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Prctica 1: Introduccin a la espectroscopa de

absorcin UV-Visible
Parte A: La ley de Lambert-Beer
En esta parte de la prctica, trabajaremos con la hemoglobina. Se trata de una
protena con una gran presencia en la sangre, dado que es la encargada de
transportar el oxgeno desde los pulmones hasta los tejidos. Lo que nos servir para
cuantificar su concentracin en la muestra, ser un cromforo que poseen las 4
subunidades que la componen: el grupo hemo, el responsable de una importante
banda de absorcin a =405 nm, que se encuentra dentro del rango visible.
Nuestro objetivo a lo largo de la prctica ser determinar la concentracin de
hemoglobina en las disoluciones problema X e Y. Para ello, primero hemos de
determinar el coeficiente de extincin (405nm) del cromforo, representando la
absorbancia frente a la concentracin de Hb.
Partiendo de una disolucin de concentracin conocida de Hb (4mg/mL),
preparamos una serie de diluciones en las que reducimos la [Hb] a la mitad en cada
paso: pipieteamos en otro tubo la misma cantidad de la dilucin del paso
inmediatamente anterior que de disolucin tampn de Tris-HCl 10 mM pH=8.0 (as
durante 8 veces).
Una vez preparadas todas las diluciones, procedemos a marcar el blanco en el
colormetro para =405 nm con la disolucin tampn, y despus medimos la
absorbancia y la transmitancia de las diferentes muestras, empezando por las de
concentracin ms baja y terminando con las ms elevadas. Siempre colocaremos el
tringulo de la cubeta orientado hacia el mismo lado.

=405 nm Los resultados obtenidos se

C(relat) C (mg/mL) A T muestran en la Tabla 1, y la
0 0 0,000 100 representacin grfica de los
puntos obtenidos, en la
1/256 0,015625 0,060 87,1
Grfica 1 (a excepcin de C0,
1/128 0,03125 0,126 74,9
dado que implicaba extender
1/64 0,0625 0,261 54,8
los ejes en exceso).
1/32 0,125 0,537 29,1
1/16 0,25 1,004 9,9
1/8 0,5 1,619 2,4
1/4 1 1,822 1,5
1/2 2 1,925 1,2

C0 4 2,040 0,9
Tabla 1: medidas experimentales de A y T para las distintas
concentraciones de Hemoglobina.

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Grfica 1: donde se representa la absorbancia frente a la concentracin de Hb en papel milimetrado

(manual) as como su correspondencia en una tabla de Excel.
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A continuacin, procedemos a calcular la pendiente de la recta en la regin donde s

se cumple la linealidad de la Ley de Lambert-Beer (o sea hasta la absorbancia igual
a 1, aproximadamente).

Con estos clculos, podemos deducir que, para =405 nm:
0,1%=4,211 (mg/mL)-1cm-1, y que M=252660 M-1cm-1
Como ya tenemos los coeficientes de extincin, podemos proceder a calcular
experimentalmente la concentracin de hemoglobina en las disoluciones problema.
Para ello, primero marcamos de nuevo el blanco con la disolucin tampn en el
colormetro, y despus tomamos medida de las absorbancias (y transmitancias) de
ambas muestras. Posteriormente, aplicando la ley de Lambert-Beer, podemos
calcular la concentracin de nuestra protena en la muestra.

Para la disolucin X, podemos concluir que [Hb]=0,092 mg/mL; sin embargo, para
la disolucin Y no es vlido el resultado, dado que se haya en la regin donde la ley
de Lambert-Beer carece de validez: es el denominado problema del rayo
extraviado, que hace que el valor de la absorbancia se sature a pesar de que la
concentracin de cromforo aumente.
Para poder averiguar la concentracin en Y, procedemos a diluir la mezcla a su
quinta parte y tomar una medida de la absorbancia:
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Concluimos as que, en la disolucin problema Y, [Hb]=1,137 mg/mL.

Parte B: Influencia del pH en el espectro de absorcin. Anlisis de mezclas.
En esta parte de la prctica, aprovecharemos los cambios espectroscpicos que
tienen lugar con la ionizacin del azul de bromofenol para estudiar los cambios en
el espectro de absorcin provocados por el pH del medio, as como para determinar
la concentracin de ambas formas en un pH intermedio (o sea, un problema de
anlisis de mezclas).
Para ello, preparamos cuatro muestras a diferentes pHs, poniendo la mitad de la
solucin de azl de bromofenol (0,02 mg/mL) y la otra mitad de tampn citrato
fijado a un determinado pH. As, consideraremos que en la muestra con el pH ms
bajo, la de pH=2,4, todo el cromforo estar en la forma protonada; y en la de pH
ms alto, 5,8, que todo se halla en la forma desprotonada.
Posteriormente, despus de marcar la lnea base de calibrado con agua en el
espectrofotmetro de doble haz, obtendremos los espectros de las dos muestras
mencionadas entre 400 y 700 nm. En el propio instrumento, podemos averiguar con
qu se corresponde cada banda de absorcin, de modo que obtenemos, a partir de
la Grfica 2, las para las que la absorcin es mxima en cada una de las formas:
1=436 nm (forma prot.); 2=591 nm (forma desprot); isos= 498 nm ( para la
cual ambas formas absorben lo mismo).

Grfica 2: donde se representa la absorbancia frente a del azul de bromofenol protonado y
desprotonado. Se indican los valores que se corresponderan con 1, 2 y isos.

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Una vez obtenidas las

pH A1 A2 Aisos
diferentes max, procedemos a
2,4 0,330 0,047 0,117
medir la absorbancia (A) de
3,4 0,265 0,245 0,115 las 4 muestras con distinto pH
4,2 0,118 0,653 0,113 en el colormetro y a las tres
5,8 0,036 0,900 0,116 obtenidas anteriormente, y
Tabla 2: medidas experimentales de la absorbancia de las 4 conseguimos los resultados
muestras a 1, 2 y isos. que mostramos en la Tabla 2,
tomando como precaucin
siempre marcar el blanco con agua cada vez que empecemos a medir con una nueva
longitud de onda.
De este modo, podemos calcular los 0,1% para cada una de las especies, en 1 y 2,
aplicando la ley de Lambert-Beer, y considerando que a pH=2,4 la concentracin
total de la muestra se encuentra en forma protonada, mientras que a pH=5,8 toda
la muestra estar desprotonada.

Sabiendo los coeficientes de extincin de ambas formas a 1 y 2, podemos plantear
un problema de anlisis de muestras, en el que desconocemos las concentraciones
de las formas protonada y desprotonada de las muestras a pH 3,4 y 4,2. Los valores
de las absorbancias en ambas disoluciones a 1 y 2, junto con los coeficientes de
extincin, nos permiten plantear el siguiente sistema:

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Lo que nos muestra la tabla a la izquierda, que forma parte

pH Aisos
de la Tabla 2, son las absorbancias en el punto isosbstico.
2,4 0,117 Podemos comprobar que todas ellas son aproximadamente
3,4 0,115 iguales, lo cual implica que el coeficiente de extincin de las
4,2 0,113 formas protonada y desprotonada ser el mismo, y por tanto
5,8 0,116 la absorbancia no depende de otra cosa sino de la
concentracin total de azul de bromofenol, en cualquiera de sus formas.

Cuestiones
1.- La prdida de linealidad en la representacin de A405 frente a la concentracin de
hemoglobina queda explicada mediante el problema del rayo extraviado. Llegado un
cierto punto de concentracin (que se correspondera con una absorbancia
relativamente alta), el cromforo est tan saturado, que deja de absorber toda la
radiacin que podra, mientras que la radiacin contaminante sigue pasando a su
travs, y pierde la linealidad, aumentando la absorbancia en menor medida. Esto
ocurre a cualquier longitud de onda y con cualquier cromforo, dado que es un
problema de superpoblacin, y por lo tanto lo nico necesario son
concentraciones elevadas de la molcula de inters.
2.- No, porque la ley de Lambert-Beer solamente permite calcular la absorbancia a
una cierta si el coeficiente de extincin se corresponde con la misma.
3.- Estructuralmente, el grupo hemo es una molcula plana, compuesta de cuatro
anillos pirroles ciclados. Posee un gran nmero de dobles enlaces conjugados, lo que
permite que se deslocalicen sus electrones a ambos lados del plano de la molcula.
Como consecuencia de esta deslocalizacin, la transicin energtica entre y * es
relativamente baja, lo que permite que se excite un electrn tan solo utilizando
fotones de luz azul.
4.- No podra determinarse la concentracin de las formas por separado, dado que
en el punto isosbstico el coeficiente de extincin de ambas molculas ser el
mismo. Lo que queremos decir con esto es que, aplicando la ley de Lambert-Beer
para una determinada absorbancia, teniendo en cuenta que y el paso ptico son
los mismos, nos dara un nico valor de la concentracin, que sera el del cromforo
en su totalidad (CT).
5.- Midiendo a una max que se correspondiera con la banda de absorcin mxima
para la forma protonada o desprotonada, habramos de preparar distintas muestras,
con la misma concentracin de azul de bromofenol, pero cada una tamponada a un
pH ligeramente superior a la anterior. Midiendo la absorbancia a 1 o 2 en las
sucesivas disoluciones, podramos obtener una representacin grfica en la cual
pasamos de una absorbancia mxima a una absorbancia prcticamente nula a
medida que aumenta el pH (en el caso de 1), o viceversa, para 2. Si tomamos el
punto en el que la absorbancia es justo el promedio entre el mximo y el mnimo de
la transicin (A1/2) y calculamos el pH, ste se corresponder con el pKa de la
molcula.