Sntesis en E.

coli de compuestos aromticos con aplicacin industrial

mediante la introduccin de genes heterlogos (caso melanina).

Resumen

Uno de los compuestos de mayo distribucin en la naturaleza aes la melanina.

Las melaninas absorben la luz UV, actan como intercambiadores catinicos
semiconductores amorfos, biopolmeros de unin a drogas, protectores de rayos X
y gama, adems de proporcionar actividad antioxidante y antiviral. Gracias a estas
propiedades se ha despertado inters de producirla para obtener un uso
teraputico. Por lo tanto, se debe de elegir un microorganismo donde sea fcil y
rpido sintetizar este compuesto a travs de su ruta metablico, un ejemplo claro
es Escherichia coli.

La bacteria Escherichia coli ha sido utilizado en procesos biotecnolgicos, como

cepa hospedero para la expresin de genes propios, as como de otras especies
(heterlogos) con el objetivo de producir protenas y metabolitos especficos.
Generalmente, es necesario un nivel de expresin alto de los genes de inters
para producir grandes cantidades de la protena requerida, para lo cual se hace
uso de plsmidos en los que se introduce el DNA forneo bajo el control de un
promotor fuerte.

Las tcnicas de ingeniera gentica permiten el aislamiento de genes de cualquier

organismo y su modificacin para que sean funcionales en otra especie. Siguiendo
este esquema, ha sido posible generar cepas de E. coli con la capacidad de
sintetizar protenas humanas de uso teraputico. De la misma manera, se ha
logrado la transferencia a E. coli de genes que codifican para enzimas y con esto
modificar su metabolismo. Es as como se abre la posibilidad de dotar a esta
bacteria con la capacidad de sintetizar metabolitos que se encontraran
normalmente fuera de su repertorio natural.

En el presente trabajo, se muestra varios estudios previos, donde se estudia la

ruta metabolica que sigue esta bacteria, para sntesis de melanina, desde la
composicin del sustrato y como va de una reaccin a otra hasta llegar as al
producto final de inters.

Introduccin

La melanina es uno de los pigmentos ms comunes y de mayor distribucin en la

naturaleza. Es responsable de la coloracin de plantas y animales; se encuentra
en los ojos, el cabello, la piel, el plumaje, la cscara de los huevos, la cutcula de
los insectos, la tinta de los cefalpodos y en la pared y el citoplasma de muchos
microorganismos. La melanina tambin funciona como sistema de evasin de los
mecanismos inmunolgicos del husped. Se sabe que la melanina de la uva tiene
propiedades inmunomoduladores, principalmente en la disminucin de las
citocinas de tipo pro inflamatorias. (1)

Las melaninas absorben la luz UV, actan como intercambiadores catinicos,

semiconductores amorfos, biopolmeros de unin a drogas, protectores de rayos X
y gama, adems proporcionan actividad antioxidante y antiviral. (2) Gracias a
estas propiedades se a despertado inters de producirla para obtener un uso
teraputico. Por lo tanto, se debe de elegir un microorganismo donde sea fcil y
rpido sintetizar este compuesto a travs de su ruta metablica, un ejemplo claro
es Escherichia coli.

La bacteria Escherichia coli ha sido utilizado en procesos biotecnolgicos, como

cepa hospedero para la expresin de genes propios, as como de otras especies
(heterlogos) con el objetivo de producir protenas y metabolitos especficos.
Generalmente, es necesario un nivel de expresin alto de los genes de inters
para producir grandes cantidades de la protena requerida, para lo cual se hace
uso de plsmidos en los que se introduce el DNA forneo bajo el control de un
promotor fuerte. (5)

La va de sntesis de compuestos aromticos es una fuente de metabolitos

esenciales, as como de un gran nmero de los llamados metabolitos secundarios
en bacterias y plantas. Actualmente, la mayora de los compuestos aromticos
utilizados en la industria qumica y de alimentos se obtienen por procesos de
sntesis qumica, empleando derivados de pe- trleo como materia prima.
Frecuentemente, este tipo de procesos genera subproductos que contaminan el
medio ambiente. Utilizando la ingeniera gentica de vas metablicas y de
protenas, es posible desarrollar cepas bacteria- nas con el potencial para
sintetizar molculas tiles, hasta ahora slo obtenidas mediante sntesis qumica.
Estas cepas bacterianas utili- zarn a la glucosa u otras fuentes renovables de
carbono como materia prima en procesos biotecnolgicos no contaminantes.

Las tcnicas de ingeniera gentica permiten el aislamiento de genes de cualquier

organismo y su modificacin para que sean funcionales en otra especie. Siguiendo
este esquema, ha sido posible generar cepas de E. coli con la capacidad de
sintetizar protenas humanas de uso teraputico. De la misma manera, se ha
logrado la transferencia a E. coli de genes que codifican para enzimas y con esto
modificar su metabolismo. Es as como se abre la posibilidad de dotar a esta
bacteria con la capacidad de sintetizar metabolitos que se encontraran
normalmente fuera de su repertorio natural. En el caso de los compuestos
aromticos, existen ya varios ejemplos de cmo se pueden extender las vas
biosintticas naturales para que este microorganismo pueda sintetizar nuevos
compuestos.

Microorganismo y su clasificacin

Dominio: Bacteria
Reino: Bacteria
Filo: Proteobacteria
Clase: Gammaproteobacteria
Orden: Enterobacteriales
Familia: Enterobacteriaceae
Gnero: Escherichia
Especie: Escherichia coli
Medio de cultivo:

Por lo general la cepa crece en medio slido agar 1.5% Luria, el cual contiene 10
g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura y 5 g/l de NaCl Luria-Bertani y en el
medio mineral M9, en cual contiene por litro : 6 g Na2HPO4 ; 3 g KH2PO4; 1 g
NH4Cl; 0.5 g NaCl; 1 ml de solucin MgSO4 7H2O 1M;1 ml de solucin CaCl2
0.1M; 1 ml de solucin tiamina 1mg/ml; y 10 ml de solucin de glucosa 20%, es
decir a una concentracin inicial de glucosa de 2 g/l agar 1.5%, ambos
suplementados con 2 g/l de glucosa, 200 g/ml de ampicilina y 2g/l de tirosina.(
16). Despus se pasa a medio de la misma composicin, pero lquido.

Condiciones: 37C por aproximadamente 24 horas, hasta que se forman colonias

de aproximadamente 1.5 mm de dimetro.

Se transfieren de 3 a 5 colonias a un tubo de ensaye estril, conteniendo 1 ml del

medio lquido correspondiente, se resuspenden y se trasfirieren a un matraz de
500 ml con 100 ml del medio de cultivo respectivo. Se incuban a 37C y 250 rpm
(incubadora C24KC, New Brunswick Scientific), aproximadamente por 12 h hasta
que alcancen una DO 600nm 1.5. (16)

Ruta metablica para la sntesis de melanina utilizando E. coli

Escherichia coli y muchos otros microorganismos sintetizan metabolitos

aromticos a partir de la va del shikimato (VSHK), que inicia con la reaccin de
condensacin del fosfoenolpiruvato (PEP) y de la eritrosa-4-P (E4P),
intermediarios de la gluclisis y de la va de las pentosas, respectivamente, para
formar 3-deoxi-D-arabinoheptulosonato 7-fosfato (DAHP). Esta primera reaccin
de la VSHK, es catalizada en E. coli por cada una de las tres isoformas de la
enzima DAHP sintasa (DAHPS), AroF, AroG y AroH, codificadas por los genes
aroG, aroF y aroH, respectivamente. Estos genes estn sujetos a control
transcripcional y alostrico por la fenilalanina, tirosina y triptofano,
respectivamente. El DAHP es convertido a 3-dehidroquinato (DHQ), por accin de
la enzima 3-DHQ sintasa, codificada por el gen aroB. El DHQ es deshidratado
para rendir 3-dehidroshikimato (DHS) por accin de la enzima 3-DHQ
deshidratasa, codificada por el gen aroD. El DHS es reducido a shikimato (SHK)
con el consumo de NADH por la enzima SHK deshidrogenasa, codificada por la
enzima aroE. El SHK es convertido a shikimato-3-P (S3P), por las enzimas
Shikimato cinasa I y II, codificadas respectivamente por los genes aroK y aroL. El
S3P es convertido a 5-enolpiruvilshikimato-3-P (EPSP), por la enzima 5- EPSP
sintasa, codificada por el gen aroA. Este ltimo intermediario es convertido a
corismato por la enzima Corismato sintasa, codificada por el gen aroC (3). Ah es
cuando la enzima tirosinasa sintetiza el corismato a L-tirosina y posteriormente la
accin de la Rhizobium etil codificara al gen MelA para convertir la tirosina en
melanina. Esto se logra apreciar en la figura 1 y 2.

Figura 1. Ruta metablica de E. coli para sntesis de melanina. (4)

Figura 2. Metabolismo central de carbono y va de sntesis de compuestos aromticos en
E. coli. (3)

En bacterias como E. coli, el repertorio metablico de compuestos derivados de la

va aromtica es limitado. Sin embargo, si se considera la totalidad de los
organismos que poseen esta va, es posible observar la gran diversidad en com-
puestos que se derivan de la misma.

Entre los compuestos aromticos con un papel protector se encuentran las

melaninas. Estos son pigmentos que se han identificado en organismos desde
bacterias hasta el hombre. Existen varios tipos de melaninas, uno de ellos, las
eumelaninas, provienen de la transformacin de la tirosina por medio de la accin
de la enzima tirosinasa (Cabrera-Valladares et al., 2006). Se sabe que la melanina
puede actuar como foto protector, intercambiador catinico, agente quelante,
semiconductor amorfo, y posee actividades antioxidantes y antivirales. Las
melaninas se pueden obtener mediante extraccin a partir de tejidos animales o a
partir de cultivos de bacterias u hongos.
Debido a las limitaciones de los mtodos descritos anteriormente, existe el inters
en el desarrollo de cepas microbianas modificadas que permitan la sntesis de
melanina qumica- mente homognea y con un nivel de produccin elevado. Los
procesos desarrollados a partir de estas nuevas cepas han tenido un xito limitado
debido a que estas cepas no han sido modificadas para sobre producir
compuestos aromticos. Adems, se han utilizado genes que codifican para
tirosinasa provenientes de hongos, los cuales no se expresan adecuadamente en
E. coli.

Tomando en cuenta estos antecedentes, se decidi trabajar en el desarrollo de

cepas de E. coli con una alta capacidad de produccin de melanina. Esta bacteria
carece de la capacidad natural para sintetizar este polmero; sin embargo, existen
otras bacterias que s pueden hacerlo. Considerando lo anterior, se decidi utilizar
las tcnicas de ingeniera gentica para transferir de alguna de estas bacterias a
E. coli el gene que codifica para una tirosinasa. De las bacterias que se sabe
pueden producir melanina, se eligi a Rhizobium etli como organismo donador del
gene de la tirosinasa. R. etli es una bacteria del suelo que se asocia con las
plantas de frijol para ayudarles a fijar nitrgeno y con esto mejorar su capacidad
de crecimiento. Con base en la informacin sobre el genoma de esta bacteria, se
dise una estrategia para aislar el gene melA que contiene la informacin para la
sntesis de la enzima tirosinasa. El gene melA fue aislado e introducido a la
bacteria E. coli. expresin de este gene en la bacteria permiti la generacin de
una cepa recombinante de E. coli que adquiri la capacidad de sintetizar me-
lanina a partir de tirosina (Cabrera-Valladares et al., 2006) (figura 3). Con esta
cepa recombinan- te de E. coli se desarroll un proceso fermentativo con el cual
se logr producir hasta 6 g/l de melanina en la escalas de 1, 10 y 100 litros
(Lagunas-Muoz et al., 2006).

A la fecha, se contina mejorando la produccin de melanina a partir de clulas

completas de E. coli. Sin duda uno de los principales retos es producir el pigmento a
partir de fuentes de carbono de menor precio que la tirosina. Esto se puede lograr
manipulando el metabolismo central del carbono, es decir, canalizando la glucosa
hacia la formacin de los precursores de los aminocidos aromticos (fosfoenol
piruvato y eritrosa- 4-fostato) y eliminando la regulacin de la va de produccin de
tirosina. En trabajos previos se han utilizado estrategias similares para maximizar la
produccin de fenilalanina (Bez et al., 2004). Sin embargo, acoplar la produccin de
melanina a la generacin de tirosina requerir de la aplicacin de estrategias
novedosas de la ingeniera de vas metablicas para lograr un proceso de alto
rendimiento. Aunado a esto, el desarrollo de estos catalizadores proveer del
conocimiento necesario para producir melaninas de diversos colores, que tienen
diferentes propiedades y aplicaciones en campos tan diversos como el de salud,
cosmetologa, biolgicos, de barnices y pinturas, de sntesis qumica y fabricacin de
polmeros conductores de electricidad, entre otros.

Lado izquierdo de la caja: cepa de E. coli silvestre (no productora de

melanina). Lado derecho: cepa de E.coli modificada por tcnicas de
ingeniera metablica para producir melanina.
Referencias

1. Urn, M. E., & Cano, L. E. (2011). Melanina: implicaciones en la patognesis de

algunas enfermedades y su capacidad de evadir la respuesta inmune del
hospedero. Infectio, 12(2).
2. Lagunas, V. H., Cabrera, N., Bolvar, F., & Gosset, G. ESTUDIO PARAMETRICO
PARA LA PRODUCCIN DE MELANINA EN Escherichia coli RECOMBINANTE.
3. Escalante, A., Valdivia, A., Gosset, G., & Bolvar, F. (2009). INGENIERA DE VAS
METABLICAS EN Escherichia coli PTSPARA LA OBTENCIN DE CEPAS
SOBREPRODUCTORAS DE SHIKIMATO. MENSAJE BIOQUMICO, 33.
4. Martnez A., Gosset G. (2007). Ingeniera metablica de bacterias. De UNAM.
Sitio web: http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/libro_25_aniv/capitulo_32.pdf
5. Sabido, A., Martnez, A., Bolvar, F., & Gosset, G. Generacin de un
Sistema para la Integracin y Expresin de Genes en el Cromosoma de
Escherichia coli.
6. Bez, J. L. et al., Metabolic engineering and protein direc- ted evolution
increase the yield of L-phenylalanine synthesized from glucose in
Escherichia coli, en Biote- chnol. and Bioeng., 87, 2004.
7. Cabrera-Valladares, n. et al., Expression of the melA gene from Rhizobium
etli CFn42 in Escherichia coli and cha- racterization of the encoded
tyrosinase, en Enzyme Microb. Technol., 38, 2006.
8. Flores, S. et al., Analysis of carbon metabolism in Escheri- chia coli strains
with an inactive phosphotransferase system by 13C labeling and nMR
spectroscopy, en Me- tab. Eng., 4, 2002.
9. Huerta-Beristin, G. et al., Ingeniera metablica para in- crementar el flux
y rendimiento de etanol en Escheri- chia coli etanolognica, en Revista
Mexicana de Inge- niera Qumica, vol. 4, 2005.
10. Ingram, L. O. et al., Enteric bacterial catalyst for fuel etha- nol production,
en Biotechnology Progress, 15, 1999.
11. LaDuca, R. J. et al., Metabolic pathway engineering of aro- matic
compounds, en Davies y Demain (eds.), Manual of industrial microbiology
and biotechnology, Was- hington, American Society for Microbiology, 1999.
12. Lagunas-Muoz, V. H. et al., Optimum melanin produc- tion using
recombinant Escherichia coli, en J. Appl. Microbiol., 101, 2006.
13. Martnez, A. et al., Etanol carburante a partir de bagazo de caa?, en
Claridades Agropecuarias, 2006.
14. Olmos, J. et al., Production in Escherichia coli of a rat chi- meric proinsulin
polypeptide carrying human A and B chains and its preparative
chromatography, en J. Bio- technol., 38, 1994.
15. Stephanopoulos, G., Metabolic fluxes and metabolic en- gineering, en
Metabolic Engineering, 1, 1999.
16. Lagunas, V. H.. (Enero 2004). Estudio paramtrico para la produccin de
melanina en Escherichia coli recombinante. Celaya, Guanajuato. Instituto
Tecnolgico de Celaya Recuperado de
http://www.ibt.unam.mx/alfredo/VictorHugoLagunas.pdf