ANALISA ASAM AMINO DENGAN METODE HPLC

Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) adalah alat yang ampuh untuk digunakn dalam
analisis. Pada darsarnya sebuah bentuk yang sangat baik dari kromtografi kolom. Selain dari pelrut
yang menetes melalui kolom yang menetes di bawah gravitasi, didukung melalui tekanan tinggi
sampai dengan 400 atm. Hal itu yang membuat kerja ini menjadi lebih cepat dan akurat. HPLC
juga memungkinkan untuk digunakan pada ukuran partikel yang sangat jauh lebih kecil untuk
bahan kemasan kolom yang memberikan luas permukaanyang jauh lebih besar untuk interaksi
antara fase diam dan molekul-molekul yang mengalir melewatinya.

Prinsip dari kerja HPLC adalah memisahkan setiap komponen dalam sampel berdasarkan
kepolarannya, untuk selanjutnya diidentifikasi (kualitatif) dan di hitung berapa konsentrasi dari
masing-masing komponen tersebut (kuntitatif). Alatnya terdiri dari kolom sebgai fase diam dan
larutan tertentu sebagai fase geraknya. Luas puncak kromatografi pada kurva elusi dipengaruhi
oleh tiga proses perpindahan massa yaitu difusi Eddy, difusi longitudinal, dan transfer massa tidak
seimbang. Sedangakan parameter-parameter yang menentukan berlangsungnya proses-proses
tersebut adalah : laju aliran, ukuran partikel, laju difusi dan ketebalan stasioner.

Protein merupakn sumber asam-asam amino yang mengandung unsure C, H, O, dan N yang
tidak dimiliki oleh lemak atau karbohidrat. Asam amino diklasifikasikan menjadi taga yaitu
diantaranya asam amino esensial, asam amino semi-esensial, dan asam amino non-esensial.

Analisa asm amino dapat dilakukan dengan menggunakan metode HPLC dengan
menggunakan OPA sebagai reagen, caranya yaitu sebagai berikut :
1. Menyiapkan bahan : asam amino standar (Merck), o-ftalaldehiluka), MPA (Fluka), ME (Fluka),
Acetonotril pro HPLC (J.T. Baker), metanol pro HPLC (Merck), Na2HPO4 (Merck),
aquabidestilata (IPHA), buffer borate pH 10,2 (Agilent), asam amino (Merck), asam phospat,
NaOH, dan natrium metabisulfit.
2. Menyiapkan alat : Kromatografi cair (HP 1100 QuatPump), kolom kromatografi Zorbax Eclipse
AAA 150 x 4,6 mm ukuran partikel 5 mikron (Agilent Tecnologies), spektrofotometer ultraviolet
 (Beckman Du 650i), pH meter (Beckman), timbangan (Mettler AG104), Vortex, dan alat gelas
yang biasa dipakai di laboratorium analitik.
3. Membuat larutan dan reagen OPA sebagai berikut :
a. Pembuatan larutan asam amino
Pembuatan dilakukan dengan menimbang sejumlah asam amino kemudian dimasukkan dalam labu
takar kemudian diencerkan dengan aquabidestilata sampai volumenya 10 ml. Konsentrasi akhir
dari asam amino asparagin 6,45 mg/ml, serin 4,6 mg/ml, histidin 4,44 mg/ml, arginin 10,6 mg/ml,
lisin 25,6 mg/ml, metionin 1,5 mg/ml, valine 5,3 mg/ml, fenilalanin 2,7 mg/ml, dan leusin 5,4
mg/ml.
b. Pembuatan reagen OPA
Ditimbang sebanyak 270,0 mg OPA ditambahkan 1,0 ml metanol, 200 L merkapto propionic
acid, divortex, kemudian diencerkan dengan dapar borat pH 10,2 sampai volume 5 mL
Dipipet 1000 l OPA-MPA tambahkan 1000 l bufer borat pH 10,2 vortek selama 1 menit
kemudian siap digunakan untuk reaksi derivatisasi
4. Melakukan analisa.
a. Pemilihan Panjang Gelombang Deteksi pada Daerah Ultraviolet
Sejumlah tertentu larutan baku induk masing-masing asam amino diencerkan dengan fase
gerakkemudian dilakukan pembacaan spektrum absorbsi masing-masing senyawa pada rentang
panjang gelombang 200-400 nm. Semua spektrum absorbsi asam amino ditampilkan secara
tumpang tindih (overlay) sehingga dapat ditentukan panjang gelombang yang dapat digunakan
untuk
mendeteksi semua asam amino yang diuji.
b. . Penentuan stabilitas intensitas fluorosensi hasil reaksi OPA/MPA dan OPA/ME
Pipet 100 L OPA-MPA dan 100 L asam amino selanjutnya ditambahkan fase gerak sampai
2 mL kemudian divorteks. Larutan dimasukkan ke kuvet dan dilakukan pengukuran
spektrofluorometri pada panjang gelombang eksitasi 335 nm dan panjang gelombang emisi 450
nm kemudian rekam intensitas fluorosensi selama 30 menit.
Dari analisa didapatka hasil Panjang gelombang maksimum eksitasi adalah 335 nm dan
panjang gelombang emisinya 450 nm. Hasil reaksi OPA/MPA dengan asam amino memiliki
intensitas fluorosensi yang tidak berbeda bermakna dengan hasil reaksi OPA/ME asam amino.
Konsentrasi optimum yang digunakan untuk mendapatkan intesitas dan stabilitas yang baik dalam
penelitian ini adalah konsentrasi 27 mg/ml.