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4
AJUSTE DE UN MODELO MATEMTICO PARA EL CRECIMIENTO DE
STREPTOCOCCUS PYOGENES EN 2 SUSTRATOS PARA LA PRODUCCIN
DE CIDO HIALURNICO A ESCALA DE LABORATORIO
Directora
ADRIANA INS PAEZ MORALES
Microbiloga Industrial
5
Nota de aceptacin
_____________________________
_____________________________
_____________________________
_____________________________
_____________________________
_____________________________
______________________________
Firma del presidente del jurado
______________________________
Firma del jurado
______________________________
Firma del jurado
6
DIRECTIVAS DE LA UNIVERSIDAD
7
Las directivas de la Universidad de Amrica, los jurados calificadores y el cuerpo
docente no son responsables por los criterios e ideas expuestas en el presente
documento. Estos corresponden nicamente a los autores.
8
CONTENIDO
pg.
INTRODUCCIN 24
OBJETIVOS 25
1. GENERALIDADES 26
1.1 CIDO HIALURNICO 26
1.1.1 Estructura del cido hialurnico 27
1.1.2 Propiedades reolgicas del cido hialurnico 27
1.1.3 Propiedades fsico qumicas del cido hialurnico 28
1.2 COMERCIALIZACION 30
1.3 APLICACIONES DEL CIDO HIALURNICO 32
1.3.1 Diagnstico y medicamento 32
1.3.2 Ortopedia 33
1.3.3 Dermatologa y cosmtica 33
1.3.4 Oftalmologa 34
1.4 PRODUCCIN DE CIDO HIALURNICO POR VA QUMICA 34
1.5 PRODUCCIN DE CIDO HIALURNICO POR VA BIOTECNOLGICA 36
1.5.1 Microorganismos 36
1.5.1.1 Streptococcus zooepidemicus 36
1.5.1.2 Streptococcus equi 37
1.5.1.3 Streptococcus pyogenes 37
1.5.1.4 Bacillus subtilis 38
1.5.1.5 Streptococcus dysgalactiae 38
1.5.2 Metabolismo 38
1.5.3 Sustratos empleados 39
1.5.3.1 Sustratos definidos 40
1.5.3.2 Sustratos complejos 40
1.5.4 Caractersticas de operacin 41
1.5.4.1 Tiempo 41
1.5.4.2 pH 41
1.5.4.3 Temperatura 41
1.5.4.4 Agitacin 41
1.5.4.5 Aireacin 42
1.5.4.6 Volumen 42
1.6 METODOS DE PURIFICACION 42
1.7 PARMETROS CINTICOS 44
1.7.1 Crecimiento microbiano 44
1.7.2 Consumo de sustrato 46
1.7.3 Produccin metabolito 48
9
1.7.4 Rendimientos 49
2. MATERIALES Y METODOS 50
2.1 TIPO DE INVESTIGACION 50
2.2 MATERIALES Y EQUIPOS 50
2.2.1 Materiales 50
2.2.2 Equipos 54
2.3 MATERIAS PRIMAS 55
2.3.1 Cepa Bacteriana 55
2.3.2 Medios de cultivo 56
2.4 REACTIVOS 56
2.5 TECNICAS DE RECONOCIMIENTO 56
2.5.1 Coloracin de Gram 57
2.5.2 Mtodo de recuento en placa 57
2.5.3 Mtodo colorimtrico DNS 58
2.5.4 Cromatografa lquida de alta resolucin 58
3. DESARROLLO EXPERIMENTAL 59
3.1 CARACTERIZACION DEL MICROORGANISMO 59
3.1.1 Coloracin de Gram 59
3.2 CARACTERIZACIN DE SUSTRATOS 61
3.2.1 BHI 61
3.2.2 Suero de leche 61
3.3 DETERMINACIN DEL COMPORTAMIENTO DE LA TEMPERATURA DE
CRECIMIENTO 63
3.4 FERMENTACIN MICROBIANA 63
3.4.1 Condiciones de operacin 63
3.4.2 Preparacin del inoculo 64
3.4.3 Fermentacin 64
3.5. MTODO DE RECUENTO EN PLACA 65
3.5.1 Diluciones 65
3.5.2 Siembra 65
3.5.3 Obtencin de datos 66
3.6 MTODO COLORIMETRICO DNS 67
3.7 DETERMINACIN DE CIDO HIALURNICO POR HPLC 70
4. ANALISIS DE RESULTADOS 73
4.1 CARACTERIZACIN DEL MICROORGANISMO 73
4.2 CARACTERIZACIN DE SUSTRATOS 74
4.3 DETERMINACIN DEL COMPORTAMIENTO DE LA TEMPERATURA 77
4.4 FERMENTACIN 77
4.5 CINETICA MICROBIANA 78
4.6 CONSUMO DE SUSTRATO 82
10
4.7 PRODUCCIN DE ACIDO HIALURONICO 91
5. CONCLUSIONES 93
6. RECOMENDACIONES 94
BIBLIOGRAFA 95
ANEXOS 102
11
LISTA DE FIGURAS
pg.
Figura 8. Micropipeta 52
12
LISTA DE CUADROS
pg.
Cuadro 6. Materiales 50
Cuadro 7. Equipos 54
Cuadro 8. Reactivos 56
13
LISTA DE DIAGRAMAS
pg.
14
LISTA DE TABLAS
pg.
15
LISTA DE GRAFICAS
pg.
16
LISTA DE IMGENES
pg.
Imagen 1. Incubadora 54
Imagen 2. Agitador 54
Imagen 3. Espectrofotmetro 54
Imagen 5. Centrfuga 55
17
LISTA DE ECUACIONES
pg.
18
LISTA DE ANEXOS
pg.
19
ABREVIATURAS
20
GLOSARIO
21
METABOLITO SECUNDARIO: es un metabolito presente en una ruta metablica,
que no est asociado al crecimiento del microorganismo y se da bajo condiciones
de estrs.
22
RESUMEN
23
INTRODUCCIN
1 LAGO MENDOZA, G.; CREMATA, J. A. y COTO VALDS, G. Cordones umbilicales residuales, nueva
fuente de obtencin de cido hialurnico y sus fracciones. En: Cubana De Farmacia. p. 100-190.
2 BLANK, Lars y NIELSEN, Lars. Microbial Hyaluronic Acid production. En: Appl. Microbiol Biotechnol. vol. 66,
p. 341-351.
3 SCHIRALDI, Chiara; LA GATTA, Annalisa y DE ROSA, Mario. Biotechnological Production and Application
OBJETIVO GENERAL
Ajustar un modelo matemtico para el crecimiento de Streptococcus pyogenes en
2 sustratos para la produccin de cido hialurnico a escala de laboratorio.
OBJETIVOS ESPECFICOS
Evaluar 2 sustratos complejos para la produccin de cido hialurnico.
25
1. GENERALIDADES
4 MEYER, Karl y PALMER, John. The polysaccharide of the vitreous humor. En: Journal Biological Chemistry.
p. 629-634.
26
polisacrido se precipit con etanol; la produccin bacteriana de cido hialurnico
que implica una cepa de Streptococcus zooepidemicus fue descrito por primera
vez en 1989, dando lugar a la primera comercializacin de cido hialurnico
producido por la fermentacin5.
Fuente: BLANK, Lars y NIELSEN, Lars. Microbial Hyaluronic Acid production. En:
Appl. Microbiol Biotechnol. vol. 66, p. 341-351.
5 NECAS, J., et al. Hyaluronic acid (hyaluronan). En: Veterinarni Medicina. vol. 53, no. 8, p. 397-411.
6 BLANK, Lars y NIELSEN, Lars. Microbial Hyaluronic Acid production. En: Appl. Microbiol Biotechnol. vol. 66,
p. 341-351.
27
El comportamiento se divide en tres regiones: diluida, semi-diluidas, y
concentrada. En la regin diluida, cada molcula acta como una partcula
suspendida y el comportamiento es casi de un fluido newtoniano. La viscosidad
intrnseca del cido hialurnico es muy alta, y la transicin entre la regin diluido y
semi-diluida se produce a bajas concentraciones dependiendo del peso molecular.
Debido a su alto grado de polimerizacin este cido puede tener peso molecular
desde 100.000 Da hasta 10 MDa. Esta propiedad depende demasiado de su
origen y los mtodos de purificacin que se lleven a cabo, por lo general cada
7 SARANJA, P. Hyaluronic Acid Production and its Applications. En: International Journal of Pharmaceutical
and Biological Archives. p. 853-859.
8 PRUSOVA, Alena. The Hydration of Hyaluronic Acid. Brno: Brno University of technology, 2008. p. 1-82.
28
unidad de disacrido o monmero tiene un peso molecular de 401 Da
aproximadamente.
Los enlaces de hidrgeno presentes en la molcula, hacen que esta molcula
presente una hlice doble, donde el agua puede ser muy importante en la
estabilizacin de su estructura molecular, el cido hialurnico puede tener zonas
hidroflicas y zonas hidrofbicas, lo que le da la caracterstica de ser una sustancia
anfiflica. Algunos factores pueden modificar las propiedades del cido hialurnico
si est en solucin entre estos las interacciones electrostticas de grupos
carboxilo, los puentes de hidrgeno de monosacridos adyacentes, la
superposicin o entrelazamiento del polmero y por ultimo las interacciones de los
parches hidrfobos9.
9 GARG, Hari y HALES, Charles. Chemistry and Biology of Hyaluronan. 1 ed. Boston: ELSEVIER, 2004. p. 1-
6050 08 044382 6.
29
Tabla 2. (Continuacin).
Peso molecular Concentracin Temperatura de Entalpa de
(kDa) %(p/p) fusin (C) fusin (J/g)
1,5 -4,17 324,9
2,0 -4,28 310,9
740
2,5 -4,40 317,3
3,0 -4,46 308,8
Fuente: PRUSOVA, Alena. The Hydration of Hyaluronic Acid. Brno: Brno
University of technology, 2008. p. 1-82. Adaptada por los autores.
Diferentes estudios se han hecho para otras propiedades fisicoqumicas del cido
hialurnico en solucin como lo es la difusividad a travs de coeficientes de auto
difusin, experimentalmente se demostr que el comportamiento de estas
soluciones con 0,2 M de NaCl a pH entre 4 y 8, al aumentar su concentracin su
coeficiente disminua radicalmente hasta una concentracin crtica. Los
parmetros para la ecuacin universal de difusividad solo se aplican para cido
hialurnico con peso molecular aproximadamente a 900 kDa, estos parmetros
son D0 = 5,6 x 10-8 cm2/s, = 0,63 mL/mg y = 0,74, estos ltimos dos describen
la fuerza de las interacciones hidrodinmicas dentro del polmero y la contraccin
de las cadenas a altas concentraciones respectivamente. La Ecuacin 1 describe
el comportamiento de la difusividad en trminos de la concentracin de cido
hialurnico10.
1.2 COMERCIALIZACION
10GARG, Hari y HALES, Charles. Chemistry and Biology of Hyaluronan. 1 ed. Boston: ELSEVIER, 2004. p. 1-
6050 08 044382 6.
30
la poblacin; aos despus en Japn el cido hialurnico empez a utilizarse y
comercializarse por Seikagaku para la viscosuplementacin en las articulaciones
artrticas en el ao 1987. El mercado japons se estableci rpidamente y para
1998 unos 2 millones de pacientes estaban recibiendo cerca de 14 millones de
inyecciones anuales11. En los Estados Unidos el cido hialurnico fue aprobado
por primera vez para la viscosuplementacin en 1997, pero el mercado ha crecido
desde un 15% anual12.
66, p. 341-351.
14 [Annimo]Clnica gbcom, Reporte marcas con permiso de comercializacin, Espaa. [Print(0)]. [Consultado
15 [Annimo]Hyaluronic Acid Market By Products (Single Injection, Three Injection, Five Injection), By
Application (Osteoarthritis, Adhesive Prevention, Drug Delivery, Dermal Fillers) Is Expected To Reach USD
10.80 Billion By 2020. [Electronic(1)]. [Consultado el Noviembre/12015]. Disponible en:
http://www.grandviewresearch.com/press-release/global-hyaluronic-acid-market.
32
Cuadro 1. (Continuacin).
Aplicaciones Usos
Tratamiento de los infartos o
Desordenes cardiovasculares accidentes cerebrovasculares y en los
daos de la isquemia en los tejidos.
Previene la adhesin en superficies
Ciruga
tisulares.
Bronquitis crnica y el enfisema En forma de aerosoles acta sobre las
pulmonar fibras elsticas protegindola.
Fuente: LAGO MENDOZA, G.; CREMATA, J. A. y COTO VALDS, G. Cordones
umbilicales residuales, nueva fuente de obtencin de cido hialurnico y sus
fracciones. En: Cubana De Farmacia. p. 100-190.
16 LAGO MENDOZA, G.; CREMATA, J. A. y COTO VALDS, G. Cordones umbilicales residuales, nueva
fuente de obtencin de cido hialurnico y sus fracciones. En: Cubana De Farmacia. p. 100-190.
33
1.3.4 Oftalmologa. Las principales aplicaciones en este campo de la medicina
se pueden observar en el Cuadro 3 y estas se deben a que el cido hialurnico
hace parte del cuerpo vtreo del ojo.
18 LAGO MENDOZA, G.; CREMATA, J. A. y COTO VALDS, G. Cordones umbilicales residuales, nueva
fuente de obtencin de cido hialurnico y sus fracciones. En: Cubana De Farmacia. p. 100-190.
19 SELYANIN, Mikhail y BOYKOV, Petr. Hyaluronic Acid. Preparation, Properties, Aplication in Biology and
hyaluronic acid. En: Journal of Bioscience and Bioengineering. vol. 107, no. 9, p. 119-123.
23 JEONG, Euijoon y et al. Metabolic engineering of Pichia pastoris for production of hyaluronic acid with high
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Tree&id=2&lvl=3&lin=f&keep=1&srchmode
=1&unlock
30 [Annimo]Streptococcus dysgalactiae. [Electronic(1)]. [Consultado el Abril/222016]. Disponible en:
https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Streptococcus_dysgalactiae.
38
la ayuda de la fosfoglucomutasa y la fosfoglucoisomerasa se producen
respectivamente la glucosa 1-fosfato y la fructosa 6-fosfato, el primer camino a
partir de la glucosa 1-fosfato con la presencia de la UDP-glucosapirofosforilasa la
transforma en UDP-glucosa posteriormente una enzima del tipo deshidrogenasa
forma el UDP cido glucurnico, por otro lado la fructosa 6-fosfato se convierte
en glucosamina 6-fosfato con la actuacin de una amidotransferasa.
Fuente: BLANK, Lars y NIELSEN, Lars. Microbial Hyaluronic Acid production. En:
Appl. Microbiol Biotechnol. vol. 66, p. 341-351.
39
microorganismo para poder desarrollarse y ejecutar la ruta metablica que se
muestra en la Figura 2 estos pueden ser complejos como definidos teniendo como
ventaja los medios de cultivo definidos ya que estn qumicamente definidos y se
caracteriza con ms exactitud su composicin nutritiva, pero sin despreciar los
sustratos complejos ya que al ser residuos industriales su valor comercial es bajo
y puede tener la cantidad necesaria de carbohidratos para seguir esta ruta
metablica.
31 LIU, Long, et al. Microbial production of hyaluronic acid: current state, challenges, and perspectives. En:
Microbial Cell Factories. vol. 10, no. 99, p. 1-9.
32 VZQUEZ, Jos, et al. Hyaluronic acid production by Streptococcus zooepidemicus in marine by-products
media from mussel processing wastewaters and tuna peptone viscera. En: Microbial Cell Factories. vol. 9, no.
46, p. 1-10.
33 BENEDINI, Leandro y ANDRADE, Mara. Effects of soy peptone on the inoculum preparation of
Streptococcus zooepidemicus for production of Hyaluronic Acid. En: Bioresource Technology. vol. 130, p. 798-
800.
40
Suero de queso concentrado de protenas35.
1.5.4.1 Tiempo. Los tiempos de produccin estn muy ligados a los tiempos de
crecimiento del microorganismo hasta la fase estacionaria, la cual para estos
microorganismos mesfilos est entre 24 a 48 horas36.
7454 0.
41
1.5.4.5 Aireacin. Este proceso no presenta aireacin debido a que los
microorganismos utilizados en el proceso son facultativos anaerbicos o se
pueden tener niveles bajos de velocidades de aireacin alrededor de 0, 0,05, 0,3,
0,5, 1 o 1,3 vvm con concentraciones de oxgeno disuelto de 10%
aproximadamente37.
37 LIU, Long, et al. Microbial production of hyaluronic acid: current state, challenges, and perspectives. En:
Microbial Cell Factories. vol. 10, no. 99, p. 1-9.
42
Cuadro 5. (Continuacin).
Fuente Extraccin Purificacin Producto final
Polvo de
Tratamiento con hialuronano
Cresta de Agua, 2 cloroformo; liofilizado con
gallo y pollo extracciones. precipitacin con contenido de
etanol. protena debajo
de 0.05%.
Filtracin; precipitacin
con cido actico
Solucin saponificado con
Polvo liofilizado
Cresta de fisiolgica, 80 hidrxido de sodio a pH
libre de cidos
gallo. 90C, 2 7,0 7,3 ; el
nucleicos.
extracciones. calentamiento a 80
90C; filtracin
repetible.
La precipitacin con
cido tricloroactico (1
2%) a partir del
volumen de extracto en
Cresta de Agua, 3
20 22C para 1 2 h; Polvo liofilizado.
gallo extracciones.
La eliminacin de
lpidos y agua con
acetona y ter tres
veces.
Similar a la fibra
sustancia blanca;
1 15% solucin contenido de
NaCl a 60C, protena 9 24%;
Cresta de Centrifugacin;
Rendimiento densidad ptica
gallo liofilizacin.
1,92% del material de la solucin
de partida. acuosa del 0,1%
0,1 0,14 a 540
nm.
Fuente: SELYANIN, Mikhail y BOYKOV, Petr. Hyaluronic Acid. Preparation,
Properties, Aplication in Biology and Medicine. 1 ed. Moscow: Wiley, 2015. p.
198978 1 118 63379 3.
43
Garantizando un alto peso molecular de cido hialurnico lo primero que se debe
hacer es utilizar un bactericida para destruir los microorganismos por un mtodo
qumico ya puede ser formaldehido o alcoholes como el isopropanol o etanol en
concentraciones moderadas que eviten la aglomeracin del cido hialurnico.
Posteriormente se hace uso de surfactantes que liberen la adhesin de este
metabolito a las capsulas microbianas, utilizando NaCl, sulfato dodecil sdico o
TWEEN 80, en concentraciones muy bajas38.
1.7.1 Crecimiento microbiano. Para este proceso se tiene que tener en cuenta
varios modelos de cinticas, de acuerdo al proceso, para crecimiento microbiano
se debe hacer un estudio a la fase de latencia donde la concentracin de
microorganismos est en funcin del periodo de latencia.
38 CARLOS DURAN MOYA. Medio de cultivo y procedimiento para la preparacin de cido hialurnico de alto
peso molecular. Inventor(es): FLAVIA CAZZOLA, MICHAEL O'REGAN y VINCENZA CORSA. 0716688.
Espaa, 2 211 883. p. 1-15. 2004.
39 JAGADEESWARA, Reddy y KARUNAKARAN, K. T. Purification and characterization of hyaluronic acid
produced by Streptococcus zooepidemicus strain. En: Journal Bioscience Biotech. vol. 2, no. 3, p. 173-179.
40 LEBLANC, Pierrick y OUESLATI, Nadia. A simple methodology for predicting the perfomances of hyaluronic
acid purification by diafiltration. En: Journal of Membrane Science. vol. 490, p. 152-159.
41 MURADO, M. A. y MONTEMAYOR, M. I. Optimization of extraction and purification process of hyaluronic
acid from fish eyeball. En: Food and Bioproducts Processing. vol. 90, p. 491-498.
42 ZHOU, Haidong y NI, Jinren. Separation of hyaluronic acid from fermentation broth by tangetial flow
microfiltration and ultrafiltration. En: Separation and Purification Technology. vol. 52, p. 29-38.
44
Para representar el crecimiento microbiano se utiliza el modelo de crecimiento
exponencial el cual est representado por la Ecuacin 2, donde es la tasa de
crecimiento especfica y X es la concentracin de biomasa que se puede obtener
en un cultivo correspondiente.
=
=
0
( ) =
=
= ( )
43 DORAN, Pauline. Bioprocess Engineering Principles. San Diego: Academic press inc., 1995. p. 4550-12-
220855-2.
45
Ecuacin 4. Ecuacin logstica para el crecimiento microbiano.
= (1 )
=
0 (1 ) 0
( ) =
1
1
( 0 ) =
1 0
0
(1 )
=
0 (1 )
( )
=
( )
( ) = ( )
( + ) =
46
Ecuacin 6. Tasa de cambio de concentracin de sustrato contra el tiempo.
1
= +
1
= +
0 0
1
( ) = ()0 +
0
1
( ) = ( ) + ( )
44 MAT DON, Mashitah y SHOPARWE, Noor Fazliani. Kinetics of hyaluronic acid production by Streptococcus
zooepidemicus considering the effect of glucose. En: Biochemical Engineering Journal. vol. 49, p. 95-103.
47
Ecuacin 8. Concentracin de sustrato en funcin del tiempo.
+
= + ( )
( + )
=
0 0
= ()
0
= ( )0
= ( () )
45 LIU, Long, et al. Enhanced hyaluronic acid production by a two-stage culture strategy based on the
modeling of batch and fed-batch cultivation of Streptococcus zooepidemicus. En: Bioresource Technology. vol.
99, p. 8532-8536.
48
Siguiendo el proceso de la ecuacin logstica se puede obtener la ecuacin
logstica para la formacin de cido hialurnico reemplazando la Ecuacin 5 en la
Ecuacin 9, como se observa en la Ecuacin 11.
()
= ( )
( + () ) ( + )
46 LIU, Long, et al. Enhanced hyaluronic acid production by a two-stage culture strategy based on the
modeling of batch and fed-batch cultivation of Streptococcus zooepidemicus. En: Bioresource Technology. vol.
99, p. 8532-8536.
47 DORAN, Pauline. Bioprocess Engineering Principles. San Diego: Academic press inc., 1995. p. 4550-12-
220855-2.
49
2. MATERIALES Y METODOS
En este captulo se describir los recursos que se van a utilizar durante toda la
investigacin, se detallaran herramientas fsicas como son equipos, reactivos,
materias primas, etc. Como herramientas terico - prcticas como son
caracterizaciones y mtodos de cuantificacin.
Cuadro 6. Materiales.
Material Caractersticas Uso Imagen
Figura 3. Schott de
Fabricado en vidrio tapa azul.
borosilicato
transparente, estn Por sus
adaptados a la norma caractersticas
ISO 4796, cuentan con de materiales,
Schott de anillo anti gote, su se pueden
vidrio tapa tapa es de color azul y esterilizar con
azul presenta resistencia facilidad y son
hasta temperaturas de utilizados para
140C. realizar la
Marca schott. fermentacin. Fuente: Disponible en
Su volumen puede ser internet
entre 200 mL a 1 L. <http://www.marienfeld
-superior.com/>.
50
Cuadro 6. (Continuacin).
Material Caractersticas Uso Imagen
Estos tubos son
hechos en vidrio Figura 4. Tubo tapa
Estos tubos rosca.
borosilicato
son utilizados
transparente, tapa
para realizar
negra y con arandela
diluciones y
de butilo/PTFE lo que
as poder
los hace altamente
Tubos de sembrar las
resistente a grandes
ensayo tapa bacterias
temperaturas
rosca. correctamente
permitiendo as su
al desarrollar
esterilizacin.
la tcnica de
Sus dimensiones son Fuente: Disponible en
cuantificacin
de 15 x 150 mm y internet
UFC.
tiene <http://www.equipamien
aproximadamente un tonafinsa.com/>.
volumen de 20 mL.
Recipiente redondo, Figura 5. Caja de Petri.
Son utilizadas
hecho de vidrio, posee
para realizar la
diferentes dimetros,
siembra de la
es de fondo bajo, con
cepa ya sea
una cubierta de la
Cajas de para activarla,
misma forma que la
Petri pruebas de
placa, pero un poco
temperatura o
ms grande de Fuente: Disponible en
para la tcnica
dimetro, ya que se internet
de recuento en
puede colocar encima <www.a3bs.com>
placa.
y cerrar el recipiente.
Figura 6. Elementos de
medicin volumtrica.
Son elementos de
laboratorio
normalmente de vidrio,
Son utilizados
que tiene como
para medir
Elementos funcin medir con gran
volmenes de
de medicin exactitud volmenes
reactivos para
volumtrica de lquidos.
la preparacin
Entre estos
de otros.
encontramos pipeta,
probeta, vaso de Fuente: Disponible en
precipitado, etc. internet
<http://slideplayer.es/sli
de/1651920/>
51
Cuadro 6. (Continuacin).
Material Caractersticas Uso Imagen
Figura 7. Baln
aforado.
Son elementos de
laboratorio
volumtricos, Utilizado para
normalmente completar
fabricados en vidrio, volmenes
Baln
con alto nivel de necesarios
aforado
precisin en la en la
medicin. preparacin
Su tamao puede de reactivos.
variar entre 100 mL o Fuente: Disponible en
ms de 1 L. internet
<www.labotienda.com>
Figura 8. Micropipeta.
Utilizado para
tomar
Es un instrumento de muestras
laboratorio utilizado pequeas
para medir con para realizar
Micropipeta exactitud volmenes las diluciones
de lquido muy y las
pequeos (menores a siembras en
1 mL). la tcnica de Fuente: Disponible en
cuantificacin internet
de UFC/mL. <www.pfhlabmedic.co
m.pe>
Figura 9. Puntas
azules.
Son elementos de
laboratorio, fabricados
Son
en plstico,
utilizados
desechables una vez
para realizar
utilizados.
Puntas las diluciones
Son utilizados con la
azules en la tcnica
micropipeta, para
de
sacar muestras de
cuantificacin
volmenes muy
UFC Fuente: Disponible en
pequeos de 0,1 a 1
internet
mL.
<www.elementosquimi
cos.com.co>
52
Cuadro 6. (Continuacin).
Material Caractersticas Uso Imagen
Figura 10. Tubos
Tubos de fondo
cnico, fabricados
Son utilizados
en polipropileno,
para realizar
Tubos Falcon graduados, su
centrifugaciones
volumen puede ser
.
entre 15 mL y 50 Falcon.
mL.
Fuente: Disponible en
internet:
<www.cientificaschonfe
ld.com.ar>
Figura 11. Frasco
Son frascos de
cristal de topacio lo
que le hace dar un Este frasco es
color mbar, puede utilizado para
Frasco
tener diferentes hacer y
mbar
tamaos y el color conservar el
permite conservar reactivo DNS. mbar.
sustancias
sensibles a la luz. Fuente: Disponible en
internet
<www.reactivosyequip
os.com.mx>
Figura 12. Rastrillo.
Utilizado para
homogenizar las
Es un tubo de vidrio
siembras de las
con la punta curva o
diluciones en
doblada, puede ser
Rastrillo las cajas de
una probeta que se
Petri en la
haya roto y fue
tcnica de
modificada. Fuente: Disponible en
cuantificacin
internet
de UFC.
<www.marienfeld-
superior.com>
53
2.2.2 Equipos. Para poder realizar la experimentacin es necesario utilizar
equipos para generar las condiciones que requiere el proceso microbiolgico entre
los cuales se encuentran los siguientes:
Cuadro 7. Equipos.
Equipos Caractersticas Uso Imagen
Imagen 1. Incubadora.
Equipos de diferentes
caractersticas que
tiene como funcin Se utiliza
generar las para generar
condiciones las
Incubadora adecuadas de condiciones
temperatura y adecuadas
humedad para el para la
crecimiento y fermentacin.
reproduccin de seres
vivos.
54
Cuadro 7. (Continuacin).
Equipos Caractersticas Uso Imagen
Es un instrumento de
laboratorio, el cual
Imagen 4. Bao
consta de un
termostatado.
recipiente y un Utilizado para
intercambiador de preparar las
Bao calor pequeo con la muestras en
termostatado finalidad de mantener la prueba de
una sustancia a una colorimetra
temperatura DNS.
deseada, tambin
utilizado para hacer
bao mara.
Es un equipo que
rota a velocidades
Se utiliza
grandes, por medio
para preparar
de la fuerza
las muestras
centrfuga hace
en la prueba
aumentar la
Centrfuga de
velocidad de
colorimetra
sedimentacin y/o
DNS y
hacer precipitar Imagen 5. Centrfuga.
cromatografa
slidos en
liquida.
suspensin en las
muestras.
55
2.3.2 Medios de cultivo. Los medios cultivos utilizados en este proyecto son el
BHI (Brain Heart Infusion) de origen comercial marca Merck fabricado en
Alemania identificado con el nmero de orden: 1.10493.0500 y el suero de leche
obtenido del proceso de fabricacin de queso como un residuo de la industria de
lcteos.
2.4 REACTIVOS
Cuadro 8. Reactivos.
Reactivo Uso
Se utiliza para la prueba de coloracin
Cristal Violeta de Gram.
de Gram como colorante.
Se utiliza para fijar el colorante Cristal
Lugol de Gram.
Violeta en la coloracin de Gram.
Se utiliza para remover el exceso de
Alcohol acetona de Gram.
colorante en la coloracin de Gram.
Se utiliza para la prueba de coloracin
Fucsina de Gram.
de Gram como colorante de contraste.
Reactivo principal para realizar la
DNS
prueba de colorimetra DNS.
Reactivo necesario para realizar la
Solucin patrn glucosa 2g/L curva de calibracin en prueba de
colorimetra DNS.
Se utiliza como solvente para realizar
Solucin salina al 0,85% p/v
las diluciones para la siembra.
Utilizado en el pretratamiento de las
NaCl
muestras para la prueba de HPLC.
Utilizado en el pretratamiento de las
SDS 5% p/v
muestras para la prueba de HPLC.
Etanol 70% v/v Utilizado como bactericida.
56
en el proceso como el crecimiento microbiano, el consumo de sustrato y la
produccin de cido hialurnico.
48 MADIGAN, Michael y PARKER, Jack. Brock, Microbiologa De Los Microorganismos. Barcelona: Pearson,
2008. p. 108984 - 205 - 3679 2.
49 UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE, Facultad de agroindustrias. Trabajo prctico N5 - Estudio
zooepidemicus considering the effect of glucose. En: Biochemical Engineering Journal. vol. 49, p. 95-103.
57
2.5.3 Mtodo colorimtrico DNS. El fundamento de este mtodo se basa en que
el reactivo DNS reacciona nicamente con los azcares reductores, la sacarosa al
ser un disacrido no es un azcar reductor, pero por su hidrlisis se obtiene
glucosa y fructosa que son reductores y reaccionan con el DNS generando una
solucin coloreada. La intensidad del color se puede medir mediante una tcnica
de espectrofotometra para determinar la concentracin de sacarosa utilizando
patrones con concentraciones de azcares reductores conocidas para construir
una curva de calibracin que se ajuste a estos datos y as encontrar los valores
desconocidos de las muestras a analizar.
51 MILLER, Gail. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. En: Pioneering
Research Division. vol. 31, no. 3, p. 426-428.
52 GISMERA, Mara. Introduccin a La Cromatografa Lquida De Alta Resolucin. Espaa: Universidad
Autnoma de Madrid, 2009. 9788483441459 8483441454.
58
3. DESARROLLO EXPERIMENTAL
Cristal violeta.
Lugol.
Alcohol acetona.
Fucsina.
Aceite de inmersin.
59
Siguiendo el proceso descrito en el Anexo A primero se realiz el frotis con el asa
preliminarmente esterilizada tomando una muestra de la cepa previamente
activada y se fij la muestra al portaobjetos.
Despus que esta reaccin se adiciona alcohol acetona que tiene como funcin
remover el complejo que se form de colorante donde a las bacterias Gram
negativas por accin del alcohol acetona se les disuelve la membrana externa
debido a que es un solvente lipdico y la capa delgada de peptidoglicano no es
capaz de retener el complejo formado, por el contrario las bacterias Gram
positivas por tener una capa gruesa de peptidoglicano logra contener el complejo
colorante y permanecen de color violeta; luego de remover el exceso de alcohol
acetona se adiciona fucsina como colorante contraste con el fin de que las
bacterias Gram negativas tomen color y se puedan identificar al observar la
muestra en el microscopio53.
Finalmente, se observa en la Imagen 6 la muestra en el microscopio.
Es necesario definir los medios cultivos por medio de una revisin bibliogrfica con
el fin de determinar si a travs del medio cultivo la bacteria va crecer y realizar la
ruta metablica expuesta en Figura 2.
3.2.1 BHI. Su nombre se da por sus siglas en ingls (Brain and Heart Infusion).
Este es un medio cultivo definido de la marca Merck, est hecho para cultivo de
bacterias exigentes, normalmente utilizado para analizar como es el
comportamiento de crecimiento de bacterias como, Staphylococcus aureus,
Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa,
Candida albicans, Bacteroides fragilis, Haemophilus influenza54.
La composicin del suero puede variar dependiendo de las caractersticas del tipo
de leche utilizada en la elaboracin de queso, el tipo de queso y el proceso
tecnolgico empleado; existen 2 tipos de suero de leche ms comunes, suero de
leche dulce es el que se obtiene de la elaboracin del queso mediante enzimas y
Porcentaje de Azufre disponible: Las protenas del suero tienen aminocidos que
contienen azufre (cistena, metionina).
Calcio (0,4 0,6 g/l en suero de leche dulce y 1,2 1,6 g/l) en lactosuero acido),
potasio, fosforo, sodio y magnesio.
Vitaminas disponibles: tiamina 0,38 mg/ml; riboflavina 1,2 mg/ml; acido nicotnico
0,85 mg/ml; cido pantotnico 3,4mg/ml; piridoxina 0,42mg/ml; cobalamina
0,03mg/ml; cido ascrbico 2,2mg/ml56.
56POVEDA, Elpidia. Whey, generalities and potential use as source of calcium from high bioavailability. En:
Rev. Chil. Nutr. vol. 40, no. 4, p. 397-403.
62
3.3 DETERMINACIN DEL COMPORTAMIENTO DE LA TEMPERATURA DE
CRECIMIENTO
58 BD. Patron de turbidez BBL preparado. [Print(0)]. [Consultado el Mayo/152016]. Disponible en:
http://bd.com/europe/regulatory/Assets/IFU/US/8808421(0205)_es.pdf.
64
Una vez ambos estuvieran a 37C se aadieron 50 mL de inoculo a los 500 mL de
sustrato y se empez la fermentacin durante 32 horas, con un sistema de
agitacin a 150 rpm asegurando el frasco para evitar posibles derrames o
problemas. Al iniciar el proceso se tomaron muestras de 5 a 15 mL de caldo de
fermentacin para su posterior anlisis, estas se tomaban cada 4 horas iniciando
en el momento que se mezcla el inoculo con el medio cultivo, obteniendo 9
muestras por fermentacin; en total 18. Las muestras eran tomadas de manera
adecuada para evitar contaminacin con el exterior para una posible alteracin del
proceso.
65
Las siembras de las muestras de la fermentacin con sustrato BHI, se hicieron por
duplicado para comparar aproximadamente la cantidad de UFC/mL y contar las
que se vieran con mayor facilidad; para la fermentacin con suero de leche se
escogieron menos siembras tomando como base los resultados obtenidos en la
primera fermentacin.
66
3.6 MTODO COLORIMETRICO DNS
El primer paso que se realiz fue la preparacin del reactivo DNS y se llev a cabo
a travs del siguiente protocolo:
En un vaso de precipitado con 50 mL de agua destilada, se aadi 1,6 g de
hidrxido de sodio y se disolvi con agitacin magntica a temperatura ambiente.
Se adiciono 43,8 g de tartrato de sodio y potasio, lentamente hasta disolver por
completo la solucin.
Se agreg lentamente 1 g de cido 3,5-dinitrosaliclico y se protegi el reactivo
de la luz, tapando los recipientes con papel aluminio.
Luego se afor la solucin hasta 100 mL con agua destilada en un baln aforado
de 100 mL y se dej en agitacin por 12 horas en un frasco mbar.
67
La preparacin de la curva se realiz mediante estas condiciones para garantizar
que la reaccin de reduccin ocurriera, est siempre ocurre a la temperatura de
ebullicin del agua, siempre protegiendo los tubos de la luz para evitar la
alteracin del reactivo DNS.
Una vez obtenida la curva patrn de glucosa se procede a realizar la prueba para
las muestras tomadas de las fermentaciones a travs del protocolo descrito en el
Diagrama 2 obteniendo como resultado las absorbancias de las muestras de la
fermentacin con BHI y la fermentacin con suero de leche expuestas en la Tabla
8 y la Tabla 9, respectivamente.
69
Tabla 9. Absorbancias para muestras con suero de leche.
Tiempo (h) Absorbancia
0 0,377
4 0,349
8 0,337
12 0,319
16 0,298
20 0,292
24 0,301
28 0,312
32 0,325
La adicin de etanol al 70% v/v se hace con el fin de matar las bacterias y evitar
que continen creciendo y produciendo ms metabolito primario que puedan llegar
a afectar las muestras, en ambos protocolos se adiciona un surfactante sulfato
dodecil sdico al 5% p/v y cloruro de sodio respectivamente en cada muestra para
separar el cido hialurnico de las clulas, la gran diferencia de los protocolos se
encuentra en la centrifugacin de las muestras la cual se realiza con el fin de
retirar slidos en suspensin que puedan llegar a presentarse como picos en la
muestra afectando los resultados y la microfiltracin se realiza con el fin de retener
las bacterias muertas y evitar que el peptidoglicano presente en la membrana
celular sea detectado por el equipo.
70
Diagrama 3. Pretratamiento no. 1 de las muestras para HPLC.
71
Las muestras pretratadas son llevadas posteriormente al anlisis de cromatografa
lquida de alto rendimiento donde se utiliza una columna Ultrahydrogel Linear de
7,8 mm x 300 mm, con un tamao de partcula de 10 m y Ultrahydrogel guard
column de 6 mm x 40 mm, con un tamao de partcula de 6 m, esta columna es
la indicada para detectar la presencia de cido hialurnico59.
Las bacterias Gram positivas se caracterizan por tener una pared compuesta de
peptidoglicano, esta estructura tambin llamada tetrapptido del glicano est
formada por 2 derivados de carbohidratos, N-acetilglucosamina y cido N-
acetilmurmico, estos se unen entre s por puentes peptdicos para formar este
compuesto el cual representa hasta el 90% de la pared celular en estas bacterias,
mientras que en las bacterias Gram negativas solo cubre un 10% de todos los
componentes que conforman la pared celular. Se pueden encontrar bacterias con
una sola capa de peptidoglicano, mientras que las bacterias Gram positivas
pueden tener hasta 25 capas en algunos casos. La diferencia entre ambas
bacterias se representa mediante la Figura 13, donde a y b son respectivamente
las paredes de una bacteria Gram positiva y Gram negativa.
La pared celular de las bacterias Gram positivas tambin se caracteriza por tener
polisacridos cidos que atraviesan o estn incrustados en la pared celular, estos
se denominan cidos lipoteicoicos y cidos teicoicos, donde los primeros se
diferencian por atravesar la pared hasta la membrana citoplasmtica y estar
unidos a los fosfolpidos de esta.
73
Gram negativa esta se decolora. Por ltimo, al agregar el colorante de contraste
este no puede penetrar en la pared de bacterias Gram positivas debido a que esta
ya tiene sus componentes de pared enlazados fuertemente al colorante cristal
violeta.
74
Cuadro 12. Macronutrientes.
Forma del nutriente en Forma suministrada en
Elemento
el ambiente el medio cultivo
Glucosa, malato, acetato,
piruvato, aminocidos,
CO2, Compuestos cientos de otros
Carbono (C)
orgnicos. compuestos o mezclas
complejas (extracto de
levadura, peptona, etc.).
H2O, Compuestos H2O, Compuestos
Hidrogeno (H)
orgnicos. orgnicos
H2O, O2, Compuestos H2O, O2, Compuestos
Oxigeno (O)
orgnicos orgnicos.
Inorgnico: NH4Cl,
(NH4)2SO4, KNO3, N2
NH3, NO3, N2, Orgnicas: aminocidos,
Nitrgeno (N) Compuestos orgnicos bases nitrogenadas de
nitrogenados. nucletidos, muchos
otros compuestos
orgnicos con N.
Fosforo (P) PO43- KH2PO4, Na2PO4
H3S, SO42- , Compuestos Na2SO4, Na2S2O3, Na2S,
orgnicos con S, sulfuros Cistena u otros
Azufre (S)
metlicos (FeS, CuS, compuestos orgnicos
ZnS, NiS,etc) azufrados.
K+ en solucin o como
Potasio (K) KCl, KH2PO4.
varias sales con K
Mg2+, en solucin o como
Magnesio (Mg) MgCl2, MgSO4.
varias sales con Mg
Na en solucin, NaCl o
Sodio (Na) NaCl.
como otras sales con Na
Ca2+ en solucin, CaSO4
Calcio (Ca) o como otras sales con CaCl2.
Ca
FeCl3, FeSO4, Varias
Fe2- o Fe3- en solucin,
soluciones de hierro
Hierro (Fe) FeS2, Fe(OH)3, o como
quelado (Fe3+ EDTA,
otras sales con Fe
Fe3+ citrato, etc).
Fuente: MADIGAN, Michael y PARKER, Jack. Brock, Microbiologa De Los
Microorganismos. Barcelona: Pearson, 2008. p. 108984 - 205 - 3679 2.
75
Cuadro 13. Micronutrientes.
Elemento Funcin celular
Requerido por los mamferos para el metabolismo de la
Cromo (Cr)
glucosa; se desconoce si los microorganismos lo requieren.
Cobalto (Co) Vitamina B12; transcarboxilasa (bacterias del cido propanoico).
En la respiracin, citocromo c oxidasa; en fotosntesis,
Cobre (Cu)
plastocianina y en algunas superxido dismutasas.
Activador de muchas enzimas; presente en algunas superxido
Manganeso
dismutasas y en la enzima que rompe el agua en fottrofos
(Mn)
oxigenicos.
Algunas enzimas que contienen flavinas; nitrogenasa, nitrato
Molibdeno
reductasa, sulfito oxidasa, DMSO-TMAO reductasas y algunas
(Mo)
formatodeshidrogenasas.
La mayora de las hidrogenasas; coenzima F de metanogenos,
Nquel (Ni)
deshidrogenasa del monozido de carbono y ureasa.
Formato deshidrogenasa; algunas hidrogenasas y el
Selenio (Se)
aminocido selencisteina.
Algunas formatodeshidrogenasas y oxotransferasas de los
Tungsteno (W)
hipertermofilos.
Vanadio (V) Vanadio nitrogenasa; bromoperoxidasa.
Anhidrasa carbonica, alcohol deshidrogenasa, RNA y DNA
Zinc (Zn)
polimerasas, y muchas protenas que se unen al DNA.
Citrocromos, catalasas, peroxidasas, protenas con hierro y
Hierro (Fe)+
azufre, oxigenasas y todas las nitrogenasas.
Fuente: MADIGAN, Michael y PARKER, Jack. Brock, Microbiologa De Los
Microorganismos. Barcelona: Pearson, 2008. p. 108984 - 205 - 3679 2.
76
4.3 DETERMINACIN DEL COMPORTAMIENTO DE LA TEMPERATURA
8
7,8
7,6 7,62
7,4
7,2
7,08
7
34 35 36 37 38 39 40
Temperatura (C)
4.4 FERMENTACIN
Al observar los resultados de las diversas pruebas que se realizaron durante todo
el proyecto se puede decir que las fermentaciones se llevaron a cabo de una
manera adecuada, debido a que en estos se evidencia que los tiempos de
fermentacin se escogieron adecuadamente observndose varias fases de la
cintica microbiana esto tambin indica que la temperatura y la agitacin fueron
las correctas; en el conteo de UFC/mL se evidencia que la fermentacin no se
contamino con algn otro microorganismo que hubiera podido afectar el resultado
de la misma consumando que la fermentacin se llev a cabo en buenas
condiciones aspticas.
77
4.5 CINETICA MICROBIANA
11,0
10,5
10,0
9,5
9,0
8,5
8,0
7,5
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Tiempo (h)
61 MADIGAN, Michael y PARKER, Jack. Brock, Microbiologa De Los Microorganismos. Barcelona: Pearson,
2008. p. 108984 - 205 - 3679 2.
78
De igual forma se obtiene la Grfica 3, representando los datos obtenidos en las
muestras de fermentacin con suero de leche que se expresaron en la Tabla 5.
Para esta fermentacin la fase exponencial dura 16 horas, como anteriormente se
explic las aproximaciones de este mtodo no se logra diferenciar una fase
estacionaria, por otro lado, despus de las 16 hasta las 24 horas se evidencia una
pequea fase de muerte, pero el microorganismo desde las 24 hasta las 32 horas
vuelve a crecer, en este punto se puede analizar una posible fase de diauxia.
10,0
Log UFC /mL
9,5
9,0
8,5
8,0
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Tiempo (h)
62 PRESCOTT, Lansing y HARLEY, John. Microbiology. 6 ed. Colorado: McGraw Hill, 2005. p.
11300072951753
79
se observa en la Grfica 4. No obstante, podemos determinar que el sustrato BHI
produce ms biomasa que el sustrato suero de leche, respectivamente se observa
que la diferencia entre la biomasa producida entre ambos sustratos no vara hasta
la fase exponencial del suero de leche (16 horas), como se explic anteriormente,
un nutriente que se ha agotado en este ltimo sustrato complejo puede frenar el
crecimiento del microorganismo; despus de las 16 horas se observa que
Streptococcus pyogenes sigue creciendo de manera exponencial en la primera
fermentacin donde se utiliz BHI; el BHI al ser un sustrato con alto contenido de
protenas y carbohidratos debido a su infusin de cerebro y corazn tiene un
impacto positivo en la nutricin microbiana de esta bacteria, siendo el sustrato que
favorece un mejor crecimiento de la biomasa.
11,0
10,5
10,0 Suero
de
9,5
leche
9,0
8,5
8,0
7,5
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Tiempo (h)
2,5000
Ln (Log UFC)
2,4000
y = 0,017x + 2,1324
2,3000 R = 0,901
2,2000
2,1000
2,0000
0 4 8 12 16 20 24
Tiempo (h)
2,35
Ln (Log UFC)
2,3
y = 0,0133x + 2,1342
2,25 R = 0,9748
2,2
2,15
2,1
0 4 8 12 16
Tiempo (h)
Como primer paso para analizar esta seccin se debe hacer la implementacin de
la curva de calibracin realizada en el captulo anterior, se procedi a medir la
absorbancia de soluciones de 0, 0,5, 0,7, 1, 1,5, 1,7 y 2 g/L de glucosa y los
resultados se determinaron en la Tabla 7, la curva de calibracin se realiz con el
fin de determinar las concentraciones de glucosa de las muestras extradas de
ambas fermentaciones para poder analizar el consumo de sustrato en ambas
fermentaciones y observar cual sustrato tiene mejor rendimiento con respecto a la
biomasa. La curva de calibracin se representa en la Grfica 7.
82
Grfica 7. Curva de calibracin.
Absorbancia vs concentracion de glucosa
(g/L)
0,12 y = 0,0541x + 0,0021
Absorbancia 0,1 R = 0,9846
0,08
0,06
0,04
0,02
0
0 0,5 1 1,5 2
Concentracin de glucosa (g/L)
83
Tabla 10. (Continuacin).
Concentracin azucares
Tiempo (h) Absorbancia
reductores (g/L)
24 0,133 2,420
28 0,127 2,309
32 0,144 2,623
4,7
4,2
3,7
3,2
2,7
2,2
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Tiempo (h)
Por otro lado, usando de nuevo el mtodo colorimtrico DNS, se analizaron las
muestras obtenidas para la fermentacin de suero de leche expresando sus
resultados en la Tabla 9, realizando los clculos nuevamente con la ecuacin de
84
la curva de calibracin previamente despejada se obtienen los resultados para la
concentracin de glucosa en suero de leche en funcin del tiempo del proceso de
la fermentacin en la Tabla 11.
68,0
66,0
64,0
62,0
60,0
58,0
56,0
54,0
52,0
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Tiempo (h)
85
Ahora comparando ambas fermentaciones se obtiene la Grfica 10, donde se
puede observar como es el consumo de azucares reductores en ambos sustratos,
y determinar en qu momento el sustrato empieza a escasear. Observando estos
comportamientos se refleja algo muy diferente a la comparacin establecida entre
el crecimiento de Streptococcus pyogenes para los 2 sustratos como se observaba
en la Grfica 4. Ahora se debera esperar que el sustrato se agotara por completo
cuando la fase exponencial haya terminado, pero para el sustrato BHI la
concentracin de azucares reductores sigue disminuyendo en las 4 horas
siguientes, y lo mismo ocurre para el suero de leche, a las 24 y 16 horas
respectivamente para cada sustrato; esto se debe a varios factores, entre los
cuales este mtodo puede dar una idea de donde se encuentra la fase
estacionaria la cual dura aproximadamente 4 horas en cada sustrato, despus se
observa la fase de muerte y con ella un incremento en la concentracin de
azucares reductores, lo cual indica que los azucares liberados en la lisis celular si
son reconocidos por este mtodo, pero no se tienen en cuenta para realizar
clculos de parmetros cinticos o rendimientos.
68
4,7
66 BHI
4,2 64
62
3,7 Suero
60
de
3,2 58 leche
56
2,7
54
2,2 52
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Tiempo (h)
86
Grfica 11. Comparacin del crecimiento de biomasa y consumo de sustrato en
BHI.
Crecimiento y consumo vs tiempo en BHI
13,0 5,2
11,0 4,2
10,5
3,7
10,0
9,5 3,2
9,0
8,5 2,7
8,0
7,5 2,2 Biomasa
0 4 8 12 16 20 24 28 32
Tiempo (h) Sustrato
64 MADIGAN, Michael y PARKER, Jack. Brock, Microbiologa De Los Microorganismos. Barcelona: Pearson,
2008. p. 108984 - 205 - 3679 2.
87
Grfica 12. Comparacin del crecimiento de biomasa y consumo de sustrato en
suero de leche.
Crecimiento y consumo vs tiempo en suero
10,5
de leche 72
70
9,5 64
62
9,0 60
58
8,5 56
54
8,0 52
0 4 8 12 16 20 24 28 32 Biomasa
Tiempo (h)
Sustrato
Para analizar la parte del rendimiento con respecto a la biomasa y el sustrato Y X/S,
se calcularon 2 tipos de rendimiento en este caso un rendimiento instantneo
como se observa en la Tabla 12 y la Tabla 13 para la fermentacin con BHI y suero
de leche respectivamente. El cual se calcula mediante cambios en las
concentraciones de azucares reductores y de biomasa entre periodos especficos,
para los cuales estn divididos cada 4 h; los clculos se pueden observar en el
Anexo J.
88
As como se puede calcular el rendimiento instantneo se puede calcular un
rendimiento global mediante una regresin lineal en graficas de concentracin de
biomasa vs concentracin de glucosa65. Para los datos obtenidos con BHI se
representa la Grfica 13, la linealizacin arrojo un coeficiente de correlacin R2
igual a 0,9688, al obtener la pendiente se tiene que el rendimiento es igual a
1,6854 Log UFC/g glucosa; la pendiente negativa indica que con un incremento de
la biomasa hay una disminucin en la concentracin de glucosa.
Para el caso del sustrato suero de leche, se obtiene mediante la regresin lineal
una ecuacin de una lnea recta con un coeficiente R2 igual a 0,9979; esto indica
que los datos de biomasa y sustrato representan un comportamiento lineal, dando
un resultado para el rendimiento global de 0,1443 Log UFC/g glucosa. Estos datos
se obtienen de la Grfica 14.
65 DORAN, Pauline. Bioprocess Engineering Principles. San Diego: Academic press inc., 1995. p. 4550-12-
220855-2.
89
Grfica 14. Biomasa vs sustrato en suero de leche.
Biomasa vs sustrato en suero de leche
11,0
10,5
9,5
9,0
7,5
54 56 58 60 62 64 66 68 70
S (g/L)
Al ajustar los datos podemos comparar los rendimientos obtenidos con los
globales y analizar que ambos resultados fueron adecuados y se aproximan uno al
otro; la comparacin se encuentra en el Cuadro 17.
90
Cuadro 17. Comparacin de rendimientos obtenidos.
Mtodo BHI Suero de leche
Crecimiento exponencial 1,5796 0,1558
Ecuacin logstica 1,344 0,0773
Regresin lineal 1,685 0,1443
92
5. CONCLUSIONES
Los 2 sustratos utilizados para la produccin de cido hialurnico son afines con
la bacteria debido a sus caractersticas nutricionales.
93
6. RECOMENDACIONES
94
BIBLIOGRAFA
AMADO, Isabel y VZQUEZ, Jose. Cheese wey: A cost effective alternative for
hyaluronic acid production by Streptococcus zooepidemicus. En: FOOD
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PURIFICATION TECHNOLOGY. vol. 52, p. 29-38.
101
ANEXOS
102
ANEXO A.
DIAGRAMA COLORACIN DE GRAM
103
Anexo B
Diluciones y siembras realizadas para sustrato BHI
Dilucin
Hora Dilucin terica
sembrada
10-1 10-1
10-2 10-2
0
10-3 10-3
10-4 10-4
10-1 10-1
10-2 10-2
10-3 10-3
1
10-4 10-4
10-5 10-5
10-6 10-6
10-1 10-1
10-2 10-2
10-3 10-3
2
10-4 10-4
10-5 10-5
10-6 10-6
10-1 10-1
10-2 10-2
10-3 10-3
3 10-4 10-4
10-5 10-5
10-6 10-6
10-7 10-7
10-1 10-1
10-2 10-2
10-3 10-3
4 10-4 10-4
10-5 10-5
10-6 10-6
10-7 10-7
10-1 10-1
10-2 10-2
10-3 10-3
10-4 10-4
5
10-5 10-5
10-6 10-6
10-7 10-7
10-8 10-8
104
Dilucin
Hora Dilucin terica
sembrada
10-1 10-1
10-2 10-2
10-3 10-3
10-4 10-4
6 10-5 10-5
10-6 10-6
10-7 10-7
10-8 10-8
10-9 10-9
10-1 10-1
10-2 10-2
10-3 10-3
10-4 10-4
7 10-5 10-5
10-6 10-6
10-7 10-7
10-8 10-8
10-9 10-9
10-1 10-1
10-2 10-2
10-3 10-3
10-4 10-4
8 10-5 10-5
10-6 10-6
10-7 10-7
10-8 10-8
10-9 10-9
105
Anexo C
Diluciones y siembras realizadas para suero de leche
Dilucin
Hora Dilucin terica
sembrada
10-1 10-1
10-2 10-2
10-3 10-3
0
10-4 10-4
10-5 10-5
10-6 10-6
10-1 10-1
10-2 10-2
10-3 10-3
1 10-4 10-4
10-5 10-5
10-6 10-6
10-7 10-7
10-1 10-1
10-2 10-2
10-3 10-3
2 10-4 10-4
10-5 10-5
10-6 10-6
10-7 10-7
10-1 10-1
10-2 10-2
10-3 10-3
10-4 10-4
3
10-5 10-5
10-6 10-6
10-7 10-7
10-8 10-8
10-1 10-1
10-2 10-2
10-3 10-3
10-4 10-4
4
10-5 10-5
10-6 10-6
10-7 10-7
10-8 10-8
106
Dilucin
Hora Dilucin terica
sembrada
10-1 10-1
10-2 10-2
10-3 10-3
10-4 10-4
5 10-5 10-5
10-6 10-6
10-7 10-7
10-8 10-8
10-9 10-9
10-1 10-1
10-2 10-2
10-3 10-3
10-4 10-4
10-5 10-5
6
10-6 10-6
10-7 10-7
10-8 10-8
10-9 10-9
10-10 10-10
10-1 10-1
10-2 10-2
10-3 10-3
10-4 10-4
10-5 10-5
7
10-6 10-6
10-7 10-7
10-8 10-8
10-9 10-9
10-10 10-10
10-1 10-1
10-2 10-2
10-3 10-3
10-4 10-4
8 10-5 10-5
10-6 10-6
10-7 10-7
10-8 10-8
10-9 10-9
107
Anexo D
Imgenes de siembras realizadas de BHI para conteo
Hora 0:
Hora 12:
Hora 16:
108
Hora 24:
Hora 32:
109
Anexo E
Imgenes de siembras realizadas de suero de leche para conteo
Hora 0
Hora 4:
Hora 8:
110
Hora 16:
Hora 32:
111
Anexo F
Muestras colorimetra DNS
112
Anexo G
Clculos UFC/mL
BHI:
0 = 590 10 104 = 59106
4 = 420 10 106 = 42108
8 = 766 10 106 = 77108
12 = 560 10 107 = 56109
16 = 1284 10 107 = 131010
20 = 264 10 108 = 261010
24 = 392 10 109 = 391011
28 = 236 10 109 = 241011
32 = 24 10 109 = 241010
Suero de leche:
0 = 216 10 105 = 22107
4 = 13 10 107 = 13108
8 = 23 10 107 = 23108
12 = 7 10 108 = 70108
16 = 30 10 108 = 30109
113
20 = 10 10 108 = 10109
24 = 2 10 108 = 20108
28 = 3 10 108 = 30108
32 = 1040 10 106 = 10109
114
Anexo H
Concentraciones de curva de calibracin
2 2
1 =
1
Solucin 0,5 g/L de glucosa.
10 0,5 /
0,5 = = 2,5
2 /
115
Anexo I
Concentraciones de glucosa en muestras de BHI y suero de leche
BHI:
0,0021
( ) =
0,541
0,276 0,0021
0 ( ) = = 5,063 /
0,541
0,23 0,0021
4 ( ) = = 4,213 /
0,541
0,198 0,0021
8 ( ) = = 3,621 /
0,541
0,182 0,0021
12 ( ) = = 3,325 /
0,541
0,170 0,0021
16 ( ) = = 3,104 /
0,541
0,152 0,0021
20 ( ) = = 2,771 /
0,541
0,133 0,0021
24 ( ) = = 2,420 /
0,541
0,127 0,0021
28 ( ) = = 2,309
0,541
0,144 0,0021
32 ( ) = = 2,623 /
0,541
Suero de leche:
0,377 0,0021
0 ( ) = ( ) 10 = 69,298 /
0,541
0,349 0,0021
4 ( ) = ( ) 10 = 64,122 /
0,541
0,337 0,0021
8 ( ) = ( ) 10 = 61,904 /
0,541
0,319 0,0021
12 ( ) = ( ) 10 = 58,577 /
0,541
116
0,298 0,0021
16 ( ) = ( ) 10 = 54,695 /
0,541
0,292 0,0021
20 ( ) = ( ) 10 = 53,586 /
0,541
0,301 0,0021
24 ( ) = ( ) 10 = 55,250 /
0,541
0,312 0,0021
28 ( ) = ( ) 10 = 57,283 /
0,541
0,325 0,0021
32 ( ) = ( ) 10 = 59,686 /
0,541
117
Anexo J
Calculo de rendimientos instantneos biomasa sustrato
=
BHI:
(9,6232 7,7709)
0 4 = = 2,179
4,213 5,063
(9,8865 9,6232)
4 8 = = 0,445
3,621 4,213
(10,7482 9,8865)
8 12 = = 2,914
3,325 3,621
(11,1139 10,7482)
12 16 = = 1,649
3,104 3,325
(11,415 11,1139)
16 20 = = 0,905
2,771 3,104
(12,5911 11,415)
20 24 = = 3,349
2,42 2,771
Suero de leche:
(9,1139 8,3424)
0 4 = = 0,149
64,122 69,298
(9,3617 9,1139)
4 8 = = 0,112
61,904 64,122
(9,8451 9,3617)
8 12 = = 0,145
58,577 61,904
(10,4771 9,8451)
12 16 = = 0,163
54,695 58,577
118
Anexo K
Calculo de volmenes para el pretratamiento de caldos de fermentacin
2 2
1 =
1
Volumen de etanol:
100 1% /
1 = = 1,429
70% /
Volumen de sulfato dodecil sdico:
100 0,03% /
1 = = 0,6
5% /
Masa de cloruro de sodio:
0,15 58,44 1
1 = 100 = 0,877
1 1 1000
119
Anexo L
Cartas Cromatografa liquida de alta resolucin
Muestra BHI 1:
120
Muestra BHI 2:
121
Muestra suero de leche 1:
122
Muestra suero de leche 2:
123
Muestra patrn de cido hialurnico diluido:
124
Muestra patrn de cido hialurnico:
125
Anexo M
Reportes obtenidos de Polymath V6.10.
126
Modelo de crecimiento microbiano para suero de leche:
127
Consumo de sustrato para BHI:
128
Consumo de sustrato para BHI:
129
Consumo de sustrato para suero de leche:
130
Anexo N
Protocolo prueba Carbazol para cuantificacin de cido hialurnico
La prueba es basada en la reaccin de cido urnico con Carbazol que forman
compuestos que generan color. 68
Para cuantificar cido hialurnico producido a partir de una fermentacin
microbiana es necesario realizar un pretratamiento para acondicionar la muestra y
obtener resultados correctos y coherentes en las pruebas.
Pretratamiento:
Con el fin de lisar las clulas y evitar que continen con la actividad metablica se
adiciona etanol y se calcula su cantidad utilizando la ecuacin 1 = 2 2 .
1
Para evitar que las clulas puedan intervenir en los resultados de las pruebas se
realiza una microfiltracin (0,2 m) para eliminar las clulas.
Es necesario eliminar los azcares como la glucosa y otros que pueden reaccionar
con Carbazol para dar se realiza un lavado a la muestra con un disolvente
orgnico al 70% que puede ser acetona.
Una vez lista la muestra se realiza el siguiente protocolo. 69
Colocar en un tubo de ensayo:
5 mL de la solucin de Tetraborato de sodio 0.025M en cido sulfrico
concentrado.
1 mL de la solucin problema
Mezclar y calentar en bao de agua hirviente por 10 min.
Aadir 0.2 mL de Carbazol 0.125% en etanol absoluto, agitar y dejar en el bao
durante 5 min ms.
Dejar enfriar y leer en el espectrofotmetro a 530 nm.
68 JUNG-MIN, Song ,JONG-HYUNK, Im y JAE-HOON, Kang. A simple method for hyaluronic acid
quantification in culture broth.
69 Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Laboratorio de Alimentos I. Procedimientos.
131
Ajustar previamente con un blanco.
La concentracin se calcula a partir de una curva patrn realizada de la misma
forma con cido hialurnico patrn en concentraciones de 4 a 40 g/mL.
132