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PRCTICA 1
Contenido
1.1 Capacitacin para el uso de micropipetas y equipo de laboratorio. ...... 2
1.2. Capacitacin para el uso de espectrofotmetros y centrfugas. ............ 7
1.3. Preparacin de reactivos requeridos en el laboratorio de
bioconversiones. ................................................................................................. 13
1.4 Determinacin de crecimiento celular por turbidimetra (D.O.), peso
seco, protena y cuenta directa en cmara de Neubauer. ........................ 14
1.5 Determinacin de azcares reductores y azcares totales. ................... 17
1.6 Determinacin de la concentracin de protena de las enzimas
elegidas. ................................................................................................................. 20
1.7 Medicin de la actividad cataltica de enzimas y/o de extractos crudos
enzimticos: Amilasas. ...................................................................................... 23
1.8 Efecto de la concentracin de enzima y fuerza inica en la actividad de
la enzima elegida. ................................................................................................ 25
1.9 Efecto de la temperatura y pH en la actividad enzimtica. ...................... 27
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Cada pipeta sirve para medir un determinado volumen. Las de volumen fijo
miden solamente un volumen determinado. En las de volumen variable, se
puede seleccionar un volumen dentro de un intervalo de valores determinado.
En stas, no se deben ajustar volmenes superiores o inferiores a los que se
recomiendan para cada pipeta.
Los modelos que toman volmenes inferiores a 200 L usan puntas amarillas
(o blancas), y las micropipetas que toman volmenes superiores a 200 L
hasta 1 mL usan puntas azules (en algunos casos son blancas). Las pipetas
que manejan volmenes mayores de 1 o de 0.5 y 10 L, pueden usar otro tipo
de puntas especficas.
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Posicin Inicial 1 2 3 4
Primer Tope
Segundo Tope
Fig. 1 Manera de asir una pipeta automtica y tomar una muestra (presin
del mbolo).
Figura 3 Figura 4
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Figura 5 Figura 6
http://www.um.es/bbmbi/AyudasDocentes/Practicas/Quimica/Practica00/Micropi
petas.htm
TRABAJO PRCTICO
Cuando se tomas muestras viscosas o densas como el glicerol, debe esperar a que
suba muy lentamente todo el volumen, al no hacerlo y retirar la punta entrar aire. Esto
indica que an no se haba tomado todo el volumen y se debe repetir todo el
procedimiento.
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1000 L 200 L 20 L
600 150 16
200 100 12
100 50 8
4
1
1000 L 200 L 20 L
600 150 20
200 100 10
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Fotometra
La luz es una forma de energa electromagntica, igual que los ultravioletas, infrarrojos etc.
Que es irradiada a partir de una fuente energtica en lneas o rayos virtualmente rectos. Se
propaga en el vaco sin necesitar sustancia transportadora. Dentro de su trayectoria
rectilnea describe ciclos en forma de ondas regulares que vibran perpendicularmente a su
direccin de desplazamiento y cuya longitud de onda se sita entre 380 y 780 nanmetros.
Longitud de onda: Es la distancia entre dos picos sucesivos de una onda. La luz
que percibe el ojo humano es la luz visible y comprende desde 400 a 700 nm.
Longitudes de onda superiores a 700 nm no son visibles para el ojo y se llama
infrarroja; entre 100 y 400 nm es radiacin ultravioleta (UV).
donde
C = concentracin de la sustancia absorbente
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Sol.Absorbente
concentracin C
Luz Rayo incidente Rayo emergente
monocromtica
Intensidad I0 Intensidad I
L
Espesor de la solucin
Figura 1. Diagrama del paso de luz monocromtica a travs de una solucin
I0
-CL
I = I0 10 log = cL
I
I - cL I
T= =10 %T = x 100
I0 I0
I0
La expresin log se conoce como absorbancia (A) o densidad ptica (DO)
I0
A = D.O. = log = c L ; para L=1, A = c
I
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La luz que sale del colimador se hace pasar por la solucin y luego incide sobre
el fototubo donde es detectada. La seal se enva a un registrador que
convierte la seal a un registro anlogo, digital o grfico.
Colimador Fototubo
Registro
Monocromador Celda con
muestra
Fuente de luz
%T 0 100
A 0
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Actividad en laboratorio:
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Para abrir:
Mueva el interruptor a la posicin ON.
Accione la palanca de apertura (al lado derecho de la puerta)
Para programar:
Oprima ROTOR e introduzca el nmero 14 20, dependiendo del tipo de
rotor a usar.
Oprima SPEED y teclee la velocidad (rpm). (verificar las velocidades
mximas para cada rotor, para esto existe una tabla)
Oprima TIME y teclee el tiempo (h : min).
Oprima TEMP y teclee la temperatura ( C)
Al terminar la seleccin, oprima ENTER.
Para operar:
Coloque cada par de tubos ya equilibrados en posiciones contrarias
(encontradas).Los contrarios deben tener el mismo peso
Coloque la tapa del rotor.
Cierre la centrfuga.
Permita que el equipo enfre a la temperatura indicada antes de comenzar
el programa.
Oprima el botn START para iniciar el programa.
Se puede abortar oprimiendo el botn STOP.
NOTAS:
La palanca de apertura solo funciona con el equipo encendido.
Apague el equipo manteniendo la puerta abierta para permitir que la cmara
de la centrfuga se deshiele. Asegrese de secar la cmara. Proceda a
cerrar el equipo.
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El equipo solo se abre cuando el LED (foco o luz verde) est encendido, seal
que el rotor se ha detenido y que es posible abrir.
Para programar:
Mantener oprimido el botn preset
Seleccionar el tiempo (min/sec) girando la perilla
Seleccionar la velocidad (rpm) girando la perilla
Para operar:
Coloque cada par de tubos equilibrados en peso (con el mismo peso) en
posiciones encontrada (contrarias). Los tubos deben estar equilibrados por
par (no todos los del rotor), pero es imprescindible que los tubos
encontrados tengas el mismo peso.
Coloque la tapa del rotor (si ste posee una).
Cierre la centrfuga.
Oprima el botn start para iniciar el programa.
Se puede parar oprimiendo el botn stop.
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Reactivo de Bradford
Disolver 100 mg de azul brillante de Coomassie G-250 en 50 mL de etanol al
95%. A esta solucin se le aaden 100 mL de cido fosfrico al 85% (w/v). La
solucin resultante se diluye a un volumen final de 1L. Las concentraciones
finales en el reactivo son 0.01% (w/v) de azul brillante de Coomassie G-250,
4.7% (w/v) de etanol y 8.5% (w/v) de cido fosfrico.
Una vez terminado el reactivo se debe verificar el color, debe ser caf. Si tiene
un tono azulado no es adecuada y se desecha, debiendo preparar
nuevamente. Filtrar el reactivo cuando sea necesario.
Solucin de alfa-amilasa
La concentracin de enzima ser indicada por el profesor y ser en mg de protena o
enzima por mL de regulador de fosfatos, 0.1 M, pH 7.0.
Solucin de antrona
Disolver 0.2 g de antrona en 5 ml de etanol y aforar a 100 ml con H2SO4 al
75%.
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PARTE EXPERIMENTAL
1) Densidad ptica
2) Peso seco
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3) Cuenta directa en Cmara de Neubauer
Las diferencia entre las reas 1,3,7 y 9; 4,2,6,8 y la 5 son las subdivisiones, lo
que permite en ese orden contar clulas de mayor a menor tamao, contando
bacterias y levaduras en el rea 5, que cuenta con 25 subdivisiones y se
observa en 40 o 100X
Donde:
N: La media de las clulas contadas (suma de clulas contadas por
subdivisin/Nmero de subdivisiones contadas)
25: es el nmero de cuadrados en cada grilla.
104: factor para pasar el nmero de clulas en el cuadrado central (volumen =
0.1mm3 = 0,1L) a nmero de clulas por mL (1000mm3 = 1000L=1 mL)
F: factor de dilucin
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Fugelsang, K.C. and Edwards, C.G. (2007). Wine Microbiology. Practical applications
and procedures., Edn. 2nd. (Springer, USA).
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1) Azcares reductores
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y = mx + b
La curva patrn ser correcta cuando se obtenga una r mayor o igual a 0.98,
con lecturas de absorbancia entre 0 y 1.
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y = mx + b
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Objetivo
Introduccin
La determinacin de la concentracin de protenas puede realizarse por varios
mtodos, entre ellos:
Sol. de BSA
1000 g/mL 0.0 0.10 0.2 0.30 0.40 0.50 0.60 0.70 0.80 0.90 1.0
(mL)
Agua destilada
(mL)
1.0 0.90 0.80 0.70 0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.0
Concentracin
de BSA
( g/mL) 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
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Desarrollo experimental
(BSA) 200
0.0 0.025 0.05 0.075 0.10 0.125 0.15 0.175 0.20 0.225 0.25
g/mL (mL)
Agua destilada
(mL)
0.25 0.225 0.20 0.175 0.15 0.125 0.10 0.075 0.05 0.025 0.0
Concentracin
de BSA 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
(g/mL)
A partir de una solucin que contenga X mg/mL de tripsina (en agua destilada)
hacer por triplicado 7 diluciones adicionando 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.25, 0.5
mL de la solucin de tripsina y agregar a cada uno agua destilada para llevar a
un volumen final de 1.0 mL (0.99, 0.98, .095, 0.9, 0.8, 0.75 y .05 mL), de agua
respectivamente) y leerlas a 280 nm.
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Informe
1. Establecer la curva patrn de protena con Bradford y otra por
espectrofotometra a 280 nm.
2. Calcular la concentracin de protena de la solucin de tripsina usando los
dos mtodos de determinacin de protena.
2. Discutir los resultados obtenidos.
Cuestionario
Referencia.
Bradford, M. M., 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.
Anal. Biochem. 72, 248-254.
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OBJETIVO
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Reactivos:
Realizar la curva de maltosa de 0.0 a 2.0 g/L. y determinar por mtodo de DNS
(prctica 1.5)
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0.1 mL de la mezcla de reaccin (otra persona), transferirlo rpidamente a
un tubo conteniendo 0.1 mL de reactivo DNS (ste ser el testigo). Realizar:
un el Blanco sin agregar la enzima, es decir a los 0.1 mL de DNS, adiciones
0.1 mL de solucin de almidn.
4) Dejar que la reaccin se desarrolle a tres tiempos y por triplicado (9 tubos)
0.0 (testigo), 3.0 y 6.0 minutos exactamente. Transcurrido el tiempo
EXACTO transferir 0.1 mL de la mezcla de reaccin a uno de los tubo que ya
contiene 0.1 mL del reactivo DNS.
5) Tratar todos los tubos al mismo tiempo segn la tcnica de DNS: Poner en
bao de agua a ebullicin durante 5 min, exactamente. Cuidar de que no
entre agua a los tubos.
6) Transcurrido el tiempo sacra y poner en hielo o un bao de agua fra durante
10 min.
7) Posteriormente aadir 1.0 mL de agua destilada a dicha solucin.
8) Se homogeniza la solucin invirtiendo con la mano los tubos.
9) Se determina la absorbancia a 540 nm, ajustando a cero con el blanco,
determinando la absorbancia para cada tubo testigo y problema (tiempo 3 y
6 min). La absorbancia del tubo testigo se resta al tubo problema con la
finalidad de eliminar la absorbancia que no sea atribuible a la reaccin
enzimtica. .
10) Se utiliza la curva patrn de DNS realizada con maltosa para determinar la
concentracin de azucares reductores expresados como mg maltosa/ mL
de la muestra.
11) Expresar la actividad enzimtica en unidades de actividad de alfa
amilasa/mL. Considerar la siguiente definicin de una unidad de actividad
alfa amilasa: cantidad de enzima que libera 1 mg de maltosa a partir de
almidn despus de 1 min de reaccin con la enzima a 20C y pH 6.9
III. INFORME:
1. Elaborar la curva tipo Abs540nm vs concentracin de maltosa y determinar
la ecuacin de la regresin lineal.
2. Calcular la actividad enzimtica en unidades de actividad enzimtica (U)
y actividad especfica (Uesp).
U =
[ producto ]t1 [ producto ]t 0 U esp =
[ producto ]t1 [ producto ]t 0
t (t )[ protena ]
3. Hacer la grfica de unidades de actividad de amilasa vs tiempo de
reaccin.
4. Cules son los productos de esta reaccin?
5. Recopilar y comparar los resultados de todos los equipos, discutir si hay
diferencias.
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OBJETIVO
DESARROLLO EXPERIMENTAL
Reactivos:
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e) Continuar la determinacin de DNS de acuerdo a lo indicado en la
prctica 1.5 y 1.7.
Procedimiento:
A
INFORME:
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*Sol. de
Enzima en
regulador PO4
pH 7.0 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
(mL)
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b) Posteriormente adicionar a cada tubo 0.05 mL de la solucin de amilasa
(excepto al testigo) con un intervalo entre cada tubo de 30 segundos
para poder detener la reaccin en el tiempo exacto a la reaccin
c) Incubar los tubos (un triplicado, un testigo y el blanco (sin enzima), por 5
min (tiempo de reaccin) en un bao a cada temperatura.
d) Pasado el intervalo de tiempo tomar 0.1 mL de la mezcla de reaccin y
adicionarlo a un tubo conteniendo 0.1 mL del reactivo DNS.
e) Continuar la determinacin de DNS de acuerdo a lo indicado en la
prctica 1.5 y 1.7.
Reactivos:
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Tabla 8. Soluciones de enzima a diferentes pH para determinar el efecto
del pH en la actividad enzimtica.
Sol. de
almidn al 1.0 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95 0.95
% (mL)
Enzima +
regulador al 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
pH indicado
(mL)
INFORME:
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La invertasa es producida por una amplia gama de microorganismos que pueden utilizar la
sacarosa como nutriente. Comercialmente, la invertasa es biosintetizada principalmente por
cepas de levaduras de Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces carlsbergensis. Incluso
dentro del mismo cultivo de levadura, la invertasa existe en ms de una forma. Por ejemplo,
la invertasa intracelular tiene un peso molecular de 135,000 Da, mientras que la variedad
extracelular tiene un peso molecular de 270,000 Da.
Parte experimental:
Preparacin de reactivos:
Sustrato: preparar sacarosa (30.0 g/L), disolver el sustrato en agua, la mitad del volumen
que se vaya a preparar y se afora con regulador de acetatos 0.05M pH 5.0. Preparar 50 mL
de sustrato.
Enzima: invertasa 0.4 mg/mL en regulador de acetatos 0.025M pH 5.0.
Diluciones de sutrato:
Obtencin de concentraciones de sacarosa: Realizar diluciones con regulador de acetatos
0.025 M de 0 a 30 g/L
1
Tabla 1. Preparacin de las soluciones de sacarosa a diferentes concentraciones
Sacarosa (30 g/L) Acetatos 0.025M Concentracin final
(mL) (pH 5.0)(mL) de sacarosa (g/L)
0 10 0.0
1 9 3.0
3 7 9.0
4 6 12.0
5 5 15.0
8 2 24.0
10 0 30.0
Preparar 10 ml de cada concentracin por grupo, dividir las soluciones por equipos.
Procedimiento:
La prueba se realizar por triplicado con un blanco para toda la prueba y un testigo para
cada concentracin.
1. Colocar 0.95 mL de sustrato, para cada concentracin y de acuerdo a la tabla 2, en un
tubo eppendorfd, se deja equilibrar a temperatura ambiente por 5 min.
2. Agregar 0.05 mL de la enzima y agitar el tubo para homogenizar y dejar proceder la
reaccin durante 5 min.
Condiciones de la reaccin: regulador de acetatos 0.025M pH 5.0, temperatura de en C
(temperatura ambiente, determinar la temperatura del laboratorio al momento de realizar el
experimento).
3. Inmediatamente despus de terminada la reaccin (5 min), tomar un alcuota de 0.1 mL y
transferirla a un tubo que contiene 0.1 mL de DNS (para detener la hidrlisis enzimtica).
*testigo se adiciona la enzima al final del tiempo de la reaccin e inmediatamente el reactivo
de DNS
4. Los tubos se calientan a ebullicin en bao Mara durante 5 min. Se enfran en bao de
hielo, adiciona 1.0 mL de agua y se leen a 540 nm en un espectrofotmetro, contra un
blanco de reactivos (0.1 mL de regulador de acetatos 0.25 M pH 5.0 + 0.1 de DNS + 1 mL
de agua).
5. Tomar la lecturas de Abs (tabla 2) del mtodo de azucares reductores y determinar la
concentracin de producto, utilizando la curva tipo de glucosa (se har en laboratorio o se
proporcionar en funcin del tiempo).
2
Los valores de A540nm netos son: (A540nm Problema)- (A540nm Testigo) = A540nm Neto
S 1 Km
Agustinsson: [S]/vo versus [S] o S
V Vmax Vmax
Eadie Hofstee: vo versus v/ [S] o V
V Km Vmax
S
Nota: Considerar la concentracin real o final de la sacarosa que se utiliza en la reaccin.
INFORME:
1. Hacer la grfica de velocidad vs concentracin de sustrato.
2. Hacer las grficas de 1/vo vs 1/[So], [So]/vo vs [So] y vo vs vo/ [S] o y Calcule Km y
Vmax,
4. Discutir los resultados obtenidos por todos los equipos del grupo.
Referencia.
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PRCTICA 3
INMOVILIZACIN DE ENZIMAS.
OBJETIVOS
INTRODUCCIN.
Tcnicas de inmovilizacin.
La inmovilizacin se define como el proceso por el cual el movimiento en el
espacio de las clulas, enzimas, orgnulos, etc. se ve restringido total o
parcialmente por medio de un soporte o una matriz. En la industria se usan
frecuentemente enzimas o clulas inmovilizadas debido a que stas se pueden
rehusar o usar en procesos continuos.
Algunas ventajas del empleo de enzimas inmovilizadas son:
Atrapamiento
Consiste en la retencin fsica de la enzima en las cavidades interiores de una
matriz slida porosa constituida generalmente por prepolmeros entrucruzables
o polmeros del tipo poliacrilamida, colgeno, alginato, carraginato o resinas de
poliuretano. El proceso de inmovilizacin se lleva a cabo mediante la
suspensin de la enzima en una solucin del monmero. Seguidamente se
inicia la polimerizacin por un cambio de temperatura o mediante la adicin de
un reactivo qumico. El atrapamiento puede ser en geles o en fibras, que suelen
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ser ms resistentes que los geles. En el primer caso, la enzima queda atrapada
en el interior de un gel, mientras que en el segundo caso la enzima se
encuentra ocluida dentro de las microcavidades de una fibra sinttica. El
atrapamiento requiere un control riguroso de las condiciones de polimerizacin,
as como la comprobacin de que la naturaleza qumica del proceso no altera
los grupos reactivos de la protena.
Unin a soportes
Son los mtodos de inmovilizacin ms utilizados y de los que se dispone de
una mayor informacin. La eleccin del soporte y del tipo de enlace resultan
determinantes en el comportamiento posterior del biocatalizador. Se debe
procurar que la inmovilizacin incremente la afinidad por el sustrato, disminuya
la inhibicin, ample el intervalo de pH ptimo y reduzca las posibles
contaminaciones microbianas. Adems el soporte debe tener resistencia
mecnica adecuada a las condiciones de operacin del reactor y ser fcilmente
separable del medio lquido para que pueda ser reutilizado. Se han utilizado
una gran variedad de materiales como soportes para la inmovilizacin de
numerosas enzimas. Estos materiales difieren en tamao, densidad, porosidad
y forma, aunque generalmente nos los encontramos en forma de cilindro, hojas,
fibras y ms corrientemente en forma de esferas. Los soportes pueden
clasificarse en dos grandes grupos:
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Adsorcin
En la adsorcin, la enzima se une a un soporte sin funcionalizar mediante
interacciones inicas, fuerzas de Van der Waals y por puentes de hidrgeno.
Unin covalente
La unin covalente de una enzima a un soporte es quiz el mtodo de
inmovilizacin ms interesante desde el punto de vista industrial. La
metodologa de la unin covalente se basa en la activacin de grupos qumicos
del soporte para que reaccionen con nuclefilos de las protenas. De entre los
20 aminocidos diferentes que se encuentran en la estructura de las enzimas,
los ms empleados para la formacin de enlaces con el soporte son
principalmente la lisina, la cistena, la tirosina y la histidina, y en menor medida
la metionina, el triptfano, la arginina y el cido asprtico y glutmico.
Reticulado
Tambin denominado entrecruzamiento o cross-linking, es una tcnica que ha
sido ampliamente utilizada en la estabilizacin de muchas enzimas (7). El
mtodo del reticulado consiste en uso de reactivos bifuncionales que originan
uniones intermoleculares entre las molculas de enzima. Como reactivos
bifuncionales se pueden emplear dialdehdos, diiminosteres, diisocianatos,
sales de bisdiazonio e, incluso, diaminas si estn activadas con carbodiimida.
El resultado del reticulado son enzimas con enlaces intermoleculares
irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de pH y temperatura.
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MATERIAL Y EQUIPO.
Materiales: Equipos:
Seccin experimental.
Parte experimental
Se debe trabajar en condiciones limpias (no es necesario trabajar en
condiciones de esterilidad).
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a) invertasa libre,
b) enzima inmovilizada (la enzima liberada) y
c) de la solucin de cloruro de calcio residual,
Sustrato: sacarosa, 30.0 g/L en buffer de acetatos 0.05M pH 5.0, para preparar las
diferentes concentraciones de sustrato.
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Diluciones de sustrato:
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Informe:
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PRCTICA 4
OBJETIVOS
INTRODUCCIN
Efectos en la estabilidad
Generalmente se observa un incremento en la estabilidad de las enzimas despus
de su inmovilizacin, que se debe principalmente a las siguientes razones:
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zona que en el medio de reaccin. En otros casos el soporte tiene un efecto
tampn o buffer de tal manera que mantiene el pH ptimo de la enzima en su
microentorno, aunque en la disolucin se produzcan cambios importantes de pH.
Por otra parte, en aquellas reacciones catalizadas por enzimas inmovilizadas en
presencia de disolventes orgnicos, la hidrofilia del soporte o su capacidad para
retener agua, regula la actividad de la enzima. Cuanto mayor es la hidrofilia del
soporte, ms agua adsorbe y la enzima poseer la cantidad necesaria de agua en
su microentorno para mantener su conformacin activa.
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3) Impedimentos estricos o de tamao de sustrato. En un principio, cualquier
enzima puede ser inmovilizada sin que haya una prdida apreciable de su
actividad. Este hecho suele ser vlido en el caso de que el sustrato sea de bajo
peso molecular, pero si se trata de sustratos con pesos moleculares elevados, la
actividad de la enzima inmovilizada disminuye drsticamente. Por ejemplo,
muchas hidrolasas unidas covalentemente a soportes slidos, a pesar de que son
muy activas frente a sustratos pequeos, muestran una actividad muy baja hacia
protenas, polisacridos y cidos nucleicos. Este efecto estrico se puede evitar
mediante una inmovilizacin covalente a travs de un brazo espaciador enzima-
soporte ms largo
MATERIALES
Materiales: Equipos:
o Esptulas de acero inoxidable. o Espectrofotmetro.
o Matraces Erlenmeyer. o Refrigerador comercial.
o Flotadores o Vrtex.
o Gradillas para microtubos o Parrillas con agitacin
o Termmetro o Pipetas de 100, 200 y 1000 L
o Tubos eppendorf 1.5 mL
PARTE EXPERIMENTAL:
Se realizar en las siguientes 3 o 4 sesiones, posteriores a la prctica 3, en al cual
se inmoviliz y se conserv la enzima libre y las perlas de alginato con la enzima
inmovilizada.
Sustrato: sacarosa, 30.0 g/L en buffer de acetatos 0.05M pH 5.0, para preparar las
diferentes concentraciones de sustrato.
Enzima: invertasa 0.8 mg/mL en regulador de acetatos 0.025M pH 5.0, e inmovilizada
(nmero de perlas necesarias para igualar la concentracin de invertasa libre)
3
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Diluciones de sustrato:
4. Los tubos sellados con pelcula plstica, se calientan a ebullicin en bao Mara
durante 5 min. Se enfran en bao de hielo, y posteriormente de adiciona 1.0 mL
de agua (en el tubo eppendorf) y posteriormente se pasa a la celda y se leen a
540 nm en un espectrofotmetro, contra cada blanco (solucin de sacarosa en
buffer de acetatos)
5. Tomar las lecturas de Abs del mtodo de azcares reductores y determinar la
concentracin de producto, utilizando la curva tipo de glucosa (se har en
laboratorio o se proporcionar en funcin del tiempo).
Comparar los resultados de la enzima libre e inmovilizada en los diferentes
tiempos con grficos y cuadros adecuados.
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ANLISIS DE RESULTADOS
5
5. Adiestramiento en la operacin de un biorreactor de laboratorio.
5.1 Manejo de un biorreactor
5.2 Preparacin y esterilizacin de medio de cultivo en el biorreactor.
5.3 Preparacin de de Inculo e inoculacin del medio en biorreactor.
MARCO TERICO.
1
Biorreactores de Mesa o Bench-Top (Biorreactores de laboratorio): Poseen
volmenes de trabajo de 0.5 a 10 L, el vaso puede ser de acero inoxidable, vidrio
o una combinacin de ambos y no son esterilizables in situ, su esterilizacin
requiere la introduccin del biorreactor dentro de una autoclave.
2.1) Agitacin.
2.2) Temperatura
2
crecer en un rango restringido de temperaturas. As los microorganismos se
pueden clasificar en funcin de la temperatura de crecimiento: los
microorganismos psicrfilos presentan un rango de temperatura de crecimiento de
5 a 15C; los mesfilos de 25 a 40C y los termfilos de 45 a 60 C, sin mebargo
se han reportado casos de crecimiento de hasta 94C.
2.3) pH
3
Para la determinacin de la concentracin de oxgeno disuelto en el caldo de
cultivo se utilizan electrodos galvanomtricos y polarogrficos que permiten
realizar lecturas de forma continua. Los impulsos elctricos generados por el
electrodo son convertidos en el mdulo de control del biorreactor en lecturas de
porcentaje de oxgeno disuelto. El mismo mdulo de control del biorreactor puede
justamente controlar la cantidad de oxgeno disuelto en el medio de cultivo por
medio de la inyeccin de aire u oxgeno o en su caso de nitrgeno gaseoso, todo
ello con la ayuda de un conjunto de electro-vlvulas. La adicin de nitrgeno
gaseoso al medio de cultivo permite disminuir la concentracin de oxgeno disuelto
ya que el nitrgeno desplaza al oxgeno disuelto. As con base a una
concentracin de oxgeno disuelto predeterminada, el mdulo de control puede
ajustar la inyeccin de aire o de nitrgeno.
EQUIPO.
-Biorreactor de laboratorio con su mdulo de control, partes y electrodos
(ya sea un biorreactor New Brunswick Scientific modelo Bioflo II de jarra
de 5 litros o un biorreactor marca Applikon de jarra de 3 litros).
DESARROLLO EXPERIMENTAL.
4
b) El profesor explicar el funcionamiento del mdulo de control del
biorreactor.
c) El profesor desmontar todas las partes del Biorreactor indicando las
medidas de cuidado que deber tenerse al manipular el biorreactor y sus
partes.
d) Los estudiantes tendrn que armar de nuevo el biorreactor y sus partes.
REPORTE DE RESULTADOS.
BIBLIOGRAFA.
Bailey, J.E. and Ollas, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, 2nd Edition,
McGraw-Hill International Editions, 1986, New York, 984 p.
Lydersen, B.K. , Delia, N.A. and Nleson, K.L. Bioprocess Engineering Systems,
equipment and facilities, John Wiley & Sons, 1994, New York, 805p.
5
5.2 Preparacin y esterilizacin de medio de cultivo y biorreactor
OBJETIVO.
Adquirir conocimientos prcticos relacionados con el proceso de esterilizacin de
medio de cultivo contenido en un biorreactor.
OBJETIVOS ESPECIFICOS:
MARCO TERICO
6
La esterilizacin y el mantenimiento de las condiciones aspticas a veces
conducen a la prdida o degradacin de los cultivos. El diseo del procedimiento
de esterilizacin depende de:
7
dependiendo de la consecuencia de una falla. Un ejemplo es la de enlatado de
alimentos, donde el criterio de esterilizacin se apoya en la tpica probabilidad de
sobrevivencia de 1x10-12 de esporas de Clostridium botulinum. Un criterio
semejante aplicado a la fermentacin se aplica para el caso de patgenos
peligrosos o ciertos productos peligrosos involucrados en tecnologa del DNA
recombinante.
b) MTODOS DE ESTERILIZACIN
1. Calor hmedo
2. Calor seco
3. Filtracin
4. Compuestos qumicos
5. Radiacin
a) Materiales
-Cajas de Petri
-Tubos de ensayo
-Vasos de precipitado de diferentes volmenes
-Barras magnticas para agitacin (mosca)
-Guantes de asbesto
-Solucin de Cloruro de Sodio al 0.09%
-Pipetas de 1 y 10 mL
-Pipetas automticas de 1 y 10 mL
-Portaobjetos y cubreobjetos.
-Medio de cultivo (ver anerxo)
b) Equipo
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-Agitador y Vortex
-Placa de agitacin magntica
-Contador de Colonias
C) Mtodo
a) Verificar que la autoclave elctrica contenga agua hasta el nivel marcado por
el tubo de vidrio que se encuentra a su costado (nivel de agua).
b) El biorreactor con todo y su contenido se introduce a la autoclave. Verificar que
la salida de aire del biorreactor est abierta, de lo contrario se corre el riesgo
de que el biorreactor o alguna de sus partes se rompan durante el proceso
de esterilizacin.
c) Cerrar la puerta de la autoclave
d) Encender la autoclave para provocar la generacin de vapor.
e) verificar que la salida de aire de la autoclave se encuentre totalmente abierta,
de esta forma, el aire contenido en la autoclave ser excluido por el vapor
que se genera.
f) Una vez que el vapor generado se escapa de forma importante por la vlvula
de salida de la autoclave, es posible cerrar sta.
g) Esperar que la presin dentro de la autoclave sea de 1.5Kg/cm 2 (indicado por
el medidor de presin)y que a la vez la temperatura sea de 121C (indicado
por el medidor de temperatura).
h) Una vez alcanzadas las condiciones de esterilizacin (1.5 kg/cm 2 y 121 C)
mantenerlas durante 15 minutos, por medio del apagado y encendido de la
autoclave.
i) Posterior al proceso de esterilizacin, esperar a que la presin y la temperatura
de la autoclave disminuyan.
j) Una vez que el medidor de presin indique una presin de 0.1Kg/cm 2 abrir
lentamente la vlvula de salida y dejar escapar el vapor que an no se ha
condensado. Evitar que la presin caiga por debajo de cero (Bajo vaco), ya
que ello provoca riesgos de contaminacin del material ya esterilizado.
k) Abrir la puerta de la autoclave y con la ayuda de guantes de asbesto sacar el
biorreactor esterilizado. Dejar enfriar el biorreactor hasta temperatura
ambiente antes de utilizarlo.
9
y duplicado en cajas de petri conteniendo agar nutritivo slido con las
diluciones 10-1 a 10-3
g) Realizar una preparacin en fresco del medio de cultivo esterilizado y
observarlo al microscopio visible.
h) Incubar las placas durante 24 -48 h a 37C
BIBLIOGRAFA
-Bailey, J.E. and Ollas, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, 2nd Edition,
McGraw-Hill International Editions, 1986, New York, 984 p.
Antes de inocular el medio cultivo (ya estril), se toman 5 mL del medio del
biorreactor; para control de esterilidad; observando al microscopio y por cuenta en
placa.
10
ANEXO
g/L
Glucosa 50
Extracto de levadura 1
KH2PO4 5
(NH4)2SO4 2
. 0.4
MgSO4 7H2O
pH Ajustar a 5
g/L
Glucosa 20
Extracto de levadura 10
Agar agar 20
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PRCTICA 6
OBJETIVO GENERAL
Adquirir conocimientos prcticos para establecer un birreactor con medio de
cultivo para un bioporoceso.
OBJETIVOS ESPECFICOS
MARCO TERICO
Medios de Cultivo
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Mtodos de Esterilizacin
1. Calor seco
2. Filtracin
3. Compuestos qumicos
4. Radiacin
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DESARROLLO EXPERIMENTAL
Materiales
- Cajas de Petri
- Tubos de ensayo
- Vasos de precipitado de diferentes volmenes
- Barras magnticas para agitacin (mosca)
- Guantes de asbesto
- Solucin de Cloruro de Sodio al 0.85%
- Pipetas de 1 y 10 mL
- Pipetas automticas de 1 y 10 mL
- Portaobjetos y cubreobjetos
- Medio de cultivo para levaduras
- Matraces de 250 mL
- Medio de cultivo para levaduras
Equipo
- Biorreactor New Brunswick Scientific modelo Bioflo II de jarra de 5 L
- Balanza analtica
- Incubadora con control de temperatura
- Autoclave elctrica de 50 L de volumen
- Campana de flujo laminar vertical
- Microscopio ptico
- Agitador Vortex
- Placa de agitacin magntica
Procedimiento
3
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d) Realizar una preparacin en fresco del medio de cultivo sin esterilizar y
una tincin de Gram y observarlo al microscopio.
4
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i) Aspticamente tomar una muestra de 1.5 mL del medio de cultivo
esterilizado y determinar no de clulas por cuenta en placa con la
muestra directa y dos diluciones, hasta 10-2; cada dilucin por
triplicado.
REPORTE DE RESULTADOS
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BIBLIOGRAFA
OBJETIVO GENERAL
Adquirir los conocimientos prcticos para producir una enzima extracelular por
medio de una fermentacin con clulas libres.
OBJETIVOS ESPECFICOS
MARCO TERICO
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En el caso de las enzimas, stas son consideradas metabolitos primarios
cuando la evolucin de su produccin guarda una relacin estrecha con el
crecimiento microbiano. Existen diversos tipos de enzimas y pueden ser
obtenidas de diferentes fuentes.
Levadura
Invertasa
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alimentos como en la industria refresquera, la de conservas, lcteos,
pastelera y confitera.
MATERIALES
EQUIPO
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MTODOLOGA
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De acuerdo al programa de muestreo, se ir llenando la Hoja de control de
la cintica de produccin de enzima con clulas libres (se anexa al final
de la prctica), con los datos de los parmetros establecidos.
Metodologas
Al final de la fermentacin:
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REPORTE DE RESULTADOS
BIBLIOGRAFA
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Doran, P.M. Bioprocess Engineering Principles, Academic Press, 1995, San
Diego, 439p.
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CONDICIONES
Aireacin (vvm)
Agitacin (rpm)
Fecha y hora de inicio:
Fecha y hora de trmino:
Charola
Bradford
Tiempo Pureza de Charola con DO No de DNS (DO) se
Muestra T ( C) pH (DO) de Observaciones
(h) Cultivo (+,-) (g) Muestra PS (600 nm) Cel/mL sobrenadante
sobrenadante
(g)
T0
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
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PRCTICA 7
Especficos:
- El alumno disear y construir un biorreactor nivel laboratorio para la
produccin de enzimas a partir de levadura en estado libre e
inmovilizado.
- El alumno inmovilizar clulas de S. cerevisiae en alginato de sodio.
- El alumno preparar el medio de cultivo para el crecimiento de la
levadura y la produccin de la enzima.
- El alumno llevar a cabo el seguimiento de la cintica de crecimiento de
la levadura en estado libre e inmovilizado.
- El alumno monitorear la produccin de protena en las clulas (en
estado libre e inmovilizado) durante el tiempo de proceso.
- El alumno determinar la actividad enzimtica y la actividad enzimtica
especifica de la invertasa producida por las clulas en estado libre e
inmovilizado.
MARCO TERICO
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Los procesos biotecnolgicos pueden ser sustancialmente optimizados
utilizando microorganismos inmovilizados en comparacin con los procesos
que utilizan clulas libres.
- Adsorcin.
Las clulas pueden anclarse naturalmente a una superficie, las clulas se
anclan al soporte por atracciones electrostticas (fuerzas de Van der Walls,
inicas y de puentes de hidrgeno). El crecimiento produce una biopelcula en
la superficie del soporte y las limitaciones de transferencia de masa tienen
lugar dentro de esta biopelcula.
Los soportes incluyen trozos de madera, arena, resinas de intercambio
inico y materiales orgnicos corno la celulosa y carbn activado.
- Enlace covalente.
En este tipo de inmovilizacin el fuerte enlace de la clula-soporte reduce la
prdida celular. La unin directa de las clulas a un soporte activado es posible
por la modificacin qumica de la matriz por medio de la utilizacin de sustancias
que sirvan de puente de unin qumica. El glutaraldehdo es usado para tal fin, sin
embargo, el riesgo del dao celular, debido a los enlaces covalentes alrededor de
la membrana celular, puede ser una limitante.
2
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- Micro-encapsulacin.
La micro-encapsulacin se usa en el rea farmacutica o en el campo de
medicina para produccin de frmacos e inmovilizacin de enzimas. Una
microcpsula consiste en una semi-membrana permeable, esfrica, delgada y
fuerte que rodea un centro liquido, con un dimetro que varia de unas mieras a
1mm. La membrana sin/e como una barrera semipermeable permitiendo la
entrada ce sustrato y la salida de metabolitos, pero no permite el paso de clulas.
- Atrapamiento o inclusin.
De entre los mtodos de inmovilizacin de clulas, el mtodo de inclusin celular
ha mostrado ser el que permite un mejor control de la inmovilizacin y es el que
preserva mejor las funciones celulares. Este mtodo consiste en atrapar las
clulas en una red tridimensional rgida de hidrogel; los soportes de
inmovilizacin pueden ser sintticos (por ejemplo la poliacrilamida, el
poliuretano) o naturales, (por ejemplo el agar, la gelatina, el alginato y la
carragenina). Una de las caractersticas particulares del mtodo de inclusin
o atrapamiento celular est relacionada con las condiciones de
gelificacin del soporte y la reversibilidad del proceso de gelificacin. La
gelificacin se realiza por cambios en la temperatura o por la presencia de
iones. Adems, la gelificacin es reversible, as, bajo ciertas condiciones
fsicas se cuenta con una suspensin celular que puede ser gelificada,
quedando las clulas atrapadas; posteriormente se puede volver a liberar las
clulas aumentando la temperatura o retirando los iones. Uno de ios materiales
ms empleados para realizar la inmovilizacin por inclusin celular es la K-
carragenina.
a) Kapa-carragenina.
La K-carragenina es un polisacrido no txico, de fcil adquisicin, aislado a partir
de algas marinas. Es ampliamente usado en las industrias cosmtica y alimentaria
como agente gelificante, espesante y estabilizante. Es un polmero, el cual esta
constituido por una estructura unitaria de sulfato de -D galactosa y 3,6-anhidro--D-
galactosa.
La K-carragenina gelifica al enfriarse o al contacto con una solucin de algn
agente inductor del gel, tales corno iones potasio o calcio.
Una ventaja al emplear K-carragenina es, que la inmovilizacin puede efectuarse
bajo condiciones muy suaves, sin el uso de qumicos que puedan inhibir la
actividad enzimtica de las clulas.
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Salida de aire
Alimentacin
Clulas
inmovilizadas
Aspersor de aire
Productos
A B
Productos Productos
Clulas
inmovilizadas
Alimentacin
Alimentacin
C D
Probetas. Micropipetas
Termmetro Encendedor
Autoclave Portaobjetos
Bao Mara Puntas para micropipetas
Potencimetro. Tiras de medicin de pH
Microscopio ptico Charolas de aluminio secas
Centrfuga Soluciones para realizar tincin de
Balanza analtica Gram
Espectrofotmetro UV-VIS o Cristal Violeta
Campana de flujo laminar o Lugol
Tubos Falcn o Alcohol-cetona
Tubos Eppendorf estriles (150 o Safranina
aprox.) Reactivo DNS
Portaobjetos Reactivo de Bradford
Asa bacteriolgica Solucin de sacarosa al 30%
Lmpara de alcohol Agua destilada
Mechero de Bunsen Buffer pH 4
Buffer pH 7
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Aceite de inmersin Jeringa de 10 ml con punta roma
Solucin de anthrona Manguera de silicn de 2 mm de
Alcohol al 70 % dimetro para bomba peristltica
Solucin de sacarosa Agar nutritivo.
Pinzas Parrilla de agitacin y
Charolas de aluminio calentamiento
Bao de hielo Soporte Universal
Sacarosa Solucin estril de cloruro de calcio
Extracto de levadura al 1%.
Vasos de precipitado de diferentes Solucin de alginato al 2%
volmenes Pipetas de 1 y 10 mL
Barras magnticas para agitacin 1 colador de cocina metlico
(mosca)
Primera parte:
Cada equipo debe disear un reactor, considerando material que sea factible de
conseguir, que est en el laboratorio o bien matraces, frascos de vidrio, probetas,
tubera etc. El reactor diseado deber garantizar la esterilidad del cultivo, adems de
proveer un sistema de agitacin homogneo, ya sea por medio de inyeccin de aire o
con barras magnticas. El volumen total de operacin del reactor no deber ser mayor
a 1 L.
Preparar medio de cultivo agar nutritivo (el volumen depender del tamao del reactor
diseado) y colocarlo en el reactor. Cerrar el reactor y someterlo a esterilizacin en
autoclave, a 125 C por 15 minutos. Posteriormente verificar que no se halla daado el
rector o sus partes durante el proceso y dejar funcionando durante 24 h. Al da
siguiente, comprobar por medio de turbidez y cuenta en placa que no haya crecimiento
en el reactor.
Segunda parte
Ajustar el pH a 5 con H2SO4 y NaOH 0.1 N, esterilizar a 120 oC y 1.5 Kg/cm2 durante
15 minutos.
Inmovilizacin de clulas.
Una vez obtenidas la clulas inmovilizadas montar los dos reactores diseados, uno
para clulas libres (inocularlo al 10 %) y otro para inmovilizadas. Tener listo la cantidad
de medio de cultivo estril necesario para los reactores, tener preparado ms de lo
necesario para el caso de cualquier contingencia y los blancos.
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La cintica se seguir por 24 h, tomando 5 o 6 mL de medio en cada tiempo para
anlisis; Monitoreando los siguientes parmetros en el sobrenadante:
*Cuenta en placa se realizar al inicio, tiempo cero, un tiempo intermedio y tiempo final,
por triplicado y tres diluciones, en medio para levaduras con 15 g/L de agar, inoculando
con 0.1 mL de la dilucin correspondiente (10 0 a 10-9 y extendiendo con varilla en L.
(Se requieren de 54 cajas por equipo, puntas estriles de 1000 y 100 L, para las
diluciones: 30 tubos eppendorf estriles, solucin isotnica estril)
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BIBLIOGRAFA
- Aehle, W. (2007). Enzymes in Industry - Production and Applications (Tercera edicin ed.).
Leiden: Wiley-VCH.
- Adrio, J. L., & Demian, A. L. (2005). Microbial Cells and Enzymes: A Century of Progress. En J.
Barredo (Ed.), Microbial Enzymes and Biotransformations (Vol. 17, pgs. 1-18). Totowa, New
Jersey, United States of America: Humana Press.
- Knauf, M., & Kraus, K. (2007). Specific yeasts developed for modern ethanol production. Sugar
Industry , 131 (11), 753-757.
- Lden, G. (2002). Undestanding the bioreactor. Bioprocess and Biosystems Engineering , 24 (5),
273-279.
- Manchester, K. L. (1995). Louis Pasteur (18221895) chance and the prepared mind. Trends
in Biotechnology , 13 (12), 511-515.
- Stroh, W. (1998). Industrial enzymes market: growth experienced from new products and
movement into global market. Genetic Engineering News , 18, 11-38.
- Prescott L., Harley J. y Klein D. (2004). Microbiologa (Quinta edicin ed.). Madrid, Espaa: Mc
Graw Hill. 1240 pgs.
- White, M. D.; Glick, B. R.; Robinson, C. W. Bacterial, yeast, and fungal cultures. Effects of
microorganism type and culture characteristics on bioreactor design and operation. In Bioreactor
System Design; 1995; pp 47-87.