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VIROLOGIA DIAGNSTICO

Prof. Menira
O vrus um microrganismo intracelular obrigatrio, uma partcula que
se auto replica. Ele usa a clula (uma quinase celular) para fazer
cpias dele mesmo, no se fala em reproduo viral, fala-se em
replicao viral. Tem que ter uma clula viva, vivel e suscetvel. O
vrus tem que entrar na clula, ento para isso ele tem que ligar/fazer
adsoro que feito por uma molcula, geralmente uma protena que vai
se associar de forma especfica com uma molcula na superfcie da
clula, essa molcula da superfcie da clula tem que ser reconhecida
por esse anti-receptor viral, esse encontro casual, por coliso e de
cada 100000 colises ocorre 1 adsoro. Inicialmente ela reversvel
mas depois que ocorre a ligao ela irreversvel.

Essa molcula que est na superfcie do vrus uma evoluo, o vrus


evoluiu para que ele conseguisse ligar na superfcie da clula,
geralmente ela que ativa o sistema imune, geralmente so essas que so
mais imunognicas e so elas que so o alvo dos mtodos de diagnostico.

No basta s ligar ou entrar na clula, alm de ser suscetvel tem que


ser permissvel (sustentar a replicao viral). A clula tem que
oferecer para o vrus um maquinrio que o vrus precisa para fazer copia
dele mesmo (por exemplo: ribossomos; alguns vrus precisam que a clula
esteja na fase S do ciclo de diviso para que ele possa se dividir).

Ns vamos rever a replicao porque cada genoma de vrus vai replicar de


uma maneira, se DNA fita dupla geralmente vai replicar no ncleo,
vrus que so RNA fita simples replica no citoplasma e j infeccioso.
*ela no deu muitos detalhes e falou que ao longo das aulas iria
explicar*

Os maiores conhecimentos que se tem sobre os vrus so recentes porque


com o advento da produo de anticorpos monoclonais e depois com a
biologia molecular teve um boom e com isso o descobrimento de vrios
vrus e melhor estudados. Com a metagenmica, que uma tcnica que voc
pesca e faz o sequenciamento de alta gerao, e a de acordo com

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aquela sequencia voc vai analisando o que que aquilo, muitos vrus
esto sendo descobertos. O estudo da virologia muito dinmico e sempre
tem que estar estudando, porque sempre vai descobrindo novos vrus,
analisando mutaes, estudando os vrus que podem ser patognicos.

A primeira vez que se ligou uma doena a um microrganismo que no fosse


uma bactria foi quando filtraram o sumo de uma planta que estava doente
e inoculou em outra planta... ela tambm ficou doente e morreu. O
pesquisador pensou que havia alguma toxina, um fluido, um veneno, alguma
coisa que passou de uma planta pra outra que no fosse bactria e deu o
nome disso de vrus. Os bovinos tinham aftas na mucosa oral e nas patas
que no eram causadas por bactrias e sim causadas por uma partcula bem
menor em 1898. Mas desde os egpcios tem-se documentado sobre doenas
que hoje sabe-se que eram virais. Depois foi fazendo estudos atravs de
culturas de clulas, observao do efeito citoptico de vrus,
desenvolveram os primeiros anticorpos, o primeiro vrus que infecta
humanos foi descoberto que foi o da febre amarela que uma das vacinas
mais antigas que existe. Depois foi feito o primeiro cultivo realmente
onde observaram a replicao viral. Na dcada de 70 surgiram os
anticorpos monoclonais... surgiram atravs da produo em hibridomas e
eles so muito mais especficos, aumentaram a sensibilidade e a
especificidade das tcnicas que j existiam como o ELISA e
imunofluorescencia.

Entre 1980 surgiu a PCR meio por acaso, o pesquisador foi at um


giser/aguas borbulhantes e observou que tinha microrganismos ali, ento
tinha bactria que vive ali e ele pensou que poderia usar alguma coisa
dela para fazer ensaio no laboratrio, descobriu ento uma enzima taq
DNA polimerase que resistia a altas temperaturas. Com isso as primeiras
taq dna polimerase que foram utilizadas foram essas para poder
amplificar o genoma viral in vitro para conseguir detectar vrus. As
tcnicas moleculares so muito importantes porque os vrus so muito
pequenos e geralmente na amostra clnica eles esto em pequena
quantidade, para fazer diagnostico muito difcil ento se amplifica o
genoma e consegue-se identificar.

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Porque diagnosticar? Para tratar e tambm para prevenir e entender
melhor a doena, entender os mecanismos de preveno, entender a
patognese do vrus. Por exemplo, vrus que so transmitidos por vias
respiratrias sabe-se que para prevenir no deve-se espirrar nas mos,
virus que so gastroentericos
deve-se larvar bem as mos e

lavar os alimentos e etc (quando se


entende onde o virus est no corpo pode-
se fazer medidas de preveno), serve
tambm para fazer o monitoramento, a vigilncia epidemiolgica e montar
estratgias de vacinas.

O diagnostico pode ser feito por microscopia eletrnica, mas no


comum. Geralmente se fundamenta na deteco do virus ou na deteco de
produtos/componentes desse virus. O virus feito de capsdeo que
composto de protenas virais, envelope composto de lipdeos de origem
das membranas da clula (alguns virus no tem envelope e so chamados de
desnudo). No capsdeo tem o genoma do virus que pode ser dna, rna de
fita simples, rna de fita dupla, fita segmentada, vai depender do virus.

Quais so os componentes que podem ser usados para fazer o diagnostico


do virus? Protenas, antgenos de virus, amplificando e detectando o
genoma viral. Ento podemos usar a pesquisa de antgenos ou pesquisa de
pedaos/pores do genoma viral.

No sempre que consegue pegar o virus naquele momento, o paciente


pode ter passado da fase aguda ento muitas vezes utiliza-se o soro para
pesquisar resposta imunolgica (anticorpos). Pode-se tambm por
imunohistoqumica fazer uma bipsia e avaliar o que que est
acontecendo naquele tecido junto com a infeco.

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Todo o diagnostico comea pela coleta, geralmente faz a coleta do sangue
(pesquisa de anticorpos de fase aguda ou crnica), mas se tiver o
sintoma no sitio da doena a pode coletar material daquele local (por
exemplo: sintomas respiratrios... faz uma coleta com aspirado
nasofaringeano ou com swab para fazer a pesquisa do virus. Diarreia...
coleta-se fezes e faz a pesquisa de rotavrus e rinovirus por exemplo).
Se o paciente procura o atendimento durante os sintomas a plausvel a
procura do vrus. Se o paciente est febril, dores no corpo, dores nas
juntas pode-se coletar o sangue e fazer a pesquisa de protenas e
anticorpos da fase aguda para dengue por exemplo. Ento, dependendo da
fase do curso da infeco, do momento em que o paciente procura o
servio e coletada essa amostra que vai saber qual o tipo de tcnica
vai ser feita e qual tipo de material vai ser coletado. Se o paciente
ficou doente h trs semanas atrs e resolveu procurar hoje um
atendimento para saber o que ele tinha e a vai ter que ser coletado
soro e buscar IgG, mas se fosse uma fase aguda iriamos pesquisar IgM
junto com busca de antgeno viral.

O material a ser coletado vai depender da anamnese do paciente, dos


sinais e sintomas que ele apresenta. Virtualmente qualquer local do
corpo pode-se procurar vrus mas tem que ter bom senso, por exemplo, tem
vrus que no replica no trato gastrointestinal mas que excretado nas
fezes, tem vrus que faz viremia e vai para o corpo inteiro e pode
detecta-lo na urina (um exemplo o sarampo que entra pelas vias
respiratrias e faz viremia e espalha pelo corpo todo).

O volume do material a ser coletado deve ser suficiente para fazer


vrios ensaios. Voc est suspeitando de um virus, mas a o diagnostico
foi negativo e o paciente evoluiu para outro quadro, voc pode utilizar
a mesma amostra, no precisa coletar novamente. O transporte,
armazenamento e a rapidez com que se analisa a amostra. O herpes vrus
extrememente lbil, tem-se que coletar a amostra e fazer varias
alquotas da amostra para armazenar e congelar e depois no precisar
ficar descongelando e congelando, o vrus muito sensvel ao
congelamento e a pode perder o numero de partculas virais. Armazenar
sempre no -20 e uma alquota no -80C porque a vai preservar por mais
tempo a amostra.

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A cultura de clulas bastante
importante na descoberta de novos
vrus, caracterizao dos vrus e
tambm para amplificar o nmero de
vrus.

O isolamento viral pode ser feita em


qualquer sistema vivo (animal de
laboratrio, cultura de clulas, ovos embrionados), onde tm clulas
viveis o vrus replica e consegue aumentar o nmero de vrus e muitas
vezes consegue observar o que o vrus causa na clula (chamado de efeito
citoptico).

As vantagens so que voc consegue amplificar para fazer a


identificao. pode-se ter partculas viveis e utiliza-las para
desenvolver um teste de diagnostico por exemplo, produzir antgenos
tambm. Pode-se detectar vrios agentes e identificar uma co-infeco.
As desvantagens so: muito trabalhoso, de difcil trabalho
rotineiro, tem que ter equipamentos adequados e essa necessidade de
sistemas vivos.

Um dos primeiros sistemas que se pode usar vivo a inoculao em


animais de laboratrio. So vrios animais que podem ser utilizados, vai
depender do tropismo do virus (tem vrus que infectam humanos e que s
infectam primatas em condies laboratoriais). Podemos usar camundongos,
porcos, vacas, coelhos e porquinhos da
ndia. Cada vez mais est restringindo o
uso em animais, o que uma desvantagem
e tambm por ter baixa reprodutibilidade
(voc inocula em 10 animais para estudar
a resposta imune, mas no final apenas 3
respondem da forma esperada, ento
estatisticamente tem esse problema de
reprodutibilidade). O tropismo uma predileo do vrus por determinado
tecido ou rgo ou ate mesmo uma espcie de animais, tem vrus que so
espcie especifico (o sarampo s infecta humano, j a influenza tem em

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tudo quanto tipo de bicho). Tem interferncia de outros vrus do
animal, ainda mais se ele no for germ-free. Os animais so muito
utilizados em vrus que no se replicam em cultura de clulas, vrus que
no se consegue estudar muito bem e nem diagnosticar. Quando um novo
vrus e a no se faz um ensaio clinico de cara e tambm quando se quer
entender a patogenia do vrus.

Outro sistema vivo so os ovos embrionados, no necessariamente de


galinha, mas pode-se usar tambm de peru e outras aves. Usam-se muito os
ovos em virologia, pois pode-se produzir vacinas de vrus atenuado, o
processo bastante manual e trabalhoso (febre amarela, rubola por
exemplo). Inocula-se com uma agulha fininha o vrus, cada vrus tem um
tropismo por uma regio do embrio diferente, e a ele vai infectar,
replicar, faz uma purificao, inativa (ou no), formula e a vacina est
pronta. Tambm serve para observar efeito citopatico, amplificar o vrus
para fazer diagnostico de vrus fastidiosos. um processo muito caro,
muito trabalhoso, um trabalho manual e (a tendncia que seja tudo
feito em cultura de clulas no futuro pois utilizando biorreatores voc
consegue produzir litros de vacina de uma s vez, sem desperdcio e o
custo beneficio melhor). Quando feito em ovos embrionados tem que
ter 62% de umidade e circulao de ar apropriada, tem que ter ovoscpio
para analisar ovo por ovo e estufas. Podemos utilizar o prprio embrio
ou os tecidos dos ovos para fazer o isolamento do vrus para fazer
diagnostico, podendo fazer um elisa ou imunoflourescencia. Alguns vrus
se replicam formando Pocks nas membranas dos ovos, outros multiplicam
e modificam/matam o embrio como o vrus da raiva faz isso.

O outro sistema vivo a cultura de clulas que utilizado para


diagnostico e tambm produo de
vacinas. o padro ouro (por exemplo:
tem um caso de meningite que suspeita
de vrus e no est conseguindo
diagnosticar, faz a inoculao em
cultura de clulas e a faz o PCR,
sequenciamento e v qual vrus que ).
Voc consegue ver o efeito citopatico,
consegue replicar e amplificar o numero de partculas, mas mesmo assim

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tem que fazer algum mtodo especfico como elisa, imunofluorescencia ou
pcr, pois um meio de obter informaes sobre o virus mas no
confirmatrio para o diagnostico.

Tem as dificuldades pois tem que ser muito cuidadoso, tem que ser feito
no fluxo, tomar cuidado para no contaminar. Uma aplicabilidade a
produo de vacinas, outra a produo de kits (montar um elisa) com
antgeno viral e observar o efeito citoptico. A partir da cultura de
clulas podemos observar o que o vrus fez na clula e ter uma ideia
de qual vrus que , pode pesquisar antgeno ou acido nucleico viral e
pode tambm fixar, corar e identificar por microscopia eletrnica e
olhar a morfologia, tamanho e etc.

Um tipo de efeito citoptico mais comum o efeito de lise, onde o vrus


entrou, usou o maquinrio da clula e fez cpias dele mesmo e ao sair
arrebenta a clula para passar para a prxima clula (geralmente quem
faz isso so vrus que no tem envelope, os vrus que tem envelope saem
por brotamento e a clula pode conseguir regenerar). O adenovrus faz
um efeito bem caracterstico que cacho de uva, porque tem uma protena
do vrus que vai juntando uma clula na outra (rotavirus e norovirus no
fazem isso). O herpes vrus faz sinccio (o vrus infecta a clula,
replica e vai pra prxima clula, eles conseguem fazer fuso do envelope
com a membrana da clula, com isso eles
ficam protegidos do sistema imune por
um tempo e consegue se disseminar mais
rapidamente), sarampo, dengue e hiv
tambm fazem sinccio. No porque tem
um efeito citoptico X que voc j de
cara pode falar que o vrus tal mas
j ajuda a ter uma ideia.

A microscopia eletrnica seria uma forma de diagnosticar vendo o vrus


inteiro ou usando anticorpos para unir essas partculas e detectar. Na
imunomicroscopia eletrnica voc incuba a amostra com anticorpo e depois
faz a microscopia eletrnica (o anticorpo junta uma partcula na outra e
a voc consegue ver essas partculas no campo). O problema dessa
tcnica a baixa sensibilidade, tem que ter 106 para detectar o vrus,
para melhorar usa os anticorpos. A grande vantagem poder usar tecidos
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de bipsias fixados e consegue ver o vrus l no tecido. um mtodo
muito difcil pois precisa de muitos vrus para poder detectar. Como
aprimorar essa tcnica? Usando anticorpos.

Vantagens da Microscopia eletrnica: rapidez, no requer agentes viveis


(vivo replicando), observao de vrios agentes.

Desvantagens da microscopia eletrnica: baixa sensibilidade (>106


partculas/ml), equipamento e pessoal especializado, trabalhoso.

Como pesquisar o vrus inteiro? A partir da amostra clinica usando a


microscopia ou imunomicroscopia eletrnica ou inoculando em cultura de
clulas, ovos embrionados ou animais de laboratrio para depois fazer o
diagnstico.

Como diagnostica vrus a partir dos seus componentes? Pela pesquisa de


antgenos virais, o que mais usado. Quando pesquisar? Suspeita de
infeco aguda (recente), vai depender dos sintomas do paciente; Durante
infeco crnica ou persistente (hepatite B, por exemplo); Demonstrar a
presena de antgenos em determinados tecidos/rgos (ai faz biopsia,
imunohistoquimica).

Uma das tcnicas o de imunocromatografia/teste rpido, nela voc


demonstra a formao de um imunocomplexo atravs de cor. A fita uma
membrana de acetato ou nitrocelulose, nela vo estar impregnados
anticorpos ou antgenos. Na pesquisa de antgenos, no meio entre onde
coloca a amostra e onde l-se o resultado tem
impregnado/grudados/imobilizados anticorpos especficos para o virus que
vc esta procurando, quando a amostra passar e vo se encontrar e migrar,
na regio de leitura vai ter mais antgenos virais marcados com ouro
coloidal, esse imunocomplexo vai ser barrado na regio de leitura e vai
concentrar nesse local e com isso agente consegue ver a faixa colorida.
Existe um kit de pesquisa de adenovrus de IgG e IgM e NS1 e com isso
agente consegue ver o curso da infeco, se detectar Ns1 e IgM fase
aguda, se for s IgG ento esta na convalescncia ou pregressa. A
amostra depende do teste e o que est procurando (sangue, soro, plasma,
fezes, swab nasofaringeano). A grande vantagem a rapidez. A
sensibilidade um pouco baixa as vezes, por isso um teste de triagem
que precisa de outro teste para confirmar.
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Outra tcnica a Imunofluorescncia: pode ser direta ou indireta uso de
anticorpos conjugados ao fluorocromo, a reao visualizada sob a luz
ultra-violeta (comprimento de onda especfico ao marcador fluorescente).
A Direta o anticorpo esta marcado com o fluorocromo (que a subtancia
que vai brilhar quando colocar na luz UV). O Indireto para pesquisa
antgeno, as vezes voc j tem o anticorpo (anticorpo pertencente ao
laboratrio) mas ele no esta marcado com o fluorocromo, esse anticorpo
foi feio no porquinho da ndia, a voc compra um anti IgG de porquinho
da ndia que esta marcado, a voc pode usar ele para detectar qualquer
anticorpo de porquinho da ndia que estiver no laboratrio que no esta
conjugado, ento na indireta vc usa um anti-anticorpo para fazer a
ligao para detectar aquele antgeno na amostra. A diferena que na
direta o detector esta marcado com o fluorocromo e no indireto eu tenho
um anti anticorpo que esta marcado com o fluorocromo.

Quando voc tem o swab a amostra com clulas voc fixa com acetona ou
formaldedo, eles fazem microporos na membrana da clula, com isso o
anticorpo consegue penetrar e chegar no antgeno la dentro da clula e
ligar, depois que liga ele no desliga (a voc pode at lavar que no
desliga, uma ligao estvel), incuba a lamina com anticorpo, lava,
adiciona uma gota de glicerol e coloca no microscpio com luz uv, a
clula fica brilhante, o fluorocromo mais utilizado o FITC
(Isotiocianato de fluorescena) ele verde fluorescente. Existem vrios
outros e eles vo emitir no espectro de fluorescncia um comprimento de
onda diferente, o legal que voc pode fazer um painel e ao mesmo tempo

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detectar e pesquisar vrios vrus naquela amostra, se voc marcar cada
anticorpo com um fluorocromo diferente.

Voc tem um material clnico de um paciente na lamina, voc vai usar


anticorpo para esse vrus que voc esta suspeitando (suspeita-se que
um virus de trato respiratrio, a voc faz esse painel para identificar
de uma vez s qual virus que ) ***acho que a prof estava falando da
direta**

Na indireta voc tem no laboratrio o anticorpo anti adenorivus mas ele


no esta marcado com o fluorocromo, a voc compra o anti IgG que est
marcado, faz uma primeira incubao com anti adenovrus, lava, pega o
anticorpo anti IgG que esta marcado, incuba, lava e faz a leitura. Se
brilhou pq o primeiro ligou, se o primeiro ligou pq tinha o
adenovrus, ento positivo. A especificidade esta no primeiro pq ele
que contra o virus e o outro s um sistema indicador, ele amplifica
o sinal.

A imunofluorescencia uma tcnica bastante sensvel (principalmente se


vc usa anticorpos monoclonais), tecnicamente no tao difcil de se
fazer mas requer experincia de quem esta lendo. A desvantagem que tem
q ter um microscpio com luz UV. Sempre tem que fazer a leitura junto
com os controles.

O ELISA a mesma coisa, ensaio imuno enzimtico, uma enzima vai te


mostrar que houve a reao, muito parecido. Na tirinha/pocinho j vem
imobilizado anticorpos antivrus, voc coloca a amostra, incuba a 37C,
se tiver na amostra tiver o virus o anticorpo vai se ligar de forma
especfica (no precisa nem ser o virus inteiro, pode ser uma parte
dele, pedao do capsdeo), lava, a voc coloca o anticorpo que j vem
no kit (ele j pode vir marcado com a enzima ou no, a voc lava e usa
um anti anticorpo marcado com a enzima), lava e coloca o substrato (no
pode lavar). Esse o formato sanduiche onde vc tem anticorpo em cima e
em baixo mas existem vrios formatos. Para pesquisa de antgenos
geralmente voc sensibiliza a placa com anticorpo, incuba a amostra
suspeita, lava, adc o anticorpo detector (conjugado com a enzima),
incuba, lava, adc substrato e faz a leitura no aparelho. Geralmente a
enzima a peroxidase de rbano e o substrato geralmente o TMB

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(tetrametilbenzeno) com o peroxido de hidrognio. A colorao formada
diretamente proporcional a concentrao do antgeno. Com a absorvancia
voc faz o calculo do cut-off. O principio do elisa a formao de um
complexo anticorpo e antigeno revelado por uma enzima.

A Imunohistoqumica um elisa s que feito em fase slida (biopsia,


lamina com o material), vai usar um anticorpo anti virus marcado com uma
enzima e coloca o substrato. S que esse substrato vai corar a clula
que est com o vrus. Com isso vc consegue ver se naquela clula tem
protena do virus sendo produzida e pode ver o arranjo tecidual.

A reao de hemaglutinao no um teste de diagnstico, mas tambm


uma forma de mostrar que o virus est ali na amostra. S tem como fazer
em amostra que tenha o virus que tenha hemaglutinina em sua superfcie
( o caso do influenza, dengue, sarampo). A hemaglutinina do virus uma
protena que tem afinidade pelo acido silico que esta na superfcie das
hemcias. Voc pega a amostra, incuba com uma suspenso de hemcias e o
virus vai se ligar nas hemcias. Na hora de fazer a leitura, se for
positivo vai formar um vu, uma rede/emaranhado no topo do poo, na
amostra que no tinha o vrus a amostra vai rolar para o fundo do poo e
formar um boto. No diagnostico, ela s demonstra a presena desses
virus que tem a capacidade de se ligar em hemcias.

Quando pesquisar anticorpos?


Usa-se muito na rotina de
laboratrio por causa de
infeces virais. As vezes o
paciente demora pra ir buscar
diagnostico. O sangue uma
amostra de fcil coleta. Quando
se suspeita de uma infeco
aguda vai pesquisar IgM. Durante
o perodo de convalescena
pesquisa IgG. Podemos tambm
avaliar o estado imune do paciente pesquisando IgM e IgG para saber se
precisa tomar um reforo de vacina ou se j teve exposio natural por
exemplo. Algumas infeces voc pode tambm avaliar outras classes, como
em infeces de mucosa onde vc pode avaliar IgA mas no muito usado.
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Para detectar anticorpos pode-se fazer:

Ensaios de ligao Elisa (varia o formato onde voc pode ter


sensibilizando um antgeno quanto um anti anticorpo (que vai grudar
na porcao Fc do anticorpo do paciente). Imunofluorescencia indireta
(no tem como fazer o direto pq sempre vai ter um anti anticorpo pq
vc esta pesquisando anticorpo e no antgeno).

At aqui falamos de testes qualitativos em que vc detecta a presena do


anticorpo. Agora vamos falar de ensaios funcionais que avaliam no s se
o anticorpo est al mas tambm a funo desse anticorpo. Um importante
o ensaio de neutralizao (esse teste junto com a inibio da
hemaglutinao so muitos utilizados para avaliar a eficcia de
vacinas). Quando voc quer avaliar a eficcia de uma nova vacina pode-se
usar o ensaio de neutralizao onde voc vai avaliar a presena de
anticorpos na amostra clnica capazes de bloquear a infectividade viral.
Os anticorpos neutralizantes so os anticorpos protetores e so eles que
importam nas vacinas. mais trabalhoso, mas tambm serve para fazer
diagnostico.

Voc quer saber se a paciente tem anticorpo neutralizante contra rubola


porque ela quer ficar gravida, mas na regio que ela vive tem muitos
casos de sndrome de rubola congnita. Se ela no tiver os anticorpos
neutralizantes vai ter que tomar a vacina e aguardar para poder
engravidar. Voc pega o soro do paciente, faz diluies seriadas e
incuba com o vrus que voc est procurando, pega essa mistura e inocula
em cultura de clulas que so suscetveis e permissveis ao vrus da
rubola, e observa em 12, 24, 36, 48 horas. A voc faz a fixao e cora
com violeta. Se voc esta procurando anticorpos neutralizantes (este
anticorpo vai ligar no virus e impedir que o virus entre na clula)
espera-se que as clulas se mantenham vivas e normais (teste positivo),
caso no tenha os anticorpos neutralizantes o vrus vai entrar e matar
as clulas, a voc vai ver furos na cultura de clulas (teste
negativo). um teste funcional pq alm de saber se tem ou no o
anticorpo sabe-se que ele neutralizante.

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Inibio da hemaglutinao: avalia a capacidade dos anticorpos
antivirais presentes na amostra de bloquear a hemaglutinao induzida
por antgenos virais.

muito usado em infeco em dengue, influenza e sarampo porque todos


esses vrus tem hemaglutinina. Aqui vc tem o soro do paciente e quer
pesquisar anticorpo anti influenza que inibidor da hemaglutinao.
Voc pega o antgeno do virus (voc compra) e pega o soro do paciente,
faz diluies seriadas e incuba. Se no soro do paciente tiver anticorpo
anti hemaglutinina do vrus vai grudar e vai ocupar o sitio de ligao
da hemaglutinina do vrus (no soro do paciente q no tem o vrus no vai
ligar em nada e vai ficar livre). Da voc faz uma suspenso de
hemcias e incuba novamente, se no soro do paciente tinha anticorpo anti
hemaglutinina do vrus as hemcias vo ficar sobrando porque o anticorpo
j ocupou a ligao com a hemaglutinina e no vai sobrar hemaglutinina
para ligar na hemcia, e a a hemcia vai rolar para o fundo do poo
formando um boto. Na presena do anticorpo contra a hemaglutinina do
vrus forma-se o boto ( o contrario da reao de hemaglutinao
normal). Se no soro no tem anticorpo quando voc coloca a suspenso de
hemcias forma-se o vu porque a hemaglutinina do vrus prende as
hemcias na superfcie do poo pq no tinha anticorpo para inibir a
hemaglutinao. um teste barato, sensvel, fcil e especfico.

Tem vrus que voc s estuda por biologia molecular, que no replica em
cultura de clula, faz elisa e no consegue detectar, a voc faz um pcr
com primers genricos e a consegue sequenciar e identificar qual que .
Tem que ter vrios cuidados no laboratrio tem um lugar para extrair o
acido nucleico, uma sala para fazer o pcr limpo, outra sala para fazer a
inoculao, outra para fazer a eletroforese, trocando inclusive de
jaleco em cada um desses lugares. Em cada sala/cada etapa usa-se pipetas
e ponteiras que s ficam naquela sala para evitar contaminar. Um pcr
negativo ser que negativo mesmo?! Faz-se sempre com os controles e
sempre tem que fazer controles internos para no obter falso negativo.
Alm de diagnosticar voc pode caracterizar o gentipo/variante do vrus
(saber que tipo de gentipo naquele virus), isso importante para
caracterizar os vrus circulantes. Consegue tambm avaliar a carga viral

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da amostra, podendo assim ajudar pacientes que esto fazendo o uso de
retrovirais e saber se a teraputica esta funcionando.

Ns vamos fazer em aula a eletroforese em gel de poliacrilamida, ns


vamos precisar de uma cuba, fabricar o gel e aplicar a amostra e
submeter isso a uma corrente eltrica, a amostra vai migrar no gel de
acordo com o peso molecular. A no final faz-se a leitura do gel e v os
segmentos que formaram. A tcnica na eletroforese voc vai usar uma
extrao de acido nucleico (que uma substancia que vai quebrar a
protena e arrastar lipdio e vai recuperar o genoma do virus) o rna vai
correr, a vai fixar e ler. No faz amplificao, s faz a pesquisa do
genoma do virus, uma tcnica molecular. No caso do rotavirus da pra
gente fazer porque ele um virus segmentado e da da pra contar os 11
segmentos do genoma viral.

Outra tcnica molecular a hibridizao, voc tem que ter uma suspeita
do genoma do vrus que esta na amostra porque tem que fazer uma sonda (a
sonda uma sequencia de bases complementar a aquela do vrus que voc
esta pesquisando). Vo fazer pontes de hidrognio e a sonda vai grudar
se tiver o genoma do vrus. Inicialmente fixa-se o tecido, trata com
proteases para tirar as protenas, faz um aquecimento para abrir o cido
nucleico, incuba com a sonda, se a sonda for para aquele vrus que
estamos procurando ela vai fazer pontes de hidrognio de forma
complementar. Geralmente essa sonda est marcada com fluorocromo e
aquele tecido fica corado e a voc identifica o vrus.

Southern blot e Northern blot (no faz o genoma completo do vrus que
voc est procurando) geralmente usa-se enzimas de restrio que vai
clivar o genoma do vrus em determinados locais usa o padro no gel e
padro de peso molecular, a voc compara as bandas, da voc sabe que
aquele tamanho de banda especfico de um vrus. Faz a transferncia
para uma membrana de imunocromatografia e usa-se uma sonda marcada e
depois expe ao raio x ou pode usar uma sonda marcada com enzima e
substrato. O Southern blot usa-se para DNA e Northern para RNA. ***no
entendi quase nada do que ela falou sobre esses mtodos, ela falou muito
confuso***

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O que um PCR? Voc vai usar uma enzima que vai pegar primers que so
complementares a sequencia do genoma alvo e vai copiar esse genoma
milhares de vezes, no final vai usar um gel para detectar essa banda
correspondente ao tamanho do genoma que voc amplificou. uma reao de
sntese de regies especificas de um dna alvo, voc programa os ciclos
na maquina e no final voce tem o produto da pcr. Voce tem uma regio pre
determinada pq tem que mandar desenhar os primers para no ficar sem
regio. Se voce no sabe qual virus que pode-se usar primers
randmicos que uma mistura de todos os primers que existem, vai ligar
em qualquer genoma e amplificar qualquer coisa mas tem um problema
porque depois voce vai ter que sequenciar e jogar no Gen bank ) para
pesquisar qual virus que . O pcr comea com a extrao do DNA alvo onde
voce vai usar uma substancia quimiotropica que para protenas (pode
ser fenol ou isotiocianato de alguma coisa que no deu para entender),
vai clivar essa protena/capsdeo viral liberando o acido nucleico do
virus eai faz o pcr. Voce precisa de um tampo para enzimas,
nucleotdeos especficos, dntp que atuam como tijolos para enzima copiar
o genoma, primers, e a enzima, termociclador (que voce controla o tempo
e a temperatura) e depois identificar com o gel. No final tem que
precipitar o acido nucleico e ai vai solubilizar em agua ou tampo, tem
que lembrar que aquele material clinico vai ter outros genomas (o
prprio do paciente e bactrias por exemplo), o genoma do virus tem
baixo peso molecular. No tubinho de pcr voc tem ento o pedreiro que
a dna polimerase, o ajudante que o magnsio, dntps (tijolos) e os
primers.

O DNTP uma base nitrogenada ligada a um acar (no caso a


desoxirribose) que trifosfatada e na extremidade 3 tem um OH livre pq
a que a enzima liga o prximo dntp, ao fazer isso tira 2 fosfatos que
o que fornece energia para a reao. O magnsio muito importante, se
voc tiver muito tem baixa fidelidade e a enzima coloca as bases no
lugar errado, se tiver pouco magnsio tem baixa processibilidade (ela
falou essa palavra mesmo). Altas concentraes de dntp so quelantes de
magnsio a o magnsio no vai funcionar direito e em baixas no
funcionam tambm. Tem que ter cuidado com as condies.

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Os primers so sequencias de bases que voc manda fazer para determinado
virus, tem o comprimento certo, ele delimita a rea que vai amplificar,
um ponto de apoio para a enzima comear a polimerizao. A enzima
sempre atua no sentido 5---3. Ele tem que anelar em uma nica
sequencia, no pode ter complementariedade das extremidades pq se no
vo se auto anelar.

uma tcnica bastante sensvel, o pcr em tempo real mais sensvel, se


voc tiver 3 copias do virus j se consegue detectar, j o pcr
convencional um pouco menos sensvel. Como muito sensvel e voc
amplificou o genoma do vrus, voc pode contaminar o ambiente ou outra
amostra e por isso tem que ter cuidado entre uma analise e outra. Em
cada ciclo dobra o numero de copiar, exponencial, mas teoricamente
porque os reagentes vao sendo degradados, mas de fato amplifica-se
muitas vezes.

O PCR pra quando o alvo DNA. RT-PCR pra quando o alvo RNA, a
voc converte o rna para dna complementar (a sim faz o pcr), antes tem
que usar uma transcriptase reversa para fazer a converso e depois taq
para amplificar. O Nested PCR pra quando voc quer amplificar a regio
muitas vezes ou quer aumentar a sensibilidade ou j genotipar.

Um exemplo de algo que aconteceu o surgimento de um vrus novo


coronavrus, j sabiam que existiam em sunos e que infectavam tgi
humanos mas no em trato respiratrio de humanos, comearam a morrer
pessoas na china e achavam que era pneumonia. Quando inoculou o escarro
em cultura de clulas teve efeito citoptico, quando olhou no
microscpio eletrnico viu que era uma partcula parecida com o
coronavirus. Pegaram gatos selvagens que viviam perto dessas pessoas e
pegaram amostras, detectou que neles tambm tinham o virus, a gente do
mundo todo estava estudando... usaram cultura de clulas, microscopia
eletrnica, animais de laboratrio, sequenciamento genomico. Inoculou em
primatas e observou que eles replicavam no trato respiratrio e saiam
nas fezes, ao fazer a analise filogentica viram que era um coronavirus
mas era um que sofreu mutao e comeou a afetar trato respiratrio.

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