Universidade Federal da Paraba UFPB

Centro de Cincias Exatas e da Natureza CCEN

Departamento de Biologia Molecular DBM
Laboratrio de Gentica de Microrganismos LGM

IX Semana de Biologia da UFPB

Mini-curso

COLORAO DE GRAM

www.dbm.ufpb.br/microbio
 Colorao de Gram
A colorao de Gram foi
desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista
dinamarqus Hans Christian Gram. Ela
um dos procedimentos de colorao mais
teis, pois classifica as bactrias em dois
grandes grupos: gram-positivas e gram-
negativas. Neste procedimento, um
esfregao fixado pelo calor recoberto com
um corante bsico prpura, usualmente a
violeta de genciana. Uma vez que a Figura 3 - Molculas que formam a peptideoglicana.
colorao prpura impregna todas as
clulas, denominada colorao primaria. Na maioria das bactrias gram-
Aps um curto tempo, o corante prpura positivas (Fig. 4), a parede celular consiste
lavado e o esfregao recoberto com iodo, de muitas camadas de peptideoglicana,
um mordente. Quando o iodo lavado, formando uma estrutura rgida. Alm disso,
ambas as bactrias gram-positivas e gram- contm cidos teicicos, que consistem
negativas aparecem em cor violeta escuro. primariamente de um lcool e fosfato.
A seguir, a lmina lavada com lcool ou As paredes celulares das bactrias
uma soluo de lcool-acetona. Esta gram-negativas (Fig. 5) consistem de uma
soluo um agente descolorante, que ou algumas camadas de peptideoglicana e
remove o prpura das clulas de algumas uma membrana externa. A peptideoglicana
espcies, mas no de outras. O lcool est ligada a lipoprotenas na membrana
lavado e a lmina ento corada com externa e est no espao periplasmtico,
safranina, um corante bsico vermelho. O um espao entre a membrana externa e a
esfregao p lavado novamente, seco em membrana plasmtica. As paredes gram-
papel e examinado microscopicamente negativas no possuem cidos teicicos,
(Fig. 1, 2 e Anexo). mas sim de lipopolissacardeos (LPS) e
A parede celular bacteriana fosfolipdios.
composta de uma rede macromolecular
denominada peptideoglicana, que est
presente isoladamente ou em combinao
com outras substancias. A peptideoglicana
consiste de um dissacardeo repetitivo
unido por polipeptdeos para formar uma
rede que circunda e protege a clula. A
poro dissacardica composta por
monossacardeos denominados N-
acetilglicosamina (NAG) e cido N-
acetilmurmico (NAM) (Fig.3). Figura 4 - Parede celular gram-positiva.

Figura 1 Colorao de Gram: Bacillus cereus (+) e

Escherichia coli (-). Figura 5 - Parede celular gram-negativa.

Referncias:
- Grupo de Cincias Biolgicas do IST. Colorao de
clulas pelo mtodo de Gram. Disponvel em:
http://www.e-
Figura 2 Colorao
escola.pt/site/topico.asp?topico=306&ordem=3&ca
de Gram mista:
nal=5
Streptococcus sp
- TORTORA, G. J.; FUNKE, B. R.; CASE, C. L.
(+). e E. coli (-).
Microbiologia. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2003.
 Anexo - Procedimento

1- Cobrir o esfregao da cultura em estudo

(previamente fixado lmina de vidro) com uma
soluo de Violeta de cristal (VC). Deixar atuar
durante 1 minuto.
Nota: aps este passo, todas as clulas ficam
coradas com o violeta de cristal (corante primrio).

2- Escorrer o corante e lavar com gua. Secar com

papel de filtro, sem esfregar. Cobrir a preparao
com reagente de Lugol e deixar atuar durante 1
minuto.
3- Escorrer a soluo de Lugol, lavar com gua e
secar.

Nota: o iodo da soluo de Lugol forma um

complexo insolvel com o corante primrio. O
complexo violeta de cristal - iodo (VC-I) tem uma
cor mais intensa (violeta escuro) do que o VC livre
e mais difcil de remover das clulas.

4- Diferenciar pelo lcool a 90, deixando cair a

soluo de lcool gota a gota sobre a preparao
at que no saia mais corante.

Nota: este o passo de diferenciao entre

bactrias Gram-negativas e Gram-positivas. As
primeiras perdem o complexo VC-I e as ltimas
retm-no. As clulas de bactrias Gram-positivas
ficam, ento, coradas de violeta-escuro e as Gram-
negativas ficam incolores.

5- Lavar com gua, escorrer e secar com papel de

filtro.

6- Tornar a corar a preparao, durante 5 minutos,

com uma soluo de safranina.
Nota: as clulas incolores de bactrias Gram-
negativas ficam coradas de cor-de-rosa (cor do
contra-corante safranina).

7- Escorrer o corante, lavar com gua e secar com

papel de filtro.