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Universidade Estadual do Rio Grande do Sul

Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia - Novo Hamburgo


Enzimologia Aplicada - 2017/2
Profas:.Dra. Lcia A.S. Ries e Dra. Lilian Raquel Hickert
Graduanda: Vanessa Kristine de Oliveira Schmidt
18/10/17

ATIVIDADE PRTICA:

Determinao da Atividade Lipoltica de Lipases Microbianas

1. Definio de Lipase: As Lipases so enzimas pertencentes famlia das


hidrolases (glicerol ster hidrolases E.C.3.1.1.3) que tem como funo biolgica
primordial catalisar a hidrlise de leos e gorduras liberando cidos graxos,
diacilgliceris, monoacilgliceris e glicerol. As caractersticas nicas das lipases
incluem a especificidade de substrato, habilidade de catalisar reaes
heterogneas na interface de sistemas solveis e insolveis em gua,
estereoespecificidade e a regioespecificidade. Em ambientes aquo-restritos
podem catalisar diversas outras reaes como esterificao, transesterificao
e interesterificao, entre outros processos como aminlise e lactonizao.

2. Principais fontes de Lipases: As lipases so amplamente encontradas na


natureza, podendo ser obtidas a partir de fontes animais, vegetais e
microbianas. Entretanto, somente as lipases microbianas so comercialmente
utilizadas. As lipases microbianas constituem um importante grupo de enzimas,
devido versatilidade de suas propriedades e fcil produo em massa. As
lipases microbianas so amplamente diversificadas em suas propriedades
enzimticas e especificidade do substrato, o que as torna muito atrativas para a
aplicao industrial.

3. Principais mtodos de produo: As lipases podem ser produzidas por


diversos microrganismos por fermentao em estado slido ou semi-slido
(FES) ou por fermentao submersa (FS). A FS a fermentao onde as
lipases tm sido produzidas tradicionalmente. Apesar de ter um elevado custo
de processo industrial, neste tipo de fermentao a recuperao de enzimas
extracelulares e a determinao de biomassa so facilitadas, sendo realizadas
por filtrao simples para a remoo das clulas. O sobrenadante do meio de
cultura utilizado para os estudos enzimticos e o crescimento microbiano
quantificado aps secagem da biomassa, por gravimetria. A homogeneidade do
sistema possibilita transferncia de calor mais eficiente e a facilita controlar
parmetros como pH, temperatura e oxigenao.
A FES consiste num sistema onde o teor de gua restrito. Mesmo
apresentando baixo custo por reutilizarem resduos agroindustriais que
viabilizam o processo de obteno da enzima, a produo de lipases em meio
slido no tem sido comumente utilizada, devido ao baixo rendimento
observado neste tipo de fermentao, que tem sido relacionado produo
simultnea de enzimas proteolticas, limitao de transferncia de massa e
monitoramento de cultivo.

4. Principais aplicaes: Podem ser utilizadas na modificao de leos e


gorduras, na formulao de detergentes, na indstria farmacutica, na
fabricao de alimentos, na produo de biodiesel, nos curtumes, no
tratamento de efluentes, dentre outras aplicaes. No entanto, as enzimas
devem apresentar caractersticas cinticas adequadas ao processo industrial
no qual ser aplicada.

5. Principais reaes que as Lipases catalisam:


6. Principais mtodos empregados na determinao da atividade cataltica
lipolitica e em que esto baseados: So divididos em dois grupos: Mtodos
que avaliam o aparecimento dos produtos da reao de hidrolise e mtodos
que avaliam o desaparecimento do substrato (fsico-qumicos).
A atividade lipoltica determinada pela quantificao dos cidos graxos
liberados durante a hidrlise mediada pela enzima lipase, esses mtodos so
empregados para determinar os produtos de reaes catalisadas.

Desaparecimento do substrato Aparecimento dos produtos (hidrlise)


Ensaios indiretos da liberao de prtons como
Turbidimetria e Nefelometria indicadores coloridos e titulometria.
Anlise de cidos graxos liberados a partir de
steres carboxlicos derivados do glicerol com
Tensiometria interfacial ensaios colorimtricos, uorimtricos, microscopia
eletrnica, cromatogrficos e enzimticos.
Anlise de cidos graxos liberados a partir de
Microscopia de fora atmica steres carboxlicos sintticos com ensaios
radioativos, colorimtricos, uorimtricos.
Espectroscopia de infravermelho Mtodos imunolgicos

Dentre os vrios mtodos disponveis para acompanhar a atividade da lipase


presente no meio fermentativo, os mais utilizados so os colorimtricos e o
titulomtricos que usa a triolena (leo de oliva) como substrato padro.
7. Fundamentao terica e procedimento experimental empregado: A
produo de lipase necessariamente afetada pela fonte de carbono no meio.
Como substrato para a produo de lipase e crescimento microbiano, as fontes
de carbono mais usuais so os carboidratos, os cidos orgnicos, os gliceris,
outros lcoois e cidos graxos. Meios de cultura lquidos suplementados com
concentraes fixas de vrios compostos lipdicos (leo de oliva, acido oleico,
tribitirina e leo de soja), o que sugere que a enzima seja induzida por esses
substratos.
Quando o leo de oliva a nica fonte de carbono, o microrganismo
utiliza-o de modo sequencial. Inicialmente o leo de oliva hidrolisado por uma
pequena quantidade de lipase proveniente do prprio inoculo do microrganismo
em glicerol e cidos graxos livres. Em seguida o microrganismo consome o
glicerol liberado, ainda sem a produo de lipase. Finalmente, os cidos graxos
livres so consumidos com a induo da produo de uma quantidade
significativa de lipases. Estudos mostram que o leo de oliva eficiente como
substrato padro para a determinao da atividade lipoltica, sendo o cido
oleico contido o principal indutor.

Objetivo: Determinar a atividade cataltica de lipase intracelular produzida


atravs de fermentao submersa do fungo filamentoso Rhizopus oryzae,
empregando o mtodo da hidrlise, conforme metodologia modificada por
Soareset.al.(1999).

Procedimento experimental: Em erlenmeyer de 125 mL adicionou-se 5 mL de


da suspenso do substrato 1,4 mL da soluo tampo de fosfato de sdio pH
6,82 e 0,5 g de clulas ntegras imobilizadas com lipase microbiana (massa
seca). Manteve-se os erlenmeyers por 30 minutos a 37C, em banho
termostatizado, agitando os sistemas periodicamente. Aps incubao,
paralisou-se a reao pela adio de 10 mL de soluo de parada 3. Titulou-se
em triplicata os cidos graxos liberados com soluo de KOH 0,025 mol.L-1,
empregando fenolftalena como indicador.
8. Clculo e expresso do resultado:
A atividade enzimtica calculada pela seguinte equao:

[( ). . 106 ]
= ( )
(. ) (1)

Dados:

m1 0,5001
Massa (g) m2 0,5021
m3 0,5009
VA1 35,75
VA (mL) VA2 31,50
VA3 26,10
VB (mL) VB 12,10
Tempo (min) t 30
M (mol/L) M 0,0212

Substituindo os valores experimentais na equao (1), obtemos a


atividade lipoltica para a cada amostra (triplicata). A unidade de atividade
definida como quantidade de enzima que libera 1 .mol/g.min ou U/g.

Atividade lipoltica 1(U/g) 33,4186


Atividade lipoltica 2(U/g) 27,3039
Atividade lipoltica 3(U/g) 19,7511

Os resultados da atividade lipoltica indicam que a amostra (1) = 33,4186


U/g obteve maior atividade enzimtica. As possveis causas da variao ou
diferenciao das atividades obtidas so: erros na realizao do procedimento,
pesagem, contaminantes no meio, cansao visual do manipulador entre outros.
possvel afirmar que o mtodo titulomtrico de determinao da atividade
lipoltica utilizando o leo de oliva como substrato mostrou-se eficiente e
aplicvel.