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CUANTIFICACIN DE PROTENAS
TOTALES EN EXTRACTOS CRUDOS DE
CEPAS NATIVAS DE Bacillus thuringiensis
AISLADAS DE BOYAC Y CUNDINAMARCA
TOTAL PROTEIN OF CRUDE EXTRACTS AND
QUANTIFICATION THE NATIVE Bacillus thuringiensis
STRAINS ISOLATED FROM BOYAC
AND CUNDINAMARCA
TORRES CABRA, Eneida 1
HERNNDEZ-FERNNDEZ, Javier 2
PERZ RUBIANO, Claudia Constanza 3
RESUMEN
Conexin Agropecuaria JDC - Vol 3 No. 2 - Julio - Diciembre 2013 pp. 37-43
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Torres Cabra, Eneida Hernndez Fernndez, Javier Prez Rubiano, Claudia Contanza
ABSTRACT
The Cry proteins of Bacillus thuringiensis (Bt) produce parasporal crystal du-
ring sporulation which are toxic against insect larvae of lepidopteran, coleop-
teran and dipteran. In the present study, 10 native isolations of Bt strains were
quantified from the Native Strains Bank of the Jorge Tadeo Lozano University,
isolated from soil in the municipalities of Rquira, Santa Sofa, Villa de Leyva
and Sutamarchn, in Boyac; and also in Susa, Cundinamarca. Crude extracts
of total proteins from the 10 strains incubated in Luria-Bertani medium (LB)
for 15 days at 37 C were obtained. For quantification of total protein of the
spore crystal mixture was used the Bradford method using a standard pattern a
calibration curve with bovine serum albumin (BSA). After 5 minutes, the de-
termination was realized in the spectrophotometer at a wavelength of 595 nm.
The brighter blue were presented by the strains ZBUJTL35 and ZBUJTL39,
with a concentration of 560.71 and 526.43 mg / ml, respectively. The Bradford
method is a simple and fast technique to estimate the protein concentration.
The strains will be used to determine the toxicity over Bemisiatabaci larvae.
Key words: bacteria, Bradford reagent, Coomassie Brilliant Blue G-250, Cry protein, sporula-
tion.
INTRODUCCIN
Las protenas Cry son un grupo de protenas de inclu- & Currier, 1990), dado que, la produccin de protenas
sin paraesporal de Bt, llamadas protenas insecticidas Cry de Bt dependen tanto del medio de cultivo donde se
de cristal (ICPSs) (Hfte & Whiteley, 1989), tambin reproduce, como de la cepa utilizada (Solis, 2005).
denominadas -endotoxinas, las cuales son codificadas
por los genes cry, (Schnepf et al., 1998). Actualmente, las Las protenas son sintetizadas como componentes estruc-
cepas aisladas muestran un amplio rango de especificidad turales y catalticos de la mayora de las reacciones celu-
contra insectos de diferente orden (Lepidoptera, Diptera, lares, la cuantificacin de estas protenas se puede realizar
Coleoptera, Himenoptera, Homoptera y Acari) y otros in- por diferentes mtodos, muchos se basan en la propiedad
vertebrados (Nematelmintos y platelmintos) (Feiltelson, intrnseca de las protenas para absorber luz UV, para
1993). la formacin de derivados qumicos o la capacidad de
unirse a ciertos colorantes. En particular, los principales
Es de resaltar que en este momento ms del 90% de los mtodos para la cuantificacin de protenas a travs de
bioplaguicidas comerciales basados en entomopatge- derivados colorimtricos son: Bradford, Biuret, Lowry y
nos, utilizan en sus formulaciones mezclas de esporas e cido bicinconnico (BCA) (Fernndez & Galvn, 2010).
ICPs procedentes de varias cepas de Bt (Joung & Cote,
2000). Los productos a base de Bt que contengan -endo- Dentro de los mtodos colorimtricos est el original-
toxinas, tienen que especificar en su etiqueta el porcentaje mente propuesto por Bradford (1976), que se fundamen-
de ingrediente activo de cada tipo de toxina (Brussock ta en la unin protena-colorante, donde el azul brillante
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G-250 Coomassie se adhiere a la protena, el colorante se Preparacin de medio de cultivo Luria Bertani (LB)
torna de rojizo a azulado y el mximo de absorcin del y siembra de cepas Bt. Para la preparacin de 1 litro
colorante cambia de 465 a 595 nm (Fernndez & Galvn, de medio, se pesaron 10 g de triptosa, 5 g de extracto
2010). De esta manera, el objetivo de este estudio fue rea- de levadura, 13 g de agar y 10 g de NaCl. El medio
lizar la cuantificacin de la protena Cry de los aislamien- se esteriliz en autoclave a 121 C por 15 minutos.
tos nativos de Bt para determinar su concentracin. Despus el LB preparado se sirvi en cajas de Petri en
cmara de flujo laminar, colocando aproximadamente
METODOLOGA 15 ml en cada una de las cajas.
La presente investigacin se llev a cabo en el Laborato- Posteriormente, las cepas nativas de Bt que estaban
rio de Microbiologa de la Fundacin Universitaria Juan almacenadas en tiras de papel dentro de una ampo-
de Castellanos (FUJC), y el Laboratorio de Investigacin lleta, se sembraron por triplicado en medio LB, incu-
Qumica y de Tecnologa de Alimentos de la Universidad bndose por siete das a 30 C. Se realiz un diseo
Pedaggica y Tecnolgica de Colombia (UPTC), ubica- al azar con 6 repeticiones por cada cepa. Finalmente,
dos en la ciudad de Tunja. a partir de estas bacterias se obtuvo los extractos
crudos.
Material biolgico: Se utilizaron 10 cepas de aisla-
mientos nativos de Bt provenientes del Banco de Baci- Descripcin macroscpica de colonias de Bt y colo-
los Esporulados de la Universidad Jorge Tadeo Lozano racin de Gram. Una vez crecidas las cepas se sem-
(UJTL), estas muestras fueron recolectadas del suelo en braron nuevamente en medio LB por estra mltiple
diferentes regiones productoras de tomate. Para este es- por 24 h a 30 C, con el propsito de obtener colonias
tudio se utilizaron 10 cepas de aislamientos nativos de B. aisladas para hacer descripcin macroscpica y
thuringiensis provenientes de 5 municipios de Colombia, coloracin de Gram verificando su pureza.
departamentos de Cundinamarca y Boyac (Tabla 1). Las
cepas se conservaron por triplicado en una tira de papel Obtencin de extractos crudos. Los bacilos cultiva-
filtro dentro de una ampolleta color mbar. Cada cepa dos en medio LB, se tomaron aspticamente con una
tiene asignado un cdigo compuesto por la zona mues- asa y se pasaron a tubos falcn de 15 ml, agregndose
treada, que corresponde al departamento (ZC: zona Cun- 4 ml de bicarbonato de sodio (amortiguador que per-
dinamarca, ZB: zona Boyac,), seguido de las iniciales de mite la solubilizacin de las protenas totales) (Bravo
la Universidad Jorge Tadeo Lozano (UJTL), y el nmero & Cern, 2004) agitndose en vrtex por 10 segun-
de la cepa (Tabla 1). dos y se mantuvieron a 4 C para su anlisis posterior.
Tabla 1. Departamento, municipio y nmero de cepa de aislamientos nativos de Bt del Banco de Cepas Nativas de la Universidad Jorge Tadeo Lozano
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Para la preparacin de bicarbonato de sodio (pH fic Genesys 10s Vis-serial) a una longitud de onda
10.5) utilizado como buffer, se pesaron 0,33 g de de 595 nm, ajustando el cero de absorbancia con el
bicarbonato de sodio 0,1 M (NaHCO3) y 0,65 g de blanco.
carbonato de sodio 0,1 M (Na2CO3), aforndose con
agua destilada a 100 ml. Partiendo de la Ley de Beer-Lamber, se realiz una
curva ordenando en el eje X las concentraciones y en
Preparacin del Reactivo Bradford. Se pesaron 10 el eje Y las absorbancias, luego se realiz la regresin
mg de azul de Coomassie G-250 en balanza analtica, lnea y se obtuvo la ecuacin Y=mx+b y el y el R2.
se adicionaron 5 ml de etanol al 95 % v/v y 10 ml
de cido fosfrico al 85% v/v, aforndose a 100 ml Cuantificacin de protenas totales en los extractos
con agua destilada, esta solucin se filtr con papel crudos por la tcnica de Bradford. Para cuantificar
Whatman y se almacen en frasco color mbar a 4 C las concentraciones de protena total en los extrac-
(Bradford, 1976). tos crudos de los aislamientos nativos, se emple un
diseo experimental aleatorio en donde se conside-
Preparacin de la solucin concentrada de albmi- raron para la lectura 2 rplicas y 3 repeticiones para
na de suero bovina (BSA) 1000 g/ml. Se pesaron 4 cada rplica, de cada una de las 10 muestras (cepas)
mg de BSA en balanza analtica y se disolvieron en de estudio y un blanco (el volumen de la solucin de
4 ml de agua destilada, homogenizando la solucin. protenas se reemplaza por agua), es recomendable
Despus, se hizo una curva de calibracin a partir de realizar por lo menos dos replicas, tanto por el cl-
diferentes concentraciones de BSA, las soluciones se culo de la curva patrn como para la cuantificacin
prepararon con concentracin de 100-1000 g/ml, a de la muestra. Para validar los resultados obtenidos,
partir de BSA y agua destilada (Buffer), llevndolas se realiz un anlisis de varianza. De esta manera se
a un volumen final 1 ml (Tabla 2). tomaron 100 l de cada una de ellas y se agregaron
900 l de Buffer (Bicarbonato). Posteriormente, en
Tabla 2. Concentraciones de BSA usadas para la elaboracin de la curva
de calibracin
tubos de vidrio (16 X 150) se mezclaron 100 l de
la mezcla anterior con 5 ml de reactivo de Bradford,
Concentracin BSA Cantidad de
(g/ml)
Cantidad de BSA(l)
buffer(l) pasados 5 minutos se realiz la lectura en el espec-
trofotmetro a una absorbancia a 595 nm (Bradford,
100 100 900
1976).
200 200 800
w400 400 600
500 500 500
RESULTADOS Y DISCUSIN
600 600 400
800 800 200
Descripcin macroscpica de colonias de Bt y colo-
1000 1000 0
racin de Gram. Los 10 aislamientos nativos se aisla-
ron en el medio de cultivo LB por 24 horas a 30 C,
Determinacin de protenas por la tcnica de Brad- esta bacteria se caracteriza por un crecimiento rpido
ford. Se mezclaron en un tubo de vidrio 100 l cada en medio Luria Bertani (LB) a una temperatura
una de las concentraciones de BSA con 5 ml de re- ptima entre 28 C y 32 C y un pH ptimo de 7.0
activo de Bradford, despus de 5 minutos se realiz (Holt et al., 2000). Terminada la incubacin las colo-
la lectura en el espectrofotmetro (Thermo Scienti- nias formadas presentaron una morfologa circular,
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Figura 3. Concentracin de protena total del extracto crudo de 10 cepas nativas de B. thuringiensis.
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