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Informe N2
MTODOS DE DETERMINACIN DE CLULAS Y BIOMASA BACTERIANA
Fecha de realizacin: 10, 13 y 20 de Octubre de 2016
OBJETIVOS
Hacer una estimacin poblacional de una suspensin de levaduras Saccharomyces
cerevisiae utilizando conteo en cmara de Neubauer y turbidimetra en la escala de
Macfarland.
Implementar mtodos directos e indirectos para la determinacin de clulas
presentes en una suspensin.
INTRODUCCIN
Entre los mtodos directos para la determinacin de biomasa, est el recuento celular en
cmara: Para el recuento de microorganismos se pueden emplear diferentes tipos de
cmaras como la cmara de Neubauer, Thoma, Brker, Ttirk, Fuchs-Rosenthal, Malassez,
Petroff Hauser, etc. El recuento de microorganismos se realiza en la cuadrcula central cle la
cmara y se multiplica por la profundidad, y por el factor de dilucin, en el caso que la
muestra est diluida, y se obtiene el nmero de microorganismos por unidad de volumen
(nmero de clulas/ml, generalmente). Este mtodo tiene como desventajas que se pueden
presentar irregularidades en la distribucin de la muestra, o que puede no identificarse
correctamente las clulas y estas sean confundidas con otras formas orgnicas e
inorgnicas existentes en el medio.
La escala de McFarland, consiste en una serie de tubos con diferentes grados de turbidez
que son empleados para la preparacin de suspensiones de microorganismos. La escala se
prepara utilizando cido sulfrico (1%) y Cloruro de Bario (1%), lo que genera un precipitado
de sulfato de bario suspendido
METODOLOGA
Peso seco
Se pes una caja de petri la cual en su interior se deposit un papel filtro (poro de
celulosa 0.45 m) sobre un vidrio reloj, despus se procedi a realizar una filtracin
por membrana utilizando una bomba al vaco en la cual se sirvi una muestra sobre
el papel filtro, luego de esto se llev a secar a un horno durante 24 horas a 72C.
Pasadas las 24 horas se pes el vidrio reloj con el papel filtro para determinar el
peso de la masa seca despus de la filtracin.
Escala de MacFarland
Se prepar la escala de McFarland llevando a un volumen final de 5 mL, preparando 10
tubos con cido sulfrico y cloruro de Bario en diferentes cantidades segn lo establecido
como estndar, y 1 tubo que contena solo cido sulfrico, con el fin de usarlo como blanco
en la medicin por medio de un colormetro y con la medicin de la turbidez o densidad
ptica de cada tubo de la escala de McFarland, crear una curva que permita cuantificar la
biomasa de una suspensin de cantidad desconocida de levaduras de Saccharomyces
cerevisiae por medio de la absorbancia de esta y as poder estimar el nmero de
clulas/mL.
RESULTADOS
Recuento en cmara de Neubauer
241 x 50000 = 12,05 x 106 clulas/mL
Peso seco
Peso filtro y vidrio reloj = 32,86 g
Factor de capacidad de Absorcin de humedad del filtro = 0,113 g
Escala de MacFarland
El patrn o la escala de McFarland consiste en una serie de tubos hermticamente
cerrados,previamente calibrados y con una densidad ptica diferente originada por la
aparicin de un precipitado de sulfato de bario (SO4Ba) resultante de la reaccin entre el
cloruro de bario (Cl2Ba) y el cido sulfrico (H2SO4).
Estos estndares son comparados visualmente o colorimtricamente con una suspensin
de microorganismos, con el fin de cuantificar la biomasa presente en la suspensin
0 5 0 0
1 6,94x108 1,256
2 4,65x108 0,756
CONCLUSIONES
Se puede observar en la grfica 1, que el valor obtenido del coeficiente de correlacin (r2)
es de 0.9518.
Dicho valor nos indica que:
El grado de correlacin entre las variables, pese a que se encuentra un poco por
debajo de lo esperado, nos indica que existe una relacin lineal entre las dos
variables aleatorias, por lo tanto es viable implementar la curva de calibracin para la
cuantificacin de clulas/ml de la prctica.
Los resultados obtenidos en la curva de calibracin sugieren fallos durante la
realizacin del procedimiento tales como errores del operario (volumtricos, de
manipulacin de los equipos, etc) o instrumentales (calibracin, defectos propios de
los instrumentos), los cuales intervinieron directamente en la linealidad de la curva
ms sin embargo no invalidaron la prctica.
BIBLIOGRAFA
Carmen Arniz, Laura Isac y Julin Lebrato. DETERMINACIN DE LA BIOMASA
EN PROCESOS BIOLGICOS. Grupo de Tratamiento de Aguas Residuales.
Escuela Universitaria Politcnica. Universidad de Sevilla.
Rentera Vanessa. PRODUCCIN DE BIOMASA. Universidad Central del Ecuador,
Facultad de Ciencias Qumicas
BECTON dickinson and company/ patrn de turbidez BBL preparado- Mcfarland
turbidity standard /2005.