Introduccin

La amilasa es una enzima importante que tiene una gama variada de aplicaciones
industriales desde alimentos hasta cosmticos, desde la industria farmacutica hasta
la industria de detergentes, etc. El presente estudio se llev a cabo considerando
estas importantes aplicaciones de la enzima amilasa. Monascussanguineus tampoco
ha sido explorado por su eficiencia de producir enzimas amilasa bajo fermentacin en
estado slido.
En el presente estudio, se seleccionaron varios sustratos y, entre ellos, la remolacha
como un slido, ha dado un rendimiento mximo (0,029 U / ml). La actividad
enzimtica se optimiz mediante la metodologa de superficie de respuesta (RSM) y se
obtuvo un rendimiento experimental mximo de 0,014 U / mL en condiciones
optimizadas de pH 5, temperatura de incubacin de 50C y tiempo de incubacin de
10 min. Se utiliz un paquete de software MATLAB para el anlisis grfico y de
regresin de los datos experimentados. La cintica enzimtica se calcul con
diferentes concentraciones de almidn y el valor Km observado fue 0,055 mM a partir
del anlisis de regresin lineal. La enzima fue moderadamente inhibida (44,7%) por
NaCl y KCl (0,105 U / mL) con inhibicin mnima (14,8%) observada con SDS. El
clculo del peso molecular y la confirmacin de amilasa en la muestra de protena se
realiz mediante SDS-PAGE y Zymography. El peso molecular calculado fue de 56
kDa. La amilasa alcalina producida por M. sanguineus ha mostrado una alta eficiencia
en la eliminacin de las manchas en los paos en combinacin con detergente
comercial (Surf excel) a 20C.
Antecedentes Generales
Se puede concluir que el hongo M. sanguineus es una buena fuente de produccin de
amilasa bajo fermentacin en estado slido. Tambin se llev a cabo la aplicacin de
amilasa producida por M. sanguineus en la industria detergente y se demostr que era
muy eficaz en la eliminacin de manchas de los tejidos.
A-amilasas, respecto a enzimas conocidas para catalizar la hidrlisis de enlaces a-1,4-
glicosdicos internos en almidn en un resto ms pequeo, tal como glucosa, maltosa,
etc. Las amilasas desempean un papel significativo en la biotecnologa que
constituye una una gama variada de aplicaciones industriales como farmacutica,
alimentaria, papelera, cosmtica, detergente, etc., que comparten aproximadamente el
25% del mercado mundial de enzimas. Las plantas, los animales y los
microorganismos son las principales fuentes de obtencin de la enzima a-amilasa
Monascus es un hongo homotlico clasificado en la clase Ascomycetes y la familia
Monascaceae. Monascus spp. Son bien conocidos productores de enzimas
extracelulares tales como amilasa, glutamilasa, b-glicosidasa y diversos potentes
inhibidores enzimticos. Estos compuestos bioactivos tienen gran importancia en las
industrias alimentaria y farmacutica. En las ltimas dcadas se observ una
tendencia creciente a la utilizacin de residuos agrcolas como fuente de carbono bajo
fermentacin en estado slido para producir un rango variado de enzimas y otros
metabolitos secundarios beneficiosos de los microorganismos. Los hongos
filamentosos muestran un patrn de crecimiento de hifas y son capaces de sobrevivir
bajo condiciones de presin osmtica deficiente y ms alta. Estos factores hacen que
sea un bio conversador eficiente de slidos en la microflora natural. Diversas
industrias, tales como alimentos, bebidas y otras agroindustrias generan una enorme
cantidad de residuos que son difciles de eliminar. Estos desechos pueden utilizarse
como fuente de nutrientes para el crecimiento y produccin de diversos metabolitos a
partir de fuentes microbiana.
Objetivo general:
Mostar la amplia importancia de la Alfa amilasas en la industria alimentaria,
farmaceutica y en la elaboracin de detergentes

Objetivos especficos:
Indicar la aplicacin efectiva de la amilasa producida por el hongo M.
sanguineus en la remocin de manchas en los tejidos
Demostrar las condiciones de extraccin y estimacin enzimtica para la
produccin industria de dicha enzima
MARCO TEORICO
Las enzimas son catalizadores orgnicos que disminuyen la energa de activacin de
las reacciones metablicas, por lo que aumentan la velocidad y permiten que se
produzcan a temperaturas y presiones a la que normalmente no tendran lugar. En una
curva de saturacin de una reaccin enzimtica, al inicio, la velocidad permanece
Las enzimas son catalizadores orgnicos que disminuyen la energa de activacin de
las reacciones metablicas, por lo que aumentan la velocidad, y permiten que se
produzcan a temperaturas y presiones a las que normalmente no tendran lugar. En
una curva de saturacin de una reaccin enzimtica, al inicio, la velocidad permanece
constante denominndose velocidad inicial (Vo), la cual va disminuyendo hasta llegar
a un plateau queda a conocer una saturacin de la enzima por el sustrato.
AMILASA:
Cataliza la -1,4 glucosdicos de la regin central de la cadena de amilosa y
amilopectina, exceptuando las molculas cercanas a la ramificacin, obteniendo como
resultado maltosa Y oligosacridos de varios tamaos. La actividad de la enzima se
determina cualitativamente mediante la disminucin de la capacidad de la solucin de
almidn para formar el color azul caractersticos con el yodo o midiendo la disminucin
de la viscosidad de la suspensin de almidn. La alfa-amilasa cataliza la hidrlisis de
la cadena lineal (amilosa) y la ramificada (amilopectina) del almidn, rompiendo
enlaces 1,4 interiores (Endo amilasa) para formar una mezcla de dextrinas; por ello se
la conoce como enzima dextrinognica (mezcla de amilo dextrina, eritrodextrina,
acrodextrina y malto dextrina) con poca produccin de maltosa.

Es una enzima glicoproteica, hidrolizante de polisacridos. Hidroliza ligaciones alfa-

1,4-glicosidicas de molculas de almidn, glicgeno y otros alfa 1,4-glucanos,
liberando primariamente oligosacridos de 6 -7 unidades de glucosa y posteriormente
azucares reductores
La alfa amilasa es encontrada en la saliva y es llamada Ptialina. Esta enzima puede
tener accin en el estmago por diversas horas y digerir hasta 40% del almidn, sobre
condiciones correctas de acidez estomacal y solides de las comidas.
2. Material y mtodos
2.1. Cultivo aislado
La cepa de Monascus se aisl de la granada (Punicagranatum). La cepa se identific
como M. sanguineus y se mantuvo en la papa Dextrosa Agar (PDA) medio.

2.2. Preparacin del inculo

La cultura apropiadamente cultivada en medio PDA se desech y se diluy en agua
destilada para hacer la suspensin de esporas. La suspensin de esporas se utiliz
como inculo.
Y torta de aceite de coco. Estos se obtuvieron de un mercado local de Chamarajpet,
Bangalore, India, y se usaron como sustrato slido bsico para la produccin de
enzimas bajo fermentacin en estado slido. Estos sustratos se secaron y trituraron en
polvo fino. Se pesaron cinco gramos de sustrato y se colocaron en un revoque cnico
y se le aadieron 10 ml de medio basal y se mantuvo en autoclave a 121C durante 20
min. La composicin basal de los medios fue la siguiente: Almidn soluble 5 g;
Extracto de levadura 2 g; KH _ {2} PO _ {4} 1 g; MgSO _ {4} 7H _ {2} O 0,5 g en 1000
ml de agua destilada. El pH se mantuvo a 6C. Despus de autoclavar, se inocularon
estas suspensiones con una suspensin de esporas al 10% (v / v). La fermentacin se
realiz a 30 C durante 15 das.

2.4. Extraccin y estimacin enzimtica

Los sustratos fermentados se secaron a 50C durante 24 h. Se prepar tampn de
fosfato (PO _ {4}) (pH 7). Se aadieron veinticinco ml de tampn PO4 en cada lquido
que contena los sustratos secos. La enzima se extrajo en condiciones de agitacin a
150 rpm durante la noche seguido por centrifugacin a 10.000 rpm para
15 min y se obtuvo el sobrenadante claro como enzima cruda. El ensayo enzimtico se
llev a cabo usando el mtodo DNS.
Se tomaron 0,1 ml de extracto de enzima crudo al cual se aadieron 0,9 ml
De tampn de fosfato seguido de incubacin para
30 min a temperatura ambiente. Se aadi un ml de solucin recin preparada de DNS
y se incub en bao de agua hirviendo durante 10 min. La absorbancia se registr a
540 nm despus de diluirlo con 2,5 ml de agua.
2.5. Optimizacin de la actividad enzimtica por la metodologa de superficie de
respuesta
El diseo experimental se formul de acuerdo con el mtodo de diseo compuesto
central (CCD) de RSM utilizando el software MATLAB versin 7.5.0 (R2007b) de los
trabajos de matemticas, Inc., EE.UU. para los 3 factores seleccionados, a saber pH,
temperatura y tiempo de incubacin. Un conjunto de 20 experimentos fue necesario
con cada variable a 5 niveles.
2.6. Precipitacin con sulfato de amonio
La enzima presente en el extracto libre de clulas crudas (60 ml) se purific mediante
precipitacin con sulfato de amonio hasta una saturacin del 60% a 4C y se dej
durante 4 h. El precipitado se recuper por cen- trifugacin a 10.000 rpm durante 10
min a 4 C y se disolvi en el volumen mnimo de tampn de fosfato 100 mM (pH 7,0).
Despus se transfiri en una bolsa de dilisis preactivada y se sumergi en tampn de
fosfato (10 mM) a 4C durante la noche. Buffer fue cambiado a cada 1 h de intervalo
con el fin de lograr una purificacin adecuada. El dializado se transfiri a pequeos
tubos atornillados y se almacen a 18C.
2.7. Estimacin de protenas por el mtodo de Lowry
La amilasa extracelular de muestras parcialmente purificadas de cscara de
remolacha fue estimada por el mtodo de Lowry. La densidad ptica de la mezcla de
reaccin se observ a 660 nm frente a una pieza en bruto preparada con 0,1 ml de
tampn.

2.8. Determinacin de la masa molecular por SDS-PAGE

La electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) de la enzima amilasa purificada
parcial se realiz de acuerdo con Laemmli. Despus de la electroforesis, el gel se
sumergi en una solucin de fijacin. La tincin de la banda se realiz con azul
brillante de coomassie, R-250 (CBB) durante 2 h y posteriormente se deshinch. El
peso molecular de la amilasa se estim utilizando un marcador de peso molecular de
protena estndar que consista en Albumina de Suero Bovino (66 kDa).

2.9. Tincin con zimografa / actividad de la enzima

Para obtener Zymograph se realiz PAGE no desnaturalizante. El gel obtenido de la
electroforesis se sumergi en una solucin de almidn al 1% durante 20 minutos
seguido de la adicin de pocas gotas de solucin de Lugol al mismo (0,67% de yoduro
de potasio y 0,33% de yodo). El gel se observ para una banda amarilla.

2.10. La cintica de enzimas

Se usaron diferentes concentraciones de almidn (0, 10, 15, 20, 25 mM) para estimar
los parmetros cinticos, Km y Vmax utilizando el grfico de Lineweaver-Burk
recproco doble. La ecuacin de Michaelis-Menten se us para ajustar los datos para
la constante cintica de manera no lineal y la fijacin de la curva se realiz usando el
software MATLAB. El ensayo enzimtico se llev a cabo utilizando el mtodo DNS a
540 nm como se describe anteriormente.
2.11. Efecto de los inhibidores / activadores sobre la actividad de la amilasa
Diferentes inhibidores y activadores en la concentracin de
5 mM para investigar la actividad amilasa. NaCl, KCl, CaCl2, dodecilsulfato sdico
(SDS), etilenodiamina Se us cido tetraactico (EDTA) para el ensayo enzimtico. La
enzima se incub con los compuestos fijados anteriormente para
30 minutos. Despus de la incubacin, la actividad enzimtica se observ por DNS
ensayo como se describe anteriormente.
2.12. Anlisis del rendimiento de lavado de la enzima para lavado en fro
Se estudi el uso de extracto enzimtico purificado en formulaciones de detergentes
para ropa en trozos pequeos de algodn blanco cuadrado (8 8 cm) teidos con salsa
de espinacas y chocolate. Las piezas de tela manchadas se dejaron reposar durante la
noche y se tomaron en flugs separados. Se prepararon y estudiaron los siguientes
conjuntos:
I) Frasco con agua destilada (100 ml) + pao manchado (pao manchado con salsa de
espinacas y chocolate, independientemente).
Ii) Frasco con agua destilada (98 mL) + pao manchado
+ 2 mL de detergente Surf excellent (1% p / v).
Iii) Frasco con agua destilada (96 ml) + pao manchado
+ 2 mL Surf excelente detergente (1% p / v) + 2 mL de extracto enzimtico.
Los injertos anteriores se incubaron a 28C durante 30 min en un agitador rotatorio.
Despus de la incubacin, se retiraron las piezas de tela, se aclararon con agua del
grifo fra y se secaron. Las piezas de tela no tratadas manchadas con salsa y
chocolate se tomaron como control.

2.13. Anlisis estadstico

Se utiliz un paquete de software MATLAB para el anlisis grfico y de regresin de
los datos experimentados y para examinar la superficie de respuesta y las grficas de
contorno. Los parmetros estadsticos se estimaron mediante el anlisis de varianza
(ANOVA).
3. Resultados y discusin

3.1. Tamizado del sustrato para la produccin de alfa-amilasa

El rendimiento mximo de la enzima se observ con el polvo de cscara de remolacha
(0,0287 U / mL) seguido de la cscara de naranja (0,0284 U / mL) y la actividad
mnima se observ con cebolla (0,0171 U / mL). Se sabe que la remolacha es una rica
fuente de hidratos de carbono, pigmentos b-betalnicos de color rojo carmes y
diversos micronutrientes como cido flico, potasio, manganeso, etc. Se ha producido
una mayor explotacin de residuos orgnicos de diversos sectores La agricultura y la
industria en las ltimas dcadas. Residuos de residuos orgnicos orgnicos, como la
cscara vegetal y de frutas, el salvado, el bagazo, las semillas de frutas, etc., han
tomado un lugar importante en la tcnica de bioprocesos como posibles materias
primas. Estos residuos agrcolas muestran una excelente capa slida y adems
aportan nutrientes esenciales para apoyar el crecimiento microbiano y la produccin
de metabolitos secundarios.

3.2. Optimizacin de la actividad enzimtica por la metodologa de superficie de

respuesta
Para obtener una actividad enzimtica ptima, se variaron tres factores importantes,
es decir, la temperatura de incubacin (C), el tiempo de incubacin (min.) Y el pH y se
analizaron estadsticamente los datos obtenidos. La ecuacin del modelo que explica
tres variables para la actividad de la amgdala (U / ml) se da a continuacin y los
coeficientes obtenidos se proporcionan enActividad de la amilasa U = ml

16: 3597 0: 9472 pH 0: 0599

Temperatura de incubacin 0: 5888 Tiempo de incubacin
0: 0013 pH Temperatura de incubacin 0: 0262 pH
Tiempo de incubacin 0: 0029 Temperatura de incubacin
Tiempo de incubacin 0: 0261 pH2 0: 0006
Temperatura de incubacin2 0: 0054 Tiempo de incubacin2
1
El efecto interactivo de la temperatura de incubacin y el tiempo de incubacin se da
en la actividad de amilasa se redujo gradualmente con el aumento del tiempo de
incubacin, siendo la disminucin ms ntida a una temperatura de incubacin ms
alta. Se observ una actividad mxima de amilasa con la temperatura de incubacin
ms alta y el tiempo mnimo de incubacin. El efecto interactivo del tiempo de
incubacin y la concentracin del pH tambin mostraron variacin significativa. La
actividad disminuy notablemente con el tiempo de incubacin a pH bajo, aunque la
cada observada a pH ms alto fue ligeramente baja. La mxima actividad se observ
con el pH ms bajo y el tiempo mnimo de incubacin. El efecto interactivo del pH y la
temperatura de incubacin sobre la actividad de la amilasa para la cscara de la raz
de remolacha. La actividad no muestra mucha variacin con la temperatura de
incubacin pero aumenta ligeramente con un aumento del valor del pH. Por lo tanto, a
partir de los datos obtenidos anteriormente se puede concluir que la temperatura de
incubacin no tiene un efecto muy significativo sobre la actividad de la amilasa, pero el
tiempo de incubacin tiene un efecto negativo sobre la actividad.
A partir del anlisis de la varianza , el modelo para la amyrosa fue muy significativo (p
<0,01) y el valor R2 (coeficiente de determinacin) para el modelo, siendo la medida
de la bondad del modelo, Fue 0,8405 lo que mostr que
El 84,05% de la variacin total del valor de respuesta observado podra explicarse por
el modelo, o por parmetros experimentales y sus interacciones.
La validacin de datos para la actividad amilasa (U / mL) de M. sanguineus se llev a
cabo con la ayuda de un modelo polinomial. Se encontr que los valores ptimos para
las variables de ensayo en factores codificados eran pH de 5 a 50C de temperatura
de incubacin y 10 min de tiempo de incubacin que predice una actividad mxima de
amilasa de 0,011 U / ml. El experimento se llev a cabo con las condiciones ptimas
predichas anteriormente y se observ una actividad de amilasa de 0,014 U / ml. Esto
demostr una buena concordancia entre el valor experimental y el valor predicho, lo
que confirma el modelo propuesto.
Los rangos ensayados de inculo y el pH inicial del medio no dieron ninguna variacin
signi fi cativa en la actividad de la amilasa. Hay pocos informes disponibles sobre
amilasas y glucoamilasa de algunas de las especies de Monascus, pero no se ha
realizado mucho trabajo sobre M. sanguineus.

3.3. Purificacin parcial, peso molecular y Zimografa de las enzimas

La purificacin parcial de amilasa a partir de extractos enzimticos brutos obtenidos de
la fermentacin en estado slido de la cscara de remolacha se consigui usando
saturacin de (NH _ {4}) _ {2} SO _ {4} 60% de saturacin. La a-amilasa presente en el
extracto bruto se purific mediante precipitacin con sulfato de amonio, lo que dio
como resultado una purificacin de 6,46 veces. La enzima amilasa parcialmente
purificada se asoci con otras molculas que representan dos bandas principales
como se revel a partir de SDS-PAGE. El peso molecular de la amyrosa de M.
sanguineus se calcul trazando un grfico entre logaritmos lineales de masa molecular
relativa frente al valor de Rf. El peso molecular de la amilasa obtenida de la banda de
SDS-PAGE fue de 56 kDa. Zymograma de enzima purificada parcial confirm la
presencia de amilasa en la remolacha fermentada de M. sanguineus.
Varios autores han informado una masa molecular diferente para la amilasa de
diferentes organismos aproximadamente en el intervalo de 40-70 kDa. De forma
similar, el peso molecular de la amilasa fngica aislada de Aspergillus niger JGI 24 fue
de 43 kDa segn lo informado por Varalakshmi et al. [18]. Demirkan et al. ha informado
de a-amilasa producida por B. amyloliquefaciens y la enzima purificada que tiene un
peso molecular de 52 kDa. Faber inform el peso molecular de a-amilasa de B.
licheniformis como 55 kDa.

3.4. Constantes cinticas de a-amilasa

Km y Vmax (constantes cinticas) de amilasa se estimaron mediante una tcnica de
regresin lineal utilizando la grfica de Lineweaver-Burk. Para ello, se traz la
concentracin [S] del sustrato (almidn) frente a la actividad enzimtica (V). La lnea
lineal sigui la grfica de Lineweaver-Burk que a su vez se us para calcular las
constantes cinticas. Km y Vmax (constantes cinticas) de la amilasa se estimaron
mediante la tcnica de regresin lineal utilizando el mtodo de Lineweaver-Burk, el
valor mximo de la actividad enzimtica (Vmax) fue de aproximadamente 22.075 U /
mL de protenas, como extrapolado por la Trama de Lineweaver-Burk. Segn la teora,
el valor de km es la concentracin de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la
velocidad mxima de la enzima. El valor de Km as obtenido fue 0,055 mM. El valor de
Km ms pequeo es un representante de una afi- nidad potente hacia el sustrato.
Lineweaver-Burk intento de endosar los resultados.
Esto requiere la inversa de la concentracin del sustrato sobre el eje X y la inversa de
la actividad enzimtica en el eje Y. La ecuacin puede expresarse como
1 = V Km = Vmax 1 = S 1 = Vmax 2
Se obtuvo un ajuste lineal entre estas dos variables.
1 = V 0: 0025 1 = S 0: 0451 3
De la ecuacin (2) es evidente que la interseccin en el eje X da el valor de 1 / Km y la
interseccin en el eje Y da el valor de 1 / Vmax. Por lo tanto, el valor de Vmax obtenido
fue
22,07 U / ml y el valor de Km fue de 0,055 mM. El Vmax
Y km de a-amilasa se derivaron de la Lineweaver-Burk
Y se encontr que eran 2778 U / mg / min y 8,3 mg / ml, respectivamenteTamente. A
medida que la cantidad de concentracin de almidn aumenta en el medio de
reaccin, la actividad de alfa-amilasa tambin aumenta hasta que alcanza un mximo
despus de lo cual comienza a disminuir. Este comportamiento se atribuye al hecho de
que la enzima se satura con sustrato y alcanza Vmax, la tasa mxima de la enzima. Si
una enzima tiene un valor pequeo de Km, alcanza su mxima eficiencia cataltica a
bajas concentraciones de subestato. Por lo tanto, cuanto menor es el valor de Km,
ms eficiente es el catalizador.

3.5. Efecto de los inhibidores / activadores sobre la actividad de la amilasa

Para la amilasa, se observ una inhibicin mxima con ambos
Se observ NaCl y KCl (0,105 U / mL, inhibicin 44,7%) y la inhibicin mnima con
SDS (0,152 U / mL, inhibicin 18,4%) en comparacin con el control. La actividad de
las enzimas depende de la necesidad de una coenzima, as como de un metal. La
adicin de agentes quelantes a la mezcla de reaccin interfiere con el sitio activo de la
enzima que causa la inhibicin de la actividad enzimtica. La eliminacin del in
metlico a menudo reduce la actividad enzimtica o incluso da como resultado una
prdida total de una actividad enzimtica. Los metales son los modificadores
inorgnicos comunes. Adems de acelerar la tasa de reacciones catalizadas por
enzimas, tambin puede inhibir la velocidad de reaccin.
3.6. Anlisis del rendimiento de lavado de la enzima para lavado en fro

El anlisis se llev a cabo con un nuevo pao de algodn blanco manchado con dos
manchas diferentes. La primera mancha utilizada fue la mezcla de curry Spinach y la
segunda mancha fue chocolate. La amilasa alcalina de M. sanguineus mostr una alta
eficiencia para la eliminacin de ambas manchas en combinacin con detergente
comercial (Surf excel) a 20C. Estos fragmentos se eliminan inicialmente de la
superficie de la tela bien por componente de la matriz detergente, o bien por agua
sola. Esta combinacin de detergente enzimtico hace que la tela se sienta ms suave
al tacto que cualquier otro pao de algodn lavado con manchas de almidn con
detergente. Amylase proporciona una hidrlisis mejorada del almidn, dando como
resultado una mejor eliminacin de manchas y beneficios anti-deposicin.
Recientemente, se han cambiado los tejidos y sus requisitos de lavado. La demanda
de detergente con agua fra bajo condiciones suaves ha aumentado a lo largo de las
dcadas. Anteriormente, los productos qumicos eran comunes en lavandera y
lavavajillas, que eran muy duras para el pao y las manos. Debido a la selectividad y
al lavado bajo condiciones controladas, el detergente basado en enzimas es alto en la
demanda. Por lo tanto, las enzimas microbianasUna fuente alternativa mejor a la
industria detergente. Los usos de la enzima amilasa en diversos detergentes se deben
a su capacidad para degradar los residuos de alimentos almidonados tales como
salsas, chocolate, etc., en dextrinas y otro resto de oligosacridos y monosacridos.
4. Conclusin

Este estudio se intent explorar el M. sanguineus como un productor eficiente de

enzima a-amilasa y tambin para encontrar parmetros ptimos para obtener la
mxima actividad enzimtica con la ayuda de una herramienta estadstica
ampliamente aceptada. Los resultados concluyeron que el hongo M. sanguineus es
una buena fuente de enzima amilasa bajo fermentacin en estado slido bastante
similar a otras especies de Monascus. Tambin se llev a cabo la aplicacin de
amilasa producida por M. sanguineus en la industria detergente y se demostr que era
muy eficaz en la eliminacin de manchas de los tejidos. Por lo tanto, M. sanguineus
puede ser considerado como una fuente potencial para la produccin de amilasa, y se
puede explorar ms para su aplicacin en las industrias textiles y alimentarias en el
futuro.