FACULTAD DE INGENIERA

INGENIERA AMBIENTAL

PRACTICA 06

Evaluacin de las actividades metablicas bacterianas: Enzimas hidrolticas

Utilizacin de carbohidratos y aminocidos

CURSO: MICROBIOLOGA GENERAL

ROFESORA: GONZALES MEDINA, ERIKA YOVANA

INTEGRANTES: CDIGO:

ALVAREZ ANCALLA, NORA 1520093

CAMPOS RAMIREZ, YOLIT CARMEN 1520428
LUDEA MENDOZA, NANCY MELISSA 1521256
QUISPE AYQUIPA, YENY ROCIO 1521578
USCAMAYTA LAZARO, STALYN JUNIOR 1520695

LIMA-PER
2017-02

1
NDICE
I. INTRODUCCIN .......................................................................Error! Bookmark not defined.

II. OBJETIVOS ...............................................................................Error! Bookmark not defined.

III. INTRUMENTOS ........................................................................Error! Bookmark not defined.

IV. PROCEDIMIENTO .....................................................................Error! Bookmark not defined.

V. RESULTADOS: ..........................................................................Error! Bookmark not defined.

VI. DISCUSIONES ...........................................................................Error! Bookmark not defined.

VII. RECOMENDACIONES ...............................................................Error! Bookmark not defined.

VIII. CUESTIONARIO ........................................................................Error! Bookmark not defined.

IX. BIBLIOGRAFIA ..........................................................................Error! Bookmark not defined.

2
 I. INTRODUCCIN
El metabolismo bacteriano se define como el conjunto de procesos por los cuales
un microorganismo obtiene la energa y los nutrientes que necesita para vivir y
reproducirse. Los microorganismos utilizan numerosos tipos de estrategias
metablicas distintas y las especies pueden distinguirse en base a estas
estrategias. Las principales funciones de los metabolismos son: formar las
subunidades que luego sern utilizados en la sntesis de macromolculas,
proporcionar la energa necesaria para todos aquellos procesos que requieren
tales como transporte activo, movilidad, biosntesis. El metabolismo se puede
dividir en dos clases de reacciones: catablicas y anablicas
Catabolismo: consiste en la degradacin enzimtica de macromolculas como
lpidos, hidratos de carbono y protenas que el organismo obtiene del entorno en
el que vive o de sus propias sustancias de reserva. Esta degradacin se
acompaa de la liberacin de una gran cantidad de energa, ya que a partir de
estas macromolculas de gran complejidad estructural y alto contenido
energtico se obtienen molculas sencillas estructuralmente y de bajo contenido
energtico. Anabolismo: es el proceso inverso, es la sntesis enzimtica de
macromolculas a partir de compuestos sencillos, con consumo de energa.

Las enzimas, funcionan como catalizadores naturales en las reacciones

bioqumicas. Ellas no cambian o se utilizan durante su reaccin. Por ejemplo,
durante la fermentacin, las enzimas que se elaboran a partir de clulas de
levadura, convierten las molculas de azcar en molculas de etanol.
Las enzimas son muy especficas en el trabajo que realizan. Por ejemplo, las
enzimas de amilasa, solo trabajan en almidn, las enzimas de proteasa lo hacen
con protenas, etc., esto permite que las enzimas contengan caractersticas que
son de gran beneficio en procesamientos industriales.

En el laboratorio se pondr en evidencia la capacidad de algunas bacterias de

producir enzimas hidrolticas para la utilizacin de almidn, protenas y lpidos y
de utilizar azcares y aminocidos y relacionarla con el metabolismo.

II. OBJETIVOS

3
Objetivo general

Poner en evidencia la capacidad de algunas bacterias de producir

enzimas hidrolticas para la utilizacin de almidn, protenas y lpidos.

Poner en evidencia la capacidad de las bacterias de utilizar azcares y

aminocidos y relacionarla con el metabolismo

Objetivos especficos

Determinar el tipo de agar que es ptico para la produccin de enzimas

hidroliticas para cada tipo de bacterias
Determinar la reaccin de fermentacin en diferentes bacterias

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 III. MATERIALES

Medios de cultivo en placas Medios de cultivo en placas

Incubadora Medios de cultivo

Aguja de Klle Mechero

Reactivos
Cloruro frrico Reactivo de Kovacs

Solucin de KOH

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 IV. PROCEDIMIENTO

Enzimas Hidrolticas: Placas

PASO 1 Se esteriliza la aguja

y asa de kolle con la ayuda del
mechero, una vez que ya este
esterilizada se dej enfriar de
20 A 30 segundos para su
utilizacin.

PASO 2 Seguidamente se
realiza la esterilizacin y la
A. Grasa rotulacin de las placas de
Agar Leche, Grasa, Almidn y
gelatina.

PASO 3 Tomar un inculo con

la asa de kolle de las muestras
Bacillus, E. Coli, Salmonella y
St. Aureas,

PASO 4 Realizar un solo

E. Coli estriado para los distintos tipo
de Agar Leche, Grasa, Almidn
y Gelatina.

Salmonella St. Aureas

Bacillus

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 Enzimas Hidrolticas: Tubos

PASO 1 Se esteriliza la aguja

y asa de kolle con la ayuda del
mechero, una vez que ya este
esterilizada se dej enfriar de
20 A 30 segundos para su
utilizacin.

PASO 2 Seguidamente se
realiza la esterilizacin de la
boca de los tubos con Agar
TSI, Citrato de Simmons,
Fenialanima, Lisina y Agua
Triptonada.

PASO 3 Tomar un inculo con PASO 4 Realizar una estriada

la asa de kolle de las muestras para los distintos tipo de Agar
E. Coli, Salmonella y St. TSI, Citrato de Simmons,
Aureas. Fenialanima, Agua Triptonada
excepto el Agar Lisina.

PASO 5 Sembrar aguja

mediante puncin profunda en
los tubos con Agar TSI y Agar
Lisina.

7
Al finalizar la incubacin analizar los resultados de acuerdo a lo siguiente:

Agregar Lugol sobre la superficie del

Hidrolisis de Almidn
Agar Almidn

Hidrolisis de Lpidos Agregar una solucin de sulfato de

cobre sobre la superficie de Agar Grasa

Hidrolisis de la Gelatina Agregar una solucin de HgCl2 sobre la

(Placa) superficie del Agar Gelatina

Hidrolisis de la Gelatina Colocar los tubos en un bao de hielo

(Tubo) durante 5 minutos

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 V. RESULTADOS

Parte 1 hidrolisis de enzimas (placas Petri)

Cuadro N1 Anlisis de la hidrolisis de almidn
AGAR ALMIDN
Bacterias usadas Reaccin al lugol Hidrolisis de almidn Enzima amilasa
Salmonella Si Si Si
Bacillus Si Si Si
E. coli Si No No
Aureas Si No No

En el siguiente cuadro se muestra la hidrolisis del almidn la cual se vio

presente en las placas de salmonella y bacillus.
Salmonella bacillius E. coli aureas

Cuadro N2 Anlisis de la hidrolisis de lpidos y la produccin de la enzima

lipasa
AGAR GRASA
Bacterias usadas
Reaccin al sulfato Hidrolisis de Enzima lipasa
de cobre lpidos
Salmonella Si No No
Bacillus Si No No
E. coli Si Si Si
Aureas Si Si Si
En la tabla se puede apreciar que las bacterias capaces de producir de
la enzima lipasa en el experimento fueron E.coli y Aureas

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Salmonella bacillius E. coli aureas

Cuadro N3 Anlisis de la hidrolisis de casena en la leche

AGAR LECHE
Bacterias usadas Crecimiento de hidrolisis Coloracin alrededor
colonia casena de la colonia
Salmonella Si No Blanco
Bacillus Si Si Transparente
E. coli Si No Blanco
Aureas Si No Blanco

En la siguiente tabla se aprecia que la bacteria capaz de hidrolizar la

casena es bacillus.
Salmonella bacillius E. coli aureas

Cuadro N4 Observaciones de la hidrolisis de la gelatina en las placas Petri

AGAR GELATINA
Bacterias usadas Reaccin a HgCl2 Presencia de Precipitacin
zonas claras opaca
Salmonella Si No Si
Bacillus Si Si No
E. coli Si No Si
Aureas Si Si No

En el siguiente cuadro se muestra un anlisis de las bacterias que son y

no son capaces de hidrolizar la gelatina. Las bacterias que hidrolizan la
gelatina resultaron ser la Salmonella y E. coli.

10
 Salmonella bacillius E. coli aureas

Cuadro N5 Anlisis de la produccin de hidrolisis de gelatina en los tubos

AGAR GELATINA TUBOS
Bacterias usadas Slidificacin Hidrolisis de la gelatina
Salmonella Si Si
Bacillus Si Si
E. coli No por completo Si
Aureas Si Si

en el cuadro se puede observar que solo E.coli no es capaz de hidrolizar

la gelatina por completo.
Salmonella bacillius E. coli aureas

Parte 2 Utilizaciones de carbohidratos y protenas (inoculacin de cepas

proporcionadas)
Cuadro N 1 Determinacin de la fermentacin de la glucosa en el agar Kligler
AGAR KLIGLER
Bacterias usadas Color amarillo profundidad en Formacin de gas-rotura
la cua
Salmonella Si No
E. coli Si Si
Aureas si No

Las bacterias formadoras de un color arillo en la base fueron Salmonella

y E.coli. adems de solo Ecoli formo un gas-rotura en la parte baja de la
cua.

11
Salmonella E. coli Aureas

Cuadro N 2 Determinacin de la actualizacin de la lactosa y la formacin de

H2S.
Agar Kligler
Bacterias usadas Color rojo intenso en la cua Color negro en la semicua
Salmonella si Muy poco
E. coli no no
Aureas si si

Se puede ver que las bacterias capaces de actualizar la lactosa son

Salmonella y Aureas, ya que el agar kliger presentaba un color rojo
intenso en la cua y color negro en la semicua.
Salmonella E. coli aureas

Cuadro N 3 Evidencia de la capacidad de actualizar citrato como nica fuente

de carbono en el agar Citrato de Simmons
AGAR CITRATO DE SIMMONS
Bacterias usadas Presencia de crecimiento Cambio de color
Salmonella si
E. coli no
Aureas no

Se aprecia que salmonella no es capaz de actualizar el citrato como

nica fuente de carbono.

12
 Salmonella E. coli aureas

Cuadro N4 Anlisis de la evidencia de la descarboxilacin del aminocido a

cido felipirvico
AGAR FENILALANINA
Bacterias usadas Reaccin al cloruro frrico Presencia de color verde
azulado
Salmonella no nada
Bacillus no nada
E. coli si Color verde
Aureas no nada

En el siguiente cuadro se puede observar que solo e.coli es cambia de

color luego de las 24 horas de incubacin.
Salmonella E. coli aureas

Cuadro N5 Anlisis de la evidencia de la formacin del indol a partir de

triptfano
Disolucin de gua triptonada
Bacterias Aparicin de anillo Color de anillo Presencia de
usadas indol
Salmonella si rojo Si
E. coli si rojo Si
Aureas si amarillo no

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 La bacteria Aureas no logra formar un anillo de color rojo, por ende, no
es capaz de producir indol apartir del triptfano.
Salmonella E. coli aureas

VI. DISCUSIONES

Segn Alfred Jrgensen - Fermentacin Industrial: Los polisacridos, como

el almidn son demasiado largos para ser transportados al interior de la
clula. Los microorganismos excretan 7 amilasas que hidrolizan esos
polmeros hasta oligosacridos o monosacridos que pueden usarse como
sustratos para crecer. Las colonias de bacterias que atacaron el almidn
estnrodeadas por una zona incolora que fue el resultado obtenido en el
laboratorio. Ambos resultados estn relacionados. En la hidrolisis de almidn,
se inocularon con la placa con Agar y almidn al microorganismo, estos
fueron Escherichia coli, Bacillus, staphylococcus aurea, Salmonella la
observacin fue que el Bacillus subtilis fue resistente al colorante y pudo
hidrolizar al almidn formndose un halo transparente alrededor del almidn.
La solucin de lugol se le agrega para observar la reaccin de los
microorganismos y la capacidad que estos microorganismos tienen para
producir una enzima que hidrolisis al almidn.

La presencia de la casena es la protena ms abundante en la leche y le

proporciona el aspecto blanco y opaco caracterstico, debido a que esta
presente en suspensin coloidal. Muchos bacterias poseen caseosa, una
exoenzima capaz de hidrolizar dicha protena, esta produce pptidos ms
pequeos y por lo tanto suspensiones ms claras, Forbes B, Sahm D(2002).
Se observa en la prctica que la nica bacteria que hidroliza es el bacillus.

14
La prueba de licuefaccin de gelatina se utiliza como medio de cultivo gelatina
nutritiva, en esta prueba se pretende determinar la capacidad de un
microorganismo de producir enzimas de tipo proteolticas (gelatinasas) que
licuan/hidrolizan la gelatina o muestran cambios caractersticos debido a los
productos de degradacin. La gelatina como protena derivada del colgeno
animal es hidrolizada por la gelatinosa en sus aminocidos constituidos, con
prdida de sus caractersticas gelificantes. Velsquez.C (2016) y en la prueba
se observa que las bacterias de la E.colli y bacillus.

Algunas bacterias pueden obtener energa en ausencia del proceso de

fermentacin, en este caso el citrato es el que funge como fuente de carbono.
El medio incluye citrato de sodio y algn fosfato de amonio como nica fuente
de nitrgeno. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato
y Piruvato. Este ltimo, en presencia de un medio alcalino, da origen a cidos
orgnicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen
carbonatos y bicarbonatos alcalinos, en la prueba se puedo observar que solo
la salmonella sintetiza esta enzima.

Por otro lado la Salmonella sp produce polisacridos como parte de la

membrana externa de su pared celular, estas endotoxinas se liberan cuando
las clulas del hospederos se lisan. Una propiedad biolgica importante de la
membrana externa de Salmonella sp es que resulta toxica para el hospedero.
(Brock, 1999). La para la salmonella sp se usa el citrato de Simmons.

15
VII. CONCLUSIN
En la reaccin con lactosa no todos los microorganismos la fermentan,
podemos notar que algunos liberan gas que es el hidrogeno.
En la prueba del citrato la realizamos tambin para comprobar si los
microorganismos podan utilizar el citrato como nica fuente de carbono,
provoca alcalinizacin del medio.
El agar nutriente al cual se ha aadido almidn como nica fuente de
carbohidratos, formando una especie de nutriente para microorganismo.
Muchas bacterias liberan exoenzimas que hidrolizan la gelatina, si uno de
estos organismos se inocula en un tubo de gelatina nutritiva, la gelatina
cercana a las bacterias sern hidrolificadas y pasarn del estado coloidal
al estado cristaloide (aminocido).
La fermentacin se refiere a la degradacin anaerbica del carbohidrato
y que almacena gran cantidad de energa, esta capacidad desprende a
las enzimas de microorganismos
Se realiz la siembra de las bacterias para evaluar su capacidad de
degradar almidones, lpidos, protenas como la casena y colgeno por
medio de la produccin de enzimas hidrolticas en los medios agar
almidn, agar grasa, leche y gelatina respectivamente.

16
 VIII. CUESTIONARIO
1. Mencione qu enzimas microbianos seran tiles en la elaboracin
de jugos de frutas.

PECTINASAS

ENZECO PECTINASE AJ: Este producto tiene una fuerte actividad de pectinasa
(poligalacturonasa y pectasa). Tambin contiene celulasa y hemicelulasa.
Procedente de Aspergillus niger. Presentacin lquida. Se utiliza para clarificar
jugos de fruta (manzana y uva) y para la elaboracin del vino.

ENZECOR PECTINASE PX: Es un producto especial con enzimas pectolticas,

con una fuerte actividad de poligalacturonasa y dbil actividad de pectasa. Se
utiliza para reducir la viscosidad e incrementar el rendimiento en el tratamiento
de la fruta de pepita. Procedente de Aspergillus niger. Presentacin lquida.

ENZECOR PECTINASE DV: Una pectinasa de amplio espectro con altos niveles
de arabinosa. Presentacin lquida.

ENZECOR PECTINASE PL: Una pectina liasa con ninguna actividad

complementaria. Muy til para preservar la turbidez en el lavado de la pulpa y
otras aplicaciones que requieran de una reduccin controlada de la viscosidad.
Presentacin lquida.

CELULASAS/ HEMICELULASAS

ENZECOR CELLULASE CE-2, CEP: Una preparacin de celulasa producida con

una variedad de Trichoderma longibrachiatum (tambin conocida como T.
reesei). Sus anteriormente principales son: endo-1,4-beta-D-glucanasa,
cellobiohydrolase y exo-1,4-beta-D-glucosidasa. Tambin contiene otras
actividades como hemicelulasa, -glucanasa, proteasa y amiloglucosidasa. Para
la digestin de los componentes de la pared celular. Disponible en lquido o en
polvo.

ENZECOR XYLANASE S: Una preparacin enzimtica producida con una

variedad de Trichoderma longibrachiatum. Con una fuerte actividad de
pentosana. Particularmente til para digerir las pentosanas de los cereales.
Tambin contiene actividad de betaglucanasa. Disponible en polvo o en lquido.

17
ENZECOR HEMICELLULASE: Una preparacin enzimtica producida con una
variedad de Aspergillus niger. Tambin contiene otras actividades como galacto
mananasa, poligalacturonasa y proteasa cida. Disponible en polvo.

2. Mencione cmo funcionan las lipasas, tiene alguna utilidad

industrial?

Lipasa Gstrica, Es el lquido producido por las Glndulas gstricas, reduce

los triglicridos, un tipo de lpidos presente en la leche, a cidos grasos
y glicerol, es resistente a pepsina y funciona a amplio rango de pH (pH 2-6)
lipasa acta sobre enlace ster g generando cidos grasos libres y diglicridos
da cuenta de 10-30% de la digestin lipdica.

PROPIEDADES

Principal enzima en la digestin de triglicridos, la cual es casi completa en

el yeyuno proximal.

Se secreta en forma activa (no como pro enzima) y funciona a un pH ptimo 6-7
en presencia de colipasa.

Acta rpidamente en interfase hidrofbica / hidroflica de la emulsin de grasa.

Se estabiliza en interfase aceite-agua por accin de la colipasa y cidos grasos

libres.

Se secreta en exceso y slo una reduccin a < 10% de nivel normal puede causar
mal absorcin.

APLICACIN EN LA INDUSTRIA

En las ltimas 2 dcadas existe un inters creciente en el estudio y aplicacin de

lipasas como catalizadores alternativos a los catalizadores qumicos aplicados
en la industria alimenticia, en especial en la industria oleaginosa. La reutilizacin
de aceites de fritura luego de un tratamiento enzimtico, la obtencin de
compuestos de alto valor agregado (surfactantes) a partir de aceites vegetales
de bajo costo y la obtencin de biodiesel son algunas de las aplicaciones ms
importantes. La caracterizacin de las lipasas no slo en reacciones de hidrlisis
de triglicridos sino tambin en reacciones de sntesis constituye un paso

18
necesario para expandir el campo de aplicacin a otros campos como por
ejemplo la industria cosmtica.

3. En que se basa la tcnica de Rojo de metilo y Voges-Proscauser

Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo de

fermentar la glucosa con produccin de cido por la va cido-mixta o con
produccin de un producto final neutro (acetona) por la va butanodilica.

La prueba rojo de metilo y Vogues-Proskauer son dos pruebas en una. Las

bacterias que siguen principalmente la va de fermentacin cidos mixtos a
menudo producen suficiente cido para mantener un ph menor de 4.4.

A uno de los tubos se le aade unas gotas (4-5) de solucin indicadora de Rojo
de Metilo. Se agita para homogeneizar y se observa la coloracin. Se considera
positiva si vira al rojo y negativa si permanece amarillo.

Reactivos: (Vogues P.)

A la otra porcin de cultivo se le aade:

0,6ml del Reactivo A de Voges-Proskauer (alfa-naftol 5% en etlico absoluto). El

medio adquiere un aspecto lechoso.

0,2ml del Reactivo B de Voges-Proskauer (KOH 40%). Desaparece el aspecto

lechoso y se agita fuertemente.

Si la prueba es positiva, antes de cinco minutos aparece un color rosado-

violceo, ms o menos intenso, que se inicia en la parte superior del tubo. Si la
prueba es negativa no aparece coloracin alguna.

Inocule con el asa de platino transfiriendo una porcin de cultivo puro. In-cube a
35C por 24 a 48 horas. (Para los dos medios)

Caldo de glucosa. Despus de la incubacin, Reactivos: Aadir indicador rojo de

metilo a la muestra

4. Explique la importancia del medio de Citrato de Simmons

Medio utilizado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la capacidad

de usar citrato como nica fuente de carbono y energa.

19
Fundamento
En el medio de cultivo, el fosfato monoamnico es la nica fuente de nitrgeno y
el citrato de sodio es la nica fuente de carbono. Ambos componentes son
necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema
buffer, el magnesio es cofactor enzimtico. El cloruro de sodio mantiene el
balance osmtico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color
azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los sales
de amonio como nica fuente de nitrgeno, con la consiguiente produccin de
alcalinidad.
El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato
permeasa, a travs del ciclo del cido tricarboxlico. El desdoblamiento del citrato
da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este ltimo, en presencia de un
medio alcalino, da origen a cidos orgnicos que, al ser utilizados como fuente
de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces
vira al azul y esto es indicativo de la produccin de citrato permeasa.

5. DE ACUERDO A LA LITERATURA Cules seran las reacciones de

E.coli en todos los medios usados en la prctica?

Anlisis de la hidrolisis de almidn resultados negativos.

Anlisis de la hidrolisis de lpidos y la produccin de la enzima lipasa resultado

positivo.

Anlisis de la hidrolisis de casena en la leche resultados negativos.

Observaciones de la hidrolisis de la gelatina en las placas Petri resultados

negativos.

Determinacin de la fermentacin de la glucosa en el agar Kligler, resultado

positivo.

Determinacin de la actualizacin de la lactosa y la formacin de H2S.

Resultados negativos.

Evidencia de la capacidad de actualizar citrato como nica fuente de carbono en

el agar Citrato de Simmons resultados negativos.

20
Anlisis de la evidencia de la descarboxilacin del aminocido a cido
felipirvico, resultado positivo.

Anlisis de la evidencia de la formacin del indol a partir de triptfano, resultado

positivo.

VIII. BIBLIOGRAFIA
Alfred Jrgensen (1999). Biologa de los Microorganismos, 10 dcima
edicin, pgina 162, capitulo 6 -Crecimiento Microbiano.
Forbes B, Sahm D, overview of bacterial idintification methods and
strategias en: Bailey & Scotts biagnostic Microbiology. 11 ed. 2002.
Mosby. Saint Louis.
Velsquez.C (2016). Prueba bioqumica de Licuefaccin de gelatina.
Brock T. Microbiologia. Sexta edicin. Prentice hall
hisponoamericana.S.A Naucalpan de Juarez. Mxico. 1991, p 287- Commented [YC1]:

290.
Madigan y col ( 2010). Brock Biologa de losMicroorganismos. Dcima
edicin. Editorial Pearson Prentice Hall. Espaa
Montville, T. Food microbiology: and introduction. Washington: ASM
Press. 2008.
Enzyme development corporation. Enzimas para procesar jugos. s/f.
http://www.enzymedevelopment.com/es/applications/juice/
M. L. Foresti, C. Gutirrez A., A. A. Carelli, M. L. Ferreira,. (s/f) XI CONGRESO
NACIONAL DE BIOTECNOLOGA Y BIOINGENIERA. APLICACIN DE LIPASAS EN
REACCIONES DE INTERS INDUSTRIAL PARA LA INDUSTRIA ALIMENTICIA.
http://smbb.com.mx/congresos%20smbb/merida05/TRABAJOS/ARE
A_III/OIII-16.pdf.
GISSEL GUERRERO , GUILLERMO ESPINOSA, Gabriel Gomz.
27th May 2012 Prueba bioqumica de Rojo de metilo y voges
proskauer. http://microcereus.blogspot.pe/2012/05/of-es-una-prueba-
que-indica-del-tipode.html.

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