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MAPA/SDA/CGAL Laboratório Nacional Agropecuário - LANAGRO/RS Laboratório de Produtos de Origem Animal Método de Ensaio

MAPA/SDA/CGAL Laboratório Nacional Agropecuário - LANAGRO/RS Laboratório de Produtos de Origem Animal Método de Ensaio - MET

Código: MET POA/11/02/01 Página 1 de 8 Emissão: 28/11/2013

Determinação de Nitrogênio Total em Leite e derivados Lácteos pelo método de Micro-Kjedahl

1 Escopo

Este MET tem como objetivo determinar os procedimentos para o ensaio “Determinação de

Nitrogênio Total em Leite e Derivados Lácteos utilizando o método de Micro-Kjedahl”.

É aplicável para:

a) leite fluido in natura ou nas apresentações integrais, semidesnatadas e desnatadas, tratadas

integrais, semidesnatadas e desnatadas, tratadas por processos de UHT ou pasteurização; b) derivados

por processos de UHT ou pasteurização;

b) derivados lácteos desidratados (leite em pó, caseína, caseinatos e soro);

c) queijos;

d) creme e doce de leite;

e) bebidas lácteas e leite fermentado.

2 Fundamentos

A

fração nitrogenada do leite possui nitrogênio de duas fontes: (1) protéico, da caseína e das

proteínas do soro e, (2) nitrogênio não protéico – NNP. A caseína é o principal componente da

fração protéica do leite perfazendo cerca de 80% do total das proteínas presentes no produto. Ela

encontra-se na forma de um complexo, o fosfocaseinato de cálcio. Outros componentes protéicos

encontrados no leite são as proteínas do soro lácteo que constituem cerca de 20% da fração

do soro lácteo que constituem cerca de 20% da fração protéica do leite e, portanto, juntamente

protéica do leite e, portanto, juntamente com a caseína perfazem praticamente o total das proteínas

presentes no leite. Entre as proteínas do leite encontra-se número bastante elevado de enzimas

(fosfatase, lactoperoxidase, catalase, etc.), muitos dos quais tem notável importância na

industrialização do leite e seus derivados. Os compostos nitrogenados presentes na fração de NNP

Os compostos nitrogenados presentes na fração de NNP são basicamente produtos finais do metabolismo do

são basicamente produtos finais do metabolismo do nitrogênio e representam de 5 a 6% do

nitrogênio total. Entre estes compostos estão uréia, peptídios, aminoácidos, ácido úrico, creatina e

creatinina.

A

proteína do leite é comumente expressa como proteína total ou proteína bruta e sob o ponto

de vista analítico, corresponde ao teor percentual de nitrogênio total (NT) multiplicado pelo fator de

de nitrogênio total (NT) multiplicado pelo fator de conversão 6,38 conseqüente do teor médio de 15,67%

conversão 6,38 conseqüente do teor médio de 15,67% de nitrogênio nas proteínas do leite.

O método de Kjeldahl baseia-se na transformação do nitrogênio da amostra em sulfato de

amônio através da digestão com ácido sulfúrico e posterior destilação com liberação da amônia,

que é fixada em solução ácida e titulada.

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Determinação de Nitrogênio Total em Leite e derivados Lácteos pelo método de Micro-Kjedahl

Este método é dividido em três etapas principais: a digestão, destilação e titulação.

a) Digestão: nesta etapa ocorre o aquecimento da amostra com ácido sulfúrico concentrado até

que o carbono e hidrogênio sejam oxidados. Com a finalidade de aumentar a temperatura de

2

+ H O + (NH ) SO 2 4 2 4
+
H O
+
(NH ) SO
2
4
2
4

ebulição do ácido e aumentar a velocidade de oxidação da matéria orgânica é adicionada à

reação uma mistura catalítica.

Durante a digestão, o carbono é transformado em dióxido de carbono (CO 2 ) e o hidrogênio em

água (H 2 O). O nitrogênio da proteína é reduzido e transformado em sulfato de amônio, conforme

reação abaixo:

H SO

2

4

Matéria orgânica

SO

3

+

SO

2

+

CO

b) Destilação: o objetivo desta etapa é transformar o nitrogênio presente na solução na forma de

Na SO + 2NH 2 4 3
Na SO
+
2NH
2
4
3

NH H BO

4

2

3

sulfato de amônio (NH 4 +) para NH 3 gasoso. Com adição de NaOH concentrado e aquecimento,

ocorre a liberação da amônia que é separada da mistura por destilação. O gás então reage com

+

H

2

0

uma solução de ácido bórico, formando borato de amônio.

(NH ) SO

4

2

+

2NaOH

4 NH + H BO 3 3 3
4
NH
+
H BO
3
3
3

+

H SO

2

4

2NH H BO

2

3

4
4

Quanto maior o volume de ácido sulfúrico gasto na titulação, maior a quantidade de nitrogênio

c) Titulação: a etapa final consiste na titulação do borato de amônio com uma solução de ácido

sulfúrico padronizada.

(NH 4) SO

2

4

+ 2H BO

3

3

presente na amostra.

3

Reagentes, padrões e materiais

3.1 Reagentes:

1)

2)

Ácido sulfúrico (H 2 SO 4 ) p.a.;

Indicador misto: pesar cerca de 0,132 g de vermelho de metila (C 15 H 15 N 3 O 2 ) e cerca de 0,06

g de verde de bromo cresol (C 21 H 14 Br 4 O 5 S). Dissolver em aproximadamente 200 mL de

solução de álcool etílico a 70 % (v/v). Filtrar se necessário e guardar em frasco âmbar. O

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indicador misto pode ser incorporado à solução de ácido bórico a 4 % na proporção de 8 mL

por litro;

Mistura catalítica:

a) Sulfato de potássio (K 2 SO 4 ) p.a., sulfato de sódio anidro (Na 2 SO 4 ) p.a. ou bissulfato de

potássio (KHSO 4 ) p.a.;

b)

Misturar (a) e (b) na proporção de (10+1), triturando em gral de porcelana até obter um pó

fino.

Solução de ácido bórico (H 3 BO 3 ) a 4 % (m/v): pesar cerca de 4 g de ácido bórico p.a.,

3)

) a 4 % (m/v): pesar cerca de 4 g de ácido bórico p.a., 3) Sulfato

Sulfato de cobre penta hidratado (CuSO 4 .5H 2 O) p.a.;

4)

5)

transferir para um béquer de 250 mL, adicionar aproximadamente 80 mL de água e aquecer

sob agitação branda até dissolução. Resfriar, transferir para balão volumétrico de 100 mL e

completar com água. Filtrar se necessário;

Solução de hidróxido de sódio (NaOH) a 50 % (m/v);

6)

7)

Solução padrão de ácido sulfúrico (H 2 SO 4 ) 0,1 N ou solução padrão de ácido clorídrico (HCl)

0,1 N;

Zinco metálico granulado;

Anti-espumante (talco, parafina ou silicone).

8)

9)

Anti-espumante (talco, parafina ou silicone). 8) 9) 3.2 Materiais 1) 2) 3) 4) 5) 6) 7)

3.2 Materiais

1)

2)

3)

4)

5)

6)

7)

8)

9)

Tubo de Kjeldahl de 100 mL;

Béquer de 250 mL;

Buretas de 25 ou 50 mL;

Frasco de Erlenmeyer de 125 ou 250 mL;

Frasco de Erlenmeyer de 125 ou 250 mL; Espátula;

Espátula;

Papel de pesagem (papel vegetal livre de nitrogênio);

Pipeta graduada de 1 e 10 mL ou material volumétrico similar;

graduada de 1 e 10 mL ou material volumétrico similar; Provetas de 50 mL ou material

Provetas de 50 mL ou material volumétrico similar;

Tenaz metálica.

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4 Equipamentos

1)

Bloco digestor e destilador micro-Kjeldahl;

2)

Balança analítica.

e destilador micro-Kjeldahl; 2) Balança analítica. 5 Precauções analíticas 1) Verificar as condições do

5 Precauções analíticas

1)

Verificar as condições do aparelho de destilação com solução padrão de sulfato de amônio

((NH 4 ) 2 SO 4 ) p.a., cuja recuperação deve ser no mínimo 99,5 % em nitrogênio.

2)

3) Para a pesagem de algumas amostras, como por exemplo, doce de leite, é necessário

utilizar papel livre de nitrogênio.

Como ocorre o desprendimento de vapores irritantes pelo aquecimento do ácido, realizar a

4)

Para produtos muito gordurosos, digerir a amostra com adição de um anti-espumante.

digerir a amostra com adição de um anti-espumante. etapa de digestão da amostra dentro de uma

etapa de digestão da amostra dentro de uma capela de exaustão.

6 Procedimentos

O método é usualmente classificado em macro, semi-micro e micro Kjeldahl conforme a

quantidade absoluta de proteína na amostra que vai sofrer digestão. No laboratório utiliza-se o

transferir para tubo de Kjeldahl;
transferir para tubo de Kjeldahl;

procedimento micro-Kjeldahl e realiza a determinação em duplicata.

6.1 Método micro Kjeldahl

6.1.1 Digestão ou mineralização:

1)

2)

3)

Pesar em balança analítica exatamente a quantidade de amostra de acordo com a tabela I e

Adicionar cerca de 2,5 g de mistura catalítica e 7 mL de ácido sulfúrico p.a.;

Aquecer o tubo em bloco digestor da seguinte forma: no caso de amostras líquidas, aquecer,

a princípio lentamente (iniciar com temperatura em torno de 120ºC por cerca de 30 minutos);

logo após, aumentar para 250ºC (em torno de 30 minutos) elevando gradativamente para

450ºC até que o líquido se torne límpido e transparente, de tonalidade azul-esverdeada.

Para amostras com baixa umidade (ex. leite em pó), o aquecimento é iniciado a 250ºC (em

torno de 30 minutos) e elevar a 450ºC da mesma forma descrita para amostras líquidas.

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Tabela I – Quantidades necessárias para o ensaio “Determinação de Nitrogênio Total em Leite e

Derivados Lácteos”

Item de ensaio Quantidade de amostra (g) Leite fluido e bebida láctea 1,5-2,0 Leite em
Item de ensaio
Quantidade de amostra (g)
Leite fluido e bebida láctea
1,5-2,0
Leite em pó, caseína, caseinatos, soro
0,25-0,3
desidratado, queijo e doce de leite
Creme de Leite
1,0
Leite fermentado
1,5
6.1.2
Destilação:
1)
Acoplar ao destilador um erlenmeyer contendo cerca de 20 mL de solução de ácido bórico a
4 % com 4 ou 5 gotas de solução de indicador misto (erlenmeyer receptor do destilado);
2)
Adaptar o tubo de Kjeldahl ao destilador e adicionar a solução de hidróxido de sódio a 50 %
até que a mesma se torne negra (cerca de 20 mL);

3)

Proceder à destilação. Recolher o volume necessário para a completa destilação da amônia

o volume necessário para a completa destilação da amônia (aproximadamente 75 mL). A solução coletora é

(aproximadamente 75 mL). A solução coletora é mantida fria durante a destilação.

6.1.3 Titulação:

Titular com solução de ácido sulfúrico 0,1 N ou solução de ácido clorídrico 0,1 N até a viragem

do indicador (coloração verde à leve tom róseo - avermelhado).

(coloração verde à leve tom róseo - avermelhado). 6.2 Verificação do destilador através da avaliação de

6.2 Verificação do destilador através da avaliação de recuperação de nitrogênio na

destilação

Realizar a verificação das condições do aparelho de destilação com solução padrão de um sal

de amônio, cuja recuperação deve ser no mínimo 99,5% em nitrogênio conforme procedimento

descrito na IU do destilador.

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7 Resultados

Os dados brutos obtidos na determinação do nitrogênio total são registrados em formulários

específicos descritos no POP POA/06 Controle de Itens de Ensaio Leite e Derivados Lácteos e

inseridos em planilhas eletrônicas conforme IT POA/04 para que os resultados sejam calculados

automaticamente.

V x N x 0,014 x100 m
V x N x 0,014 x100
m

O cálculo é obtido através da seguinte fórmula

% nitrogênio total =

Onde,

V

= volume da solução de ácido sulfúrico 0,1 N, ou solução de ácido clorídrico 0,1 N, gasto na

titulação após a correção do branco, em mL;

N;

N

= normalidade teórica da solução de ácido sulfúrico 0,1 N ou solução de ácido clorídrico 0,1

f = fator de correção da solução de ácido sulfúrico 0,1 N ou solução de ácido clorídrico 0,1 N;

m

O

= massa da amostra, em gramas.

método de Kjeldahl quantifica o nitrogênio total da amostra. Para que seja obtido o teor em

nitrogênio total da amostra. Para que seja obtido o teor em proteínas, aplica-se um fator, chamado

proteínas, aplica-se um fator, chamado “fator de conversão Kjeldahl”.

% protéidios = % nitrogênio total F

F = fator de conversão da relação nitrogênio/proteína, F = 6,38.

de conversão da relação nitrogênio/proteína, F = 6,38. Como a determinação é feita em duplicata, expressar

Como a determinação é feita em duplicata, expressar o resultado da média (teor de proteínas

%) com uma casa decimal.

7.1 Critérios para a repetição do ensaio:

1)

Se a diferença entre as duplicatas for maior do que 3% repetir a determinação de nitrogênio

com uma nova alíquota da amostra.

2) Outro critério considerado em conta numa eventual repetição do ensaio é o fechamento

centesimal dos componentes do leite. A soma dos teores de açúcares (lactose), proteínas e

cinzas (resíduo mineral fixo) deve ser próximo ao ESD: quando a diferença entre estes

resultados for superior a 5%, a determinação dos glicídios redutores em lactose é repetida

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para confirmação, se possível em nova embalagem. Se confirmar o resultado, repetir então o

EST, a gordura, a proteína e cinzas.

8 Arquivamento dos registros

gordura, a proteína e cinzas. 8 Arquivamento dos registros Os formulários utilizados nesta metodologia são arquivados

Os formulários utilizados nesta metodologia são arquivados conforme procedimento descrito no

POP POA/06 – Controle de Itens de ensaio Leite e Derivados Lácteos e IT POA/04 – Uso de

Planilha Eletrônica na Revisão de Cálculos de Dados Brutos nas Análises de Leite, Derivados

Lácteos, Água e Mel.

9 Referências

BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Regulamentos Técnicos de

Identidade e Qualidade dos Produtos Lácteos. Portaria 146, 07/03/96. Brasília: Ministério da

Agricultura, 1996.

BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Regulamento Técnico para

Fixação de Identidade e Qualidade de Doce de Leite. Portaria 354, 04/09/97. Brasília: Ministério

da Agricultura, 1997.

BRASIL. Ministério da Agricultura. Secretaria de Defesa Agropecuária. "Padrões de Identidade

de Defesa Agropecuária. "Padrões de Identidade e Qualidade (PIQ) de Leites Fermentados". Resolução

e Qualidade (PIQ) de Leites Fermentados". Resolução 5, 13/11/00. Brasília: Ministério da

Agricultura, 2000.

BRASIL. Ministério da Agricultura. Regulamentos Técnicos de Produção, Identidade e

Qualidade do Leite. Instrução Normativa 51, 18/09/02. Brasília: Ministério da Agricultura, 2002.

BRASIL. Ministério da Agricultura. Secretaria de Defesa Agropecuária. Regulamento Técnico

de Identidade e Qualidade de Leite de Cabra. Instrução Normativa 37, 31/10/00. Brasília:

Ministério da Agricultura, 2000.

BRASIL. Ministério da Agricultura. Secretaria de Defesa Agropecuária. Métodos Analíticos

Físico-Químicos para Controle de Leite e Produtos Lácteos. Instrução Normativa 68, 12/12/06.

Brasília: Ministério da Agricultura, 2006.

10 Anexos

Não aplicável.

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11 Alterações

Alteração da formatação dos marcadores nos itens 3, 4 e 5.

Excluído a letra “c” do item 7.1 (critérios para a repetição do ensaio) da versão anterior por não

ter relação com o procedimento descrito neste documento.

pois os mesmos podem sofrer alterações na vigência deste documento. Pequenas alterações no texto para
pois os mesmos podem sofrer alterações na vigência deste documento.
Pequenas alterações no texto para facilitar a compreensão do MET.
12 Responsabilidades
sendo corretamente seguido.
Elaboração/Revisão:
Aprovação:
Verificação:
Rita Beatriz Andrade - POA
Tiago Charão de Oliveira - POA
Juliana Nichele Kich - UGQ
Data: 27/11/2013
Data: 28/11/2013
Data: 28/11/2013

Excluído o anexo A da versão anterior que apresentava os valores estabelecidos na legislação,

É de responsabilidade do RT ou seu substituto do POA assegurar que os analistas que

utilizarem este MET tenham sido treinados e capacitados para sua execução e o mesmo esteja

que os analistas que utilizarem este MET tenham sido treinados e capacitados para sua execução e