Gua 6.

Extraccin y verificacin de la actividad de las enzimas: succnico

deshidrogenasa y citocromo oxidasa y estudio del efecto de algunos
inhibidores

I. EL PROBLEMA

Realizar experimentalmente la extraccin de enzimas a partir de un tejido animal.

Verificar in vitro la actividad de las enzimas que se extrajeron mediante el uso de

aceptores electrnicos coloreados.

Reconocer el efecto de los inhibidores en la actividad de las enzimas y sobre la

fosforilacin oxidativa y el ciclo de Krebs.

II. FUNDAMENTO TERICO

La mitocondria es el organelo citoplasmtico en donde se lleva a cabo la

respiracin celular representada en vas metablicas como el ciclo de Krebs y la
fosforilacin oxidativa. Posee dos membranas: la externa altamente permeable
por protenas de membrana llamadas porinas y la interna con pliegues o crestas y
de permeabilidad altamente selectiva (ver figura 1).

Figura 1. La mitocondria
El ciclo de Krebs

Es una ruta aerobia cuyos complejos multienzimticos se localizan en la matriz

mitocondrial con excepcin de la succnico deshidrogenasa protena integral de la
membrana interna.

Este proceso metablico permite la descarboxilacin de los esqueletos

carbonados que le llegan en forma de Acetil CoA, provenientes de diferentes
compuestos (carbohidratos, cidos grasos, aminocidos). Esta va metablica
oxidativa est asociada a la reduccin de las coenzimas FAD y NAD +, que
finalmente ingresan a la cadena de transporte electrnico para su reoxidacin (ver
figura 2).

Figura 2. Ciclo de Krebs

Figura 2. Ciclo de Krebs

Accin de la succnico deshidrogenasa.

La succnico deshidrogenasa, succinato deshidrogenasa o complejo II es una

enzima que remueve dos protones y dos electrones del succinato para dar origen
al fumarato, oxidacin asociada a la coenzima FAD +, que transfiere los electrones
a la cadena de transporte electrnico. Este proceso lo inhibe en forma competitiva
la presencia de otros cidos dicarboxlicos como el malonato, oxalacetato y y
oxalato, los cuales se unen fuertemente al sitio activo de la enzima, situacin que
genera la acumulacin de succinato.

El proceso se puede observar in vitro mediante el uso de un aceptor electrnico

artificial como el azul de metileno que tiene color en su estado oxidado e incoloro
cuando se reduce, en la medida que se reoxida la coenzima FAD. Cuando ste
indicador de oxido reduccin se encuentra en contacto con el O 2 del aire se
reoxida tomando de nuevo la coloracin azul y formando perxido de hidrgeno.
Cuando el azul de metileno se encuentra en contacto con el oxgeno del aire, se
reoxida tomando la coloracin azul y formando perxido de hidrgeno, por esta
razn el sistema se asla mediante una capa de aceite mineral.

La cadena de transporte de electrones y la fosforilacin oxidativa

La cadena de transporte de electrones o cadena respiratoria como parte de la

fosforilacin oxidativa es un proceso que se lleva a cabo en la membrana interna
mitocondrial y est constituido por una serie de complejos enzima-coenzima de
oxidorreductasas y ferroprotenas. (ver figura 3)

A travs de la cadena de transporte de electrones se realiza la reoxidacin de las

coenzimas NADH+ H+ y FADH2 producidas en las rutas catablicas, ya que permite
el transporte de los electrones hasta el O 2, que es el aceptor final reducindose
para formar agua.

Este flujo de electrones es exergnico por esto tres complejos enzimticos de la

cadena respiratoria utilizan la energa liberada para bombear protones al espacio
intermembrana de las mitocondrias, generando un potencial electroqumico que
pormueve despus el regreso de los protones a la matriz mitocondrial y la sntess
de ATP a travs del complejo V o la ATP sintasa.

Accin de la citocromo oxidasa.

El complejo citocromo oxidasa o complejo IV es el componente final de la cadena

respiratoria y est constituido por el citocromo a y a 3 y dos iones Cu ++.
Aproximadamente el 90% del consumo celular del oxgeno se debe a la accin de
este complejo que cataliza la reduccin del oxgeno para formar agua.

Esta enzima es sensible a la presencia de aceptores ms fuertes como es el caso

de in cianuro (CN-), azida (N3-), monxido de carbono (CO) y otros inhibidores
que bloquean irreversiblemente este complejo enzimtico. Con ello se ve
interrumpido el transporte electrnico y se deja de utilizar el O 2 generando una
condicin de cianosis celular.

La actividad del complejo citocromo C oxidasa se puede demostrar mediante la

oxidacin de aceptores electrnicos artificiales como la p-fenilendiamina (pFDH 2)
en presencia del sistema de citocromos de los complejos de la cadena
respiratoria. Esta sustancia es muy reactiva as que se condensa y polimeriza
fcilmente originando mezclas de pigmentos oscuros.
 Figura 3. Cadena de transporte de electrones y la fosforilacin oxidativa

La siguiente ecuacin qumica representa la accin de esta sustancia indicadora

de las reacciones de oxido reduccin en los sistemas in vitro.

III. REACTIVOS.

Buffer de fosfatos 0,1M pH = 7,4 Succinato de sodio, 1% en buffer

p fenilendiamina, 1% en agua
Azul de metileno 0,01% en agua
Oxalato de sodio, 1,5% en buffer
Arena lavada
Aceite mineral
*Cianuro de potasio, 0,05M en agua
*Azida de sodio, 0,5% en agua
Malonato de sodio, 1% en buffer
Agua destilada
Hielo

IV. MATERIALES.

12 Tubos de ensayo - gradilla Balanza

3 Pipetas (1, 2 y 5 mL) Bao termostatado
1 Vaso de precipitados (250 mL) Centrfuga
2 Tubos de centrfuga Trpode mechero
 1 Erlenmeyer Placa de calentamiento
1 Mortero pistilo Bistur cuchilla
1 Termmetro Pipeta Pasteur.
1 Esptula

MATERIAL DE PRUEBA.

Tejido muscular, heptico, cardaco de vaca, conejo o ave, bien fresco (trado del
matadero ese mismo da).

V. PROCEDIMIENTO.

Extraccin y preparacin de las enzimas y coenzimas.

Procedimiento para el monitor: pesar una muestra de aproximadamente 6 g de

tejido libre de sangre y colocarla en un mortero con arena lavada, enfriada
previamente en un bao de hielo. Proceder a macerar cuidadosamente hasta
formar una pasta suave adicionando poco a poco tres porciones (cada una de 5
mL) de buffer fosfato pH 7,4, hasta completar un volumen de aproximadamente 18
mL. Transferir la mezcla a un erlenmeyer de 150 mL y mantenerlo en un bao con
hielo durante 15 minutos, mezclando ocasionalmente. Pasar la muestra a tubos
de centrfuga y centrifugar a 1500 rpm por 7 minutos. Transferir el sobrenadante a
otro erlenmeyer de 150 mL y marcarlo como extracto enzimtico; mantenerlo en
bao de hielo hasta su uso posterior

Seguimiento de la reaccin catalizada por la citocromo oxidasa.

Preparar una serie de tubos debidamente marcados segn las indicaciones de la

Tabla 1, hasta adicionar el agua. Dejar los tubos incubando a 37C durante 10
minutos y sin retirarlos del bao agregar el extracto enzimtico y la p-
fenilendiamina, agitar bien, este momento corresponde al tiempo cero, observar y
registrar el tiempo en que aparece el complejo coloreado, el color final y la
intensidad del color.

Tabla 1. Seguimiento de la reaccin catalizada por la citocromo oxidasa

Tubos

Blanco 1 2 3 4
Reactivos (mL)

Buffer fosfatos pH 7,4 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Malonato de sodio 0,0 0,0 0,0 1,0 0,0

Cianuro de potasio 0,0 0,0 1,0 0,0 0,0

Azida de sodio 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0

 Agua destilada 2,0 1,0 0,0 0,0 0,0

Extracto enzimtico 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

p-fenililendiamina 0,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Seguimiento de la reaccin catalizada por la succnico deshidrogenasa

Prepare una serie de tubos debidamente marcados segn las indicaciones de la

tabla 2. Antes de agregar el extracto enzimtico, deje los tubos incubando a 37C
durante 10 minutos, y sin retirarlos del bao agregue el extracto enzimtico,
inmediatamente agite bien y coloque el aceite mineral. Tome como tiempo cero el
momento en que coloc el extracto enzimtico y anote el tiempo en que cambia el
color, color e intensidad de color final.

Tabla 2. Seguimiento de la reaccin catalizada por la succnico deshidrogenasa

Tubos
Blanco 1 2 3 4 5
Reactivos
mL
Buffer fosfato pH 7.4 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 1,0
Succinato de sodio 1% 0,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0
Azul de metileno 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0,5
Malonato de sodio 1%. 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0 0,0
Oxalato de sodio 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0
Extracto enzimtico 1,0 0,5 1,0 1,5 1,0 1,0
Aceite mineral 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1,0

VI. BIBLIOGRAFA.

- Mathews C., Van Holde K., Ahern K G. (2002). Bioqumica. 3 ed. Madrid: Addison
Wesley.

- Plummer, D. (1981). Bioqumica prctica. Mxico: Mc Graw Hill Latinoamericana.

- Nelson, David. L. y Cox, Michael. Lehninger. Principles of Biochemistry. 3 ed.

New York: Worth Publischer, 1993.

PREINFORME E INFORME
Extraccin y verificacin de la actividad de las enzimas: succnico deshidrogenasa
y citocromo oxidasa y estudio del efecto de algunos inhibidores

Nombre __________________________Fecha __________________Grupo___

CUESTIONARIO PARA EL PREINFORME.

En una hoja responda las siguientes preguntas

1- La ecuacin de las reacciones que catalizan las enzimas a utilizar en la

prctica.

2-Para los rganos a utilizar mencione brevemente si su metabolismo es ms

fermentativo (anaerobio) o aerobio, tenga en cuenta el color caracterstico de los
citocromos que hacen parte de la fosforilacin oxidativa.

3- tabla con los valores de potencial redox para todos los componentes de la
cadena respiratoria, as como del azul de metileno y la p-fenilendiamina,
compuesto que se usarn para evidenciar la actividad de las enzimas citocromo
oxidasa y succnico deshidrogenasa.

4- De acuerdo con el fundamento terico de la gua y la bibliografa describa

brevemente los cambios de color en el azul de metileno y la p-fenilendiamina
cuando:

a- La citocromo oxidasa y la succnico deshidrogenasa se encuentran sin

inhibidores.
b- La citocromo oxidasa y la succnico deshidrogenasa se encuentran con los
inhibidores (cianuro, azida, malonato u oxalato).

1. Seguimiento de la reaccin catalizada por la citocromo oxidasa

Con base en la consulta realizada en el preinforme escriba los resultados

esperados _________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________
__________________________________________________________________

Diagrama de flujo
2. Seguimiento de la reaccin catalizada por la succnico deshidrogenasa

Con base en la consulta realizada en el preinforme escriba los resultados

esperados _________________________________________________________
______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________

Diagrama de flujo

Fichas tcnicas. Propiedades de los reactivos a usar en el laboratorio.

 Primeros
auxilios y Forma de
Nombre Frmula Aspecto Peligrosidad*
medidas de eliminacin
higiene

*
Indique la peligrosidad con el smbolo correspondiente: explosivo (E), comburente (O), inflamable (F),
extremadamente inflamable (F+), txico (T), muy txico (T+), corrosivo (C), nocivo (Xn), irritante (Xi) y/o
peligroso para el medio ambiente (N). Pictogramas SGA

PAUTAS PARA LA ELABORACIN DEL INFORME

Escribir los datos, observaciones y fotos debidamente tabulados.

Haga un anlisis de las observaciones de la prctica con citas
Usando toda la informacin de su gua y preinforme:
Explique el propsito de agregar cada reactivo y la tempertaura de incubacin en
cada caso.
Explique el tipo de inhibidores presentes en algunos tubos de ensayo y sus
efectos.
Explique el efecto de la concentracin de extracto enzimtico en el ensayo que
corresponda.
Para cada tubo de ensayo realice una figura diferente ilustrativa de la cadena
respiratoria, con las siglas de cada componente y su secuencia, indique hasta
dnde se llevo a cabo la fosforilacin oxidativa, la ubicacin del aceptor de
electrones artificial (azul de metileno o p-fenilendiamina), de acuerdo con su
potencial de reduccin estndar(E) y aclare si qued oxidado o reducido de
cauerdo con sus observaciones.
Compare y discuta qu tan aerobio o anaerbio es su tejido muestra y por lo tanto
que rutas usa principalmente para la generacin de energa.
- Explique si se cumplieron o no los resultados esperados

Bibliografa con normas APA