha de
de pesquisas voltadas para assegu- especialistas em diferentes reas. Csar Martins O incio da expe-
rar o futuro da Amaznia. Levamos muitos pesquisadores jo- dio foi no dia 1 de setembro de
vens, inclusive estudantes, porque 2000. Partimos de Braslia por avio
BC&D - Qual foi o critrio de achamos muito importante para as at Manaus. Da, com destino a

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Ciudad Guayana no baixo trio do Meio Ambiente, atra-
Orinoco Venezuelano. Esse vs da Secretaria da Amaz-
percurso foi feito por terra, nia; o Banco do Brasil, atra-
atravessando o estado de vs da BB-Tour, que nos for-
Roraima, a serra de Pacara- neceu as passagens areas.
ima e as savanas venezuela- O WWF, que financiou toda
nas. De Ciudad Guayana a a parte de fotografia e a Fun-
Puerto Ayacucho, a viagem dao Universitria de Brasi-
foi feita de barco. O segun- lia-FUBRA . Contamos tam-
do trecho foi feito de Puerto bm com o apoio do Exrci-
Ayacucho s cidades de Es- to Brasileiro atravs do 5
meralda e San Carlos del Rio Batalho de Infantaria de Sel-
Negro no Cassiquiare, e Parte da equipe Humboldt e o va, que nos alojou em So
Cucu, j na fronteira com o Brasil. apoio dos militares do 5 Bis Gabriel da Cachoeira e o Governo
Ns tivemos alguns problemas de do Amap, que forneceu veculo e o
segurana na travessia desse trecho alojamento em Oiapoque.
por causa do recrudescimento da por quatro estados brasileiros: Rora-
guerrilha na fronteira com a Colm- ima, Amazonas, Par e o Amap. BC&D - Que reas do conheci-
bia e assim tivemos que percorr-lo Nossa expedio percorreu quase mento humano foram explora-
em helicptero da fora area vene- 10.000 km na Amaznia. das e investigadas na expedio?
zuelana. O terceiro trecho compre-
endeu a descida, de barco, pelo rio BC&D - Quem coordenou, quan- Csar Martins A expedio con-
Negro at Manaus, com escala de 10 to custou e quais foram as insti- tou com quatro microbiologistas,
dias em So Gabriel da Cachoeira. tuies que financiaram a expe- especialistas em ornitologia (pssa-
Naquela cidade as atividades foram dio? ros), botnicos, mastozoologia, sa-
intensas graas ao apoio do Exrcito de pblica, hidrologia, antroplo-
Brasileiro. Parte da equipe subiu o Csar Martins A expedio foi gos, indigenistas e historiadores.O
rio Uaups at Iauaret prximo organizada pelo Ncleo de Estudos restante da expedio era composta
fronteira colombiana; outra foi ao Amaznicos da UnB e coordenada de uma equipe de cinegrafia, foto-
morro dos Seis Lagos, prximo do por mim e pelo historiador profes- grafia e documentao; ao todo, a
parque do Pico da Neblina e outra sor Vtor Leonardi, especialista em expedio contemplou 14 reas es-
parte permaneceu pesquisando em histria da Amaznia. Foi difcil le- pecficas do conhecimento.
So Gabriel da Cachoeira. O quarto vantar todo o recurso necessrio e
trecho foi de Manaus a Santarm, tivemos de fazer muitos cortes. Ao BC&D - Poderia descrever, sucin-
passando pela foz do rio Nhamund, todo ficou em torno de R$ 180.000,00. tamente, os principais achados
pelo Paran do Ramos, baixo Trom- O principal financiador foi o Minis- que, potencialmente, permitem
betas e subimos o Tapajs at For-
dlndia e outros. O quinto trecho da
expedio desceu o rio Amazonas,
passando pelo rio Xingu e pelas
cidades de Monte Alegre, Prainha,
Almerim, Laranjal do Jari, Santana e
chegou a Macap. No Amap, fomos
por terra at o rio Oiapoque, no
extremo norte do Brasil. De l, al-
guns pesquisadores seguiram ao
norte at a foz do rio Oiapoque para
pesquisa de microrganismos marti-
mos. A equipe de hidrlogos tam-
bm fez medies importantes de
vazo e sedimentos no Estreito de
bidos e na foz do Amazonas. De Equipe Humboldt
navegando pelo Rio Tapajs
Macap, fomos at Belm. Passamos

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aprofundar os conheci- desse contexto, eu vejo gran-
mentos sobre a floresta de chance de sucesso. Os mi-
Amaznica? crorganismos foram coletados
no solo amaznico, onde a
Csar Martins Na rea da degradao da biomassa se d
biologia, realizamos muitos le- de forma intensa e natural.
vantamentos e coletas ao lon- Assim, seguramente esses mi-
go de nosso percurso. Todo croorganismos podem tam-
esse material ser agora pro- bm ser utilizados na degra-
cessado pelos pesquisadores dao da biomassa originria,
em suas respectivas unidades por exemplo, do bagao da
de trabalho. Dizer atualmente cana-de-acar, do farelo de
Extrao e transporte de madeira
que vamos ter descobertas novas na arroz, entre muitos outros, cujos
na Amaznia
rea de biologia, em funo do que produtos de hidrlise podem ser
foi coletado, ainda um pouco achado de um organismo lumi- utilizados na agroindstria. Por ou-
prematuro. Precisamos de muitas nescente. De que forma a carac- tro lado, a bioluminescncia encon-
anlises de laboratrio e anos de terstica deste microrganismo trada de longe a mais fascinante.
estudos para isso; mas, seguramen- poder vir a ter, potencialmente, Para se ter uma idia de sua impor-
te, tm achados biolgicos que pela alguma aplicao prtica? tncia basta verificarmos, na literatu-
primeira vez sero descritos e iden- ra especializada, as revolucionrias
tificados. Encontramos, por exem- aplicaes, por exemplo, do sistema
plo, um microrganismo luminescen-
Por que coletar recursos luciferase isolado do vagalume e da
te que eu no sei ainda sua natureza. biolgicos da Amaznia para GFP (Green Fluorecent Protein) iso-
Bioluminescncia tem sido muito pesquisar no exterior? Por que lada de jelyfish. preciso, contudo,
utilizada em biologia, medicina e no fazer tudo isso aqui dentro estudar muito bem esse potencial,
agricultura como rastreadores mole- que muito expressivo.
culares. Esse achado muito pro-
do nosso prprio pas ou com
missor. Na parte de cincias huma- as nossas universidades e BC&D - Quem sero os detento-
nas e sade, os pesquisadores visita- empresas, ou instalando labora- res do conhecimento e dos acha-
ram Instituies Pblicas de vrios trios, tal como se instalam dos nessa expedio e como se
municpios, pesquisaram arquivos, dar a distribuio do que foi
gravaram muitas entrevistas com ci- empresas multinacionais? encontrado?
entistas da regio, lideranas indge-
nas e de populaes ribeirinhas. Csar Martins Assim que come-
Certamente, o conhecimento exis- Csar Martins O nosso interesse armos a isolar e a classificar, todo o
tente sobre a Amaznia vai ser am- est na utilizao desses microrga- material coletado estar disponvel
pliado a partir dessa expedio. Um nismos em biotecnologia. Dentro para quem quiser e, naturalmente,
fato interessante ocorrido solicitar. Os estudos e as
na regio do Paran do pesquisas sero realizadas
Ramos, foi a descoberta pela nas universidades brasilei-
equipe de arquelogos do ras, e assim que comear-
Museu Amaznico de um mos a conhecer o que co-
sitio arqueolgico, at ago- letamos, tudo ser disponi-
ra desconhecido. Tudo in- bilizado pelas medidas le-
dica que aquele stio fora gais. importante enfatizar
habitado por uma socieda- que no existe nenhum de-
de estvel e bem estrutura- tentor especfico dos acha-
da h, pelo menos, dois mil dos e tudo ser amplamen-
anos. Trata-se de uma des- te publicado.
coberta indita que ser co-
municada ao IPHAN. BC&D - A Conveno da
Diversidade Biolgica es-
Ruinas do velho Airo, cidade
BC&D O Senhor mencionou o do alto Rio Negro tabelece que a diversidade biol-

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descritos por grandes viajantes ex-
Equipe Humboldt pedicionrios e historiadores. Como
navegando pelo Rio Tapajs garantir, por exemplo a propriedade
intelectual deste conhecimento? Ago-
ra, com a demarcao de suas terras,
a explorao dos recursos biolgi-
cos das reas que ocupam fica muito
mais fcil. fazer parcerias e contra-
tos entre as partes. Estou convicto de
que no seremos bem sucedidos se
no fizermos parceria entre esses
povos e os pesquisadores e/ou Ins-
tituies envolvidas na explorao
dos recursos biolgicos.

BC&D - Recentemente, a impren-


gica deve trazer benefcios para exercer a nossa verdadeira autono- sa denunciou um acordo fir-
a humanidade e reconhece ain- mia. mado entre a Organizao No-
da a soberania dos Estados no Governamental Bioamaznia e a
uso e disponibilidade dos recur- BC&D - Como garantir a partici- multinacional NOVARTIS para a
sos biolgicos encontrados em pao das comunidades locais e explorao dos recursos biolgi-
seus territrios. Como conciliar dos povos indgenas nas deci- cos da Amaznia. Qual a sua opi-
ento os interesses do Brasil com ses que tenham por objetivo o nio a respeito de eventos dessa
o dos outros pases quanto ao acesso e a explorao dos recur- natureza?
uso da sua biodiversidade? sos biolgicos das reas que ocu-
pam? Csar Martins Est a; esses mal
Csar Martins Esse tema pouco entendidos ocorrem. Na minha opi-
entendido, haja visto os vrios pro- nio, esses acordos tm de ser clara-
jetos de lei e medida provisria que No se combate a biopirataria mente definidos para preservar os
tramitam no Congresso. Eu tenho nossos interesses. Por que coletar
uma viso bastante pragmtica a somente com a criao de Leis, recursos biolgicos da Amaznia
respeito da autonomia da nossa bi- com as foras armadas, a polcia para pesquisar no exterior? Por que
odiversidade. Na minha opinio, federal e outros instrumentos de no fazer tudo isso aqui dentro do
quem detm a autonomia da nossa nosso prprio pas ou com as nossas
fora. A melhor forma de
biodiversidade o Estado Brasileiro; universidades e empresas, ou insta-
mas os conhecimentos dela gerados combat-la com cincia lando laboratrios, tal como se ins-
e de seu uso pertencem humanida- talam empresas multinacionais? Des-
de. s aplicar a Conveno. Entre- sa forma, criaramos empregos e
tanto, isto tem gerado muito mal- principalmente, garantiramos a for-
entendido, principalmente com res- Csar Martins As terras indge- mao de recursos humanos qualifi-
peito biopirataria. Biopirataria nas, em alguns estados brasileiros, cados, inclusive, para a prpria re-
uma atividade ilcita praticada em como por exemplo, no Amap, es- gio. Depois, s dividir os lucros.
larga escala e, como tal, tem de ser to praticamente todas demarcadas. Para o amplo conhecimento da di-
combatida. Mas como combat-la? O processo de demarcao de terras versidade biolgica da Amaznia
No se combate a biopirataria so- em outros estados tem evoludo preciso fazer parcerias e estimular os
mente com a criao de Leis, com as atravs de muitas lutas. Mas, o co- envolvidos a investirem na forma-
foras armadas, a polcia federal e nhecimento existente dos recursos o de recursos humanos. Que se
outros instrumentos de fora. A me- biolgicos , ainda no. Em alguns instalem indstrias e laboratrios den-
lhor forma de combat-la com casos, principalmente o uso fitoter- tro da Amaznia. Desta forma, sim,
cincia. A biodiversidade brasileira pico de algumas plantas, , h mui- pode vir todo mundo.
tem que ser preservada e estudada tos anos, de pleno domnio dos
ao mesmo tempo. Atravs do co- povos da floresta, mas pouco publi- E-mail do Prof. Csar:
nhecimento cientfico que vamos cado. Voc encontra alguns relatos sasa@unb.br

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8 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
PORTAL
WWW.BIOTECNOLOGIA.COM.BR
(Repete fotolito)
Obs.: Saiu na pgina 9 da edio anterior (n16)

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 9


Carta ao Leitor

Nessa edio entrevistamos o Professor Csar


Martins de S, da Universidade de Braslia, e um
dos principais coordenadores da Expedio
Humboldt 2000.

BIOTECNOLOGIA Cincia & Desenvolvimento Gostaria de destacar aqui a brilhante iniciativa


KL3 Publicaes desse projeto que, nos dias de hoje, da mais alta
importncia para Brasil, j que o objetivo princi-
Fundador
Henrique da Silva Castro pal a busca de novos achados que proporci-
Direo Geral e Edio onem novos conhecimentos, muito importante
Ana Lcia de Almeida para as mais diversas reas. Vrias expedies
Diretor de Arte como essa j poderiam e deveriam estar sendo
Henrique S. Castro F feitas por todo o Pas, por brasileiros, para asse-

Departamento Comercial, gurar a nossa autonomia sobre o patrimnio


Redao e Edio: gentico do Brasil, e com isso combatendo,
inclusive, a biopirataria.

SRTV/Sul - Quadra 701


Acreditamos que a partir de agora o governo
Ed. Palcio do Rdio II
Sala 215 - CEP 70340-902 federal dever, a exemplo dessa importante expe-
Braslia - DF dio, promover e incentivar outras expedies
Tel.: (061) 225-1512 (061) 225-0976
dessa envergadura, uma vez que, apoiando pro-
Fax: (061) 224-2830
jetos como esse, sem dvida nenhuma uma das
E-mail
kl3@biotecnologia.com.br melhores formas de proteger nosso patrimnio
gentico.
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Dr. Henrique da Silva Castro

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ISSN 1414-4522

10 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento


Conselho Cientfico Colaboraram nesta edio:
Dr. Aluzio Borm - Gentica e Melhoramento Vegetal
Dr. Henrique da Silva Castro - Sade; Adilson Leite
Dr. Maao Tadano - Agricultura; Alba Chiesse da Silva
Dr. Naftale Katz - Sade; Alosio da Silva Pinto
Dr. Pedro Juberg - Cincias;
Andra Almeida Carneiro
Dr. Srgio Costa Oliveira - Imunologia e Vacinas;
Dr. Vasco Ariston de Carvalho Azevedo - Gentica de Microorganismos;
Carlos Bloch Jnior
Dr. William Gerson Matias - Toxicologia Ambiental. Cludia Teixeira Guimres
Denise Silvina Piccini Quintas Horton
Conselho Brasileiro de Fitossanidade - Cobrafi dila de Resende Von Pinho
Dr. Ivan Rud de Moraes - Toxicologia; Edilson Paiva
Dr. Lus Carlos Bhering Nasser - Fitopatologia Edson Luis Kemper
Eliane Namie Miyaji
Conselho Federal de Biologia
Eneida Abreu Parizotto
Dr. Joo de Deus Medeiros
Ivan Pereira Nascimento
Fundao Dalmo Catauli Giacometti Letcia Jungmann
Dr. Eugen Silvano Gander - Engenharia Gentica; Luciana Cezar de Cerqueira Leite
Dr. Jos Manuel Cabral de Sousa Dias - Controle Biolgico; Magda Aparecida de Lima
Dra. Marisa de Goes - Recursos Genticos Maria das Graas Guimares Carvalho Vieira
Maria Laene Moreira de Carvalho
Instituto de Pesquisas Energticas e Nucleares - IPEN Maura Vianna Prates
Dr. Jos Roberto Rogero
Newton Portilho Carneiro
Paulo Cezar De Lucca
Renato MAtos Lopes
Rogrio Pietro Mazzantini
Tnia Toledo de Oliveira
Tanus Jorge Nagem
Waldely Oliveira Dias

Entrevista
Csar Martins de S pg. 04

Pesquisa
Plantas como Biorreatores pg. 12
Flavonides pg. 18
Peptdeos Antimicrobianos pg. 30
Emisso de gases de efeito estufa pg. 38
Tcnicas moleculares em sementes pg. 44
Desvendando o cdigo gentico pg. 50

Sade
Vacinas de BCG Recombinante - DTP pg. 24

BioNotcias
pg. 48

Seo de Cartas pg. 59


Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 11
Plantas como

PESQUISA
Biorreatores
Utilizao de plantas transgnicas como reatores biolgicos para produo de protenas
Fotos cedidas pelos autores

desenvolvimento de plan- Pen, 1995; Hood & Jilka, 1999).


tas transgnicas com no-
vas caractersticas consi- Por que usar plantas
derado uma das mais im- como biorreatores?
portantes aplicaes da
tecnologia do DNA recombinante. Atra- As plantas apresentam vantagens
vs dessa tcnica, as plantas podem ser em potencial em relao aos sistemas
geneticamente modificadas, basicamen- baseados em fermentao microbiana,
te com duas finalidades: a) melhora- clulas animais e animais transgnicos.
mento de suas caractersticas agron- Protenas heterlogas expressas em
micas e qualidades nutricionais; b) uso bactrias geralmente retm o resduo
das plantas como reatores biolgicos de metionina, derivado do sistema de
para a produo de biomolculas. traduo, na sua extremidade amino-
Inicialmente, as plantas transgni- terminal. Nas protenas expressas em
cas visavam apenas ao melhoramento eucariotos, entretanto, essa metionina
agronmico por meio da introduo geralmente faz parte de sinais de ende-
de genes capazes de conferir resistn- reamento especficos, que so retira-
cia a herbicidas e a ataques de insetos dos quando essas protenas so intro-
e microorganismos. Atualmente, as duzidas no compartimento celular para
plantas transgnicas esto sendo tam- o qual foram endereadas.
bm exploradas para o desenvolvi- Alm disso, a fermentao bacteri-
Eneida Abreu Parizotto mento de alimentos que apresentem ana freqentemente resulta na produ-
Doutoranda em Gentica e Biologia
Molecular (UNICAMP) contedo balanceado de aminocidos, o de agregados insolveis, e so
eapariz@unicamp.br ou ainda que sejam enriquecidos em necessrios gastos significativos para
leos insaturados e vitaminas (Gander solubilizar esses agregados e recuperar
Paulo Cezar De Lucca & Marcellino, 1997; Binsfeld, 2000; a estrutura da protena nativa. Por
Doutorando em Gentica e Biologia
Molecular (UNICAMP) Carneiro et al., 2000). outro lado, o processo de fermentao
pdelucca@unicamp.br As plantas, assim como os animais em si requer grandes investimentos de
transgnicos, podem ser empregadas capital.
Letcia Jungmann
Mestranda em Gentica e Biologia
como biorreatores para a produo de Ao contrrio dos sistemas bacteria-
Molecular (UNICAMP) protenas, carboidratos e lipdios em nos de expresso de protenas, os
jungmann@unicamp.br larga escala. Adicionalmente, altera- sistemas eucariticos permitem o pro-
es genticas que determinam modi- cessamento e a modificao dos pro-
Edson Luis Kemper
ficaes em vias metablicas das plan- dutos. O sistema de expresso eucari-
Doutor em Gentica (UNICAMP)
tas podem ser empregadas na produ- tico mais antigo e mais utilizado ba-
Alba Chiesse da Silva o de polmeros ou compostos org- seia-se na utilizao de leveduras, sen-
Doutora em Cincias Biolgicas nicos de baixo peso molecular. O do as espcies Saccharomyces cerevi-
(UFSCar)
Ps-doc do Centro de Biologia
nmero de compostos produzidos por sae e Pichia pastoris as mais utilizadas
Molecular e Engenharia Gentica meio dessas abordagens tem aumenta- (Torres & Moraes, 2000). Esses siste-
(CBMEG, UNICAMP) do consideravelmente, sendo que a mas so to econmicos quanto os
chiesse@unicamp.br
viabilidade do uso das plantas como bacterianos, mas as protenas sintetiza-
Adilson Leite biorreatores j foi demonstrada para a das so freqentemente hiperglicosila-
Doutor em Bioqumica produo de carboidratos, cidos gra- das e, quando produzidas em altos
Pesquisador do Centro de Biologia xos, polipeptdios utilizados como fr- nveis, so instveis e insolveis.
Molecular e Engenharia Gentica
(CBMEG, UNICAMP) macos, enzimas de uso industrial e Outros sistemas eucariticos utili-
aleite@unicamp.br plsticos biodegradveis (Goddijn & zados para a produo de protenas

12 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento


heterlogas so as culturas de clulas
de insetos e de mamferos infectadas
por vrus recombinantes. Esses vrus
apresentam o gene que codifica a
protena de interesse controlado por
um potente promotor viral (Fraser,
1992). Esses sistemas so capazes de
secretar protenas corretamente eno-
veladas e podem promover modifica-
es ps-traducionais. Por outro lado,
tm como desvantagens o requerimen-
to de meios de cultura complexos, de
condies especiais para a manuten-
o das clulas, e de reatores sofistica-
dos, que encarecem bastante o proces-
so.
Animais transgnicos tambm po-
dem ser utilizados para a expresso de
protenas heterlogas em larga escala.
Um dos sistemas descritos baseia-se na
secreo de protenas heterlogas no
Figura 1: Representao esquemtica das diferentes estratgias
leite de caprinos, ovinos e bovinos.
utilizadas na produo de protenas heterlogas em plantas.
Nesse sistema, a expresso da protena
Do lado esquerdo, esto representadas as etapas envolvidas na
de interesse controlada por promoto-
res que atuam nas clulas de glndulas produo de protenas heterlogas em plantas pelo emprego de vrus
mamrias. Devido limitao da pro- carreadores. O gene que codifica a protena de interesse inserido em
duo em fmeas em fase de lactao, um vetor viral que utilizado na infeco de plantas. Aps o
mtodos alternativos tm sido propos- desenvolvimento das plantas, os tecidos infectados so utilizados como
tos, nos quais a protena heterloga fonte para extrao de vrus recombinantes. Os extratos virais podem
secretada na urina (Kerr et al., 1998) ou ser utilizados para a amplificao da produo, atravs da infeco de
no fluido seminal (Dyck et al., 1999) de novas plantas. Do lado direito, esto representadas as etapas envolvidas
animais transgnicos. Os sistemas ba- na produo de protenas heterlogas em plantas transgnicas e
seados em animais transgnicos so, transplastmicas. O gene que codifica a protena de interesse inserido
no entanto, mais caros que os sistemas em um vetor de transformao apropriado. Alm do gene de interesse,
baseados em plantas, e a aceitao do geralmente inserido tambm um gene seletivo, codificador de uma
produto por parte do pblico consumi- protena que confere resistncia a um antibitico ou a um herbicida. A
dor menor quando este tem origem integrao simultnea dos dois genes limitar o desenvolvimento de
animal. clulas no transformadas, durante a etapa de seleo. A partir do tecido
As plantas apresentam vias de mo- selecionado, so regeneradas plantas nas quais a integrao do gene de
dificao e processamento ps-tradu- interesse avaliada por meio da tcnica de PCR e de hibridao com
cionais, e os custos da produo de sondas especficas. A presena do produto de expresso do gene de
protenas heterlogas em plantas ge- interesse investigada atravs de testes bioqumicos e imunoensaios
ralmente so menores que os dos de- com anticorpos especficos. Essas anlises permitem a seleo das
mais sistemas. Por essas razes, o uso
linhagens que apresentam maior rendimento, que sero multiplicadas
de plantas como biorreatores para a
e utilizadas no desenvolvimento de mtodos de extrao e purificao,
produo de protenas heterlogas est-
e subseqente caracterizao estrutural e funcional da protena heter-
se tornando economicamente impor-
loga.
tante. A avidina, glicoprotena encon-
trada em ovos de aves, rpteis e anfbi-
os, e utilizada na produo de reagen- produo de protenas heterlogas em na heterloga. A expresso desse gene
tes para imunoensaios, constitui a pri- plantas. Uma delas baseia-se na utiliza- transitria, pois ele no integrado
meira protena heterloga produzida o de vrus contendo RNA simples ao genoma da planta. Esta, por sua vez,
em plantas j comercializada (Sigma) fita, que ocorrem naturalmente nas funciona como um veculo para a am-
(Hood et al., 1997). plantas. O gene que codifica a protena plificao das partculas virais (Fig. 1).
de interesse inserido no genoma do A protena recombinante recuperada
As diferentes estratgias utiliza- vrus, geralmente fusionado regio atravs do processamento da protena
das para a produo de protenas estrutural de um gene que codifica da capa viral, que purificada a partir
heterlogas em plantas uma protena da capa viral. Depois de de extratos dos tecidos infectados. Op-
infectar a planta, o vrus promove sua cionalmente, as partculas virais qui-
Basicamente, duas diferentes estra- replicao e a expresso de seus genes mricas purificadas podem ser utiliza-
tgias podem ser utilizadas para a incluindo o gene que codifica a prote- das diretamente na formulao de va

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 13


cinas orais e nasais que os corpsculos lipdi-
(Beachy et al., 1996). cos e as protenas associa-
A segunda estrat- das, devido sua baixa
gia consiste em intro- densidade, so facilmente
duzir o gene que codi- purificados por flotao
fica a protena de inte- aps centrifugao em
resse no genoma da baixa rotao.
planta por meio de tc- A secreo de prote-
nicas de transformao, nas heterlogas em exsu-
envolvendo, portanto, datos de razes, a rizose-
a obteno de plantas creo, constitui outro sis-
transgnicas. O desen- tema especial de endere-
volvimento de uma amento. Borisjuk et al.
srie de tcnicas de (1999) demonstraram a
transformao permi- eficincia desse sistema
tiu a obteno de plan- atravs da expresso de
tas transgnicas da mai- altos nveis da protena
oria das plantas culti- verde fluorescente de gua
vadas. Descries de- viva (GFP), da fosfatase
talhadas das tcnicas alcalina de placenta hu-
mais utilizadas podem mana, e de uma xilanase
ser encontradas em bacteriana. Os sistemas de
Brasileiro & Carneiro rizosecreo permitem o
(1998). A integrao desenvolvimento de pro-
estvel permite a ex- cessos de produo base-
presso permanente do ados em cultivo hidrop-
gene e sua transfern- Figura 2: Comparao da tecido-especificidade dos pro- nico e cultura in vitro de
cia prognie da plan- motores PCaMV e PGKaf. razes de plantas transg-
ta transformada (Fig. Para a realizao desse ensaio foram construdos plasmdios nicas. Culturas de razes
1). Enquanto a estrat- onde os promotores do gene que codifica o transcrito 35S do so especialmente teis
gia mediada por vrus vrus do mosaico da couve flor (PCaMV) e do gene que codifica para a obteno de produ-
determina geralmente a -kafirina (protena de reserva de sorgo) controlam a tos naturais cujas fontes
a expresso apenas em expresso do gene reprter codificador da -glicoronidase so plantas difceis de cul-
folhas, a integrao (GUS). Sementes de milho seccionadas longitudinalmente tivar ou que esto em pro-
permanente apresenta foram bombardeadas com os plasmdios e, aps 48 horas, a cesso de extino (Shanks
maior versatilidade, atividade enzimtica de GUS foi revelada com a adio do & Morgan, 1999). A fitor-
permitindo que a ex- substrato 5-bromo-4-cloro-3-indolil--D-glicorondio (Xgluc). remediao de solo e gua
presso seja direciona- Os pontos azuis, indicativos da atividade de GUS, aparecem representa outra importan-
da para os diversos te e promissora aplicao
nos diversos compartimentos da semente (EB, embrio; EN,
rgos, tecidos e com- para os sistemas de rizose-
endosperma; P, pericarpo) bombardeada pelo plasmdio que
partimentos das plan- creo.
apresenta o promotor P35SCaMV (imagem da esquerda),
tas. As protenas heterlo-
A orientao da enquanto que na semente bombardeada com a construo gas podem ainda ser pro-
expresso para os di- contendo o promotor PGKaf, os pontos azuis so observados duzidas em cloroplastos
versos compartimentos apenas na regio do endosperma (imagem da direita). O de plantas, transformadas
das plantas transgni- ensaio demonstra que, ao contrrio do promotor P35SCaMV, atravs da introduo dos
cas realizada atravs o promotor PGKaf apresenta tecido-especificidade, sendo genes codificadores das
da utilizao de pro- ativo apenas no endosperma. protenas de interesse no
motores tecido-espec- prprio DNA do cloroplas-
ficos e de sinais de to, por meio de tcnicas
direcionamento intracelulares. Essa ca- estratgia foi utilizada na produo de de biobalstica e posterior integrao
pacidade tem sido explorada no de- encefalina inserida na albumina 2S de por recombinao homloga (Fig. 1).
senvolvimento de sistemas de produ- Arabidopsis thaliana (Vandekerckho- Para diferenciar essas plantas das plan-
o capazes de simplificar o armazena- ve et al., 1989), e do anticoagulante tas transgnicas com modificaes no
mento do material colhido e os proces- hirudina inserido em oleosina (Par- DNA nuclear, as plantas assim obtidas
sos de extrao e purificao das pro- menter et al., 1995). Os sinais presentes so denominadas de transplastmicas.
tenas recombinantes. Alguns sistemas nas protenas 2S e oleosina endeream O grande nmero de cloroplastos pre-
baseiam-se na insero do polipept- a expresso das protenas recombinan- sentes nas clulas das folhas (aproxi-
dio em protenas carreadoras. O direci- tes para corpsculos proticos e lipdi- madamente 100 por clula) determina
onamento da protena sintetizada, nes- cos de sementes, respectivamente. A grande amplificao gnica, podendo
se caso, realizado pelo peptdio sinal grande vantagem do sistema baseado resultar em altos rendimentos na pro-
presente na protena carreadora. Essa no uso de oleosinas reside no fato de duo da protena recombinante. A
14 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
Figura 3: Expresso de hGH em tabaco transgnico.
(A) Representao esquemtica do cassete utilizado na expresso do
hGH. O esquema mostra a regio que codifica o hGH, modificado atravs
da substituio do peptdio sinal natural por um peptdio equivalente
originrio de uma protena de reserva de planta. A expresso do gene
modificado regulada pelo promotor PGKaf e pelo sinal e stio de
poliadenilao do transcrito 35S do vrus do mosaico da couve flor
(335S). (B) Western blot de extratos proticos de diferentes tecidos de
tabaco transgnico. Amostras de extratos dos tecidos indicados, contendo
50 g de protena solvel, foram submetidas a eletroforese em gel de
poliacrilamida 14% na presena de dodecil sulfato de sdio (SDS). Aps
a eletroforese, as protenas foram transferidas para a membrana, onde a
presena de hGH foi revelada pela utilizao de anticorpo especfico. Para
indicar a posio da migrao do hGH, foram utilizados 50 ng de Saizen,
hGH comercial da Serono. A presena de banda indicadora de hGH
apenas no extrato de semente confirma a tecido-especificidade nesse
sistema de produo do hormnio recombinante. (C) Western blot de
extrato protico obtido a partir de sementes de milho transgnico. O
rendimento na produo de hGH recombinante (0,6% da protena
solvel) foi estimado pela comparao das quantidades do hormnio
presentes em diferentes alquotas do extrato de semente com diferentes
quantidades do hGH padro (Saizen). O extrato foi preparado a partir de
100 mg de farinha de sementes maduras em 1,0 ml de tampo de extrao.

transformao de cloroplastos apresenta nativa para processos, muitas vezes lidade de administrao, uma vez que
ainda vantagem em relao conteno caros e que nem sempre so capazes dispensariam todos os recursos neces-
biolgica, posto que o genoma plastidial de suprir a demanda desses produtos. srios para a produo e distribuio
raramente transmitido via plen. Re- Vandekerckhove et al. (1989) realiza- das vacinas (Langridge, 2000). Buscan-
centemente, Staub et al. (2000) descreve- ram um dos trabalhos pioneiros nesse do demonstrar que protenas produzi-
ram a obteno de rendimentos superio- ramo, onde o neuropeptdio leu-ence- das em plantas transgnicas so capa-
res a 7% da protena total solvel para a falina (um analgsico opiide) foi pro- zes de induzir resposta imune nos
produo de hormnio de crescimento duzido em Brassica napus (canola), animais, Mason et al. (1992) introduzi-
humano (hGH) em cloroplastos de taba- como parte de uma protena de reser- ram, em tabaco, o gene codificador da
co. Entretanto, grande parte do hGH va da semente, a albumina 2S. Outras protena de superfcie do vrus da he-
recombinante produzido apresentou um protenas usadas como frmacos j patite B (HBV), ligado a um promotor
resduo do aminocido prolina na regio foram sintetizadas em plantas, como o constitutivo. Imunoensaios revelaram
N-terminal no lugar do resduo de fenila- fator de crescimento epidrmico, eri- a presena da protena viral em extra-
lanina presente na mesma regio do tropoietina, interferon, protena C hu- tos das folhas transformadas, indican-
hormnio natural. Esse resultado indica mana, glucocerebrosidase, entre ou- do a viabilidade da expresso de ant-
que a estratgia utilizada no processa- tras (Goddijn & Pen, 1995; Cramer et genos exgenos em plantas para uso
mento, catalisado pela protease especfi- al., 1996). em vacinas. Posteriormente, Thanava-
ca para ubiquitina, que produzida si- As plantas transgnicas tambm la et al. (1995) demonstraram que a
multaneamente com a protena de fuso esto sendo testadas para a produo protena viral obtida nos extratos das
ubiquitina-hGH, no apresentou a efici- de antgenos vacinais. Enquanto os folhas transformadas era capaz de in-
ncia desejada em cloroplastos. Portan- sistemas baseados na amplificao de duzir resposta imune in vivo.
to, apesar do alto rendimento de expres- vrus em plantas apresentam capacida- A mesma estratgia foi utilizada
so descrito, esse sistema requer aperfei- de de expressar apenas pequenos do- tambm na produo dos antgenos
oamento adicional na etapa de proces- mnios antignicos fusionados s pro- vacinais bacterianos toxina termolbil
samento ps-traducional das protenas tenas da capa viral, plantas transgni- (LT) de Escherichia coli enteropatog-
recombinantes. cas podem expressar antgenos de nica (Haq et al., 1995), e toxina colrica
maior complexidade estrutural, sem (CT) de Vibrio cholerae (Arakawa et
Plantas transgnicas na produo perda de suas propriedades imunog- al., 1998). Haq et al (1995) demonstra-
de peptdios e protenas de interes- nicas originais. Diversas abordagens ram a formao espontnea de estrutu-
se farmacutico tm sido usadas para obteno de ras pentamricas LT-B idnticas s na-
vacinas a partir de plantas, sendo as turais, em batatas transgnicas. Os an-
A expresso de protenas usadas como vacinas comestveis as mais promis- tgenos recombinantes produzidos em
frmacos em plantas constitui uma alter- soras, pela reduo nos custos e faci- batatas foram capazes de produzir res-

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 15


posta imune e proteo parcial em alta atividade proteoltica da maioria diversos rgos do tabaco transforma-
camundongos (Mason et al., 1998) e no dos tecidos vegetais. As sementes, por do com o cassete de expresso de-
homem (Tackett et al., 1998). sua vez, apresentam tecidos especiali- monstrou a produo do hormnio
Anticorpos ou imunoglobulinas so zados que permitem o armazenamen- recombinante especificamente nas se-
protenas multimricas complexas, que to de protenas por longos perodos, mentes (Fig. 3B). O seqenciamento da
requerem, para a sua produo, siste- sem a ocorrncia de degradao. Alm regio amdica do hGH purificado a
mas eucariticos de expresso. A pro- disso, o emprego de promotores se- partir das sementes indicou a presena
duo de anticorpos em plantas pode mente-especficos impede que haja ex- de resduos idnticos aos encontrados
ter aplicaes in situ ou ex situ (White- presso generalizada da protena na no hormnio natural. Esse resultado
lam & Cockburn, 1996). As aplicaes planta, de modo que seus processos demonstra que o peptdio sinal adicio-
in situ compreendem aquelas em que o metablicos bsicos no so significa- nado, de maneira similar ao peptdio
anticorpo age como um reagente na tivamente afetados. sinal original, pde ser reconhecido
prpria clula, modulando a atividade Com o objetivo de explorar as como um sinal de endereamento, ten-
de um antgeno, ou ainda, promovendo vantagens da produo em sementes, do sido adequadamente processado.
imunizao intracelular contra patge- foi desenvolvido, em nosso laborat- Posteriormente, ensaios de ligao a
nos. Os anticorpos apresentam uma rio um, cassete de expresso onde a receptores especficos mostraram que
grande variedade de aplicaes ex situ, expresso do gene codificador da pro- o hormnio produzido em sementes
tais como controle de poluio ambien- tena de interesse controlada pelo de tabaco apresenta propriedades simi-
tal, produo de reagentes industriais, promotor de -kafirina. A -kafirina, lares s da protena nativa, dando uma
sensores moleculares, reagentes para uma protena de reserva de sorgo, clara indicao de sua funcionalidade
diagnsticos, soros contra toxinas e acumula-se em grande quantidade na (Leite et al., 2000).
venenos, imunizao passiva contra semente, onde constitui fonte de nitro- O nvel de expresso do hGH re-
agentes infecciosos, contraceptivos, te- gnio e enxofre durante a germinao combinante obtido em sementes de
rapias contra cncer, entre outras. A (Leite et al., 1999). Conforme demons- tabaco resultou um rendimento de pro-
maioria dessas aplicaes requer gran- tram os experimentos de expresso duo de, aproximadamente, 0,16%
des quantidades de anticorpos, sendo transiente mostrados na Figura 2, en- das protenas solveis da semente. O
sua utilizao limitada pelo rendimento quanto o promotor constitutivo deriva- baixo rendimento deve-se possivelmen-
dos sistemas de produo. As plantas do do transcrito 35S do vrus do mosai- te ao fato de um promotor originrio de
transgnicas, alm de apresentarem al- co da couve flor (P35ScaMV) dirige a uma planta monocotilednea ter sido
tos rendimentos de produo, constitu- expresso do gene reprter gus para os usado no controle da expresso de
em at o momento, o nico sistema de diversos compartimentos da semente genes em tabaco, uma planta dicotile-
expresso capaz de produzir anticorpos de milho, o promotor de -kafirina dnea. Corroborando com essa hipte-
completos funcionais. Esse fato foi efe- estimula essa expresso especificamen- se, resultados obtidos recentemente
tivamente comprovado atravs da pro- te no tecido de reserva, o endosperma. por nosso grupo demonstram rendi-
duo de um anticorpo do tipo IgA em O cassete de expresso baseado no mentos superiores (cerca de quatro
tabaco (Ma et al., 1995). Com esse promotor de -kafirina foi inicialmente vezes) em sementes de milho transg-
objetivo, esses pesquisadores produzi- testado na produo de hormnio do nico. Estimativas baseadas nesse rendi-
ram quatro diferentes plantas de tabaco crescimento humano (hGH) em se- mento indicam a possibilidade de se
transgnicas, cada uma expressando mentes de tabaco transgnico (Leite et produzir, aproximadamente, 250 g de
uma das quatro cadeias polipeptdicas al., 2000). Com essa finalidade, a se- hGH a partir de uma tonelada de se-
que compem um anticorpo monoclo- qncia de cDNA codificadora do hGH mente de milho transgnico (Fig. 3C).
nal do tipo IgA. Atravs de cruzamentos foi inserida na extremidade 3' da se- A baixa complexidade protica que
sucessivos entre essas plantas, obtive- qncia promotora (Fig. 3A). Na hip- caracteriza o endosperma, aliada re-
ram plantas capazes de expressar, si- fise, o hGH produzido na forma de duzida solubilidade em gua da maio-
multaneamente, as quatro cadeias poli- um pr-hormnio que apresenta um ria de suas protenas, deve facilitar o
peptdicas e de produzir uma imuno- peptdio sinal em sua extremidade desenvolvimento de processos indus-
globulina funcional. Devido capacida- amdica. O peptdio sinal respons- triais de extrao e purificao do hGH
de de ligao do anticorpo original com vel pelo endereamento da protena produzido em sementes de milho trans-
uma adesina da bactria Streptococcus para o retculo endoplasmtico (RE) gnico. Com o objetivo de comparar o
mutans, o anticorpo recombinante, pro- determinando, dessa forma a secreo rendimento da produo de hGH re-
duzido em larga escala em plantas, do hormnio. Apesar da existncia de combinante em sementes de diferentes
dever ser utilizado na imunizao pas- evidncias de que sinais de enderea- espcies de plantas, a mesma constru-
siva contra crie, pela sua adio em mento de animais so funcionais em o utilizada na transformao de taba-
dentifrcios. plantas, no intuito de maximizar seu co e de milho est sendo testada em
processamento na semente o peptdio soja. Os experimentos com soja trans-
Produo de hormnio do sinal original do hGH foi substitudo gnica esto sendo realizados em cola-
crescimento humano em por um peptdio sinal equivalente ori- borao com os pesquisadores Dr. El-
sementes de plantas transgnicas ginrio de uma protena de reserva de bio L. Rech e Dr. Francisco J. L. Arago,
Coix lacryma-jobi, um cereal filogene- da EMBRAPA-Recursos Genticos e Bi-
As protenas recombinantes, de ma- ticamente relacionado ao milho (Leite otecnologia (Braslia, DF).
neira geral, devem ser processadas ime- et al., 1999). Esse trabalho abriu perspectivas para
diatamente aps a colheita, devido A anlise de extratos proticos dos a expresso de outros frmacos de
16 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
interesse econmico em sementes e, Dyck, M.K.; Gagn, D.; Ouellet, M.; Generation and assembly of secre-
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Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 17
PESQUISA
FLAVONIDES
Fotos/ilustraes cedidas pelos autores

Farmacologia de flavonides no controle hiperlipidmico em animais experimentais

INTRODUO

Desordens coronarianas so uns dos problemas causados pelo acmulo de


colesterol, e tm sido causa de alta taxa de mortalidade no Brasil, Japo, Inglaterra,
Estados Unidos e outros pases (Truswell, 1984).
A aterosclerose e, em particular, a cardiopatia coronria, relaciona vrios
fatores de risco, tais como: idade, sexo, obesidade, estresse emocional, baixos
nveis de colesterol -HDL, fumo, dietas ricas em gordura saturada e ainda
problemas genticos. A importncia de todos esses fatores de risco correlacio-
nada com o aumento dos nveis de colesterol no sangue, assim como as atividades
pr-oxidantes de radicais livres sobre as lipoprotenas de baixa densidade (LDL)
no nvel endotlio. O consumo de gorduras saturadas aumentam os valores do
colesterol na corrente sangnea, impedindo a atividade dos receptores de LDL e,
conseqentemente, dificultando a sua eliminao (Leite, 1994).
Nveis elevados de colesterol-HDL esto associados com a diminuio de risco
da cardiopatia coronariana; seu efeito oposto ao colesterol-LDL, uma vez que
este transporta o colesterol para os tecidos, enquanto o HDL atua no transporte
do colesterol em excesso para o fgado. O quociente colesterol LDL/colesterol-
HDL um indicativo confivel de risco aterognico. Nas populaes onde so altas
as concentraes tanto do LDL como do HDL, os indivduos com menores nveis
de HDL esto mais susceptveis a padecer de cardiopatia coronariana. Ainda que
os nveis de HDL possam estar condicionados geneticamente, a alimentao um
fator determinante (Feinleb, 1984).
As partculas de HDL facilitam o transporte de colesterol dos tecidos perifricos
ao fgado, para sua excreo. Os cidos saturados no reduzem os nveis de
colesterol-HDL, mas aumentam a concentrao de colesterol-LDL. A maioria das
Renato Matos Lopes investigaes epidemiolgicas mostram uma correlao positiva entre as concen-
Mestrando do curso de Agroqumica traes sricas de triacialgliceris e a cardiopatia coronariana (Feinleb, 1984).
Departamento de Bioqumica e Biologia
Molecular
A reduo nas concentraes plasmticas de lipoprotenas LDL, VLDL podem
Universidade Federal de Viosa diminuir o risco do infarto do miocrdio (Lipid Research, 1984).
renato@tdnet.com.br O esquema 1 apresenta a formao de uma placa aterosclertica. Partculas de
Tnia Toledo de Oliveira LDL e plaquetas penetram no endotlio e causam leses (1). Fatores de
Doutora, Professora Adjunta do crescimento liberados pelas plaquetas estimulam as clulas musculares abaixo do
Departamento de Bioqumica e Biologia
Molecular da Universidade Federal de
endotlio, causando proliferao no stio da leso. Todo processo acompanhado
Viosa pela migrao de moncitos e outras partculas de LDL (2), conseqentemente,
ttoledo@mail.ufv.br ocorre a formao de clulas espumosas (3). Desenvolve-se, ento uma aglome-
Tanus Jorge Nagem rao na regio de fosfolipdios, colesterol e clcio e, gradualmente, ocorre o
PhD, Professor Adjunto do Departamento endurecimento deste, formando salincias fibrosas e resistentes que so as placas
de Qumica da Universidade Federal de
Ouro Preto
de ateroma.
tjnagen.bh@zaz.com.br Como preveno da doena arterial coronariana, comum o uso de frmacos
hipolipemiantes como adjuvantes da dietoterapia para pacientes com dislipopro-
Alosio da Silva Pinto
Mestre, Professor Assistente do Departa-
teinemia. A busca de novos frmacos que possam atuar em uma reduo dos nveis
mento de Veterinria da Universidade de colesterol tem sido motivo de novas pesquisas.
Federal de Viosa
aloisio@mail.ufv.br

18 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento


FLAVONIDES mana HIV (Lin et al. 1997).
Sabe-se que os flavonides po-
Os flavonides compem uma dem inibir vrios estgios dos proces-
ampla classe de substncias de ori- sos que esto diretamente relaciona-
gem natural, cuja sntese no ocor- dos com o incio da aterosclerose,
re na espcie humana. Entretanto, como ativao de leuccitos, adeso,
tais compostos possuem uma srie agregao e secreo de plaquetas
de propriedades farmacolgicas que (Hladovec, 1986b), alm de ativida-
os fazem atuar sobre sistemas bio- des hipolipidmicas (Lin et al, 1986)
lgicos. Conseqentemente, mui- e aumento de atividades de recepto-
tas dessas propriedades atuam de res de LDL (Kirk et al, 1998).
forma benfica para a sade huma- Segundo Anton & Beretz (1990),
na. Atualmente, j foram as propriedades farmacolgicas dos
identificadas mais de quatro mil flavonides ainda no haviam sido
substncias pertencentes ao grupo totalmente avaliadas. Aps uma d-
dos flavonides (Peterson & Dwyer, cada de avanos nessa linha de pes-
1998). quisa, pode-se afirmar que novos
Estruturalmente, os flavonides estudos toxicolgicos e farmacolgi-
constituem substncias aromticas cos devem ser realizados, uma vez
com 15 tomos de carbono (C15) no que a ampla diversidade estrutural
seu esqueleto bsico, sendo com- desses compostos - bem como a
postos fenlicos, que possuem nes- capacidade de interao com outras
sa estrutura anis aromticos C 6-C3- substncias - nos reporta a imaginar
C6. O esqueleto C15 dos flavonides que novas descobertas ainda podem
biogeneticamente derivado do e devem ser realizadas.
fenilpropano (C6-C3) e trs unida- Com o objetivo de se avaliar a
des de acetato (C 6). Portanto, ao hipolipidmica de flavonides e
flavonides so derivados de ben- de corantes naturais em animais ex-
zo-gama-pirona de origem vegetal Esquema 1: Formao da perimentais com hiperlipidemia in-
(Yokozawa et al, 1997), podendo placa aterosclertica duzida, o laboratrio de Biofrmacos
haver facilmente interconverso da Universidade Federal de Viosa
entre eles (vide figura 1). vem desenvolvendo uma srie de
A explicao para a existncia Propriedades farmacolgicas estudos para conhecer o potencial
de uma grande diversidade estrutu- dos flavonides farmacolgico desses compostos.
ral dos flavonides explicada pelas A seguir, so descritas algumas
modificaes que tais compostos Diversos ensaios in vivo e in metodologias empregadas pelo labo-
podem sofrer, tais como: vitro vm comprovando e determi- ratrio de Biofrmacos da Universi-
hidroxilao, metilao, acilao, nando a ampla variedade das ativida- dade Federal de Viosa, utilizando-se
glicosilao, entre outras (Koes et des biolgicas dos compostos flavo- coelhos com hiperlipidemia induzi-
al, 1994). nodicos. Segundo Ratty & Das (1998), da a partir de uma dieta rica em cido
Consumidos em grandes pro- algumas dessas propriedades farma- clico e colesterol ou aplicao de
pores dentro de uma dieta huma- colgicas j foram observadas por Triton:
na regular, os flavonides so en- Szent-Gyorgi em 1936. Destacam-se,
contrados em vegetais, legumes, dentre outros, os seguintes efeitos METODOLOGIA GERAL.
frutas, chs de ervas, mel, entre dos flavonides sobre os sistemas
outros produtos de consumo coti- biolgicos: capacidade antioxidativa Considerando-se um nmero de-
diano. (esta constitui a atividade mais eluci- terminado de coelhos machos, albi-
Apesar do termo flavonide dada pelos estudos at agora desen- nos, adultos, da Raa Nova Zelndia
derivar do latim flavus, que signifi- volvidos); atividades antiinflamatria (com peso mdio de 2500 200g),
ca amarelo, observa-se que os gru- e de efeito vasodilatador; ao antia- dispostos em gaiolas individuais com
pos flavonis e flavonas so incolo- lrgica; atividade contra o desenvol- temperatura local que varia entre 22
res e que a classe das antocianinas vimento de tumores, anti - hepatot- 3 0 C, e taxa de umidade relativa do
possuem substncias que variam xica, antiulcerognica; atuao anti- ar situada na faixa de 70%. Esses
no seu espectro de colorao do plaquetria, bem como aes antimi- animais so submetidos a uma dieta
verde ao azul. A tabela 1 apresenta crobianas e antivirais. Pesquisas re- com rao comercial SOCIL, na pro-
algumas das principais classes de centes demonstraram que alguns fla- poro de 130 g ao dia e gua potvel
flavonides, assim como alguns dos vonides atuam na inibio da repli- ad libitum ( figura 2).
seus principais representantes e cao viral do agente causador da Aps o perodo de adaptao s
caractersticas. Sndrome da Imunodeficincia Hu- condies locais, os animais so or-
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 19
denados em grupos, de acordo com
o tratamento a ser aplicado: a) Grupo
controle; b) Controle + substncias
indutoras de hipercolesterolemia; c)
Controle + substncias indutoras de
hipercolesterolemia + substncias
teste (flavonides ou medicamen-
tos). Os tratamentos so efetuados
durante perodos predeterminados
de tempo e, normalmente o trata-
mento dos animais realizado por
via oral atravs de cpsulas (figura 3).
Amostras de sangue so retiradas
antes, durante e aps o tratamento
desses animais para verificao e
acompanhamento dos efeitos dos tra-
tamentos sobre os constituintes lip-
dicos, o sangue retirado centrifuga-
do a 7100 G por 15, para obteno do
soro. As dosagens sorolgicas so
realizadas e os resultados do coleste-
rol, do colesterol-HDL e dos triacilgli-
ceris so obtidos por meio de Kits
Biolab no equipamento multipara-
mtrico Aliz (figura 4).
As substncias utilizadas como
indutores das hiperlipidemias so:
colesterol a 1% e cido clico 0,1%
misturados rao, assim como a Figura 1: Interconverso dos principais grupos de flavonides.
aplicao intraperitonial de Triton Adaptado de Domingues (1973)
WR 1339 na dose de 300mg/kg de
peso corporal do animal, utilizando O flavonide Naringina associado et al., 1999). Dessa forma, a associa-
como veculo NaCl 0,9%. antocianina e ao carmim (corantes es entre naringina/antocianina e
Triton tambm conhecido como naturais utilizados na indstria de naringina/carmim demonstraram alta
tyloxapol, um detergente no anini- alimentos) reduziram em at 70,21% eficincia na reduo dos nveis de
co de estrutura polimrica da Sigma, os triacilgliceris e em 63,01% os colesterol e triacilglicerol.
cuja utilizao vem sendo ampla- nveis de colesterol em ratos hiperli- Os flavonides quercetina, mori-
mente empregada para promover hi- na e o medicamento cido nicotnico,
perlipidemia em cobaias (Mathur et empregados de forma isolada e asso-
al., 1964; Sharma, 1979; Choi et al., ciada, apresentaram ao no metabo-
1991). lismo lipdico em ratos machos hiper-
lipidmicos (Santos et al. 1999a). Os
RESULTADOS OBTIDOS resultados mostraram uma reduo
de 83,77% de triacilgliceris e 76,89%
Nossos trabalhos demonstram que de colesterol, quando se empregou
naringenina e chitosan tm efeitos um tratamento conjunto de morina e
sobre lipdios no soro de coelhos cido nicotnico. Quercetina e cido
com hiperlipidemia induzida por Tri- FIGURA 2: Coelho da Raa Nova nicotnico promoveram uma varia-
ton. Certificou-se, inclusive, que a Zelndia confinado em gaiola o positiva em 21,96% para o coles-
associao entre naringenina e chis- individual durante o tratamento terol-HDL.
tosan foram mais eficazes no controle com a substncia-teste O cido nicotnico um medica-
do metabolismo lipdico. Os resulta- mento empregado de forma usual no
dos obtidos demonstram que, em um controle de nveis de lipdios no
efeito sinrgico das duas substncias- pidmicos, atravs de Triton. Narin- organismo. Aes hipolipidmicas
teste, promovem uma reduo de gina e antocianinas foram tambm as desse medicamento decorrem da ini-
71,42% de triacilgliceris, em compa- responsveis pelo acrscimo de bio da liplise do tecido adiposo,
rao com o grupo de animais que 15,27% de colesterol HDL, quando mobilizao dos cidos graxos, redu-
apresentaram hiperlipidemia induzi- comparado aos animais tratados ape- o da esterificao dos triacilglice-
da pelo Triton ( Lopes, 2000). nas com a rao e o indutor ( Nagem ris no fgado e aumento da lipase
20 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
Tabela 1: Principais classes de flavonides e descrio de suas caractersticas bsicas
CLASSES COLORAO EXEMPLOS COMENTRIOS

Antocianinas Azul, vermelha e Cianidina; Antocianinas esto predominantemente em frutas e flores


violeta Delfinidina; e provavelmente foram os primeiros flavonides a serem
Peonidina. isolados provenientes de pigmentos florais, conforme
indicam seus prprios nomes. So usadas como corantes.

Flavanas (mono, Incolor Catequina; Flavanas so encontradas em frutas e chs (verdes ou


bi e triflavans) Epicatequina pretos). Biflavanas so encontradas em frutas, lpulo,
Luteoforol; nozes e bebidas como chs e gua de coco. O sabor
Procianidina. peculiar de algumas bebidas, frutas, chs e vinhos
Theaflavina devido, principalmente, presena das biflavanas.

Flavanonas Incolor para um Hesperidina; Flavanonas so encontradas quase que exclusivamente em


amarelo plido. Naringenina. frutas ctricas.

Flavonas Amarelo plido Apigenina; Flavonas so encontradas quase que exclusivamente em


Luteolina; frutas ctricas. Mas tambm em cereais, frutas, ervas e
Diosmetina; vegetais. Conferem o pigmento amarelo em flores. Os
Tangeretina; compostos mais comuns so a apigenina e a luteolina.
Nobiletina
Flavonis Amarelo plido Quercetina; Os flavonis esto presentes em diversas fontes, sendo
Rutina; predominantes em vegetais e frutas. A quercetina o
Mircetina; principal representante da classe.
Kaempherol
Isoflavonides Incolor Daidzena; Isoflavonides so encontrados quase que exclusivamente
Genistena. em legumes, particularmente na soja.
Fonte: Adaptado de Peterson & Dwyer, 1998

Nagem et al, 1995; Santos et al,


1999c).

CONCLUSES

Os resultados obtidos demons-


tram redues estatisticamente sig-
nificativas para os nveis de coles-
terol e de triacilgliceris, assim
como aumento dos valores de co-
FIGURA 4: Equipamento
lesterol-HDL, destacando-se, inclu-
Aliz (Analisador Automtico
FIGURA 3: Recipiente lacrado sive, efeitos sinrgicos dos com-
de Bioqumica), capaz de
e identificado contendo as postos flavonodicos testados.
realizar anlises de concentra-
cpsulas com a substncia-teste Dessa forma, fundamental o de-
es de constituintes
a ser utilizada durante o ensaio senvolvimento de novas pesqui-
sangneos, aproximadamen-
biolgico sas sobre o potencial dos flavoni-
te 180 testes/hora
des no tratamento e na preveno
das hiperlipidemias, uma vez que
lipoprotica ( Goodman & Gilmans, a obteno de novos resultados mecanismos de aes desses com-
1996). serviro de instrumentos para a postos naturais, assim como obter
Diversos compostos flavonodi- utilizao desses produtos na pre- novas avaliaes de suas proprieda-
cos de diferentes plantas, que foram veno de doenas cardiovascula- des farmacolgicas.
extrados, isolados, identificados e res. Evidencia-se tambm a importn-
quantificados, foram transformados As interaes com outros n- cia e a aplicabilidade de avaliaes
quimicamente e empregados em en- cleos de pesquisas para o desen- de toxicidade de flavonides sobre
saios biolgicos para avaliaes dos volvimento de novas metodologi- sistemas biolgicos. Essa afirmao
seus potenciais farmacolgicos sobre as de anlises permitiro aprofun- reside no fato de que ensaios toxico-
lipdios em ratos (Santos et al, 1999b; dar os conhecimentos sobre os lgicos permitiro o emprego de doses
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 21
seguras dos flavonides como fr- flavonoid biosynthetic pathway naturais antocianina e carmim no
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22 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento


Anncio COBRAFI
Conselho Brasileiro de
Fitossanidade
(REPETE FOTOLITO)
Obs.: Saiu na pgina 37 da edio anterior n 16

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 23


Vacinas de BCG Recombinante-DTP
Waldely Oliveira Dias Eliane Namie Miyaji Denise Silvina Piccini Quintas
PhD pela Escola Paulista de Medicina PhD pela Universidade de So Paulo, Ps- Horton
Pesquisadora do Instituto Butantan Doutoranda no Instituto Butantan PhD pela Escola Paulista de Medicina
Centro de Biotecnologia. Centro de Biotecnologia. Pesquisadora do Instituto Butantan

Rogrio Pietro Mazzantini Ivan Pereira Nascimento Luciana Cezar de Cerqueira Leite
Centro de Biotecnologia - Instituto Doutorando do Departamento de PhD pela Universidade de So Paulo
Butantan Bioqumica - Instituto de Qumica USP. Pesquisadora do Instituto Butantan
SADE Mestrando do Curso Interunidades em Centro de Biotecnologia, Instituto lccleite@quim.iq.usp.br
Biotecnologia. Butantan.

Resposta imune e proteo induzida por vacinas de BCG recombinante-DTP


Fotos cedidas pelos autores

A imunoprofilaxia, ou vacinao, no ocorrer reverso para a viruln- monstrando a induo de respostas


a medida mais eficiente e menos one- cia, tambm conferia resistncia a um humorais e celulares, inclusive em
rosa na preveno de doenas infecci- desafio subseqente com M.bovis vi- tecidos mucosos. Todas essas vanta-
osas. A erradicao da varola e o rulento ou M.tuberculosis. Essa cepa, gens favorecem o uso da cepa viva
sucesso com a trplice (DTP - difteria, hoje conhecida como Bacilo de Cal- atenuada de BCG como veculo mul-
ttano e pertussis, ou tosse comprida) mette-Guerin, ou BCG, foi utilizada tivacinal para a induo de imunidade
e com a Sabin so provas contunden- oralmente, pela primeira vez, em 1921, humoral e celular contra diversos pa-
tes da importncia desses programas e sua aplicao generalizada foi reco- tgenos (2, 3).
de vacinao. No entanto, fatores cul- mendada pela Liga das Naes, em
turais, sociais e econmicos dificul- 1927. BCG recombinante
tam a realizao de diversas campa- Hoje o BCG a vacina mais utiliza-
nhas de vacinao, especialmente em da no mundo, tendo j sido adminis- Micobactrias como M.tuberculosis
pases em desenvolvimento, onde os trada a 3 bilhes de indivduos, com ou BCG infectam macrfagos e po-
sistemas de sade so por vezes defi- uma freqncia baixssima de efeitos dem sobreviver por longos perodos
citrios. Essa conjuntura levou a co- adversos srios. Isso torna o BCG um no seu interior, estimulando continu-
munidade cientfica a um esforo para bom candidato a veculo para apre- amente o sistema imune. Vrios estu-
desenvolver vacinas multivalentes. Em sentao de antgenos heterlogos, dos tm demonstrado que BCG re-
especial, procuram-se veculos vivos tendo em vista a possvel validao de combinante expressando protenas
de apresentao de antgenos, uma uma vacina recombinante baseada em heterlogas pode induzir os 3 tipos de
vez que a expresso contnua do imu- BCG. Uma vacina multivalente, que resposta imune necessrios para pro-
ngeno poderia eliminar a necessida- utilize BCG como veculo vivo, apre- teo contra vrios patgenos: I) pro-
de de vrias doses de reforo para se sentaria vrios outros fatores vantajo- duo de anticorpos IgG por clulas
alcanar uma proteo mxima, o que sos, como: I) o BCG a nica vacina B; II) proliferao de linfcitos T e
o caso de vrias vacinas atualmente recomendada pela WHO (Organiza- produo de linfocinas, inclusive in-
em uso. Veculos que tm sido parti- o Mundial da Sade) para ser admi- terferon-gama (IFN-); III) e produo
cularmente investigados so: Vacc- nistrada ao nascimento; II) requer ape- de linfcitos T-citotxicos, com restri-
nia, Salmonella atenuada, ou BCG nas uma imunizao para conferir o por classe I do complexo princi-
(Bacilo Calmette-Guerin, vacina con- imunidade celular duradoura, pois o pal de histocompatibilidade (Figura
tra a tuberculose), com resultados em- BCG pode permanecer no organismo 1). Antgenos de diversos patgenos
polgantes (1). por anos (dependendo do indivduo) virais, bacterianos e de parasitas, como
- a apresentao contnua dos antge- HIV, Streptococcus pneumoniae, Clos-
O Bacilo de nos eliminaria a necessidade de pro- tridium tetani, Borrelia burgdorferi,
Calmette-Guerin, BCG gramas de vacinao seqenciais, que Plasmodium falciparum, Schistosoma
o caso de diversas vacinas em uso mansoni, etc, foram expressos em
Albert Calmette e Camille Guerin, atualmente; III) seu processo de pro- BCG recombinante, induzindo res-
trabalhando no Instituto Pasteur, de duo de baixo custo, sendo vendi- postas humorais e/ou celulares e, em
Lille, no incio do sculo, atenuaram da atualmente a apenas 55 centavos alguns casos, levando proteo con-
uma cepa virulenta de Mycobacterium de dlar; IV) o BCG um dos mais tra um desafio com o patgeno (2,3).
bovis ao longo de 13 anos com 215 efetivos adjuvantes conhecidos para
passagens sucessivas. A imunizao induo de imunidade celular em ani- A Vacina Trplice - DTP
com essa cepa foi ento testada em mais e humanos; e V) estudos recen-
diversas espcies de animais experi- tes tm reanalisado a possibilidade de A vacina trplice - DTP convencio-
mentais para demonstrar que, alm de uma vacinao oral com BCG, de- nal mostrou-se extremamente eficien-
24 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
te no controle de infeces por difte- e III) para a frao pertussis, o gene da utilizados so os promotores das pro-
ria, ttano e pertussis (tosse compri- Subunidade 1 da toxina pertussis tenas de choque trmico, hsp60 e
da), quando a vacinao completa (S1PT), com 2 mutaes que a tornam hsp70. Mais recentemente, outros pro-
alcanada. Essa vacina constituda atxica, porm mantendo sua imuno- motores tm sido utilizados para a
de anatoxina diftrica e anatoxina te- genicidade (PT-9K/129G) (fornecido expresso de protenas heterlogas,
tnica (as respectivas toxinas detoxifi- pelo Dr. Rino Rappuoli). como o promotor pAN, isolado de
cadas por tratamento qumico) e por No desenvolvimento de uma vaci- M.paratuberculosis; os promotores dos
clulas inteiras de Bordetella pertussis, na de BCG recombinante, a expresso antgenos de 18kDa, 19kDa e 85A, de
quimicamente inativadas. Um incon- da protena heterloga pode ser M.tuberculosis, e o promotor mutado
veniente na tecnologia utilizada na conseguida atravs de um vetor de da -lactamase de M.fortuitum, pBlaF*.
produo da vacina trplice a neces- expresso extracromossomal ou a par- Outro fator importante na resposta
sidade de manipulao de grandes tir de um vetor integrativo, sendo que imune induzida a localizao do
quantidades de material txico na pre- o primeiro, em geral, leva a maiores antgeno heterlogo. A fuso com
parao de cada um dos componen- nveis de expresso e o segundo, a seqncias sinais de exportao de
tes. Embora essa vacina seja muito expresso mais estvel. Os vetores de diferentes protenas de micobactria
eficiente, algumas vezes tem sido rela- expresso extracromossomais tm sido pode levar exportao dos antge-
cionada a efeitos colaterais indesej- mais utilizados, sendo vetores-ponte nos e, conseqentemente, alterao
veis. Alm disso, necessria a aplica- com origem para replicao em mico- na resposta imune induzida (2,3).
o de diversas doses para se alcanar Ns utilizamos vetores de expres-
a proteo mxima, o que pode levar Tabela 1: Sobrevivncia de so que contm o promotor pBlaF*,
a uma cobertura reduzida, especial- camundongos imunizados com que levou a elevada expresso de
mente em pases em desenvolvimen- rBCG-S1PT contra desafio com B. antgenos de outros patgenos, com
to. Assim, a cobertura mundial para pertussis virulentaa ou sem a seqncia sinal de exporta-
vacinao com DTP, que estava esta- o da -lactamase (ssBlam) (gentil-
cionada h anos em 80%, em 1998 Grupo Sobrevivncia mente cedidos pela Dra. Brigitte Gic-
caiu para 74%, sendo a baixa cobertu- Salina 1/10 quel, Instituto Pasteur, Paris), que os
ra concentrada nos pases em desen- rBCG-S1PT 8/10 direcionaria exportao. Assim, o
volvimento. Isso significa que 1 em DTP 9/10 vetor pJEM17 leva expresso do
cada 4 crianas no mundo no est gene nativo e o vetor pLA71 coloca o
coberta contra esses patgenos, resul-
a
Grupos de 10 camundongos gene em fuso com ssBlam (Figura 2).
tando em uma mortalidade anual de imunizados 2 semanas antes com
quase 1 milho de crianas (4). Por- 106 CFU/0,5 ml of rBCG-S1PT, ou Abordagem Experimental
tanto, existe um esforo para a aplica- o controle negativo recebendo 0,5
o de novas tecnologias para o de- ml de salina e o controle positivo A Figura 3 ilustra a abordagem
senvolvimento de vacinas contra tta- recebendo 0,4 ml de DPT, foram experimental utilizada. Os genes dos
no, difteria e pertussis, buscando-se submetidos a desafio intracerebral antgenos heterlogos de ttano, dif-
alternativas para reduo do nmero com uma dose letal de cepa teria e pertussis, respectivamente, FC,
de doses necessrias. A utilizao de virulenta de B. pertussis. A CRM197 e S1PT, foram amplificados
vetores vivos de apresentao de an- sobrevivncia foi monitorada por por PCR a partir de plasmdeos con-
tgenos poderia ser, neste caso, extre- 17 dias. tendo os genes e clonados nos vetores
mamente vantajoso. de expresso em micobactria con-
tendo o promotor pBlaF*, pJEM17 e
BCG recombinante - DTP bactria e em Escherichia coli, onde pLA71, sem fuso e com fuso com a
realizada toda a manipulao gentica seqncia sinal da -lactamase, res-
O objetivo deste trabalho consiste dos vetores. Os vetores de expresso pectivamente. BCG eletrocompeten-
em desenvolver uma vacina multiva- devem ter um marcador de seleo tes foram transformados por eletropo-
lente, utilizando BCG como veculo para isolar os transformantes, onde se rao e plaqueados em meio slido
vivo para apresentao de antgenos usa em geral um gene de resistncia a para crescimento de micobactria con-
de difteria, ttano e pertussis. Utiliza- antibitico. O gene que tem sido mais tendo kanamicina (o plasmdeo con-
mos os seguintes antgenos: I) para a usado o gene Tn903, que confere tm o gene de resistncia a este anti-
frao diftrica, o CRM 197, toxina resistncia a kanamicina, uma vez que bitico) para seleo dos transfor-
diftrica, com uma mutao que elimi- as micobactrias so naturalmente re- mantes.
na sua atividade txica, mas mantm sistentes a antibiticos -lactmicos Colnias de BCG recombinante
a sua imunogenicidade (gentilmente (3). resistentes kanamicina, portanto con-
cedido pelo Dr. Rino Rappuoli, Bioci- O nvel de expresso e localizao tendo os vetores, foram cultivadas em
ne, Itlia); II) para a frao tetnica, o dos antgenos so fatores importantes meio lquido, tambm contendo ka-
fragmento C da toxina tetnica (FC), para o nvel de resposta imune indu- namicina. Uma parte foi utilizada para
que se tem mostrado atxico e imuno- zida. So os promotores que regem o preparao de extratos proticos por
gnico (clonado pela Dra. Ana Lucia nvel de expresso. Os promotores sonicao e extrao com detergente
T.O. Nascimento, Instituto Butantan); micobacterianos que tm sido mais SDS e outra parte foi utilizada para
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 25
Resultados:
Expresso dos Antgenos
Heterlogos em rBCG

Os vetores de expresso de mico-


bactria contendo os antgenos de
ttano, difteria e pertussis foram ele-
troporados em BCG e as colnias
resistentes kanamicina, seleciona-
das e cultivadas para a preparao de
extratos proticos e lotes de vacinas.
Os extratos proticos foram analisa-
dos por Western blot.
Os extratos proticos de clones de
BCG recombinante (rBCG) transfor-
mados com os vetores contendo o
gene FC, sem ou com fuso com
Figura 1. Resposta imune induzida por BCG recombinante ssBlam, respectivamente, rBCG-JFC e
rBCG-LAFC, mostraram expresso da
protena heterloga por Western blot
preparaes vacinais congeladas em soros dos camundongos imuniza- revelado com antissoro anti-anatoxi-
glicerol a -80 C. Os extratos proticos dos. Para as preparaes de BCG- na tetnica, com os respectivos pesos
foram analisados por eletroforese em S1PT, avaliou-se tambm a induo moleculares esperados: rBCG-JFC
gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) e de resposta imune celular especfica apresentou uma banda de ~ 51 kDa e
por Western blot (reao com anticor- contra toxina pertussis (PT), dosan- rBCG-LAFC de ~ 55 kDa (incluindo
pos especficos), para verificao da do-se a liberao de IL-4 e IFN- por 4kDa da ssBlam). No entanto, os ex-
expresso dos antgenos heterlogos. linfcitos esplnicos isolados dos ca- perimentos de localizao do antge-
Na revelao dos Western blots, foram mundongos imunizados, aps est- no heterlogo no BCG mostraram
utilizados anticorpos especficos: I) mulo com toxina pertussis detoxifi- que, em ambas as construes, o FC se
soro policlonal anti-anatoxina tetni- cada (dPT). encontrava no citosol, indicando que,
ca e II) anti-anatoxina diftrica produ- Camundongos imunizados com nesse caso, a fuso com ssBlam no
zido em cavalos no Instituto Butantan, as diferentes vacinas de BCG recom- resultou em exportao do antgeno.
e III) anticorpos monoclonais anti- binante expressando os antgenos Clones de rBCG transformados com
toxina pertussis (cedidos pelo Dr. Yuji de difteria, ttano e pertussis, foram os vetores de expresso contendo o
Sato, NIH, do Japo). A localizao ento submetidos a ensaios para ve- antgeno de difteria CRM197 mostra-
dos antgenos foi verificada por extra- rificao do nvel de proteo indu- ram expresso da protena em Wes-
o diferencial com detergente Triton zida. A proteo contra ttano tern blot quando revelado com antis-
X-114, em que se separam as fraes verificada pela capacidade do soro soro anti-anatoxina diftrica (6). O
de citosol (aquosa), membrana celular de camundongos vacinados em neu- clone de rBCG-JCRM197 apresentou a
(detergente) e parede celular (insol- tralizar a toxina tetnica ativa. O banda de peso molecular esperado a
vel) (5). ensaio pode ser in vivo, onde a ~50 kDa. J o clone de rBCG-LA-
Preparaes vacinais de clones de toxina tetnica administrada aos CRM197 apresentou uma banda de
BCG recombinante que expressaram camundongos vacinados, ou in vitro mesmo peso molecular, indicando que
os antgenos heterlogos foram, en- onde a toxina misturada com o a fuso com ssBlam no foi estvel. O
to, administrados intraperitonealmen- antissoro e o complexo administra- interessante que, em ambas as cons-
te em grupos de 5 a 10 camundongos do em camundongos no vacinados. trues, o antgeno se localizou na
Balb/c, NIH, ou Swiss, a uma dose de Verifica-se a sobrevivncia dos ani- frao de membrana, mesmo sem a
106 unidades formadoras de colnia mais por 4 dias. A proteo contra seqncia sinal de exportao, suge-
(CFUs) em 0,5 mL de salina apirogn- difteria avaliada pela capacidade rindo uma afinidade prpria da prote-
cia (Figura 3). Foram tambm admi- de soroneutralizao da toxina dift- na pela membrana celular.
nistrados: salina, BCG e BCG conten- rica in vitro, verificando a toxicidade No caso de rBCG-S1PT (contendo
do os vetores vazios, como grupos da mistura toxina-antissoro aplicada a subunidade S1 da toxina pertussis
controles negativos e DTP, como con- sobre culturas de clulas de mamfe- mutada), realizamos apenas a cons-
trole positivo. Os camundongos fo- ro (Clulas Vero). A sobrevivncia truo em fuso com ssBlam, pois
ram sangrados por via retro-orbital a das clulas avaliada aps 3 dias. A relatos da literatura haviam indicado
cada 30 dias por at 6 meses. A indu- proteo contra pertussis avaliada uma dificuldade de express-la sem
o de resposta imune humoral foi pela sobrevivncia dos camundon- fuso em outros sistemas. O Western
avaliada por ELISA, onde se verificou gos imunizados aps desafio intrace- blot revelado com anticorpo anti-PT
a presena de anticorpos homlogos rebral com cepa virulenta de Borde- mostrou uma banda de ~30kDa, pou-
especficos contra os antgenos nos tella pertussis, seguida por 14 dias. co acima da banda de S1 da toxina
26 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
pertussis (de 26,2 kDa). O S1PT re-
combinante localizou-se na frao de
parede celular (Figura 4, 2 e 3), indi-
cando ter havido uma tentativa de
exportao do antgeno que no che-
gou a se completar (7).

Resposta Imune e Proteo


induzida pelas vacinas de rBCG
em camundongos

Camundongos Balb/c ou NIH fo-


ram imunizados com as preparaes
vacinais de rBCG-JFC, rBCG-LAFC, Figura 2. Vetores de expresso de antgenos heterlogos em
rBCG-JCRM197 ou rBCG-LACRM197, micobactria. Os vetores pJ-Ag e pLA-Ag contm origem de replicao
ou diferentes combinaes desses. Um em E.coli (ori-E.coli) e origem de replicao em micobactria (ori-
reforo foi realizado nas mesmas con- mico), o gene de resistncia kanamicina (Km), e o promotor mutado
dies aps 2 meses e meio. A forma- da -lactamase de M.fortuitum, pBlaF*. pJ-Ag expressa o gene do
o de anticorpos anti-anatoxina tet- antgeno nativo e pLA-Ag expressa os gene em fuso, com a seqncia
nica ou diftrica foi avaliada mensal- sinal da lactamase (ssBlam) (ss). Ag pode ser FC, CRM197 ou S1PT
mente nos soros dos camundongos
vacinados, durante 6 meses, por ELI-
SA. Imunizao com rBCG expressan- capaz de neutralizar a atividade da dos evidenciaram um efeito adjuvante
do FC em ambas as construes indu- toxina diftrica in vitro sobre clulas recproco de rBCG-FC e rBCG-
ziu a formao de anticorpos anti- Vero. CRM197. A expresso de FC em rBCG
anatoxina tetnica, mostrando, ento, Camundongos Swiss foram imuni- j havia sido descrita utilizando outros
uma elevao dos ttulos sricos aps zados com as preparaes vacinais de vetores, mas a proteo induzida foi
o reforo. A expresso de FC, com e rBCG-S1PT, e a induo de resposta parcial. A expresso de CRM197 em
sem fuso, com ssBlam mostrou-se humoral especfica contra PT seguida veculos vivos de apresentao de
equivalente, porm a resposta humo- por ELISA do soro dos camundongos antgenos tem se mostrado difcil. Esta
ral foi mais elevada sem a fuso, imunizados por at 6 meses. A induo a primeira vez que se obtm a
indicando ser a expresso do gene de anticorpos anti-PT foi baixa. A res- expresso de CRM197 em BCG. A
nativo mais adequada. A imunizao posta celular foi avaliada por liberao imunizao de camundongos com
de camundongos com rBCG expres- de IL-4 e IFN- de linfcitos esplnicos rBCG-S1PT induziu a uma elevada
sando CRM197 tambm induziu for- de animais imunizados. Uma elevada resposta celular especfica contra PT,
mao de anticorpos anti-anatoxina liberao de INF- pelos linfcitos, aps que foi capaz de proteger os animais
diftrica, que foi aumentada aps o estmulo com dPT, caracterizou uma contra um desafio intracerebral com
reforo (6). Tambm, nesse caso, a resposta celular tipo Th1 (7). Esses dose altamente virulenta B. pertussis.
construo sem fuso com ssBlam camundongos foram submetidos a de- A expresso em BCG de S1PT em
induziu a um nvel maior de anticor- safio intracerebral com dose letal de fuso com FC havia sido recentemen-
pos anti-anatoxina diftrica. Quando cepa virulenta de B.pertussis, apresen- te descrita, porm a resposta celular
os camundongos foram imunizados tando uma elevada sobrevivncia, com- induzida foi baixa. Estamos investi-
com uma mistura de rBCG expressan- parvel obtida com a vacina trplice gando, atualmente, a resposta imune
do FC e rBCG expressando CRM197, (Tabela I). induzida pela administrao conjunta
ambos sem fuso, a resposta imune de rBCG-FC, rBCG-CRM197 e rBCG-
induzida contra cada um foi aumenta- Discusso S1PT, com a expectativa de que pro-
da, evidenciando um efeito adjuvante priedades adjuvantes dos antgenos
de rBCG-FC sobre a resposta contra A expresso dos antgenos de difte- combinados possam ainda aumentar
difteria e a recproca, de rBCG-CRM197 ria, ttano e pertussis em BCG atravs a resposta imune induzida contra cada
contra o ttano. O soro obtido dos dos vetores de expresso em micobac- um dos patgenos.
camundongos imunizados com a mis- tria contendo o promotor pBlaF* mos- Nossos estudos demonstraram
tura de rBCG-FC e rBCG-CRM197 apre- trou-se adequada, levando induo que rBCG expressando os antgenos
sentou um padro de istipos de imu- de elevados nveis de anticorpos anti- de DTP induzem resposta imune efici-
noglobulina preponderantemente anatoxina tetnica e diftrica, e de uma ente e protetora contra ttano, difteria
IgG1, semelhante ao obtido com as resposta celular contra a toxina pertus- e pertussis. No entanto, uma vez que
vacinas convencionais compostas pe- sis. A resposta humoral obtida contra essas so vacinas vivas, podendo per-
las respectivas anatoxinas. Esse mes- ttano e difteria pela mistura de rBCG- manecer no organismo por longos
mo soro foi capaz de neutralizar a FC e rBCG-CRM197 foi capaz de neu- perodos, no seria aceitvel sua ad-
atividade da toxina tetnica in vitro e tralizar a atividade das respectivas toxi- ministrao em humanos, pela possi-
in vivo. O mesmo soro foi tambm nas tetnica e diftrica. Nossos resulta- bilidade de disseminao do gene de
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 27
Figura 4. Localizao da
subunidade S1 da toxina
pertussis em BCG
recombinante analisada por
Western blot. Lisado de
BCG recombinante foi
fracionado por
centrifugao e
particionado em detergente.
As amostras corresponden-
tes a cada frao ou locali-
zao foram aplicadas em
gel de SDS-PAGE,
transferidas para uma
membrana de nitrocelulose
e submetidas a um
Figura 3. Construo e imunoensaio utilizando um
teste de vacinas de BCG soro policlonal contra a
recombinante toxina pertussis

resistncia a antibitico para outras na de dose nica, eficiente e de baixo System, 1999 Global Summary.
bactrias. Recentemente foi descrito custo, contra tuberculose, ttano, dif- 5) Parish, T., P.R. Wheeler. 1998.
um sistema de expresso em BCG, teria e pertussis, com claras vantagens Preparation of cell-free extracts from
utilizando cepas auxotrficas, desen- para pases em desenvolvimento. mycobacteria, p. 77-89. In, T. Parish and
volvidas para posterior complementa- N.G Stoker (ed.), Methods in Molecular
o com um vetor que expresse o gene Referncias: Biology, Vol. 101: Mycobacteria Proto-
eliminado, conjuntamente com o ant- cols, Humana Press, Totowa, NJ.
geno recombinante. Dessa forma, evi- 1) Levine, M.M., Lagos, R. 1997 6) Miyaji, E.N., Mazzantini, R.P., Dias,
ta-se a seleo com antibitico e, con- Vaccines and vaccination in a histori- W.O., Nascimento, A.L.T.O, Marcovistz,
seqentemente, o uso do gene de resis- cal perspective, 1-12. . In M.M. Levine, R., Matos, D.S., Raw, I., Winter, N.,
tncia, produzindo-se uma cepa de G.C. Woodrow, J.B. Kaper, G.S. Co- Gicquel, B., Rappuoli, R. and Leite,
rBCG adequada para administrao em bon (ed.), New generation vaccines, L.C.C. Induction of Neutralizing Anti-
humanos. Estamos atualmente desen- 2nd ed. Marcel Dekker, Inc. NY. bodies Against Diphtheria Toxin by Pri-
volvendo esse sistema no laboratrio, 2) Gicquel, B. 1995 BCG as a ming with Recombinant Mycobacterium
para posterior verificao da resposta vector for the construction of multiva- bovis BCG Expressing CRM197, a Mutant
imune induzida pelos antgenos de lent recombinant vaccines. Biologi- Diphtheria Toxin, submetido (2000).
DTP expressos dessa forma. cals 23, 113-8. 7) Nascimento, I.P., Dias, W.O., Ma-
Em conjunto, este trabalho repre- 3) Fennelly, G.J., W.R. Jacobs Jr., zzantini, R.P., Miyaji, E.N., Gamberini,
senta um fato indito na expresso dos and B.R. Bloom. 1997. The BCG as a M., Quintillo, W., Gebara, V.C., Cardo-
3 antgenos de DTP em um mesmo recombinant vaccine vector, p. 363- so, D.F., Ho, P.L., Raw, I. Winter, N.,
sistema, com induo de resposta imu- 385. In M.M. Levine, G.C. Woodrow, Gicquel, B., Rappuoli, R., Leite, L.C.C.
ne protetora contra cada um dos pat- J.B. Kaper, G.S. Cobon (ed.), New Recombinant BCG Expressing S1-Per-
genos, condio necessria imple- generation vaccines, 2nd ed. Marcel tussis Toxin induces Protection against
mentao de qualquer uma das vaci- Dekker, Inc. NY. an Intracerebral Challenge with Live
nas. Nossos resultados indicam que 4) WHO/V&B/99.17 WHO Vacci- Bordetella pertussis in Mice, Infection
rBCG-DTP poderia constituir uma vaci- ne Preventable Diseases Monitoring Immunity, 68 (9), 4877-4883 (2000).
28 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
Anncio ANBIO

Associao Nacional de
Biossegurana

(FOTOLITO NOVO)
Obs.: Fotolito fornecido em anexo

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 29


PEPTDEOS ANTIMICROBIANOS
Maura Vianna Prates Carlos Bloch Jnior
Aluna de doutorado do curso de Ps-graduao do Departamento de Professor adjunto do Instituto de Qumica da Universidade
Biologia Celular da Universidade de Braslia/UnB. de Braslia/UnB, Pesquisador do Cenargen/Embrapa.
mprates@unb.br cbloch@cenargen.embrapa.br

Uma alternativa no combate a microrganismos resistentes


Fotografias gentilmente cedidas pelo Prof. Antnio Sebben

s ameaas sade de pesquisa, assim como a indstria far- pacientes e funcionrios.


seres vivos causadas por macutica para desenvolvimento de O corpo humano um conhecido
infeces de microrganis- novas drogas que sejam capazes de habitat de uma microflora muito di-
mos resistentes a antibi- lidar efetivamente com as estratgias versificada, composta de populaes
ticos e a vrios agentes de adaptao que esses organismos benficas, populaes prejudiciais
germicidas vm atingindo ndices ja- elaboram, em face de todo o tipo de sade e populaes que vivem co-
mais registrados. Muitos microrganis- situao adversa. mensalmente, as quais exercem pou-
mos tm desenvolvido resistncia tan- O surgimento da resistncia a an- ca influncia sobre seu hospedeiro
to contra os j bem estabelecidos timicrobianos um exemplo clssico em condies normais. A respeito
antibiticos de uso convencional de evoluo em resposta a uma forte dos microrganismos patognicos, a
quanto contra os antibiticos de lti- presso de seleo. Hospitais e ou- maior preocupao o surgimento
ma gerao (Austin D. J., et al., 1999), tros estabelecimentos constituem uma de cepas resistentes aos antimicrobi-
causando graves problemas de sade comunidade ecolgica particular, na anos disponveis. Entretanto, os mi-
pblica e vultosos prejuzos econ- qual diversos tipos de micrbios cir- crorganismos comensais estabelecem
micos. O impacto da crescente resis- culam e interagem entre si direta- um tipo de problema diferente da-
tncia de microrganismos a medica- mente, por meio da reproduo e da quele imposto pelos microrganismos
mentos e a substncias especficas troca de plasmdeos, e/ou indireta- patognicos. Sob condies normais,
tem movimentado vrios grupos de mente, por meio de interaes entre eles vivem em locais como a pele ou
30 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
o trato respiratrio, causando pouco
ou nenhum problema. Porm, quan-
do transferidos para regies estreis,
como a corrente sangnea e os pul-
mes, eles podem ser malficos e
provocar srios distrbios na sade
do hospedeiro (Stewart F. M., et al.,
1998).
Uma vez que os antimicrobianos
so introduzidos para tratar os verda-
deiros patgenos e no os comen-
sais, vrios fatores de transferncia
de resistncia so assim dissemina- Figura 1a:
dos e podem ser transmitidos a linha- Phyllomedusa tarsius:
gens sensveis, por meio do contato "Perereca da Floresta"
entre as clulas. Muitos fatores de - espcie amaznica
virulncia, como, por exemplo, os de
Staphylococcus aureus, so carrega-
dos por plasmdeos e podem ser resistncia meticilina (http:// empregados como os da classe dos
consignados entre diferentes linha- www.bhj.org/journal/1997/3901_jan/ benzimidazis, das estrobilurinas, das
gens. Sem dvida, esse o principal special_064.htm). fenoxiquinolinas e das anilinopirimi-
mecanismo para o rpido espalha- Infeces causadas por microrga- dinas (Steffens, J. J., et al., 1996).
mento de linhagens com resistncia nismos resistentes no atingem so- Nos ltimos anos, tem-se consta-
mltipla (Brock, T. D., et al.,1994). mente a sade humana. Na pecuria, tado que mesmo fungicidas de amplo
Alm disso, o problema da resistn- grandes so os problemas enfrenta- espectro de ao como o Benomyl,
cia introduz questes relacionadas dos pelos criadores de gado leiteiro tornaram-se alvo de resistncia. O
com a durao e com a intensidade susceptvel mastite, uma condio emprego deste fungicida tem-se mos-
do tratamento, com as estratgias que inflamatria da glndula mamria cau- trado cada vez mais ineficiente para
envolvem o uso de vrias drogas sada por bactrias, (S.aureus, E. coli combater a antracnose, doena pro-
concomitantemente e com o rigor e P. aeruginosa, principalmente) que vocada pelo gnero Colletotrichum
que deve ser obedecido por parte acarreta mudana das caractersticas sp., em culturas de diversas fruteiras
dos pacientes. fsicas do bere e do leite, em vacas. susceptveis e, sobretudo, contra a
As perdas na indstria leiteira dos doena da flor preta em morango
PROBLEMTICA DA Estados Unidos somam mais de dois (Tanaka, M. A. S., et al., 1997).
RESISTNCIA A DROGAS bilhes de dlares por ano. Os custos Conforme comentado anterior-
incluem a diminuio da produo e mente, o uso indiscriminado de dro-
A infeco hospitalar vem desper- a perda da qualidade do leite, seja gas o principal fator de induo
tando interesse no somente para a provocada pela inflamao propria- resistncia; contudo, a preveno
rea sanitria como tambm para a mente dita, seja causada pelo uso de desse abuso no garantia de que a
econmica, devido, sobretudo, ver- antibiticos para o tratamento e as susceptibilidade seja um fator rever-
satilidade com que os microrganis- despesas com veterinrios, com labo- svel, uma vez que os efeitos provo-
mos causadores tm driblado a ao ratrios e com a perda dos animais cados pelos antimicrobianos na fisio-
de drogas. A infeco hospitalar atin- (http://classes.aces.uiuc.edu/AnS- logia e ecologia dos microrganismos
ge dois milhes de norte-americanos ci308/mastitisintro.html). impossibilitam, cada vez mais, o re-
a cada ano e cerca de setenta mil O mesmo quadro pode ser verifi- torno ao estado de susceptibilidade
acabam morrendo. O S. aureus um cado no que diz respeito aos fitopa- anterior. Dessa forma, o uso de novas
dos microrganismos mais comumen- tgenos. O surgimento de resistncia tecnologias para o desenvolvimento
te encontrados em hospitais e um dos de fungos fitopatognicos de impor- de drogas mais eficazes constitui uma
principais agentes causadores da in- tncia agronmica considerado um estratgia promissora no campo da
feco hospitalar. A resistncia da fator limitante na eficcia e na vida biotecnologia, uma vez que possibi-
bactria S. aureus a antibiticos vem til das mais variadas estratgias de litar a iniciativa de prospeo de
crescendo assustadoramente, mesmo controle de doenas (Heaney S., et novas classes de molculas naturais
em se tratando de drogas poderosas al., 1994). Muitos gneros tais como e/ou sintticas, capazes de neutrali-
e de amplo espectro como a metici- Aspergillus, Botrytis, Venturia, Ustila- zar ou de danificar o patgeno-alvo
lina. Em 1981, 5% da populao de S. go, Marnaporte, Colletotrichum, Al- ao invs de inviabiliz-lo genetica-
aureus eram resistentes a este antibi- ternaria, Cercospora, Cladosporium mente, inibindo assim o desenvolvi-
tico. Dez anos depois a porcenta- e Penicillium, tm desenvolvido es- mento da resistncia (Heinemann, J.
gem aumentou para 38% e as estima- tratgias elegantes de resistncia con- A., et al, 2000). Atualmente, peptde-
tivas atuais so de cerca de 50% de tra os fungicidas mais amplamente os antimicrobianos de origem animal
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 31
gas como o LOCILEX, que um
creme de uso tpico com ao micro-
bicida e empregado no tratamento da
infeco de lceras diabticas. Alm
disso, derivados da magainina II tm
sido amplamente aplicados nas tera-
pias contra o cncer, no tratamento
de conjuntivites, de acne, de doenas
sexualmente transmissveis, de mico-
ses, alm de serem drogas promisso-
ras no tratamento da gripe (http://
www.magainin.com).

SUBSTNCIAS BIOATIVAS
DE ORIGEM NATURAL

Venenos e toxinas de origem na-


tural h muito representam uma fon-
te de fascnio para o homem, graas
aos seus extraordinrios efeitos far-
Figura 1b: Leptodactylus ocellatus: "R-Manteiga" - macolgicos. Sua utilizao cientfica
amplamente distribuda no Brasil tem contribudo com sucesso para a
elucidao de vrios mecanismos fi-
esto sendo utilizados como mode- diferenas significativas encontradas siolgicos, como demonstrado por
los para o desenho de novas drogas na sensibilidade entre os microrga- Claude Bernard em seus experimen-
com aplicao nas reas agrcola e de nismos e as clulas vegetais tm tos clssicos da dcada de 1850, com
sade. Para tanto, seqncias anfifli- mostrado que tais peptdeos podem o curare (Erspamer, V., 1994), as-
cas de peptdeos vm sendo dese- ser teis como modelos para o dese- sim como sua explorao industrial
nhadas, sintetizadas e testadas in vi- nho de genes de resistncia (Powell, para o uso teraputico, a exemplo de
tro, a fim de permitirem a obteno W. A., et al., 1995). vrias comunidades indgenas e na
de genes com potencial de resistn- O uso das magaininas na agricul- medicina popular (Daly et al. 1992).
cia a fitopatgenos, bem como com- tura no se restringe a cultivares Os vertebrados, mais precisamen-
postos ativos para a fabricao de frutferos ou alimentcios de um modo te os anfbios da ordem Anura, repre-
drogas de amplo espectro e de ml- geral, mas abrange tambm o ramo sentam um verdadeiro laboratrio de
tipla aplicabilidade. de plantas ornamentais geneticamente bioqumica, tendo em vista o arsenal
Um exemplo dessa abordagem modificadas, as quais expressam ge- de toxinas que fabricam. Nas clulas
so os anlogos sintticos da magai- nes de magaininas resistentes a fun- que revestem as paredes de glndu-
nina II, peptdeo proveniente da se- gos e outros patgenos causadores las granulares presentes na pele des-
creo da pele do anfbio africano de leses. Da mesma forma, a magai- ses animais produzida uma varieda-
Xenopus laevis (Zasloff, M., 1987) nina II j vem sendo utilizada como de de princpios ativos que compre-
que foram testados com sucesso na princpio ativo na fabricao de dro- endem molculas alifticas, aromti-
inibio da germina- cas e heterocclicas, alm
o de condios de de uma diversificada gama
Cryphonectria parasi- Figura 1c: de esterides, de alcali-
tica, Fusarium oxys- Dendrobates galactonotus: des, de aminas biogni-
porum f. sp. lycopersi- Espcie amaznica cas, de derivados guani-
ci, e Septoria musiva, dnicos, de protenas e de
e que no provoca- peptdeos, incluindo-se
ram nenhuma interfe- na produo desses dois
rncia detectvel na ltimos, seus precursores
germinao de plen e todo o sistema enzim-
dos organismos hos- tico envolvido na sua bi-
pedeiros, alm de se- ossntese. Essas molcu-
rem eficazes tambm las acumulam-se em gr-
contra as bactrias nulos, os quais compem
Agrobacterium tume- a luz de glndulas drmi-
faciens, Erwinia cas e so liberadas medi-
amylovora e Pseudo- ante estmulos apropria-
monas syringae. As dos. Seu papel muito
32 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
diversificado sobre as funes fi- daquele constitudo pelas clu-
siolgicas da pele ou na defesa las T e B do sistema imune, e
contra predadores e microrganis- detm a capacidade de promo-
mos. Grande nmero desses com- ver a sntese de peptdeos de
postos j se encontra caracteriza- baixa massa molecular com ati-
do estrutural e funcionalmente vidade antimicrobiana de am-
(Sebben, A. et al., 1993). plo espectro, efetivos contra bac-
Entre todos os tipos de mol- trias e fungos. Tal ocorrncia
culas mencionados acima, os pep- poderia explicar a acentuada
tdeos tm despertado bastante resistncia desses grupos de an-
interesse devido s suas ativida- fbios a doenas (Nicolas, P e
des como mediadores farmacol- Delfour, A., 1994).
gicos e descoberta de molculas O lume das glndulas sero-
homlogas ou anlogas em teci- sas e das parotides rico em
dos do trato gastrointestinal e grnulos que armazenam secre-
sistema nervoso de mamferos. O Figura 2: es txicas. Em situaes de perigo,
exemplo mais freqente de molcu- Exemplar adulto de Physalaemus um estmulo nervoso recebido pe-
las encontradas em ambos os grupos fuscomaculatus. Notar o aspecto las paredes glandulares provocando
so as taquicininas, as cerulenas, o granuloso da pele dorsal. Marca- a contrao da musculatura local e
hormnio liberador de tirotropina, as do pelo acmulo de glndulas causando uma descarga sincronizada
bobesinas e os peptdeos opiides granulosas do seu contedo. Aps a liberao da
(Erspamer, V. e Melchiorri, P., 1980). secreo, o sistema glandular inicia
O primeiro relato da ocorrncia seu processo de regenerao, que
de peptdeos com atividade antibac- pode variar de poucas horas a alguns
teriana e hemoltica na pele de anf- hidratao da pele por onde ocorrem dias, dependendo da espcie de an-
bio data de 1969, quando foi identi- cerca de 90% das trocas gasosas (Orr, fbio, at que o contedo do lume
ficada a bombinina, um peptdeo de R. T., 1986). glandular seja reconstitudo (Delfino,
24 resduos de aminocidos, prove- As glndulas granulares, tambm G., et al., 1990).
niente da secreo cutnea do anuro chamadas glndulas serosas ou de
europeu Bombina variegata (Csor- veneno, podem estar distribudas ao PEPTDEOS ANTIMICROBIANOS
das, A. e Michl, H., 1970). No final da longo de todo o corpo ou concentra-
dcada de 1980, foram isoladas as das em algumas reas, formando pro- Mais de cinqenta peptdeos anti-
magaininas de Xenopus laevis (Zaslo- tuberncias, especialmente na regio microbianos de anfbios j foram iso-
ff, M., 1987) e, somente a partir da, dorsal do animal (Duellman, E. W. e lados, tendo como principal caracte-
outros peptdeos com atividade mi- rstica a natureza catinica e a capa-
crobicida de origens diferentes co- cidade de permeabilizar membranas
mearam a ser estudados mais deta- de microrganismos. Podem ser agru-
lhadamente. Atualmente, as magaini- pados segundo sua estrutura prim-
nas representam uma das mais bem ria e muitos so encontrados em
estudadas classes de peptdeos anti- indivduos do mesmo gnero e at
biticos, os quais so considerados mesmo em indivduos de gneros
efetores da imunidade inata, agindo distintos, pertencentes mesma subfa-
em uma primeira linha de defesa mlia ou no. Em 1970, a bombinina
contra infeces bacterianas e fngi- foi descrita como um peptdeo anti-
cas nos organismos superiores (Zas- bacteriano e hemoltico isolado da
loff, M., 1992; Boman, H. G., 1995; Figura 3: secreo da pele do anfbio B. varie-
Corte histolgico da pele de anf-
Nicolas, P., 1995; Barra, D., et al., gata (Csordas, A. e Michl, H., 1970).
bio mostrando a epiderme (E) e as
1998). Pouco tempo depois, outras bombi-
glndulas granulosas (G) e muco-
ninas foram detectadas na secreo
sas (M) localizadas na derme.
GLNDULAS DE VENENO do mesmo anfbio, as quais diferiram
Aumento: 100 X
entre si por poucos resduos de ami-
Colorao: Azul de toluidina
Especificamente nos anfbios h nocidos (Simmaco, M., et al., 1991).
pelo menos dois tipos de glndulas Peptdeos do tipo bombinina tam-
drmicas denominadas mucosas e Trueb, L., 1986). Em muitas espcies, bm foram isolados da espcie B.
granulares, alm das glndulas paro- essas glndulas, juntamente com as orientalis e mostraram pouqussima
tides posteriores aos olhos da mai- glndulas parotides secretam subs- variao em relao aos encontrados
oria dos anuros. As mucosas encon- tncias bioativas que constituem um em B. variegata. As bombininas pos-
tram-se distribudas no tegumento e novo sistema de defesa coordena- suem amplo espectro de ao contra
sua secreo umectante promove a do pelo sistema nervoso, diferente microrganismos em geral, porm apre-
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 33
sentam toxicidade se- zante. As dermaseptinas
letiva contra clulas Peptdeos Anfbios so molculas catini-
sangneas, provocan- Magaininas Xenopus sp. cas de 24 a 34 resduos
do a lise das mesmas Bombininas Bombina sp. de aminocidos que for-
(Gibson, B. W., et al., Dermaseptinas Phyllomedusa sp. mam uma cadeia linear
1991). Brevininas Rana brevipoda com estrutura secund-
A secreo da pele Caerinas Litoria sp. ria aleatria em solven-
de Xenopus laevis tam- Gaegurinas Rana rugosa te aquoso, porm orde-
bm tem sido objeto Rugosinas Rana rugosa nada (-hlice) quan-
de intensa investigao. Buforina Bufo bufo do em meio apolar (Mor,
Nessa secreo, foram Ranalexinas Rana catesbeiana A., et al., 1991; Mor, A.
detectados o TRH (hor- Xenoxinas Xenopus sp. e Nicolas, P., 1994a; Mor,
mnio liberador de ti- Temporinas Rana temporaria A., et al., 1994; Mor, A.
rotropina), a xenopsi- Maculatinas Litoria genimaculata e Nicolas, P., 1994b).
na e a cerulena, com Esculentinas Rana esculenta Outras espcies, tais
potente atividade hipo- Pipininas Rana pipiens como P. rhodei e P.
tensora. Alm desses PGLa Xenopus laevis burmeisteri, tambm
peptdeos bioativos, Xenopsina (fragmento precursor) Xenopus laevis tm sido investigadas
foram encontrados ain- Levitdeo (fragmento precursor) Xenopus laevis como provveis produ-
da peptdeos homlo- Cerulena (fragmento precursor) Xenopus laevis toras de peptdeos anti-
gos s bombininas, de- Cerulena Litoria cerulea microbianos, da famlia
nominados magaini- Frenatina Litoria infrafrenata das dermaseptinas.
nas, que tambm so Alm disso, peptdeos
encontradas no estmago do anfbio, no que se refere ao contedo de relacionados com as dermaseptinas
porm sem funo definida nesse peptdeos antimicrobianos da pele. foram detectados em outros hildeos
rgo. Foram detectados peptdeos com ati- dessa subfamlia, nas espcies Pa-
Os peptdeos de defesa isolados vidade antimicrobiana nas espcies chymedusa dacnicolor e Agalychnis
da pele de Xenopus sp. esto agrupa- R. esculenta (Simmaco, M., et al., annae, ambas provenientes da Am-
dos em subfamlias de acordo com 1993, 1994), R. brevipoda (Morikawa, rica Central (Wechselberger, C., 1998)
sua origem biossinttica. A xenopsi- N., et al., 1992), R. catesbeiana (Cla- .
na e a cerulena so molculas de rk, D. P., et al., 1994) R. rugosa (Park, As dermaseptinas exercem ativi-
estrutura e atividades farmacolgicas J. M., et al., 1994; Suzuki, S., et al., dade ltica sobre bactrias gram-posi-
anlogas s da neurotensina e da 1995) e R. temporaria (Simmaco, M., tivas e gram-negativas, protozorios
gastrina/CCK (colecistocinina) dos et al., 1996) denominados esculenti- ciliados, leveduras e fungos filamen-
mamferos, respectivamente. Esses nas, brevininas, ranalexinas, rugosi- tosos em concentraes micromola-
peptdeos adotam a estrutura de h- nas e temporinas, respectivamente. A res (Fleury, Y., et al., 1998). Contudo,
lice anfiflica quando em ambiente particularidade encontrada nos pep- tais efeitos citolticos no foram ob-
hidrofbico, sendo ativos em doses tdeos desse gnero a sua estrutura- servados em clulas de mamferos,
micromolares contra uma variedade o secundria, a qual decisiva no devido, possivelmente, estrutura e
de bactrias gram-positivas, gram- modo de interao toxina/microrga- composio da membrana celular
negativas, fungos e leveduras (Be- nismo, distinta de todas as outras at desses animais. De fato, estudos de
vins, C. L. e Zasloff, M., 1990). As ento descritas (Simmaco M., et al., citlise usando lipossomas de dife-
magaininas I e II so peptdeos ho- 1998). rentes composies fosfolipdicas e
mlogos que possuem um amplo Na Amrica do Sul, os hildeos da crescente concentrao de colesterol
espectro de ao antimicrobiana. Em subfamlia Phyllomedusinae consti- (caracterstica de animais superiores)
doses micromolares, interrompem o tuem uma fonte muito rica de pept- mostraram maior resistncia dessas
crescimento e/ou induzem a lise os- deos antimicrobianos. Atualmente membranas artificiais ruptura (Ba-
mtica de diversos tipos de bactrias quatro espcies do gnero Phyllome- tista, C. V. F., 1999). A adenoregulina
gram-positivas e gram-negativas e de dusa vm sendo estudadas: P. bicolor de P. bicolor um peptdeo de estru-
protozorios. Elas so capazes de (Daly, J. W., et al., 1992; Mor, A., et al., tura similar s dermaseptinas, mas foi
induzir uma lise irreversvel das clu- 1994; Charpentier, S., et al., 1998), P. isolada primeiramente por sua fun-
las tumorais hematopoiticas e de sauvagei (Mor, A., et al., 1991; Mor, A. o farmacolgica neurotransmisso-
tumores slidos de diversas origens, e Nicolas, P., 1994a), P. distincta ra, que consiste na sua capacidade de
mas no provocam efeito sobre clu- (Batista, C., et al., 1999) e P. tarsius induzir a ligao de agonistas aos
las diferenciadas de eucariotos (Zas- (Prates, M. V., 1999). Nesse gnero receptores A1 de adenosina, prova-
loff, M., 1987). foram detectados potentes agentes velmente devido presena de D-
As espcies do gnero Rana de antimicrobianos denominados der- aminocidos em sua composio
diferentes reas geogrficas tm-se maseptinas, com amplo espectro de (Daly, J. W., et al., 1982). Posterior-
mostrado igualmente interessantes, atividade antimicrobiana e cicatri- mente, foi relatada sua atividade an-
34 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
timicrobiana, semelhante a das ou- madoras de bombas, as quais podem idntica ou similar nos mamferos e
tras dermaseptinas. ser a chave para a elucidao do invertebrados. Sua presena nos ver-
Da mesma forma, muitas espcies mecanismo de resistncia contra di- tebrados, considerada como efetora
australianas de anfbios do gnero versas classes de antibiticos (Stover, ancestral da imunidade, possui muito
Litoria tm sido estudadas por apre- C. K., 2000). A hiptese aceita atual- mais que um significado vestigial.
sentarem peptdeos antimicrobianos. mente sugere que bactrias gram- No que diz respeito s vantagens,
As espcies L. xanthomera e L. chloris negativas, grupo do qual a P. aerugi- no surpreendente o que esse
revelaram a presena de peptdeos nosa faz parte, podem resistir ao sistema de defesa qumica pode
antimicrobianos denominados caeri- efeito letal de muitos antimicrobia- conferir ao hospedeiro. De fato, um
nas (Stone, D. J. M., et al., 1992; nos, utilizando uma estratgia de repertrio fixo, porm extenso, de
Steinborner, S. T., et al., 1997; Stein- bombeamento dos agentes qumicos pequenos peptdeos antimicrobia-
borner, S. T., et al., 1998), e as esp- para fora das clulas bacterianas mais nos oferece aos animais superiores
cies L. splendida e L. cerulea, o pep- rapidamente do que seu acmulo no um modo de controle particular-
tdeo cerulena, todos ativos contra interior destas. Dessa forma, tais pro- mente rpido e eficaz contra a pro-
bactrias gram-positivas (Stone, D. J. tenas formadoras de bombas teriam liferao microbiana (Nicolas, P. e
M., et al., 1992; Waugh, R. J., et al., a capacidade de conferir a essas Delfour, A., 1994).
1993). J as espcies L. infrafrenata e bactrias a propriedade de resistn- As possibilidades de aplicao
L. genimaculata apresentaram pept- cia (Nikaido, H., 1998). Ainda no foi dos peptdeos antimicrobianos pela
deos denominados frenatinas e ma- esclarecido o procedimento da evo- agroindstria, assim como pela in-
culatinas (Raftery, M. J., et al., 1996; luo das bombas. Especula-se que dstria farmacutica, so inmeras.
Rosek, T., et al., 1998), sendo o elas teriam surgido da necessidade Um trabalho sistemtico de prospe-
primeiro de amplo espectro e o se- dos microrganismos em eliminar to- o dessas molculas, com identifi-
gundo, com atividade semelhante xinas naturalmente presentes no seu cao e sntese qumica em larga
das caerinas. ambiente (Greenberg, E. P., 2000). escala, possibilitar, no somente
Na tabela, esto listados os princi- Sabendo disso, torna-se cada vez um grande avano na produo de
pais peptdeos com atividade antimi- mais importante a investigao e a novas drogas, melhor conhecimen-
crobiana encontrados nas secrees descoberta de drogas capazes de atu- to biolgico das espcies doadoras,
da pele ou em outros rgos de arem diretamente sobre a parede e a reconhecimento do valor de cada
anfbios anuros. membrana plasmtica, provocando uma delas, como novas categorias
lise e morte celular, ao primeiro con- de recursos genticos e, por fim, a
CONCLUSO tato. At onde se tem registro, sabe- necessidade de preservao desses
se que mesmo os mais sofisticados animais.
O recente progresso da indstria mecanismos de defesa desenvolvi- Agradecimentos: Os autores de-
farmacutica relacionado com a des- dos pelos microrganismos ainda no sejam agradecer ao Professor Ant-
coberta e a produo de novos agen- so suficientes para neutralizar uma nio Sebben pelas fotos deste artigo,
tes antimicrobianos no vem alcan- ao do tipo detergente produzida EMBRAPA-CENARGEN e Funda-
ando o sucesso desejado na conten- por peptdeos de carter catinico. o Universidade de Braslia.
o da mutagnese de resistncia a O modo de defesa mediado pela
drogas desenvolvida pelos microrga- resposta humoral e celular confere Referncias Bibliogrficas
nismos. Enquanto os mecanismos de aos vertebrados uma proteo espe-
resistncia criados por muitos micr- cfica e de longa durao contra os AUSTIN, D. J., KRISTINSSON, K.
bios vm-se tornando cada dia mais microrganismos patognicos, porm G. e ANDERSON, R. M., (1999).
eficazes, as drogas conhecidas mos- no de forma alguma adaptado Proc. Natl., Acad. Sci. USA, 96:1152-
tram-se cada vez menos eficientes no para responder rapidamente e de 1156.
combate s patologias. A resistncia maneira eficaz a uma invaso micro- BATISTA, C. V. F. (1999) Tese de
microbiana a drogas um problema biana local, por ocasio de uma le- Doutorado, Universidade de Bras-
complexo, uma vez que consiste no so. Uma das descobertas mais inte- lia-DF.
produto de um processo natural e, ressantes a esse respeito revelou que, BATISTA, C. V. F., SILVA, L. R.,
muito mais que isso, essencial, no alm da resposta imune celular alta- SEBBEN, A., SCALONI, A., FERRA-
somente para a origem, como tam- mente especfica, os vertebrados pos- RA, L., PAIVA, G. R., OLAMENDI-
bm para a evoluo de todos os suem um mecanismo qumico de PORTUGAL, T., POSSANI, L. D. e
seres vivos, o qual fundamenta-se na defesa, composto por peptdeos an- BLOCH JR., C. (1999). Peptides
mutao espontnea, na transfern- timicrobianos, anlogo ao encontra- 20:679-686.
cia e recombinao de genes, crian- do em invertebrados (Boman, H. G. BARRA, D., SIMMACO, M. e BO-
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Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 35
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36 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento


Anncio Novo
(O fotolito est sendo
enviado pelos Correios)

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 37


Emisso de Gases de
PESQUISA
Efeito Estufa Magda Aparecida de Lima
Embrapa Meio Ambiente
Jaguarina, SP
magda@cnpma.embrapa.br

Emisso de gases de efeito estufa provenientes de sistemas agrcolas no Brasil


Fotos cedidas pela autora

umentos recentes na nejo das culturas, assim como nos produo em reas tropicais e subtro-
concentrao de gases sistemas sociais, econmicos e de picais, principalmente na frica sub-
trao na atmosfera, de- polticas pblicas. A mudana climti- Saara, devido s grandes reas de
vido atividade antr- ca pode afetar a produo agrcola de clima rido e semi-rido e sua depen-
pica, tm levado a um vrias formas: pela mudana nos fato- dncia de agricultura, tende a ser mais
impacto no balano de res climticos, includos a freqncia afetada em relao s regies tempe-
entrada e sada de radiao solar do e a severidade de eventos extremos; radas (Jones et al., 1997, CGIAR, 1998).
planeta, tendendo ao aquecimento da Ao mesmo tempo em que constitui
superfcie da terra. A mudana na uma atividade potencialmente influ-
radiao lquida mdia no topo da encivel pela mudana do clima, a
troposfera, decorrente de uma altera- agricultura tambm contribui para o
o na radiao solar ou infraverme- efeito estufa, com emisses de gases
lha, designada forante radiativa. como o metano (CH4), dixido de
Os principais gases responsveis pelo carbono (CO2), monxido de carbono
efeito estufa adicional so: o dixido (CO), xido nitroso (N2O) e xidos de
de carbono (CO2), o metano (CH4), o nitrognio (NOx). Estimam-se que 20%
xido nitroso (N2O), clorofluorcarbo- do incremento anual da forante radi-
nos (CFCs) e oznio (O3). Estima-se ativa global so devidos ao setor agr-
que, se a taxa atual de aumento desses cola considerando-se o efeito dos ga-
gases no planeta continuar pelo prxi- Figura 1: Contribuio relativa ses metano, xido nitroso e gs carb-
mo sculo, as temperaturas mdias de gases provenientes de nico (baseado em IPCC, 1996a), ex-
globais subiro 0,3oC por dcada, com atividades antrpicas ao efeito cluda a frao correspondente s
uma incerteza de 0,2 oC a 0,5 oC por estufa (baseado em Krupa, mudanas do uso da terra relaciona-
dcada (Cotton & Pielke, 1995), de 1997) das com as atividades agrcolas (15%).
modo que, no ano 2100, o aquecimen- O metano e o xido nitroso so os
to global estaria compreendido na principais gases emitidos pelo setor
faixa de 1,0 a 3,5 oC (European Comis- pelo aumento da produo, devido ao agropecurio, e contribuem com 15%
sion, 1997). A Figura 1 mostra a con- efeito fertilizador do carbono por cau- e 6%, respectivamente, para a forante
tribuio relativa de gases para o au- sa da maior concentrao de CO2 radiativa global (Cotton & Pielke, 1995).
mento da forante radiativa global, e a atmosfrico; pela alterao da intensi- As fontes agrcolas de gases de efeito
Tabela 1 mostra as atividades princi- dade da colheita, devido a uma mu- estufa so o cultivo de arroz irrigado
pais responsveis pelas emisses, tem- dana no nmero de graus-dia de por inundao, a pecuria, dejetos
po de permanncia e taxa atual de crescimento, ou devido a modificao animais, o uso agrcola dos solos e a
acrscimo desses gases na atmosfera. da ocorrncia e a severidade de pra- queima de resduos agrcolas. O culti-
A agricultura uma atividade alta- gas e doenas (Shaw, 1997), entre vo de arroz irrigado por inundao, a
mente dependente de fatores climti- outros efeitos. Estudos baseados em pecuria domstica e seus dejetos,
cos, como temperatura, pluviosidade, modelos de circulao geral (GCM) assim como a queima de resduos
umidade do solo e radiao solar. Os tm mostrado que a produtividade de agrcolas promovem a liberao de
principais efeitos das alteraes des- vrias culturas tende a diminuir em metano (CH4) na atmosfera. Estima-se
ses fatores na agricultura certamente algumas regies do globo e a aumen- que cerca de 55% das emisses antr-
incidiriam na produtividade e no ma- tar em outras, de tal modo que a picas de metano provm da agricultu-

38 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 1


Tg = 1012 gramas
Tabela 1- Gases trao atmosfricos significantes para o aumento do efeito estufa (krupa, 1997)

Gs Carbnico Metano xido Clorofluor- Oznio Monxido Vapor dgua


(CO2) (CH4) Nitroso carbonetos (O3) de Carbono (H2O)
Principal Combustveis Cultivo de (N2O) (CFCs) Hidrocarbonetos (CO) Converso de
fonte fsseis, arroz Fertilizantes, Refrigeradores, (com NOx), Combustveis uso da terra,
antrpica desflorestam- inundado, converso aerossis, queima de fsseis, irrigao
ento pecuria, do uso da processos biomassa queima de
combustveis terra industriais biomassa
fsseis,
queima de
biomassa
Tempo de 50-200 anos 10 anos 150 anos 60-100 anos Semanas a meses dias
vida na meses
atmosfera
Taxa anual 0,5% 0,9% 0,3% 4% 0,5-2,0% 0,7-1,05 desconhecido
atual de
aumento
Contribuio 60% 15% 5% 12% 8% - desconhecido
relativa ao
efeito estufa
antrpico

ra e da pecuria juntas (IPCC,1995). gases trao potencialmente aplicveis produo de metano, tendo como
Os solos agrcolas, pelo uso de fertili- ao setor agropecurio brasileiro. Dado origem as razes mortas de plantas de
zantes nitrogenados, fixao biolgi- que o metano constitui o principal gs arroz, as algas e plantas aquticas na
ca de nitrognio, adio de dejetos produzido por atividades agrcolas no gua de inundao, exudatos de ra-
animais, incorporao de resduos cul- pas, uma ateno especial dada zes (secrees) de plantas de arroz,
turais, entre outros fatores, so res- neste artigo s opes para a sua fertilizantes orgnicos adicionados e a
ponsveis por significantes emisses reduo. matria orgnica existente no solo. Os
de xido nitroso (N2O). A queima de materiais mais facilmente degradveis
resduos agrcolas nos campos libe- (como exudatos de razes de plantas
ram, alm do metano (CH4), tambm Opes e medidas para a de arroz, adubo verde) contribuem
xido nitroso (N2O), xidos de nitro- reduo das emisses de para taxas mais elevadas de produo
gnio (NOx) e monxido de carbono gases de efeito estufa de metano. Alm do tipo de substrato
(CO). orgnico, a composio, a textura e,
Criada em 1992, durante a Confe- Campos inundados de arroz principalmente, a temperatura dos so-
rncia das Naes Unidas sobre Meio los so fatores que influenciam a pro-
Ambiente e Desenvolvimento, com a O cultivo de arroz irrigado por duo de metano nos campos de
finalidade de proteger o sistema cli- inundao (Foto 1) uma importante arroz inundado. O metano produzido
mtico global para as presentes e fonte de emisso de metano (CH4), nos campos de arroz liberado para a
futuras geraes, a Conveno Qua- contribuindo com 16% das emisses atmosfera por vrias rotas, sendo a
dro de Mudana do Clima estabeleceu antrpicas de metano (Figura 2). Es- principal delas por transporte difusivo
compromissos para os pases signat- tima-se em 20 a 100 teragramas1 (m- pelo aernquima (tecido vascular de
rios, a fim de que estes se responsabi- dia de 60 Tg) por ano a taxa de aerao). Segundo demonstrado por
lizassem pela elaborao de inventri- emisso desse gs nos campos de Bont et al. (1978), a presena de
os peridicos das emisses antrpicas arroz irrigado (IPCC, 1995). O metano plantas de arroz facilita o escape de
de gases e pela formulao e imple- produzido nos solos inundados, metano para a atmosfera na ordem de
mentao de programas nacionais vol- durante a decomposio anaerbia de 7 a 10 vezes mais que solos inundados
tados para a mitigao da mudana do substncias orgnicas, mediante a ao sem cultivo de arroz. A formao de
clima, bem como pela promoo e de bactrias (metanognicas). A con- bolhas de gs na superfcie da gua e
cooperao para o desenvolvimento, dio mais importante para a sua sua difuso na gua do solo constitu-
aplicao e difuso de tecnologias, formao de anaerobiose (ausncia em outras vias de escape de metano a
prticas e processos de reduo ou de oxignio), que ocorre no solos sob partir desses sistemas agrcolas.
preveno das emisses de gases de inundao. A matria orgnica rica em Do total de metano gerado por
efeito estufa. A seguir, so identifica- carbono presente nesses solos consti- essa fonte, cerca de 90% so atribu-
das algumas opes de reduo de tui o fator mais importante para a dos ao continente asitico. No Brasil,

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 39


estima-se uma con- dos resduos da cultura
tribuio de 0,3 Tg do algodo, para contro-
(Tg = 1012 gramas) de le fitossanitrio. Embora
metano proveniente ocorra liberao de CO2
do cultivo de arroz durante a queima da
irrigado (Embrapa, cana-de-acar, as emis-
1998). Essa cultura re- ses desse gs no so
presenta cerca de consideradas como uma
55% do total de arroz emisso lquida ao longo
produzido no pas, do tempo por esses siste-
embora este seja ain- mas, pois, no ciclo se-
da um grande impor- guinte da cultura, o CO2
Figura 2: Fontes globais de
tador de arroz (mais de 1/4 da emitido reabsorvido (IPCC, 1996b).
produo nacional). emisso de metano proveni- No Brasil estima-se que a queima
Desde que a produo de me- ente de atividades antrpicas de cana-de-acar e de resduos de
tano ocorre em solos sob condi- (baseado em IPCC, 1995) algodo herbceo, juntos, gerem emis-
es de anaerobiose, regimes de ses de 2,8 Tg de CO, 0,1 Tg de CH4,
inundao intermitentes, condici- 0,006 Tg de N2O e 0,2 Tg de NOx
onados s precipitaes pluvio- (Embrapa, 1999a). As emisses de
mtricas, ou de mltipla aerao composta e humificada, fornecendo gases provenientes da queima de cana-
devem promover reduo das menos substrato para as bactrias me- de-acar correspondem a 97% des-
emisses de metano. Outras op- tanognicas. ses totais. A cultura do algodo herb-
es de reduo incluem: ceo, alm de apresentar produes
a) melhoramento vegetal de- Queima de biomassa na bem menores (cerca de 1,3 milhes de
senvolvimento de novas cultiva- agricultura toneladas, em 1994, segundo IBGE
res, seleo e gerao de plantas (1997)), proporcionalmente cana-
de arroz com baixas taxas de emis- A combusto da biomassa de res- de-acar (292 milhes de toneladas),
ses de metano. De acordo com duos de colheita e de culturas agrco- tem empregado cada vez menos a
estudos de Minami & Neue (1994), las na pr-colheita (Foto 2), como prtica de queima dos resduos aps a
as variaes no coeficiente de di- prtica agrcola, leva produo de colheita. Entre as medidas possveis
fuso na transio da raiz para o metano, xido nitroso (N2O), xidos para reduzir as emisses de gases
aernquima parecem desempenhar de nitrognio (NOx) e monxido de provenientes da queima de resduos
um importante papel na emisso carbono (CO), alm do dixido de agrcolas no Brasil destacam-se: a)
de metano entre as variedades de carbono (CO2). O fogo libera carbono corte mecnico da cana-de-acar e
arroz. da biomassa durante a combusto e aproveitamento energtico da biomas-
b) acelerao da decomposi- acentua diretamente a liberao de sa, com consequente diminuio de
o de metano atravs da oxida- carbono do solo do qual a vegetao desperdcios de matria vegetal e ener-
o por breves interrupes da foi queimada. No Brasil freqente a gia; b) a reduo de queimadas de
inundao. O aumento da drena- queima de cana-de-acar na pr- culturas e de seus resduos; c) uso de
gem de gua (troca da lmina colheita (para auxiliar a colheita ma- prticas agrcolas de conservao dos
dgua) e a secagem intermitente nual), e, em menor escala, a queima solos; d) aplicao e implantao de
do solo ou no fim da esta- legislao relacionada com
o de crescimento resul- o controle de queimadas nas
ta na oxidao do metano unidades de federao.
retido no solo. Sabe-se,
contudo, que ciclos alter- Pecuria
nativos de anaerobiose e
aerobiose, que favorecem Herbvoros ruminantes,
a reduo das emisses de como bovinos, ovinos, bu-
metano, aumentam a emis- balinos e caprinos produ-
so de N2O, quando com- zem metano atravs da fer-
parado s condies de mentao entrica, um pro-
anaerobiose ou aerobiose cesso digestivo que ocorre
permanentes. no rmen. As emisses glo-
c) modificao do ma- bais desse gs geradas a
nejo de fertilizao, de for- partir dos processos entri-
ma que se opte pela adio de Figura 3: Principais fontes cos so estimadas em 80 milhes de
material orgnico compostado, antrpicas de emisses de xido toneladas anuais, correspondendo a
onde a matria orgnica facilmen- nitroso (N2O) para a atmosfera cerca de 22% das emisses totais de
te mineralizvel encontra-se j de- (baseado em IPCC, 1995) metano geradas por fontes antrpicas
40 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
(U.S.EPA, 2000) (Figura 2). em pases africanos e asiticos, esti- meio de suplementao alimentar,
A produo de metano d-se tam- mam-se emisses entre 36 a 56 kg de controle de zoonoses, melhoramento
bm a partir dos dejetos animais, prin- metano/animal/ano (IPCC, 1995). gentico e de taxas de reproduo, e
cipalmente quando manipulados na A intensidade da emisso de meta- outras melhorias, pode contribuir para
forma lquida, em condies de anae- no depende do tipo de animal, da a estratgia de reduo das emisses
robiose. As emisses globais de meta- quantidade e grau de digestibilidade de metano por unidade de produto
no provenientes dessa fonte so esti- da massa digerida e do esforo ao qual (Embrapa, 1999d). Com esse intuito,
madas em cerca de 25 milhes de o animal submetido. Em bovinos, a programas governamentais de apoio
toneladas por ano (IPCC, 1995), cor- taxa de converso em metano esti- produo animal, muitos deles atu-
respondendo a 7% das emisses totais mada, em mdia, em 6% da energia almente em fase de implementao,
de metano. bruta do alimento ingerido. Desde so fundamentais para o alcance deste
No Brasil, 68% da pecuria repre- que a produo de metano varia de objetivo. A bioengenharia de alimen-
sentada por bovinos (87% de corte e acordo com a quantidade e qualidade tos uma oportunidade a ser explora-
13% de leite, aproximadamente), com do alimento digerido (U.S.EPA, da no melhoramento da eficincia dos
pouco mais de 163 milhes de animais 1990a,b), as vrias modalidades e con- processos microbianos com vistas
em 1998 (IBGE, 2000), sendo conside- dies de sistemas de criao de ani- otimizao da digesto de fibras no
rado o maior rebanho bovino do mais domsticos implicam fatores di- rmen e sntese microbiana. Outras
mundo com fins comerciais. Grande possibilidades incluem o desenvolvi-
parte desses animais do tipo zebu- mento de organismos que oxidam
no, criados em sistemas predominan- metano ou outros sumidouros de hi-
temente extensivos, de baixo investi- drognio no rmen, usando engenha-
mento de capital (Foto 3). O aumento ria gentica (Embrapa, 1999b).
da produo animal tem sido devido, O desenvolvimento de modernas
em grande parte, ao elevado nmero tcnicas de medio e de monitora-
de animais e no tanto da produtivida- mento das emisses de gases trao
de. A produtividade mdia anual de tm propiciado a avaliao das emis-
leite no pas, como exemplo, de ses de metano em pequenos e gran-
pouco mais de 1.000 kg/vaca/ano, des ruminantes, sob diferentes siste-
Foto 1: Cultivo de arroz irrigado
para um total de 17 milhes de vacas mas de produo. Para animais man-
por inundao fonte antrpica
ordenhadas, segundo dados do Insti- tidos em regime de pastagens, desta-
de emisso de metano para a
tuto Brasileiro de Geografia e Estats- ca-se a tcnica do traador (interno)
atmosfera
tica - IBGE), e, mesmo assim, a produ- hexafluoreto de enxofre (SF6) (John-
o nacional, em 1998, totalizou cerca son & Johnson (1995)). Nessa tcnica,
de 20 bilhes de litros. um dispositivo de permeao, que
Do total das emisses de metano ferentes de emisso de metano. libera o SF6 a uma taxa conhecida,
no Brasil, a pecuria, atravs da fer- As opes de reduo das emis- colocado no rmen do animal, de
mentao entrica e dos dejetos, con- ses de metano na atividade pecuria modo que amostras de metano so
tribui com cerca de 96% do total, com esto associadas ao aumento da pro- coletadas nas proximidades da boca e
emisses estimadas em 9,7 Tg de CH4, dutividade animal, com o objetivo de do nariz do animal (Foto 4- Foto do
em 1994 (Embrapa, 1999b). Desse se obterem maiores valores de produ- Tom Wirth, USEPA). Assume-se nes-
total, a pecuria bovina contribui com o animal por quantidade de metano se mtodo que o padro de emisso
96% das emisses, sendo que as ou- emitido. de SF6 simule o padro de emisso de
tras categorias de animais (bubalinos, Ruminantes manejados extensiva- CH4. As concentraes do metano e
muares, caprinos, asininos, eqinos, mente podem ter suas emisses redu- do traador so ento determinadas
sunos), juntas, so responsveis pe- zidas por meio da melhoria da diges- pela cromatografia gasosa ou outro
los 4% restantes das emisses de me- to fermentativa no rmen, adminis- mtodo de quantificao. A partir da
tano. As emisses provenientes de trando-se dietas a base de uria e de taxa conhecida de liberao do traa-
sunos so consideradas negligenci- protenas e fornecendo nutrientes vi- dor no rmen e das concentraes de
veis (1kg CH4/animal/ano). tais. No Brasil, onde a maior parte das metano e do traador nas amostras de
Os fatores de emisso de metano, emisses de metano provm de reas gs, calcula-se o metano produzido
que so obtidos a partir do consumo extensivas de pastagem, a suplemen- pelo animal (U.S.EPA, 2000). Outros
de alimento e da taxa de sua conver- tao alimentar de gado em pasto com mtodos de medio empregados so:
so em metano, variam em funo do protenas constitui um fator limitante mtodo de cmara fechada, (para ani-
sistema de produo e das caracters- para significante parte das proprieda- mais confinados), mtodo de traador
ticas dos animais. Para bovinos de des rurais. Devem ser, pois, investiga- externo e mtodo micrometeorolgi-
leite, por exemplo, os valores mdios das alternativas alimentares, em fun- co.
de fatores de emisso podem variar de o dos recursos naturais, condies Por meio de estimativas acuradas
81 a 118 kg de metano/animal/ano na climticas e estrutura scio-econmi- das taxas de emisso de metano deri-
Amrica do Norte e em pases do leste ca especficas de cada regio. O au- vada de ruminantes, bem como do
europeu, respectivamente, enquanto, mento da produtividade animal por seu monitoramento, com base no uso
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 41
de tcnicas como as acima descritas, cado no sistema solo-vegetao. atravs da mineralizao da matria
possvel se estabelecerem diferentes A implantao de florestas (reflo- orgnica. As emisses de N2O dos
estratgias de manejo animal voltadas restamentos) ou culturas permanen- solos ocorrem como conseqncia
para a reduo das emisses de meta- tes em reas degradadas por ativida- dos processos microbiolgicos de
no por unidade de produto (leite, des agrcolas, alm da recomposio desnitrificao e nitrificao, a partir
carne, etc.). vegetal de reas ribeirinhas e de pro- de nitrognio mineral. A desnitrifica-
teo ambiental (como as de risco de o2 , que o processo mais importan-
Solos Agrcolas eroso, montantes de bacias de abas- te nesse caso, consiste na reduo
tecimento, etc.), so oportunidades microbiana do nitrato (NO3-) a formas
Os solos so um importante reser- para capturar (ou sequestrar) carbono intermedirias de N, e ento a formas
vatrio de carbono ativo, orgnico e atmosfrico, ao mesmo tempo que gasosas (NO, N2O e N2) liberadas na
inorgnico, e desempenham um im- restauram outras propriedades ambi- atmosfera (Embrapa, 1999c). As esti-
portante papel no ciclo do carbono entais e influi em indicadores econ- mativas globais de emisso de N2O
global. A agricultura tem sido respon- micos. Programas de reflorestamento indicam uma mdia de 5,7 Tg N/ano
svel por significativas perdas de car- e recuperao de reas de proteo (IPCC, 1995), sendo que os solos cul-
bono pelo solo, atravs de prticas ambiental vm sendo implementadas tivados e os dejetos da pecuria con-
agrcolas de baixa sustentabilidade tribuem com quase 70% do total das
ambiental. Entre essas prticas, citam- fontes (Figura 3). No Brasil, os dejetos
se a arao excessiva, gradeao e animais depositados nos solos consti-
desmatamentos, que expem os solos tuem uma das principais fontes de
a processos de eroso e compactao emisso de xido nitroso (0,1 Tg N/
e, por conseguinte, reduo dos ano). Algumas das medidas de redu-
nveis de matria orgnica no solo. o das emisses de xido nitroso
Alm disso, fatores como a fertilizao so: o uso eficiente de fertilizantes
inadequada, a queima de restos cultu- sintticos, o tratamento de dejetos
rais e o cultivo intensivo das terras, animais, manejo de nutrientes do solo,
contribuem para o aumento dessas uso de inibidores de nitrificao, inte-
perdas. Em contraste, prticas agrco- grao da agricultura e pecuria.
las que restauram a capacidade dos O setor agropecurio pode contri-
solos como reservatrio de carbono buir para a mitigao da mudana do
incluem: reflorestamento, cultivo de clima pela aplicao de diferentes
culturas perenes (culturas extrativis- prticas de reduo das emisses de
tas, como seringueira, cacau, casta- gases de efeito e pela proteo e
nhas, fruticultura, etc.), uso adequado expanso de sumidouros e reservat-
de fertilizantes qumicos e adubos rios de carbono. Os principais desafi-
Foto 2: Queima de cana-de-
orgnicos, pastagens bem manejadas, os para o alcance desse objetivo resi-
aucar prtica geradora de gases
agrofloresta e prticas de conservao dem: a) na identificao de sinergias
de efeito estufa, como monxido
do solo (Embrapa, 1999d). entre os objetivos de aumento de
de carbono (CO), metano (CH4),
Os reflorestamentos estocam car- produtividade e o equilbrio climtico
xido nitroso (N2O) e xidos de
bono e, se mantidos intactos ou se global; b) na produo de alimentos
nitrognio (NOx).
seus produtos florestais forem usados limpos e seguros para o consumo
Foto: Humberto Rocha
em aplicaes durveis, essa estoca- humano, com menor impacto ambi-
gem adicional pode ser significativa. A ental; c) na adoo de boas prticas
produtividade de florestas de folho- em sistemas agrcolas; d) no fomento
sas, como o eucalipto, no Brasil, mais recentemente, em decorrncia ao desenvolvimento de pesquisa bsi-
uma das mais elevadas do mundo do estabelecimento de consrcios de ca para compreender os processos,
(30m3/ha/ano), contribuindo para a bacias hidrogrficas e de outras inici- prticas e tcnicas que influenciam as
fixao de carbono em cerca de 9 ton ativas governamentais e no governa- emisses de gases nos diferentes agros-
C/ha/ano (Sociedade Brasileira de Sil- mentais para a restaurao de reas sistemas, desde que uma produtivida-
vicultura, 1999), o que evidencia o florestais, em diversos estados brasi- de agrcola maior possa ser obtida
potencial do setor para fixar carbono leiros. com o conhecimento e uso de melho-
atmosfrico. Sistemas agroflorestais, Os solos agrcolas constituem tam- res tcnicas.
mediante a utilizao de prticas sus- bm uma das mais importantes fontes Entre as aes e estratgias poss-
tentveis de manejo de florestas, po- de xido nitroso (N2O) para a atmos- veis de ser empregadas como contri-
dem tambm ser uma importante con- fera, o que se d por meio de adies buio reduo de gases de efeito
tribuio mitigao do efeito estufa, de fertilizantes nitrogenados sintti- estufa, destacam-se: a) recuperar re-
medida que so evitadas emisses cos, da deposio de dejetos animais as degradadas, com o objetivo adicio-
por atividades mais predatrias (des- ricos em nitrognio, da fixao biol- nal de fixar carbono atmosfrico; b)
matamento e queima de florestas), gica de nitrognio aumentada, e do adotar poltica agrcola orientada para
ficando grande parte do carbono esto- cultivo de solos orgnicos e minerais a converso de terras degradadas ou
42 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
2
Desnitrificao : NO3- => NO2 => 2NO => N2O => N2
abandonadas para uso florestal e re- de arroz irrigado por inundao (rela- tatistica. Consulta em 2000.
generao de florestas, assim como trio revisado). Relatrio tcnico apre- IPCC. 1995. Climate Change 1994.
para propiciar meios e recursos para a sentado ao Ministrio da Cincia e Radiative Forcing of Climate Change
adoo de boas prticas agropecuri- Tecnologia. Jaguarina: Embrapa Meio and an evaluation of the IPCC IS92
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des agroflorestais sustentveis, como Embrapa. 1999a. Inventrio de bridge University Press. 339p.
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de forma no predatria e que, ao provenientes de atividades agrcolas 1995. Impacts, adaptations and mi-
mesmo tempo, favoream o estoque no Brasil: emisses de gases de efeito tigation of climate change: Scienti-
de carbono nos solos e na vegetao; estufa provenientes da queima de fic-Technical Analysis. Cambridge:
d) desenvolver tecnologias que inte- resduos agrcolas. Relatrio tcnico University Press. 878p.
grem objetivos de produtividade e apresentado ao Ministrio da Cincia IPCC. 1996b. Revised 1996 IPCC
reduo das emisses de gases; e) e Tecnologia. Jaguarina: Embrapa Guidelines for National Greenhouse
fomentar o desenvolvimento de pes- Meio Ambiente. Gas Inventories: Reference Manual.
quisa para a compreenso dos proces- Embrapa. 1999b. Inventrio de Krupa, 1997.S.V. Global Climate
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sil: emisses de metano provenientes IBGE. http://www.ibge.gov.br/es- Review Draft, June, 2000.
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 43
Tcnicas Moleculares em
SEMENTES
Maria Laene Moreira de Carvalho
PhD, Prof. Adjunta IV do Depto. de Agricultura-UFLA

Maria das Graas Guimares Carvalho Vieira


Prof. Titular do Depto. de Agricultura-UFLA

PESQUISA dila de Resende Von Pinho


Prof. Adjunto do Depto de Agricultura-UFLA
Universidade Federal de Lavras /UFLA/DAG
email: sementes@ufla.br

Aplicao de tcnicas moleculares no controle de qualidade das sementes


Fotos cedidas pelas autoras

termo qualidade das se- para garantir o direito de propriedade identificados em nvel de planta inteira
mentes envolve aspec- intelectual. Para ser submetida prote- ou adulta; como a necessidade de
tos genticos, fsicos, fisi- o, a nova cultivar, ou a cultivar amplo espao fsico para a avaliao
olgicos e sanitrios que, essencialmente derivada, deve se apre- do material; alm de possveis influn-
avaliados de maneira in- sentar distinta de outra, utilizando-se cias do ambiente no qual esto inseri-
tegrada, propiciam o conheci- dos. Comparados aos morfol-
mento do valor real e do poten- gicos, os marcadores molecula-
cial de utilizao de um lote de res se mostram mais versteis,
sementes. rpidos e seguros. Os princi-
A pesquisa na rea de pais marcadores moleculares
biologia molecular associada ao utilizados para a identificao
controle de qualidade de se- de cultivares e da pureza gen-
mentes tem evoludo rapidamen- tica envolvem a anlise de pro-
te e novas tcnicas tm-se mos- tenas e de DNA.
trado teis na obteno de clas- A utilizao da eletroforese
ses distintas de marcadores mo- de protenas em identificao
leculares que auxiliam na eluci- de cultivares se baseia no fato
dao dos fatores que afetam a de estas serem produtos dos
qualidade, na manipulao e genes e, portanto, poderem ser
identificao do material genti- consideradas como marcado-
co, assim como na preservao res para os genes que as codi-
desses materiais. Tais tcnicas permi- FIGURA 1. Diferenciao de ficam. Na maioria das espcies, prote-
tem o monitoramento durante todo o cultivares de cafeeiro por nas de armazenamento de sementes
processo produtivo, eliminando custos RAPD, utilizando o primer OP- exibem considervel polimorfismo com
e garantindo a qualidade. I20. UFLA- Lavras, MG. 2000. relao carga, tamanho, ou ambos os
Acima de cada linha encontra- parmetros. Alm do mais, elas so
Marcadores moleculares na se a denominao das cultiva- codificadas em vrios lcus, esto pre-
determinao da qualidade sentes comparativamente em grandes
res. (Gentilmente cedido por
gentica de sementes quantidades e so prontamente extra-
Padilha, L., aluna do curso de
veis. No caso de espcies autgamas,
Doutorado em Fitotecnia/
O registro de diferentes cultivares e pode ocorrer uma base gentica estrei-
Sementes da UFLA)
os problemas que envolvem a comer- ta, dificultando a certificao da pureza
cializao nacional e internacional de gentica pelo uso dessa tcnica. Nas
sementes fazem com que a habilidade espcies algamas, as populaes de
de distinguir e de identificar cultivares para isto descritores homogneos quan- indivduos expressam uma ampla vari-
se torne um ponto crucial para o mo- to s suas caractersticas em cada est- edade de caracteres fenotpicos. Estes
nitoramento e controle desse comr- dio de desenvolvimento e estveis indivduos podem ser geneticamente
cio. quanto repetio dessas caractersti- distintos, contendo diferentes combi-
No Brasil, pela lei de no 9.456, de cas ao longo de geraes sucessivas. naes de lcus em homozigose e
1997, foi instituda a proteo de culti- Atualmente, para submeter uma culti- heterozigose, includos aqueles que
vares, que reconhece a propriedade var proteo, so usados marcadores codificam para protenas de armazena-
intelectual e os direitos ao titular de morfolgicos, que apresentam uma mento e isoenzimas. Neste caso,
materiais genticos protegidos. Nessa srie de inconvenientes, como a neces- indicada a anlise em bulk, para que
lei, a caracterizao de forma precisa sidade de um grande nmero desses se tenha todo o genoma da populao
da cultivar um dos pontos essenciais descritores, que, na sua maioria, sero representado.
44 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
As isoenzimas, por sua vez, devem aps a deteco de polimorfismo, os
ser usadas com muito critrio para este produtos RAPD so clonados e se-
fim, pois determinados sistemas enzi- qenciados, redesenhando primers
mticos podem apresentar variaes PCR, mais longos e ento convertendo
em funo do estdio de deteriorao esses marcadores ao acaso para regi-
em que as sementes se encontram ou es amplificadas caracterizadas por se-
quando esto presentes microrganis- qncia (marcadores SCARs). Nesse
mos em associao com as sementes. caso, a amplificao da seqncia es-
Existem diversas tecnologias base- pecfica do DNA ocorre em temperatu-
adas no polimorfismo do DNA utiliza- ras de pareamento mais elevadas, o
das para identificao de cultivares e que torna o processo mais reproduz-
determinao da pureza gentica em vel.
lotes de sementes. A principal vanta- A tecnologia AFLP combina, em
gem do uso de DNA que eles no so parte, as tcnicas RFLP e RAPD. Nesta
afetados pelo ambiente, permitindo tcnica, o DNA clivado com enzimas
uma anlise mais objetiva e precisa. de restrio, e os fragmentos obtidos
Entre as tcnicas utilizadas, destacam- FIGURA 2. Diferenciao de so amplificados por PCR a partir de
se: RFLP (fragmentos de restrio de cultivares de algodoeiro por primers complementares aos adapta-
segmentos polimrficos) RAPD (poli- AFLP. UFLA Lavras/MG, 2000. dores que foram previamente ligados
morfismo do DNA amplificado ao aca- As setas indicam distino das s extremidades dos fragmentos. Des-
so); os microsatlites ou SSRs (sequn- cultivares colorida e precoce, sa forma, a maioria das dificuldades
cia simples repetida) e o AFLP (frag- das demais.(Gentilmente cedida apresentadas em RAPD resolvida,
mentos de comprimento polimrfico por Mann,R.S., aluna do curso pelo uso de condies de alta adstrin-
amplificado). de Doutorado Fitotecnia / gncia para o anelamento do primer
A tcnica de RFLP propicia alto Sementes / UFLA) PCR. Ressalta-se no entanto, que tanto
nvel de discriminao entre indivdu- RAPD quanto AFLP so marcadores
os, alta reprodutibilidade e tem apre- dominantes, o que torna sua utilizao
sentado resultados positivos quando o. O baixo anelamento relativo do um problema prtico para anlise de
utilizado na identificao de cultivares primer tambm resulta em falhas na pureza gentica, uma vez que os hete-
de milho e soja. No entanto, para amplificao de algumas bandas pa- rozigotos podem no ser detectveis.
espcies como tomate e trigo, alguns rentais do hbrido em F1. Sobretudo Um exemplo de utilizao da tcnica
autores tm revelado que essa tcnica falhas na reprodutibilidade de resulta- de AFLP para diferenciao de cultiva-
no detecta muita variao, o que pode dos comprometem grandemente a pre- res de algodoeiro pode ser visualizado
inviabilizar sua utilizao na identifica- ciso e a praticidade do uso de RAPDs na Fig. 2.
o e certificao da pureza gentica para anlise de pureza gentica, fazen- Simples Seqncias Repetidas (SSRs)
dessas espcies. A des- ou microsatlites consis-
peito dessas vantagens, a tem de pequenas seqn-
anlise de RFLP lenta, cias , com 1 a 4 nucleo-
requer grande quantida- tdeos de comprimento,
de de material da planta, repetidas ao longo do
exige trabalho intensivo, genoma, podendo ocor-
muito espao em labora- rer tanto em regies co-
trio e apresenta custo dificadoras quanto em re-
elevado, o que restringe gies no codificadoras.
seu uso em programas de Devido a erros (inser-
controle de qualidade para es/delees) durante
certificao da pureza FIGURA 3. Padres de o processo de replicao
gentica. microssatlites de linhagens e do DNA, que normalmente ocorrem
Mtodos baseados em PCR (reao hbrido de milho pelo primer com mais freqencia nessas regies
em cadeia da polimerase) tais como bnlg2291 em folhas e sementes repetidas do genoma, os microsatlites
RAPD, AFLP e SSR ou microsatlites (5 repeties). UFLA, Lavras, so normalmente polimorfos. As regi-
tm sido preferencialmente utilizados es com seqncias simples repetidas
MG. 2000. (Gentilmente cedida
para anlise da pureza gentica e uma so amplificadas individualmente atra-
por Salgado, K.C.C., aluna do
vez que pequenas quantidades de DNA vs de PCR, pela utilizao de um par
curso de mestrado em
so requeridas, os perfis podem ser de primers especficos que so com-
Fitotecnia/Sementes/UFLA.)
obtidos mais rapidamente do que com plementares s sequncias nicas que
RFLPs. Desses mtodos, o RAPD o flanqueiam os microsatlites. Essas re-
menos aceito, devido ao baixo grau do com que este mtodo seja utilizado gies do genoma que contm a se-
relativo de complementaridade entre o com grande cuidado. No entanto, o qncia repetida devem ser inicial-
primer e a seqncia de DNA alvo, o RAPD tem sido bastante usado em mente identificadas, isoladas e seqen-
que torna o teste de difcil padroniza- etapas iniciais de diferenciao (Fig1); ciadas, o que demanda tempo e eleva

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 45


o custo operacional. Ao contrrio do dcios da qualidade das sementes. Pro- so de germinao.
RAPD e AFLP, lcus SSR so codomi- tenas termoestveis como as LEA pro- A perda da viabilidade das sementes
nantes, multiallicos, ou seja, todos os teinas (Late Embriogenise Abundant) no processo de deteriorao precedi-
alelos de um determinado lcus po- tm sido utilizadas como um dos indi- da por reduo na capacidade de sinte-
dem ser detectados e discrimina- tizar protenas, devido ao declnio
dos, alm de serem somaticamen- de componentes como ribossomos,
te estveis. Apesar da tecnologia RNA mensageiro e alteraes em
SSR ser onerosa em sua implemen- nvel de transcrio e traduo, com
tao, h de se ressaltar que, no o envelhecimento das sementes.
caso de plantas, esto disposi- A integridade e o metabolismo celu-
o, no mercado, pares de pri- lar dependem da grande variedade
mers para diversas espcies de de enzimas e protenas estruturais de
interesse econmico, o que viabi- cada espcie. Desta forma, os testes
liza o seu uso na identificao e mais sensveis para determinar o
anlise de pureza gentica. Marca- estdio de deteriorao so aqueles
dores SSRs tambm tm sido utili- que medem a atividade de certas
zados para detectar a contamina- enzimas associadas com a quebra
o gentica em campos de produo FIGURA 4. Acumulao de das reservas ou com a biossntese de
de sementes (Fig 3). tubulina em embries de tecidos novos. As protenas de armaze-
Apesar da recomendao do uso de sementes de tomate durante a namento tambm podem sofrer mudan-
marcadores bioqumicos pela Interna- germinao. (Gentilmente as resultantes de quebras parciais ou de
tional Seed Testing Association (ISTA) cedido por Delmondez, R., degradao para subunidades.
e pela Assocation of Official Seed bolsista recm-Doutor em A atividade especfica de enzimas e
Analysts (AOSA) e da gama de tcnicas Fitotecnia/ Sementes da UFLA) a integridade das protenas de armaze-
disponveis, a escolha do mtodo mo- namento tm sido determinada por meio
lecular a ser utilizado vai depender da de tcnicas de eletroforese e usadas
estrutura gentica de cada espcie, do como marcadores do processo de dete-
seu modo de reproduo, do tamanho cativos de tolerncia dessecao, e a riorao das sementes. As enzimas mais
do seu genoma e, sem dvida, da atividade da enzima -amilase, como pesquisadas nesse sentido so aquelas
relao custo/benefcio. H de se res- marcador relacionado com a tolerncia que atuam no processo de respirao, a
saltar ainda a necessidade de investi- secagem de sementes de milho. exemplo da malato desidrogenase, ou
mentos nestas tecnologias, de forma Isoenzimas tambm podem ser utili- aquelas envolvidas no metabolismo de
que sejam adaptadas e postas dispo- zadas como marcadores de dormncia, ligao nitrognio-carbono, (fundamen-
sio para uso em anlises rotineiras de germinao e deteriorao. A enzima tal no processo de germinao de se-
laboratrio. mentes), como a glutamato desidro-
genase ou ainda aquelas que possu-
Marcadores moleculares na em funes especficas no metabolis-
determinao da qualidade mo dos lipdeos, como o caso das
fisiolgica de sementes esterases. Ainda tem sido considera-
do o estudo da atividade de enzimas
Tm sido desenvolvidas pesqui- removedoras de perxidos como as
sas para detectar as diversas reaes peroxidases, catalases, peroxido dis-
metablicas que envolvem sntese mutase, entre outras, e enzimas liga-
e degradao de molculas durante das destruturao do sistema de
o desenvolvimento, a germinao e membranas, a exemplo da esterase,
a deteriorao de sementes. No fosfatase cida e alcalina (Fig 6). J as
processo de morfognese tem sido protenas de armazenamento tm sido
utilizado marcadores moleculares, Figura 5. Perfis eletroforticos de utilizadas para deteco de estgios mais
como a -tubulina, com a finalidade de atividade enzimtica da -amilase, avanados de deteriorao.
acompanhar as seqncias de proces- em sementes de arroz recm- No intuito de melhorar o desempe-
sos que ocorrem durante a diviso germinadas, antes e aps o nho de sementes com determinados
celular. A atividade da -tubulina pode armazenamento. UFLA, Lavras- nveis de deteriorao, tem-se trabalha-
ser detectada pelas tcnicas de imuno- MG, 2000. (Gentilmente cedido do por meio da restrio hdrica (pri-
deteco ( Fig 4). Esse tipo de anlise por Vieira, A.R. Doutor em ming). Para o monitoramento desta tc-
tem grande aplicao em pesquisas Fitotecnia/ Sementes da UFLA) nica, a eletroforese de isoenzimas espe-
relacionadas com envigoramento de cficas (Fig 7) vem sendo recomendada.
sementes e em estudos de tolerncia a Muitas vezes podem ocorrer manifesta-
dessecao. -amilase tem se apresentado eficiente es bioqumicas indesejveis em fun-
Durante a fase de maturao das para monitorar a intensidade de dor- o do mtodo de condicionamento
sementes, a anlise do acmulo de mncia de sementes de arroz ao longo empregado, o que pode ser detectado
materiais de reserva por meio de mar- do armazenamento (Fig 5), e a endo-- pelos perfis eletroforticos de enzimas
cadores moleculares pode fornecer in- mananase, como marcador no proces- envolvidas na rota anaerbica, a exem-
46 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
plo da lcool desidrogena- conseqentemente, mais ban-
se. das podem ser detectadas com
Em ltima anlise, fica uma simples amplificao.
evidenciado que o uso de Para algumas espcies de
marcadores moleculares fungos, tem-se ainda utilizado
para avaliao da qualida- outros recursos, como a anlise
de fisiolgica das semen- de DNA mitocondrial o que
tes, apesar de j ter tido um tem permitido a identificao
avano expressivo, ainda entre isolados, apesar de em
requer muitas pesquisas, alguns casos apenas possibili-
antes de que seja estabelecido como tar diferenciao entre espcies.
ferramenta decisiva em programas de A anlise da regio ITS (Internal
controle de qualidade. FIGURA 6. Padres enzimticos Transcribed Spacers) indicada para a
da fosfatase cida de Aspergillus identificao de espcies de microrga-
Marcadores moleculares glaucus, Aspergillus flavus e de nismos, inclusive nos casos em que a
na determinao da sementes de algodoeiro inocula- taxonomia controvertida, pois esta
qualidade sanitria das e no inoculadas com regio pouco varivel em estudos
ambos os fungos separadamente intra-especficos, e apresenta variabili-
Os mtodos tradicionais para iden- e submetidos a envelhecimento dade em torno de 0-2%.
tificao de fungos envolvem estudos artificial. UFLA Lavras MG, A escolha das melhores tcnicas
de sua morfologia na planta infectada 1995 para avaliao da qualidade gentica,
e nos meios de cultura. Esses mtodos fisiolgica ou sanitria de lotes de se-
so geralmente demorados e podem
ser pouco conclusivos ou levar a erros do, para a construo dos primers.
de interpretao. O RAPD tem-se apresentado
Tcnicas moleculares, baseadas na como um mtodo vivel, e tem detec-
imunologia e anlises de cidos nucli- tado variaes em muitos organismos
cos tm sido aplicadas em diversas (Fig 8). Apesar de seu problema de
reas da micologia, o que tem gerado repetio, existe a possibilidade de,
grandes perspectivas para o desenvol- aliado a este, usar-se SCARs, onde
vimento de mtodos rpidos, sensveis
e especficos no diagnstico de pat-
genos de plantas, comumente transmi-
tidos por sementes. Por um grande
perodo de tempo, as isoenzimas e
protenas foram os marcadores mole-
culares mais escolhidos. Recentemen- FIGURA 8. Padres de ampli-
te, com o advento cada vez mais rpido ficaes obtidos com DNA
do conhecimento em cincias, outras FIGURA 7. Padres isoenzimti- extrado de 3 isolados de C.
tcnicas baseadas em molculas de cos de sementes de cafeeiro gossypii e 1 isolado de C.
DNA e RNA foram disponibilizadas. gossypii var. cephalosporioides.
submetidas a diferentes potenci-
RFLP foi a principal tcnica mole- Nas linhas, a seqncia dos
ais hdricos nos tempos de 3 e 6
cular utilizada para identificao de isolados 1, 2 e 3 (C. gossypii) e
dias, reveladas para lcool
isolados fngicos antes da reao de do isolado 4 (C. gossypii var.
desidrogenase (ADH). UFLA,
polimerase em cadeia, no entanto, cephalosporioides), 1o grupo
apresenta algumas desvantagens, como Lavras - MG, 1998. (Gentilmente
cedido por Camargo, R., aluno de de 4 foram amplificados pelo
requerer grande quantidade de DNA primer A4 e o 2o grupo, pelo
para visualizao em autoradiografia, doutorado em Fitotecnia/ Semen-
tes da UFLA) primer A7. UFLA MG 1998
DNA de alta qualidade, intacto e sem
inibidores de enzimas de restrio.
Marcadores moleculares baseados
em microssatlites podem ser obtidos fragmentos so seqenciados e pri-
para a discriminao de txons. Este mers maiores construdos. Esses pri- mentes, depende de vrios fatores, in-
mtodo j foi testado em fungos, de- mers so mais longos e especficos cludas a finalidade da anlise, as carac-
tectando polimorfismo inter e intraes- para um lcus, o que possibilita a sua tersticas das espcies e a relao custo/
pecficos nos patgenos. Apesar da utilizao por diferentes laboratrios. benefcio. O desenvolvimento de tcni-
utilizao desta tcnica ter auxiliado na Outro mtodo que pode ser utiliza- cas moleculares tem evoludo de modo
identificao e caracterizao de fun- do e que tem algumas vantagens sobre extremamente rpido, possibilitando
gos, ela apresenta a desvantagem de o RAPD, o AFLP. Uma vantagem maior segurana e confiabilidade dos
necessitar do conhecimento prvio das significante do AFLP sobre o RAPD resultados na avaliao e no controle da
seqncias do organismo a ser estuda- que muitos fragmentos so gerados e, qualidade de sementes.

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 47


O Centro de Pesquisas em Tu- to, fatores relacionados com a disse- passada, 300 milhes de pessoas
berculose (CPT) da Faculdade de minao da doena, freqentemen- foram infectadas, 90 milhes de no-
Medicina de Ribeiro Preto USP te associados pobreza, mudaram o vos casos da doena apareceram e
anuncia a sua disponibilidade de quadro de euforia para um cenrio 30 milhes de pessoas morreram.
realizar ensaios pr-clnicos de no- de recrudescimento do flagelo. Tal Morreram mais pessoas de TB em
vos medicamentos contra o bacilo situao agrava-se com o apareci- 1996 do que em qualquer ano da
da tuberculose (TB). Todos os con- mento de bacilos resistentes s dro- histria. As perspectivas para elimi-
tatos devem ser feitos com a Dra. gas habituais, fruto, na maioria das nar o bacilo da tuberculose do gran-
Ana Olvia de Souza (e-mail: vezes, de tratamentos irregulares, de nmero de indivduos infectados
olivia@rpm.fmrp.usp.br) ou com o com grandes percentuais de aban- um tero da populao mundial,
Dr. Clio Lopes Silva (e-mail dono. O problema pode ser revers- so baixas. O bacilo se aloja com
clsilva@fmrp.usp.br) vel desde que sejam tomadas medi- maior freqncia no pulmo, por
das urgentes e inovadoras em vrias tempo indefinido, mas pode infectar
Desde que o alemo Robert Koch frentes. O CPT, dando sua parcela outros rgos, permanecendo con-
anunciou a descoberta do bacilo da de contribuio para a soluo des- tido pelas clulas de defesa do orga-
TB, em 1882, a preveno e o trata- ses problemas, desenvolveu tecno- nismo. Em decorrncia da diminui-
mento da doena desafiam cientis- logias avanadas para testes pr- o da resistncia orgnica (desnu-
tas em todo o mundo. E pela dimen- clnicos de novos medicamentos an- trio, subnutrio, estresse ou asso-
so que essa doena infecto-conta- timicobacterianos e coloca dispo- ciao de outras doenas), o bacilo
giosa tem alcanado na atualidade - sio das Universidades, Institutos tende a se reproduzir intensamente
2 bilhes de pessoas infectadas e 3 de Pesquisas e Empresas Farmacu- e pode levar o indivduo morte,
milhes de mortes anuais - tornou ticas a possibilidade de testar produ- caso no seja tratado devidamente.
particularmente importante o de- tos obtidos por cada uma dessas A primeira droga contra a TB, a
senvolvimento de um novo medica- Instituies. estreptomicina, foi descoberta em
mento para o tratamento dessa en- 1946. Na dcada de 50, outras dro-
fermidade, por uma equipe de pes- A TB um problema secular s gas foram pesquisadas e surgiram as
quisadores do CPT - USP, coordena- portas do terceiro milnio primeiras associaes medicamen-
da pelo professor Clio Lopes Silva tosas. Naquela poca, acreditava-se
e pela Dra. Ana Olvia de Souza. Na sua marcha desafiadora a TB que a erradicao da doena estaria
Segundo a Organizao Mundial de atingiu em mbito mundial, e nos prxima. Contudo, uma srie de
Sade, a TB um flagelo milenar. No tempos atuais, 10 milhes de casos fatores est contribuindo para a dis-
passado, a doena foi disseminada novos, com 3 milhes de mortes por seminao da TB, entre os quais
pelos fluxos migratrios e em decor- ano, representando 18,5% de todas podemos destacar: a pobreza, o uso
rncia das guerras e da colonizao as mortes em adultos entre 15-59 incorreto da teraputica; o abando-
das novas terras descobertas a partir anos - a fase mais produtiva da no do tratamento; a alta capacidade
do sculo XV. Antes dos antibiti- populao mundial. Cerca de meta- infectante desses agentes; as via-
cos, o tratamento da TB era precrio, de dos doentes nunca tiveram trata- gens migratrias constantes; a ocor-
com elevada taxa de mortes dos mento. Segundo a OMS, 32% da rncia de grandes aglomerados po-
indivduos afetados. O advento da populao mundial est infectada pulacionais e a co-infeco pelo
quimioterapia, baseada nos antibi- com o bacilo da TB e, portanto, com HIV. Como o tratamento da doena
ticos, com ndice esperado de cura maior risco de adoecer por reativa- feito exclusivamente por medica-
de at 95% dos casos, deu origem o e, tambm, por infeco exge- mentos, e os que esto atualmente
euforia pela possvel erradicao de- na. Entre 1850 e 1950, um bilho de em uso, alm de causarem graves
finitiva da peste branca. No entan- pessoas morreram de TB. Na dcada efeitos colaterais, esto sendo inefi-

48 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento


48 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
cientes contra cepas resis-
tentes, indispensvel que
se desenvolvam novos me-
dicamentos, novos frma-
cos ou novas formulaes
farmacuticas para o
combate TB.

Informaes sobre as
atividades do CPT

Alm do desenvolvimen-
to da terapia gnica, que
usada, tanto para a pre-
veno como para o trata-
mento da TB j instalada,
o CPT est envolvido com
a realizao de ensaios de
susceptibilidade de mico-
bactrias a produtos sint-
ticos e a extratos e/ou
fraes purificadas de
plantas, fungos, bactrias
do solo etc., abrangendo todas as nos ensaios para determinao con- na-se o nmero de bactrias que
etapas na fase pr-clnica da tria- centrao da droga que inibe 50% da sobreviveram, a concentrao bac-
gem de uma droga candidata a proliferao celular e verificadas tam- tericida mnima, a capacidade da
medicamento anti-TB. As tcnicas bm a ao das drogas sobre orga- droga em retardar o incio do cresci-
aplicadas nos ensaios seguem os nelas celulares como lisossomas e mento micobacteriano aps a remo-
padres adotados internacional- mitocndrias. Com os resultados ob- o da droga, e a dose efetiva para
mente assim como os padres do tidos nessa etapa, calcula-se o ndice a reduo de 50% do crescimento
Centro de Controle e Preveno de de seletividade da droga utilizando- micobacteriano intracelular. As dro-
Doenas (CDC/EUA). A triagem se os parmetros acima avaliados. gas com atividade dentro dos pa-
pr-clnica constituda de 4 eta- Como requisito para a droga ser dres estabelecidos pelo CPT, avali-
pas. Na primeira etapa determina- submetida aos testes da terceira eta- adas frente a vrias cepas isoladas de
se a concentrao inibitria mni- pa, esse ndice deve ser igual ou pacientes portadores de TB, e resis-
ma contra o bacilo utilizando o superior a 10. As drogas seleciona- tentes a uma das drogas utilizadas na
sistema automatizado MB/Bact ou das para a terceira etapa so avalia- quimioterapia da TB, passaro para
a microdiluio em placa. Nesses das sobre as micobactrias localiza- a quarta etapa. Na quarta etapa, os
testes, cepas de Mycobacterium sp das dentro dos macrfagos as testes so realizados em animais de
so submetidas diretamente em clulas que albergam o bacilo da TB experimentao como camundon-
contato com a ao da droga em na infeco e na doena. Essa etapa gos, cobaias e macacos. Eles so
teste. As drogas que atingem 90% crtica e de grande importncia, experimentalmente infectados com
de inibio do crescimento mico- uma vez que, para a droga ser bacilos da TB e tratados com as
bacteriano passam para a segunda efetiva, ela deve permear a membra- drogas em teste. Durante o trata-
etapa dos testes. Na segunda eta- na celular e atingir o interior do mento, monitora-se o nmero de
pa, os ensaios so repetidos para macrfago onde a micobactria est bacilos presentes em rgos como o
confirmar a concentrao que ini- presente. A droga ainda deve resistir bao e o pulmo. Os dados obtidos
be 99% do crescimento micobacte- s condies do meio intracelular na quarta etapa indicam se uma
riano. Outro fator de extrema im- para combater os bacilos. Muitas droga apresenta potencial teraputi-
portncia e tambm considerado drogas so inefetivas porque no co para a quimioterapia da TB e a
em nossos ensaios a determina- atingem o interior do macrfago ou viabilidade de continuidade dos
o da toxicidade de um compos- porque, de alguma forma, so de- ensaios na fase clnica.
to. Para essa finalidade, vrias li- gradadas no citoplasma celular. Aps Dr. Clio Lopes Silva
nhagens de clulas so utilizadas 15 dias do incio dos testes, determi- clsilva@fmrp.usp.br

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 49


Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 49
Desvendando o
PESQUISA
Cdigo Gentico
Um quebra-cabea que comea a ser montado

Newton Portilho Carneiro Seqenciamento de Genes tro lado, o genoma funcional base-
Ph.D. Biologia Molecular
newtonc@cnpms.embrapa.br
Projetos Genomas ado apenas no seqenciamento dos
Embrapa Milho e Sorgo - Sete Lagoas, MG genes expressos e tem a vantagem de
Existem basicamente dois tipos de poder caracterizar a expresso tem-
Andra Almeida Carneiro
Ph.D. Biologia Molecular projetos genoma. Um chamado estru- poral e local dos genes. O seqencia-
andreac@cnpms.embrapa.br tural que o seqenciamento total do mento no genoma funcional feito
Embrapa Milho e Sorgo - Sete Lagoas, MG genoma, e outro funcional, que se em cerca de 800 pares de bases (bp)
Cludia Teixeira Guimares baseia no seqencimento apenas dos de apenas uma das fitas de cDNA.
D.S. Biologia Molecular genes expressos. A estratgia mais Considerando que as bibliotecas de
claudia@cnpms.embrapa.br
Embrapa Milho e Sorgo - Sete Lagoas, MG
utilizada para genomas estruturais a cDNA so montadas direcionalmente,
chamada shotgun, que uma se- a maior parte do seqenciamento
Edilson Paiva qncia em grande escala de subclo- feito a partir da extremidade 5 do
Ph.D. Biologia Molecular
edilson@cnpms.embrapa.br
nes de fragmentos de DNA j mapea- cDNA, devido ser a mais informativa e
Embrapa Milho e Sorgo - Sete Lagoas, MG dos. Estudos estruturais de genomas conservada. Embora possa haver er-
estruturais tm a principal vantagem ros de leitura nas seqncias geradas,
estes no comprometem, na maio-
ria dos casos, a identificao dos
correspondentes genes. Desta for-
Os genes so as unidades biolgicas responsveis em determi- ma, milhares de seqncias podem
nar as caractersticas de um organismo. Apesar de atualmente conhecer- ser determinadas com um limitado
mos como as informaes contidas nos genes so codificadas em investimento. A terminologia do in-
protenas, muitas dessas protenas / genes no possuem uma funo gls para etiqueta dos genes cha-
conhecida. Como descobrir a(s) funo(es) de uma protena codificada mada de Express Sequence Tags
por um determinado gene? Protenas podem ter funes enzimticas, (ESTs).
estruturais ou de reserva, a que iremos nos referir nesta discusso, como O banco de dados de ESTs tem
funes bioqumicas. Contudo, funes bioqumicas esto encaixadas mostrado ser uma grande fonte de
em um contexto mais amplo, como por exemplo: protenas participam identificao, principalmente da fun-
de processos de regulao celular, de defesa, de tolerncia a estresses, o bioqumica de muitos genes e
etc, os quais sero referidos neste texto como funo biolgica de uma de funes biolgicas que podem
protena. Este artigo tem por objetivo descrever alguns dos mecanismos ser inferidas com base na freqn-
utilizados para o estudo da funo bioqumica e biolgica de protenas cia de certos genes, que so identi-
codificadas por um gene ou em grande escala, por grupos de genes. ficados em bibliotecas de cDNAs
construdas sob diferentes condi-
es. Exemplificando: uma prote-
na X pode ser identificada como
de combinarem o seqenciamento e o uma quinase (funo bioqumica) atra-
mapeamento fsico dos genes, mas a vs do seqenciamento do gene que
desvantagem de um elevado custo. a codifica e da comparao com o
Considerando esse aspecto, est sen- banco de dados. Se essa mesma pro-
do feito o seqenciamento total do tena for identificada apenas em teci-
genoma, apenas de organismos com dos ou orgos que sofreram o ataque
genomas pequenos ou daqueles que de um patgeno Y , esse fato pode
j tm grande financiamento. Por ou- levantar a suspeita de que a protena

50 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento


X esteja relacionada com os blicos pode ser acessado no
processos de defesa contra o endereo internet http://
organismo Y (funo biolgi- www.ncbi.nlm.nih.gov/
ca). dbEST/dbEST_summary.html.
Atualmente (Outubro/ No Brasil, projetos genoma tm
2000), mais de 5 milhes de sido principalmente realizados
seqncias, correspondendo no Estado de So Paulo, com o
a genes de vrios organismos auxlio da Fapesp (Fundao
esto disponveis em bancos de Apoio Pesquisa, do Estado
de dados pblicos. Os proje- de So Paulo).
tos genomas, no incio dos Como um seqenciamento
anos 90, comearam seqen- per si pode ser til na determi-
ciando principalmente genes nao da biologia de um gene?
abundantes e indicavam que Dependendo do nmero de
cerca de 60% das seqncias clones seqenciados e das va-
eram desconhecidos. Como riedades das bibliotecas de
j era de se esperar, pesquisa- Figura 1 - Mutao por cDNAs construdas, possvel
dores das mais diversas reas foram antisenso. A Clula no tirar concluses relacionadas abun-
depositando informaes de seqn- mutante contendo o gene X; dncia, expresso temporal e espacial
cias e suas funes no banco de da- B Construo contendo o de muitos genes. Apesar de muitos
dos. Para muitos desses genes, as gene X na orientao desses seqenciamentos serem feitos
funes foram determinadas pela uti- antisenso; C - Clula A trans- a partir do final 5 do gene, possvel
lizao da combinao de uma srie formada com construo B. ter toda a regio codante do gene
de estudos que envolveu caracteriza- Clula da Planta Mutante na devido presena de clones de cD-
o de mutantes, nveis e localizaes Proteina X NAs derivados de mRNA de diferentes
da expresso gnica, modificaes de tamanhos. A bioinformtica pode re-
substratos especficos, hibridao in conhecer um bom seqenciamento,
situ, mapeamento, interao protena- gnica ou variaes de um alelo. Hoje, retirar regies dos vetores, submeter
protena in vitro e in vivo entre outros. projetos genomas descrevem que para automaticamente a anlise do Blast
Essas seqncias gnicas, cujas fun- um e value de 10-25 existem cerca de e montar contigs ou grupos de se-
es j esto determinadas, servem de 35% de genes desconhecidos. qncias que tenham overlaps e,
suporte para a identificao da funo Existe um grande nmero de pro- com isso, caracterizar membros de
gnica de novas seqncias deposita- jetos genomas sendo desenvolvidos uma famlia, alelos, single nucleoti-
das em bancos de dados. Quantos no mundo. Um resumo dos ESTs deo polymorphism (SNPs) etc.
genes so desconhecidos hoje, com- depositados em banco de dados p- Nem sempre os projetos genomas
parando-se com o incio dos pblicos descrevem as seqn-
anos 90? A comparao de cias desconhecidas. A vanta-
seqncias pode ser feita a gem de um banco de dados
nvel de nucleotdeos, amino- disponibilizar as seqncias
cidos ou de domnios funci- desconhecidas a oportuni-
onais. As anlises de compa- dade que um pesquisador
rao so feitas enviando-se a poder comparar as expres-
seqncia editada para o ban- ses de um gene em outros
co de dados e os resultados organismos e de sugerir pro-
so devolvidos em uma forma vveis funes. As sees a
chamada de e value. Quanto seguir descrevem processos
menor esse valor, maior a si- usados para auxiliar a melhor
milaridade da seqncia com descrio da(s) funo(es)
aquela presente no banco de gnica(s).
dados. Cabe ao pesquisador
responsvel determinar qual Gentica Direta e Reversa
o limite mnimo para conside-
rar que uma seqncia est qualitativa Gentica direta um processo que
ou quantitativamente representada no Figura 2 - Co-supresso de envolve, inicialmente, a anlise do
banco de dados pblicos. Apesar do fentipo e depois o isolamento e a
promotor. O experimento de
sistema de bioinformtica estar bas- identificao do gene responsvel pela
SDS-PAGE demonstra
tante sofisticado nesses projetos, caracterstica. Genes tm sido isolados
que a protena X no existe
difcil para um computador indicar o por clonagem posicional, mutagnese
mais na planta transgnica
que pode ser considerado um novo com insero de transposons ou de T-
contendo a construo gnica
gene, um membro de uma famlia DNA, por escrutnio de bibliotecas de
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 51
DNA expresso e por tcnicas modificado (homozigose). A
de expresso diferencial (diffe- planta homozigota para o gene
rental display). modificado de interesse pode
Com o aumento da capaci- apresentar ou no um fentipo
dade de clonar, modificar e aparente, mas as plantas com
examinar as atividades biolgi- os fentipos mutantes eviden-
cas de segmentos de DNA, a tes podem proporcionar uma
caracterizao de um gene pode forma rpida de correlacionar
tambm ser realizada pela uti- o fentipo com o gene modifi-
lizao de uma rota inversa, cado. Mtodos de distrbio da
denominada de gentica rever- funo gnica, via recombina-
sa. Esse novo processo parte o homloga tm sido descri-
de um gene cuja estrutura mo- tos para leveduras e ratos, sen-
lecular conhecida e procede do poucos os casos descritos
por explorar a contribuio do em plantas. Uma aplicao com
gene para um determinado fe- sucesso da recombinao ho-
ntipo. Assim sendo, um cami- mloga, em plantas foi a de-
nho experimental parte do gene monstrada para o gene AGL
como uma seqncia de nucle- MADS-box, em Arabidopsis.
otdeos para a sua funo cor-
respondente. Sendo a seqncia do Figura 3 - Identificao de um Antisenso
gene conhecida, sua funo pode ser gene utilizando transposon por
desvendada pela sua inativao por meio de gentica direta. A A metodologia do antisenso envol-
meio da recombinao homloga com grande maioria dos indivduos ve a introduo, na clula, de molcu-
uma seqncia defeituosa, ou pela F1 do cruzamento entre um las de RNA ou de DNA, construdas
diminuio da sua expresso por tc- indivduo A contendo um artificialmente, que sejam complemen-
nicas de antisenso ou de co-supres- transposon ativo com o indiv- tares (antisenso) ao RNA mensageiro
so. duo mutante de interesse B (mRNA) do gene de interesse. Uma
sero normais devido comple- das hipteses para explicar o motivo
Tcnicas de Gentica Reversa mentao do alelo normal da pelo qual o RNA antisenso pode cau-
Usadas para Manipular Genes e linhagem A, contudo, em uma sar mutaes no organismo transfor-
para Produzir Organismos freqncia baixa na populao mado o fato de que estas molculas
Mutantes F1, o transposon estar inserido de RNA ou de DNA artificiais se ligam
no locus do indivduo A ao mRNA celular, inativando-o (Fig.
Mutao por Perda da corresponde ao gene mutado do 1). Usando essa tecnologia, o antisen-
Funo Gnica indivduo B. Nesse caso, o so do gene da chalcone sintase (chs),
indivduo F1 ser semelhante ao responsvel pela pigmentao das flo-
Nesse prximo seguimento de- indivduo B. Dessa forma o res, foi introduzido em plantas de
monstraremos como tcnicas de re- alelo mutado do indivduo B petnia e de tabaco, resultando em
combinao homloga, antisenso e pode ser substitudo pelo plantas com alterao na pigmenta-
co-supresso podem ser empregadas transposon, um marcador o das suas flores (fentipo mutan-
para mutar um gene conhecido, fa- conhecido, atravs de cruzamen- te). Sheehy et al. (1988) tambm usa-
zendo com que ele se torne no fun- tos, e o gene de interesse ram a tecnologia do antisenso para
cional e a importncia das plantas identificado atravs da constru- inibir a produo de enzimas respon-
transgncias como importantes ferra- o de uma biblioteca genmica sveis pelo desenvolvimento do fruto
mentas cientifcas para auxiliar na iden- do tomate, produzindo, assim, um
tificao da funo gnica. tomate mutante com o amadureci-
mento retardado.
Recombinao Homloga mloga, criando um organismo mu-
tante. Um gene marcador pode ser o Co-supresso
A recombinao homloga a gene bar de seleo para o herbicida
alterao de uma pequena parte da fosfinotricine (PPT). As plantas con- Na tcnica de co-supresso, um
seqncia de um gene de interesse tendo o gene modificado com o mar- gene de interesse engenheirado por
que geralmente feita com a incorpo- cador so selecionadas na presena meio de tcnicas de biologia molecu-
rao de um gene marcador e a rein- do herbicida e, aps ficar demonstra- lar, para superexpressar uma protena
troduo desse gene mutado no orga- do a incorporao do gene modifica- de interesse. Uma vez que a clula
nismo de origem. Uma vez dentro do do no genoma da planta transforma- possui uma maquinaria minuciosa-
organismo de interesse, o gene muta- da, essa autofecundada e, por estu- mente ajustada, qualquer alterao
do tem a capacidade de substituir o dos moleculares, possvel identificar nos nveis de expresso de uma pro-
gene nativo pela recombinao ho- a planta que tenha apenas o alelo tena produz uma grande confuso
52 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
contrrio do que seria espera- plementar ao final do transposon e
do, forma-se, ento, um orga- outro complementar ao final do gene.
nismo mutante, que no pro- Dessa forma, os produtos de Polime-
duz a protena de interesse. rase Chain Reaction (PCR) s sero
Isso pode acontecer a nvel de obtidos se um transposon estiver inse-
gene ou a nvel de promotor. rido no gene de interesse. Genes que
Um exemplo de co-supresso tiveram sua expresso alterada pela
a nvel de promotor demons- insero do transposon so recupera-
trado na Figura 2 onde um dos por meio da amplificao por PCR
mutante foi produzido no na do DNA extrado do indivduo com
protena que estava sendo su- fentipo mutante. Esse processo tem
perexpressa, mas na protena sido utilizado na identificao de ge-
de onde foi retirado o promo- nes em Caenorhabditis elegans e mi-
tor. Embora seja difcil compre- lho.
ender como a superexpresso A famlia dos transposons Mutator
de um gene possa ocasionar a (Mu) em plantas apresenta altas taxas
diminuio da sntese de sua de mutaes e tem alto grau de con-
protena, vrios experimentos servao nas extremidades das se-
tm sido realizados demons- qncias invertidas. Essas duas carac-
trando a ocorrncia desse fato. tersticas so bastante interessantes,
O primeiro resultado de co- pois ajudam a selecionar alelos que
Figura 4 TUSC (Trait Utility supresso foi obtido por meio de um contenham os elementos Mu cuja se-
System in Corn). Plantas conten- estudo envolvendo a variao da co- qncia previamente conhecida. In-
do transposons ativos so multi- lorao de flores de petnia pela seres dos elementos Mu podem ser
plicadas para a montagem de introduo do gene da chs sob o identificadas pela amplificao por
uma biblioteca de mutantes. controle do promotor 35S. PCR. O gene mutado pode, ento, ser
Conhecendo a freqncia com recuperado e propagado em semen-
que o transposon se multiplica e Mutao por Insero de tes F2. Outros aspectos importantes
se insere em regies codantes, Transposon ou T-DNA desse processo, e essenciais para a
pode-se calcular teoricamente o anlise de um menor nmero de plan-
nmero de plantas necessrias Transposons tas, so o nmero de transposio e o
para se ter um transposon em nmero de cpias do transposon Mu
cada gene. Cada planta mutante Transposons so elementos de na planta. A tecnologia de caracteriza-
autofecundada e as sementes DNA que tm a capacidade de sair de o de funes gnicas atravs do Mu
estocadas. Uma reao de PCR uma regio do genoma e se incorpo- foi utilizada pela primeira vez em
feita com DNA extrado de folhas rar em outra. Sendo o movimento do milho pela Pioneer Hi-Bred Co., sen-
de grupos de plantas dessa transposon um processo aleatrio, do denominada Trait Utility System
biblioteca de mutantes, usando- quando estes elementos pulam em (TUSC) (Fig. 4). Bensen et al. (1995)
se um primer do transposon e um genoma, podem se inserir no utilizaram a tcnica do TUSC para
um primer do gene (a seqncia meio de um gene, tornando-o inativo. caracterizar o mutante Anther ear1
de ambos conhecida). A Em plantas, uma srie de transposons (An1), cujo produto gnico est en-
hibridao feita para auxiliar tm sido usados como ferramenta, volvido na sntese do primeiro inter-
no escrutnio de um grande tanto na gentica direta quanto na medirio tetracclico na via da biossn-
nmero de plantas. Os grupos de reversa, para isolamento e caracteri- tese de giberelina (GA). A mutao
plantas cujo sinal foram positivos zao de vrios genes ou fentipos. O An1 resultou em um fentipo respon-
so subdivididos at que seja princpio da tcnica est descrito na sivo GA, que inclui uma altura redu-
encontrada a planta que conte- Figura 3. O primeiro gene de planta zida de planta, atraso na maturidade e
nha o transposon inserido no clonado por transposon, via gentica desenvolvimento de flores perfeitas
gene. Para aumentar a chance de direta, foi o gene bronze, de milho, em espigas normalmente pestiladas.
encontrar a planta mutante, testa- que codifica UDP-glucose:flavonide Um projeto financiado pela Natio-
se uma srie de primers de um 3-O-glucosiltransferase, uma enzima nal Science Foundation (NSF) coor-
nico gene simultaneamente da via metablica das antocianinas denado pela Dra. Virginia Walbot (Uni-
(Fedoroff et al., 1984). versidade de Stanford, EUA) tem por
A gentica reversa usando mutan- objetivo demonstrar a funcionalidade
tes por insero de transposons foi de genes de milho usando dois mto-
nos mecanismos de regulao celular. descrita, inicialmente, em Drosophila dos complementares: o seqencia-
Como conseqncia, na maioria das melanogaster. Essa metodologia ba- mento de DNA genmico flanquean-
vezes, a superexpresso de uma pro- seada em uma reao em cadeia da do as inseres do transposon Mu e a
tena na clula faz com que a produ- polimerase (PCR Polymerase Chain identificao e caracterizao dos in-
o dessa protena seja desligada e, ao Reaction), que utiliza um primer com- divduos mutantes contendo esses
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 53
transposons. Um banco de mu- da, grupos ou supergrupos po-
tantes est sendo criado usando dem ser organizados em matri-
plantas transformadas com os zes de duas ou trs dimenses
elementos Mu contendo o plas- para facilitar a determinao fi-
mdeo Bluescript (Fig. 5). A nova nal do indivduo carregando a
insero contendo o transposon insero desejada. As reaes
poder ser seletivamente clona- de PCR so realizadas em su-
da direto em E. coli, gerando pergrupos de DNA usando-se
uma biblioteca de mutao in- combinaes de oligonucleot-
sercional para anlise de DNA. deos do gene e do elemento de
Cada planta F2 ser autofecunda- insero. Os produtos de PCR
da e as sementes sero estocadas so carregados em um gel de
no Maize Genetics Cooperative agarose, transferidos para mem-
Stock Center, um rgo especi- brana e hibridizados com son-
almente criado para armazenar das produzidas a partir do gene
os estoques de sementes muta- de interesse e do elemento de
das. Os usurios podero utilizar Figura 5 Projeto NSF coorde- insero. Apesar do PCR ape-
a tcnica de PCR para seleo de uma nado pela Dr. Virginia Walbot nas permitir a amplificao do gene
coleo de plasmdeos que foram in- (University of Stanford). O mutado pelo elemento de insero,
seridos em genes de interesse. Cerca transposon contendo uma marca backgrounds podem ocorrer. Desta
de 50.000 ESTs, flanqueadas pelo trans- de seleo para resistncia forma, apenas as bandas que hibridi-
poson Mu, j foram completamente ampicilina em bactria transfe- zarem com ambas sondas sero leva-
seqenciados durante o primeiro ano rido para o milho por transfor- das adiante. Uma vez que o produto
do projeto. O objetivo final seqen- mao. As plantas so multiplica- de PCR tenha sido confirmado e se-
ciar cerca de 150.000 segmentos de das e so feitas bibliotecas qenciado, o supergrupo pode ser
DNA genmico contendo inseres genmicas a partir de colunas e subdividido em grupos cada vez me-
do transposon Mu. fileiras de plantas contendo esses nores. A determinao final da linha
transposons engenheirados, mutante pode ser obtida em menor
T-DNA inseridos aleatoriamente no tempo, dependendo do esquema de
genoma. Os plasmdeos origina- agrupamento dos DNAs.
O T-DNA um segmento de DNA dos da biblioteca genmica
presente no plasmdeo Ti (DNA no contendo esse cassetes so Uso de Microarrays de DNA
cromossmico) de Agrobacterium tu- seqenciados e as plantas que para Estudar a Expresso de
mefaciens, uma bactria de solo que contm os transposons inseridos Genes em Todo o Genoma
causa tumores quando infecta plan- nos genes de interesse so de Um Organismo
tas. O tumor causado pela capacida- identificadas
de da bactria de transferir seu T-DNA O microarray uma metodologia
para as clulas vegetais. O T-DNA utilizada para comparar a expresso
contm genes que codificam horm- et al., 1990). de um grande nmero de genes, si-
nios e aminocidos necessrios so- Gentica reversa em Arabidopsis multaneamente. Essa tcnica empre-
brevivncia da Agrobactria dentro da usando grandes populaes de plan- ga arranjos (arrays), que contm um
planta. Cientistas descobriram que tas mutadas, com um elemento de grande nmero de genes robotica-
podiam alterar este fragmento de DNA insero, taes como o T-DNA de A. mente distribudos de forma ordenada
substituindo os genes nativos por tumenfaciens. Grandes populaes sobre placas de vidro. A quantificao
qualquer gene de interesse e, que de plantas mutantes foram geradas dos nveis de expresso na tecnologia
esses novos genes continuariam sen- para constituir uma biblioteca de in- de microarray baseada em experi-
do transferidos para as plantas pelo sero. Em Arabidopsis, uma unidade mentos onde os milhares de clones de
sistema mediado pela bactria. A par- de transcrio tem em mdia 2.5 kb cDNA so hibridizados com duas son-
tir dessa descoberta, o T-DNA passou (intron e exon), o que significa que das marcadas com diferentes fluores-
a ser usado como uma ferramenta na um genoma de 100 Mb pode ser cncias (geralmente uma que emite
gentica direta e reversa de maneira dividido em cerca de 40.000 genes. cor vermelha e outra, verde). As son-
semelhante aos transposons. O T- Para ter 95% de chance de acertar um das podem ser conjuntos de cDNAs
DNA se insere aleatoriamente no meio dos genes, so necessrias 120.000 gerados a partir de clulas ou de
de genes tornando-os no funcionais inseres aleatrias independentes. O tecidos em duas situaes diferentes
e produzindo um organismo mutante. DNA extrado de plantas mutageni- que se deseje comparar (por exem-
A funo do gene Agamous de Arabi- zadas e agrupadas em grupos maio- plo: resistncia e suscetibilidade ao
dopsis foi caracterizada como sendo res. Inseres simples podem ser de- alumnio). Os resultados so produzi-
um regulador transcricional necess- tectadas por PCR em grupos de cerca dos sob forma de diferentes intensida-
rio para o desenvolvimento floral uti- de milhares de indivduos. Depen- des de fluorescncia, que so capta-
lizando essa metodologia (Yanofsky dendo da natureza da populao usa- das por microscopia de fluorescncia
54 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
a laser, em funo dos diferentes rie de fatores especficos.
nveis de expresso de cada gene. A anlise de expresso gni-
A imagem dos pontos fluores- ca em grande escala oferece
centes processada por compu- grandes vantagens, porm esse
tadores e programas especficos, processo possui limitaes. Uma
sendo gerada simultaneamente clara limitao na aplicao des-
uma grande quantidade de in- sa tecnologia a grande quan-
formao (Fig. 6). tidade de RNA necessria du-
A tecnologia de microarrays rante a etapa de hibridao. A
no fornece apenas informaes quantidade de RNA total para
sobre a funo de genes anni- uma hibridao de 50 a 200 g
mos, o que favorecer bastante (2 a 5 g para mRNAs). Certa-
os processos de gentica rever- mente, os resultados gerados
sa, mas tambm constitui uma por esse processo no determi-
ferramenta indispensvel para nam a funo de um gene, mas
estudos globais de expresso fornecem uma forte ferramenta
gnica, com grandes aplicaes para a sua compreenso. Os
nos estudos de biologia molecu- resultados fornecidos por esse
lar e fisiologia vegetal. Apesar do processo servem para indicar
microarray ser um dot blot de Figura 6 - Anlise de expresso genes candidatos interessantes
RNA, grande nmero de concluses gnica usando microarray. O para estudos mais detalhados. Estu-
podem ser tiradas com o uso desse mRNA total de cada situao dos adicionais tero de ser feitos para
processo. usado para preparar sondas de verificar se os nveis de transcrio
Uma importante aplicao da tec- cDNA usando a transcriptase alterados refletem mudanas na snte-
nologia de microarray o fato que reversa na presena de um se ou turnover. Alm disso, uma
muitos arrays podem ser produzidos nucleotdeo marcado com fluo- resposta diferente pode estar relacio-
para servir como uma plataforma co- rescncia. Um dos grupos de nada com processos ps-transcricio-
mum entre vrios pesquisadores. Se mRNA marcado com um nais como fosforilao, metilao, gli-
aclopado para o desenvolvimento de nucleotdeo com fluorescncia colisao, etc.
um banco de dados centralizado, os verde e o outro, com fluorescn- Devido a essa grande capacidade
pesquisadores sero capazes de pes- cia vermelha. As duas sondas so de anlise de transcritos ao mesmo
quisar em multiplos grupos de dados misturadas e hibridizadas com o tempo, a tecnologia de microarray
diferentes padres de expresso de DNA no microarray. Assim, a pode, muitas vezes, antecipar os pro-
interesse. Com essa tecnologia, ser relativa abundncia de cada jetos genomas de seqenciamento es-
possvel acessar o impacto de especfi- mRNA comparada por um trutural e funcional. Os microarrays
co tratamento, fatores ambientais, est- analisador de imagem atravs do hoje so construdos a partir de clones
gios de desenvolvimento e efeitos na sinal gerado pelas duas sondas. O conhecidos. Essa etapa envolve se-
expresso global de todos os genes em objetivo do processo identificar qenciamento de genes, identificao
um transgnico, estudos envolvendo genes cujos sinais gerados foram de clones em placas de estoque, ma-
heterosis e produtividade, anlise com- mais voltados para o verde ou nipulaes desses clones para novas
parativa de organismos de genomas para o vermelho. Aqueles clones, placas de estoque, reaes de PCR e
menores, como vrus, melhoramento cujo mRNA no so diferencial- eletroforese em gel de agarose para
assistido por marcadores, fingerprin- mente expressos entre as duas confirmar a eficincia do processo,
ting e escrutnio de germoplasma para populaes de mRNA, tero uma etc. Uma nova idia que tem surgido
identificar genes envolvidos em pro- cor intermediaria entre verde e o uso de microarrays sem o seqen-
cessos especficos, entre outros. Devi- vermelho, aqui representada pela ciamento prvio. Clones de bibliote-
do a informao gerada por estudos de cor amarela. Os clones represen- cas normalizadas so submetidos a
microarrays ser quantitativa, mudan- tados pela cor cinza representam amplificao do inserto por PCR e
as sbitas na expresso de um gene aqueles que esto representados automaticamente transferidos para o
podem ser detectadas e podem substi- em pequenas quantidades nas microarray. Assumindo que a quanti-
tuir metodologias de subtrao e diffe- sondas. Toda a anlise de ima- dade de clones raros tenha aumenta-
rential display. gem feita em um computador do em relao aos abundantes na
Apesar da obteno de cDNAs de que calcula intensidade de sinal normalizao da biblioteca, e que, em
organismos procariotas ser difcil devi- gerado na hibridao cada lmina de vidro, podem ser orga-
do principalmente falta do poli A+ e nizados pelo menos 10.000 clones, o
alta instabilidade dos mRNAs, esses processo pode tornar-se bem mais
organismos ainda so um excelente variabilidade de mutantes disponveis. simples e interessante. Clones relacio-
sistema para anlise de microarray Estudos de microarrays podem ser nados com o estresse poderiam ser
devido principalmente ao seu genoma usados para comparar o organismo isolados com base na confeco de
pequeno (em torno de 3 Mb) e a grande selvagem com mutantes, em uma s- uma biblioteca de cDNA de raiz de
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 55
uma planta tolerante ao es- mento de DNA. Isso faz
tresse, e sondas de cDNAs microarrays baseado em
da planta tolerante e da oligonucleotideos parti-
planta susceptvel ao mes- cularmente apropriados
mo estresse marcados com para genotipagem e apli-
duas fluorescncias dife- caes de seqencia-
rentes. Um rob de micro- mento. A maior desvan-
array capaz de colocar tagem do microarray
16 amostras em 48 placas baseado em oligos que
de vidro, lavar e secar a sua construo depende
sonda para o prximo gru- da disponibilidade de um
po de cDNA em 70 segun- banco de dados seguro.
dos. Assim, cerca de 10.000 Ao contrrio de micro-
amostras podem ser im- arrays baseados em frag-
pressas em, aproximada- mentos de DNA, infor-
mente, 12 horas. Vrios sis- Figura 7 - Identificao de maes de seqncias
temas robotizados mais rpidos e efi- interao protena-protena (in no so necessrias para a constru-
cientes para a impresso e processa- o. Em comparao dot blots de
vitro).
mento dos cDNA nas placas de vidro, clones arranjados em membranas de
A) A protena de interesse
alm de metodologias cada vez mais filtro, microarrays so mais sensveis,
clonada em um vetor de expres-
sensveis e precisas para deteco e exibindo uma dinmica mais ampla e
so em bactria que permite a
anlise dos resultados tm sido desen- permitindo uma anlise simultnea de
sua purificao em uma coluna
volvidos e disponibilizados. No exem- duas sondas complexas. Assim, ape-
de afinidade. Um extrato de
plo anterior, apenas clones expressos sar dos dot blots poderem ser apropri-
protenas produzido nas clulas
diferencialmente seriam seqenciados. ados para pequena escala, apenas
vegetais tambm submetido
Portanto, mesmo que tenhamos clo- microarrays baseados em fragemen-
coluna que j contm fixada a
nes repetidos, estaremos com um n- tos de DNA podem fornecer anlises
protena de interesse. A coluna em escala genmica. Uma desvanta-
mero de clones para seqenciamento
bastante reduzido em relao a um lavada e as protenas que intera- gem do processo, similar em qualquer
seqenciamento aleatrio. Se na pr- girem com a protena de interes- outro mtodo de hibridao, o fato
tica de microarrays pode, ou poder se podem ser seqenciadas ou de que hibridao cruzada entre mem-
em um futuro prximo, ser usado sem usadas para produzir anticorpos bros de uma famlia gnica pode ocor-
auxlio de classificao prvia dos que sero utilizados em uma rer, ocasionando uma anlise confusa
clones, grupos que tenham, ou este- biblioteca de expresso de de expresso gnica de membros de
jam desenvolvendo, organismos con- cDNA. uma mesma famlia.
trastantes para diversas caratersticas B) Protenas X e Y produzi-
de interesse, estaro com excelentes das em E. coli so misturadas e SAGE (Serial Analysis
ferramentas para ajudar a identificar passadas atravs de uma coluna of Gene Expression)
os genes envolvidos em vrios pro- de nquel. Se a protena Y
cessos fisiolgicos. Linhas recombi- interagir com a X, ambas SAGE a extenso lgica do se-
nantes provinientes de cruzamentos ficaro retidas na coluna. O qenciamento de EST. Um inventrio
de indivduos contrastantes e mutan- processo pode ser visualizado de mRNAs feito com base no se-
tes so as melhores opes, atualmen- por anticorpos ou raio-X, caso a qenciamento de cDNAs curtos, clo-
te, para as anlises de microarrays. proteina Y esteja marcada com nados em tandem. O tamanho desses
radioatividade cDNAs o suficiente para identificar
Vantagens e desvantagens do genes correspondentes no banco de
microarray baseado em dados. O padro de restrio desses
fragmentos de DNA rays baseados em fragmentos de DNA. genes diferentes est relacionado com
O potencial de colocar clones em a abundncia relativa de cada cDNA.
Existem basicamente dois proces- locais errados pode ser evitado no Os padres gerados pelo SAGE
sos em que os microarrays podem ser mtodo do oligo porque so sintetiza- tm sido estudados em humanos e em
confeccinados. Um a impresso de dos in situ, baseado na seqncia do levedura, contudo tm sido pouco
oligos e o outro, os de framentos de gene obtido diretamente do banco de utilizados em plantas. Um pr-requisi-
DNA previamente isolados na lmina dados. Alm disso, devido seqn- to para a identificao dos ESTs a
de vidro. O microarray baseado em cia que os hibridiza no microarray disponibilidade de um banco de da-
oligos, em particular aqueles produzi- baseado em oligo ser muito curta (20 dos grande para a espcie estudada.
dos por mtodo de fotolitografia, tem a 25 nucleotdeos), as reaes de Essa tcnica poderosa, mas no
alta densidade (250.000 olinucleotide- hibridao so muito sensveis na tro- conveniente para a comparao de
os/cm2) e so mais consistentes nos ca de um simples nucleotdeo, ao muitas amostras diferentes e para o
arrays comparados com os microar- contrrio do mtodo baseado no frag- estudo de transcritos raros.
56 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
Proteomics Estudo do Perfil protena em estudo e identificar
Protico de Um Organismo regies dentro de uma protena
que so importantes no processo
Cientistas tm utilizado o ter- de reconhecimento e da interao.
mo proteomics para descrever Existe um grande nmero de alter-
as anlises do perfil protico de nativas e variaes para estudar as
um organismo. O comportamen- interaes entre protenas (Fig. 7).
to de muitas protenas em um Apesar de bastante informativas,
proteoma pode ser monitorado as reaes in vitro podem masca-
por meio de gis de eletroforese rar os resultados reais devido
em duas dimenses. Nesse pro- impossibilidade de se reproduzir
cesso, protenas provenientes de Figura 8 - Interao protena- in vitro todas as condies exis-
clulas ou de tecidos em duas condi- protena in vivo. A- O ativador de tentes nas clulas in vivo. Por esse
es fisiolgicas diferentes (por exem- transcrio GAL4 possui dois motivo, foram desenvolvidos proto-
plo, plantas resistentes e sensveis a domnios: um que se liga ao DNA colos que estudam a interao entre
uma determinada doena ou condi- e outro que ativa a transcrio; B protenas in vivo.
o de estresse) so extradas, aplica- e C - Os dois domnios foram Uma maneira eficiente para detec-
das em gis e comparadas qualitativa separados: o primeiro pode ser o de interao in vivo utilizar o
e quantitativamente. As protenas pre- fundido protena de interesse sistema hbrido duplo de levedura.
sentes em apenas um dos gis ou que Esse processo constitui a construo
(B) e o segundo, protena
tenham a sua quantidade alterada so de duas protenas de fuso, por enge-
desconhecida (C); D - As colnias
fortes candidatadas para atuarem no nharia gentica. Uma delas gera um
de levedura contendo os dois
controle do processo em estudo. A hbrido entre seqncias para um do-
plasmdeos cujas protenas intera-
partir da identificao das protenas mnio que se liga ao DNA do fator de
gem sero azuis em meio conten-
de interesse, pode-se, utilizando-se as transcrio Gal4 (aminocidos 1-147)
do X-GAL (substrato para a
tcnicas de biologia molecular, isolar e a protena de interesse. Um segundo
enzima), devido resconstituio
sua seqncia gnica e caracteriz-la. plasmdeo de expresso contm uma
do fator de transcrio GAL4 e
seqncia que ativa o fator de transcri-
ativao do gene da beta-galacto-
Localizao Celular de um o Gal4 (aminocidos 768-881) fun-
sidase (lac Z)
mRNA ou Protena para dida com cDNAs (Fig. 8). Os cDNAs
Inferir sobre sua Funo so provenientes de bibliotecas de
onde existem genes candidatos. Des-
Os genes so transcritos em mol- sa forma, se as duas protenas expres-
culas de RNAs mensageiros (mRNA), localizao da molcula dentro de um sas na levedura so capazes de intera-
que so traduzidos em protenas. Es- organismo podem ser programados gir, o complexo resultante ativar a
sas so transportadas para locais espe- experimentos mais refinados para a transcrio dos promotores contendo
cficos dentro da clula de um deter- definio de sua funo. Tcnicas de stios de ligao para o Gal4, gerando
minado tecido ou organismo. Enquan- hibridizaes in situ tm sido ampla- uma colnia azul em meio contendo
to alguns genes codificam para prote- mente utilizadas para localizar genes e um substrato apropriado (X-GAL). O
nas que so expressas em todas as os seus produtos em cromossomos, sucesso dessa metodologia foi primei-
clulas de um indivduo durante toda tecidos e clulas de diversos organis- ramente demonstrado pela interao
a sua vida (genes constitutivos), ou- mos. Gal4-Gal80 (Fig. 8).
tros codificam para protenas que so
expressas apenas em algumas clulas, Interao Protena-Protena Concluso
ou em um determinado perodo de
desenvolvimento, ou em resposta a A caracterizao da funo gnica Desde a redescoberta das leis de
algum estmulo externo (genes teci- pode ser auxiliada por meio de estu- Gregor Mendel, cientistas comearam
do-especficos). A localizao de uma dos de interao protena-protena in a questionar a natureza do gene. Que
protena ou de seu mRNA nas clulas vitro e in vivo. A observao de que tipo de molcula seria o gene? Como
ou tecidos onde so produzidos uma protena, cuja funo desco- a informao contida em uma mol-
uma importante fonte de informao, nhecida, interage com uma que cula poderia ser transmitida para as
que pode auxiliar na determinao da conhecida pode sugerir que as duas prximas geraes? Por que e como
funo de um gene ou protena. Um protenas fazem parte do mesmo pro- apareceriam indivduos mutantes?
dos princpios dessa metodologia a cesso ou que podem estar localizadas Apenas em meados do sculo XX,
identificao do mRNA ou da protena no mesmo compartimento celular. Os com a descoberta da estrutura do
de interesse por meio de sondas espe- dois tipos de testes (in vitro e in vivo) DNA por Watson e Crick, essas e
cficas. As sondas aps se ligarem podem ser usados para verificar a muitas outras questes comearam a
protena ou ao mRNA em estudo so existncia de interao entre duas ser respondidas. Nas primeiras trs
detectadas com o auxlio de tcnicas protenas conhecidas, identificar no- dcadas aps a compreenso da es-
de microscopia. Uma vez conhecida a vas protenas que interagem com uma trutura do DNA, o conhecimento a
Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 57
mente, um nico laborat-
rio pode seqenciar 1000
(ou mais) genes por dia.
Um pesquisador pode utili-
zar os dados gerados e che-
gar a concluses muito mais
precisas sobre a funo de
um gene em poucas sema-
nas de trabalho, do que
outro, em muitos meses de
trabalho, h alguns anos
atrs. Hipteses podem ser
testadas muito mais rpida
e precisamente. Est haven-
do um redirecionamento na
maneira como os grupos
conduzem seus projetos de
pesquisas na rea da biolo-
Figura 9 - Esquema dos plasm- gia molecular. A primeira
dios usados no sistema de fase dos chamados projetos
levedura de hbrido duplo. Os genoma, seqenciamento
plasmidios pAS2 e pACT2 de genes, est gerando uma
contm as protenas de fuso de grande quantidade de informaes, as Figura 10 - Processo de seleo
ligao no DNA (DBD) e ativa- quais sero provavelmente, multipli-
de leveduras contendo os
o de transcrio (DAD), cadas com a implementao da se-
plasmdios pAS2 e pACT2 e
respectivamente. Os genes Trp e gunda fase, ou seja, com a anlise
seleo das leveduras contendo
Leu permitem que a levedura funcional do material seqenciado.
interao entre as protenas X
cresa em meio sem triptofano e Neste texto foram mencionadas meto-
e Y
leucina. O gene Ap seleciona os dologias que tm por objetivo auxiliar
plasmdios em Escherichia coli. na identificao da funo gnica tan-
HA a protena hemoaglutinina to em mbito bioqumico como biol-
e pode ser usada como protena gico. Entre elas, os microarrays tm aumento da qualidade nutricional,
reprter de leveduras transfor- revolucionado a anlise funcional de entre outras caractersticas de interes-
madas seqncias gnicas em grande escala, se econmico.
uma vez que diferenas nos nveis de
expresso de milhares de genes po- Referncias
respeito de sua biologia cresceu fan- dem ser detectados simultaneamente.
tasticamente. Dentro desse perodo, Desta forma, vrios genes ainda des- BENSEN, R.J.; JOHAL, G.S.; CRA-
ficou conhecida a natureza qumica conhecidos podero ter suas funes NE, V.C.; TOSSBERG, J.T.; SCHNA-
dos genes, como a informao gen- biolgicas desvendadas utilizando esse BLE, P.S.; MEELEY, R.B.; BRIGGS, S.P.
tica era armazenada, como as clulas processo. Em um futuro no muito (1995). Cloning and characterization
respondiam a essa informao e como distante, ao invs de se comprarem of the maize An1 gene. Plant Cell 7:
ela era transmitida de uma gerao kits para construo de bibliotecas, 75-84.
para outra. sero compradas bibliotecas j arran- FEDEROFF, N.V.; FURTEK, D.B.;
A partir dos anos 70, cientistas jadas em matrizes, e o pesquisador NELSON, O.E. (1984). Cloning of the
aprenderam a manipular a molcula testar sondas diferentes. Os resulta- bronze locus in maize by a simple and
de DNA utilizando as tcnicas de bio- dos sero organizados no mais em generalized procedure using the trans-
logia molecular. Inaugurou-se a era da ESTs, mas em nveis de expresso posable element Activator (Ac). Proc.
tecnologia do DNA recombinante, tam- desses genes sob diferentes condi- Natl. Acad. Sci. USA 81: 3825-3829
bm denominada engenharia genti- es. As metodologias de anlise g- SHEEHY, E.R.; KRAMER, M.; HI-
ca. Desde ento, a biologia molecular nica, tanto individuais quanto em lar- ATT, W.R. (1988). Reduction of poly-
tem experimentado grandes avanos ga escala, fornecero um acesso a galacturonase activity in tomato fruit
tecnolgicos que tm culminado em informaes sem precedentes para by antisense RNA. Proc. Natl. Acad.
importantes fontes de conhecimento todas as reas da biologia. Entre elas, Sci. USA 85: 8805-8809.
sobre a funo, expresso e regulao a agropecuria ser amplamente be- YANOFSKY, M.F.; MA, H.; BOW-
de genes em diferentes organismos. neficiada, uma vez que existe grande MAN, J.L.; DREWS, G.N.; FELDMANN,
Trabalhos de isolamento, seqencia- necessidade de identificar e de estu- K.A.; MEYEROWITZ, E.M. (1990). The
mento e caracterizao de um ou dar genes que sejam responsveis por protein encoded by the Arabidopsis ho-
poucos genes eram comumente pu- conferir resistncia a doenas, tole- meotic gene agamous resembles trans-
blicados at a dcada de 90. Atual- rncia a estresses biticos e abiticos, cription factors. Nature 346: 35-39.
58 Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento
SEO DE CARTAS
Para entrar em contato com Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento voc pode enviar sua
correspondncia via Internet, fax ou carta para esta seo. A critrio do editor, as mensagens pode-
ro ser publicadas resumidamente. Nossos endereos so:
Redao de Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento: SRTV/Sul Quadra 701 Ed. Palcio do
Rdio II, sala 215 Cep 70340-902 Braslia DF Tel: (061) 225-1512 Fax: (061)224-2830
CARTAS Home-page: www.biotecnologia.com.br Email: kl3@biotecnologia.com.br

Prezados Senhores, ana, e tenho obtido excelentes resul- informaes sobre a rea.
O motivo dessa mensagem solicitar tados. Vejo no processo de controle
informaes. Fui escalado para uma biolgico uma sada saudvel para a Ricardo A.G da Silva
discusso sobre a MP2052 durante o produo de alimentos e outros pro- e-mail: fouly@uol.com.br
prximo EVINCI (Curitiba/PR - UFPR), blemas sanitrios. Sou assinante da
em uma mesa-redonda, na qual esta- revista biotecnologia e gostaria de dar Prezado Ricardo,
ro presentes representantes do IBA- a minha participao, parabenizando No momento estamos disponibili-
MA. Tenho acompanhado algumas primeiramente, por este excelente tra- zando um espao em nosso site na
listas de discusso e percebo que o balho. Como produtor, sinto que a Internet, por meio do Portal Biotec-
desconhecimento sobre o assunto maioria dos colegas produtores no nologia chamado Biocurriculum,
geral, indo desde os alunos da gradu- conhecem nenhuma tecnologia de espao no qual o senhor poder
ao at o MCT e CNPq, que suspen- controle fitossanitrio biolgico, e esto disponibilizar o seu curriculum.
deram os processos de projetos com extremamente bitolados com o uso de Caso tenha interesse, envie o seu
cooperao internacional at que os controles convencionais qumicos. curriculum A/C da sesso Biocurri-
advogados do IBAMA possam enten- Vejo a necessidade de mudar isso culum.
der a lei. Preciso de sugestes sobre mediante disponibilidade de informa-
temas que podem ser discutidos. J es, o que procuro fazer um pouco Prezado Sr.
estou preparando uma pequena pau- aqui em minha regio. Sinto que h Voc poderia me enviar o intervalo
ta para meu discurso mas queria mais poucos produtos no mercado para de pginas do artigo Extraction of
sugestes. Aproveito o ensejo para que possamos utilizar e no so bem DNA from Plants SOLUTIONS FOR
informar que produzo um boletim divulgados, sendo difcil para o pro- COMMONLY FOUND PROBLEMS
enviado por e-mail para cerca de uma dutor encontrar tais informaes. Os publicado na revista Biotecnologia
centena de estudiosos da rea de produtos que, eventualmente, neces- (volume 9, ano 1999)? Desde j, lhe
Ornitologia em todo o Brasil e vrios site manipular na prpria propriedade agradeo muito pela ateno!
pases da Amrica do Sul. para aplicao so muito rejeitados Flavio Ayres
FERNANDO COSTA STRAUBE pelo produtor por entenderem que
no h tempo e pessoal treinado para Prezado Sr. Flvio,
Mlleriana: Sociedade Fritz Mller de isso. Assim, a minha opinio seria no O artigo Extrao de DNA de plan-
Cincias Naturais sentido de criarem uma coluna dentro tas - solues para problemas comu-
E-mail: juruva@milenio.com.br da revista onde disponibilizassem in- mente encontrados esto na edio
formaes dos produtos existentes, n 9 da Revista Biotecnologia. Pgs.
Prezado Sr.Fernando, Estamos dispo- suas finalidades e formas de utiliza- 40, 41, 42, 43.
nibilizando um espao no nosso site, o.
denominado BIOCORREIO, para tro- Sem mais, subscrevo-me. Vocs poderiam me informar sobre
ca de informaes entre pesquisado- Atenciosamente o Dermanyssus, pois estou desen-
res, portanto poder deixar essa sua Hugo Yamada volvendo um trabalho universitrio
mensagem para que algum eventual e no estou encontrando nada so-
pesquisador entre em contato com Prezado Sr.Hugo, bre esse assunto.
voc. Basta enviar novamente sua Acusamos e agradecemos seu e mail, Desde j agradeo,
mensagem A/C de Biocorreio do por- assim como informamos que sua su- Fleury
tal www.biotecnologia.com.br. gesto foi encaminhada. fleuri@osite.com.br

Prezado Senhores, Meu nome Ricardo Alexandre Gue- Caro Sr. Fleury, todo o material que
Sou fruticultor de Mamo, Maracuj, des da Silva e sou universitrio. Curso dispomos encontra-se em nosso site.
Banana, e algumas Cucurbitceas biologia, estou no 6 perodo, na UPE Pedimos por gentileza que faa uma
como Abbora e Melancia. H algum e tenho conhecimento de informti- pesquisa no nosso sistema de busca,
tempo j utilizo produtos como Meta- ca/internet. Estou procurando vagas a fim de encontrar o assunto deseja-
rhizium anisopliae e Beauveria bassi- de pesquisador (laboratrio) e quero do.

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 59


FUNDAO GIACOMETTI
(Repete Fotolito)
Obs.: Saiu na Pg. 31 da edio anterior (n16)

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MONSANTO
(Repete Fotolito)
Obs.: Saiu na pgina 49 da edio anterior (n16)

Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento 61


EMBRAPA
(Repete Fotolito)
Obs.: Saiu na 3 Capa da edio anterior (n16)