Manual Microbiologia

Universidad Autnoma de Tlaxcala
Facultad de Ciencias Bsicas

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Manual de Prcticas de
Microbiologa
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NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA
Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar las mochilas, libros y otros objetos
personales en el lugar que se les indique para tal fin.
Llevar puesta la bata de laboratorio en todo momento. La misma debe permanecer

completamente cerrada.
Limpiar y descontaminar las superficies de trabajo, antes de comenzar y al finalizar la

sesin prctica.
Lavar las manos con agua y jabn antes de realizar las actividades programadas,
antes de salir del laboratorio y siempre despus de manejar materiales que se sabe o
se sospecha que son contaminantes.
Trabajar cerca de la mesa, adoptando una buena postura y estando fsicamente

cmodo.
Mantener el rea de trabajo ordenada, limpia y desinfectada, antes, durante y despus

de realizar sus actividades.
Llevar un calzado apropiado, preferiblemente cerrado y de suela antideslizante en las

reas de laboratorio.
Evitar llevar en el laboratorio, accesorios que podran ser fuente de contaminacin

(por ejemplo joyas).
Recoger el cabello largo.
No comer, beber, fumar, almacenar comida, objetos personales o utensilios, aplicarse

cosmticos ni ponerse o quitarse lentes de contacto en ningn rea del laboratorio.
Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear antes de iniciar las
actividades indicadas en la prctica.
Mantener las mesas libres de libros, cuadernos u objetos personales, excepto aquellos
equipos y materiales necesarios para la realizacin del trabajo prctico.
Tener cuidado con el alcohol cuando manipule el mechero. Nunca debe dejar ste
desatendido.
Regresar los reactivos y equipos empleados (microscopio, mechero, etc.), limpios y de

manera ordenada a su respectivo lugar una vez finalizada la actividad. Reporte
cualquier dao de los mismos al profesor.
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Colocar los materiales de vidrio contaminados en los recipientes dispuestos para tal fin,
por ejemplo: las pipetas en los pipeteros, tubos y placas en las ollas de material sucio,
etc.
No usar ningn reactivo que no est debidamente identificado, verificar las etiquetas de
los mismos y estar seguro de cmo emplearlo.
No devolver sustancias a sus envases originales.
Emplear la propipeta al medir lquidos biopeligrosos.
Realizar solamente aquellas actividades indicadas por el profesor, no llevar a cabo

experimentos no autorizados.
Reportar inmediatamente cualquier accidente al profesor (derrame de material

contaminado, heridas, quemaduras, etc.), ninguno ser catalogado como menor.
Reducir al mnimo la formacin de aerosoles durante la realizacin de cualquier trabajo

prctico.
Extremar las precauciones cuando se utilicen agujas y jeringas para evitar la

inoculacin accidental y la generacin de aerosoles durante su manipulacin y desecho.
Emplear tcnicas aspticas para el manejo de cultivos de microorganismos.
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PRCTICA 1.
EMPLEO DEL MICROSCOPIO PTICO
OBJETIVO: Al finalizar el estudiante estar en capacidad de:
Reconocer las partes de un microscopio de luz y su funcin respectiva.
Utilizar correctamente un microscopio de luz para observar preparaciones,
montajes y/o frotis.
INTRODUCCIN.
El microscopio es el instrumento ptico que permite apreciar clulas y estructuras

celulares que a simple vista no pueden observarse.
METODOLOGA
Experimento 1.Observacin de epidermis de cebolla
1. Separar una de las hojas interna de la cebolla y desprender la tenue membrana

que est adherida por su cara inferior cncava.
2. Depositar el fragmento de membrana en un porta con unas gotas de agua. Pon
el porta sobre la cubeta de tincin para que caiga en ella el agua y los
colorantes. Si es preciso, estirar el trozo de epidermis con ayuda de dos asas de
platino.
3. Escurrir el agua, aadir una gotas de verde de metilo actico (o azul de metileno)
sobre la membrana y dejar actuar durante 5 minutos aproximadamente. No debe
secarse la epidermis por falta de colorante o por evaporacin del mismo!
4. Con el cuentagotas baar la epidermis con agua abundante hasta que no suelte
colorante.
5. Colocar sobre la preparacin un cubreobjetos evitando que se formen burbujas y
llevarla al microscopio.
6. Observa la preparacin a distintos aumentos, empezando por el ms bajo.
Identifica las distintas clulas del tejido epidrmico y las de las hojas del bulbo de
cebolla.
Experimento 2. Observacin de bacterias del yogurth
1. Realizar el frotis disolviendo una mnima porcin de yogur en una pequea gota
de agua.
2. Fijar con metanol para eliminar parte de la grasa.
3. Teir con un colorante cualquiera de los arriba indicados durante 1-2 minutos.
Observar al mximo aumento del microscopio.
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Experimento 3. Observacin de levaduras del pulque
1. Extiende una gota de pulque sobre un portaobjetos limpio y seco.

2. Permite que la muestra se seque o bien fija por calentamiento leve.
3. Teir con un colorante cualquiera de los arriba indicados durante 1-2 minutos.
Observar al mximo aumento del microscopio.
Experimento 4. Observacin de clulas sanguneas.
1. Con la lanceta estril realizar una puncin en un pulgar.

2. Depositar una gota de sangre en la parte central de un portaobjetos.
3. Colocar un portaobjetos como indica el dibujo y deslizarlo sobre toda la superficie
del porta de manera que se pueda obtener una fina pelcula de sangre.
4. Colocar el frotis de sangre sobre la cubeta de tincin y aadir unas gotas de

alcohol absoluto y dejar que el alcohol se evapore para fijar la preparacin.
5. Cubrir con unas gotas de hematoxilina y dejar actuar durante 15 minutos. Evitar
la desecacin del colorante agregando ms lquido.
6. Lavar la preparacin y aadir unas gotas de eosina dejndola actuar 1 minuto.
7. Volver a lavar hasta que no queden restos de colorante.
8. Dejar secar aireando el porta o bien al calor muy lento de la llama del mechero.
Observar al microscopio.
Experimento 5. Observacin de clulas de tejido adiposo.
1. Con ayuda de un bistur, cortar una finsima capa de grasa, colocarla en un porta
y cubrirla con unas gotas de formol. Dejar actuar 4 minutos.
2. Lavar la muestra con agua y cubrirla con unas gotas de Sudn III. Dejar actuar
unos 5 minutos.
3. Volver a lavar la preparacin con agua, cubrirla con un cubreobjetos y observar
al microscopio.
Experimento 6. Observacin de microorganismos presentes en agua estancada.
1. Recolectar una muestra de agua estancada (charco, floreros, etc.)

2. Con un asa de siembra tomar una gota y colocarla sobre un portaobjetos, cubrir
con un cubreobjetos y observar directamente.
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Procedimiento para efectuar observaciones al microscopio.

1. Colocar sobre la platina la lmina portaobjeto con la muestra colocada en la
parte superior. Situar cuidadosamente la parte que va a examinar sobre el
agujero central de la platina.
2. Ajustar la fuente de iluminacin hasta que pase la mayor cantidad de luz a travs
de la muestra. El diafragma y el condensador, se deben ajustar hasta que la luz
cubra todo el campo visual.
3. Seleccionar el objetivo adecuado y con el tornillo macromtrico aproximar a la
lmina el tubo del microscopio hasta que los separe aproximadamente la
distancia focal adecuada.
4. Observar por el ocular, con ambos ojos abiertos, aproximando lentamente el
objetivo, con ayuda del tornillo macromtrico.
5. Enfocar totalmente la muestra con el tornillo micromtrico y ajustar el diafragma y
el condensador hasta lograr una buena iluminacin, es decir, ni demasiado
brillante ni demasiado oscuro.
Enfoque con el objetivo de inmersin.

El enfoque con el objetivo de inmersin se debe realizar con mayor cuidado, pero el
procedimiento es esencialmente el mismo.
1. Enfocar primero con el objetivo de mediano aumento (40 X) un rea conveniente.
2. Levantar el tubo y colocar el objetivo de inmersin girando el revolver hasta que
ste encaje.
3. Colocar una gota de aceite de inmersin sobre la muestra.
4. Bajar cuidadosamente el objetivo de inmersin, observando lateralmente, hasta
que el objetivo quede sumergido en el aceite.
5. Enfocar la imagen con el tornillo micromtrico. Este enfoque debe lograrse casi
inmediatamente, puesto que la distancia de trabajo del objetivo de inmersin es
relativamente corta.
6. Ajustar el condensador y diafragma hasta lograr la iluminacin adecuada.
Una vez realizadas las observaciones:

1. Anotar lo observado.
2. Remover todo el aceite de inmersin que queda sobre el objetivo con un papel
especial que le suministrar el profesor.
3. Guardar el microscopio.
RESULTADOS Y OBSERVACIONES.
Dibujar en los crculos lo observado, anotando el objetivo utilizado y el aumento final
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Preparacin No. 1
Objetivo: _______
Ocular: ________
Aumento: ______
Descripcin de lo observado:
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Preparacin No. 2
Objetivo: _______
Ocular: ________
Aumento: ______
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Preparacin No. 3
Objetivo: _______
Ocular: ________
Aumento: ______
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CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFA
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PRCTICA 2.
TCNICAS BSICAS DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA
OBJETIVO: Al finalizar el trabajo prctico el estudiante estar en capacidad de:

Desinfectar las mesas al comenzar y al finalizar cada sesin de trabajo.
Preparar adecuadamente el material de vidrio a utilizar en un laboratorio de
microbiologa, previo al proceso de esterilizacin.
Preparar adecuadamente medios de cultivo a partir de sus ingredientes y a partir
de medios de cultivo deshidratados.
INTRODUCCIN
Disminuir la contaminacin de las mesas de trabajo, previamente limpiados, utilizando
desinfectantes.
Al acondicionar adecuadamente el material de vidrio, se puede mantener su esterilidad
hasta el momento de su uso.
La preparacin adecuada de un medio de cultivo nos permite disponer de los nutrientes
y condiciones necesarias para favorecer el crecimiento de los microorganismos en el
laboratorio.
METODOLOGA.
I. Limpieza de mesas de trabajo

1. Verificar que sobre la mesa de trabajo no exista polvo, basura, etc.
2. Si la mesa se encuentra con suciedad adherida limpiar con agua y jabn. Secar.
3. Impregnar una toalla desechable con solucin desinfectante (compuesto de amonio
cuaternario, solucin de hipoclorito de sodio, solucin diluida de fenol, etc.)
4. Pasar la toalla con el desinfectante sobre la superficie sobre el mesa de trabajo
haciendo trazos paralelos de atrs hacia delante. Dejar secar la solucin desinfectante
antes de comenzar a trabajar.
5. Repetir el procedimiento al finalizar el trabajo prctico.
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II. Preparacin de material.

Cada estudiante preparar el siguiente material de vidrio:
Hisopos
1. Preparar un hisopo colocando un trozo de algodn en forma envolvente sobre un
palillo de madera.
2. Envolver en papel Craft y sellar con cinta testigo.
Tubos de ensayo
1. Colocar a cada tubo una tapa plstica o de metal o una torunda de algodn,
siguiendo las instrucciones dadas por el profesor.
2. Colocar los tubos preparados en una cesta destinada para tal fin.
3. Cubrir la cesta con papel Craft.
Matraces.
1. Colocar un tapn de algodn siguiendo las instrucciones dadas por el profesor.
2. Cubrir el algodn con una porcin de papel Craft
NOTA: cuando se utiliza algodn para cubrir tubos, matraces se debe tomar la
precaucin de que ste pueda ser manipulado con facilidad, para ello no debe quedar ni
muy apretado ni muy flojo y debe alcanzar aproximadamente 3 cm dentro del material
de vidrio.
Pipetas
1. Colocar una pequea torunda de algodn en el extremo superior de la pipeta.
2. Envolver completamente con papel Craft, segn las indicaciones dadas por el
profesor; si se cuenta con portapipetas metlicos no se requiere envolver con papel.
3. Rotular, por la parte externa del papel, la capacidad de la pipeta. Por ejemplo: 5 mL,
1 mL, etc.
Placa de Petri.
1. Envolver con papel Craft siguiendo las indicaciones del profesor. Se pueden utilizar
portacajas.
Todo el material preparado se esteriliza empleando calor seco o calor hmedo de

acuerdo con las indicaciones de su profesor.
III. Preparacin de medios de cultivo.

1. Leer cuidadosamente las instrucciones de preparacin del medio de cultivo asignado.
2. Pesar la cantidad exacta del medio deshidratado o las porciones correctas de cada
uno de los ingredientes. Cerrar inmediatamente el frasco de medio de cultivo.
3. Disolver la porcin pesada de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Si es
necesario calentar se debe tener cuidado de no sobrecalentar.
4. Ajustar el pH final de cada lote de medio preparado, preferiblemente a temperatura
ambiente (25C). Para ello se debe tomar una alcuota de 50 mL, medir el pH y de ser
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necesario ajustar al pH indicado utilizando HCl 0,1N o NaOH 0,1N. Luego hacer el
ajuste de pH al resto del medio de cultivo utilizando la solucin correspondiente pero
1N.
5. Distribuir el medio de cultivo de acuerdo a las indicaciones sealadas por el profesor.
6. Identificar el lote de medio de cultivo preparado indicando su nombre, distribucin y
fecha de preparacin.
7. Esterilizar de inmediato el medio de cultivo siguiendo las instrucciones sealadas en
el frasco de medio de cultivo.
Si se presenta algn inconveniente, antes de su esterilizacin, el medio se puede

almacenar por un periodo mximo de 12 horas bajo refrigeracin. Una vez que el medio
de cultivo ha sido preparado y esterilizado es esencial que se efecten controles para
confirmar que el medio es satisfactorio y cumple con el propsito de uso deseado. Por
ello se deben realizar pruebas para verificar la esterilidad, pH, capacidad de promocin
de crecimiento, etc.
Una vez preparado todo el material de vidrio se somete a esterilizacin.
Una vez que el material ha sido sometido al proceso de esterilizacin se pueden

realizar ensayos muy sencillos para verificar su esterilidad. Generalmente estos
ensayos consisten en colocar una muestra del material esterilizado en contacto con un
medio de cultivo estril, el cual, despus de ser incubado a 35C + 2C por 24 48 h,
se observa para determinar si hay o no evidencia de crecimiento microbiano.
IV. Almacenamiento del material estril.
Una vez que un material est estril, puede mantener esta condicin si est protegido
en la forma apropiada. Es decir, la duracin de la esterilidad de un material no est
relacionada directamente con el tiempo, sino con factores que comprometen su
exposicin al medio ambiente. Los materiales estriles pierden su esterilidad:
Cuando se produce cualquier ruptura, accidental o no, del material que lo
recubre durante su transporte o almacenamiento.
Al humedecerse el material de empaque. Es importante no manipular los
materiales estriles con las manos hmedas, ni colocarlos sobre superficies
mojadas.
Al almacenar los materiales estriles se deben tomar una serie de precauciones, tales
como:
Controlar el acceso a las reas de almacenamiento de materiales estriles.
Mantener el rea de almacenamiento limpia, libre de polvo, basura e insectos.
Controlar la temperatura y la humedad de las reas de almacenamiento.
La temperatura ideal debe estar por debajo de los 26C y la humedad relativa
entre 30 y 60%.
Los periodos prolongados de almacenamiento en lugares tibios y hmedos,
pueden producir condensacin de humedad sobre el material de empaque.
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Utilizar, preferiblemente, estantes cerrados para colocar el material.

Dejar que los materiales que salen del horno o el autoclave alcancen la
temperatura ambiente antes de ser almacenados; de esta forma se evita la
condensacin dentro del empaque.
V. Eliminacin de material contaminado.

A continuacin se presentan algunas medidas que se deben tomar en cuenta para
manipular y eliminar el material contaminado dentro del laboratorio.
No se debe descartar ningn material contaminado directamente al desage ni

en los depsitos de basura.
Todo el material contaminado deber ser colocado en recipientes irrompibles y
resistentes al calor, ubicados en el rea de trabajo.
No se debe retirar el material contaminado una vez que ha sido colocado en los
recipientes destinados a su recoleccin, pues ello puede ocasionar accidentes
por cortaduras, pinchazos o contacto directo con material contaminado.
No se debe pasar el material de un recipiente a otro.
Las pipetas deben descartarse dentro de recipientes plsticos especiales que
contengan en el fondo una solucin desinfectante.
Los materiales punzantes deben descartarse en recipientes especiales a prueba
de perforaciones.
Las lminas porta-objetos, as como los cubre-objetos, se deben descartar
recipientes plsticos especiales que contengan en el fondo una solucin
desinfectante.
Todos los recipientes que contienen material contaminado debern trasladarse al
rea de esterilizacin, lavado y preparacin.
No se deben dejar por ningn motivo, recipientes con material contaminado en
los pasillos o en lugares que no correspondan al rea de trabajo o esterilizacin.
Todo material reutilizable contaminado deber seguir la siguiente secuencia de

tratamiento:
1. Esterilizacin. La esterilizacin por calor hmedo (autoclave) es uno de los
mtodos ms empleados para la descontaminacin de medios de cultivo y cualquier
material que contiene sustancias que se pueden adherir al emplear la esterilizacin por
calor seco (horno).
2. Lavado
3. Secado
4. Preparacin
5. Esterilizacin
6. Almacenamiento
Todo material no reutilizable contaminado deber seguir la siguiente secuencia de

tratamiento:
1. Esterilizacin (autoclave o incineracin)
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2. Eliminacin en bolsas plsticas resistentes bien anudadas. Se recomienda que

el material a desechar se coloque en contacto con una solucin desinfectante
antes de su esterilizacin.
Para manipular los recipientes con material contaminado el personal debe utilizar
guantes resistentes, delantales plsticos, botas, gorros y otros elementos de proteccin,
los cuales deben adaptarse a la tarea que se va a realizar y mantenerse en buenas
condiciones de higiene.
En caso de que se produzca la ruptura de uno de los guantes, ste debe retirarse y
descartase en bolsas plsticas; inmediatamente el analista debe lavar sus manos con
abundante agua y jabn, colocar una solucin antisptica y colocar un nuevo par de
guantes.
Se deben mantener en ptimas condiciones de higiene todos los recipientes donde se
coloca el material contaminado y las reas de disposicin final del material de desecho.
CLCULOS:
Cantidad de medio de cultivo a emplear
RESULTADOS Y OBSERVACIONES
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFIA
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PRCTICA 3.
LA OMNIPRESENCIA DE LOS MICROORGANISMOS.
OBJETIVO. Al finalizar el trabajo prctico el estudiante estar en capacidad de:

Comprobar la existencia de los microorganismos en diversos ambientes,
superficies corporales, lquidos y objetos inanimados.
INTRODUCCIN
Los microorganismos al ser colocados en medios de cultivo slido, se multiplicarn

dando un crecimiento caracterstico.
METODOLOGA
1. Marcar con el nmero de su equipo la tapa de una placa con agar nutritivo y, de
acuerdo a su nmero, seguir el procedimiento que se seala en la tabla de
instrucciones.
2. Tapar la placa e incubar en posicin invertida a 37C durante 48 horas.
EQUIPO # INSTRUCCIN
1 Colocar una gota de saliva sobre el agar y diseminarla mediante un
movimiento de vaivn
2 Abrir la placa sobre la mesa y dejar el agar expuesto al aire durante
10 minutos
3 Toser sobre el agar
4 Tomar un hisopo estril y pasarlo por el piso, luego trazar sobre el
agar varias lneas paralelas con el hisopo
5 Tomar un hisopo estril y pasarlo por la pared, luego trazar sobre el
agar varias lneas paralelas con el hisopo
6 Colocar una gota de agua del chorro sobre el agar y diseminarla
mediante un movimiento de vaivn
7 Colocar una gota de agua destilada sobre el agar y diseminarla
mediante un movimiento de vaivn
8 Colocar una moneda sobre el agar y retirarla despus de unos
segundos de contacto
9 Colocar el dedo pulgar sobre el agar y retirarlo rpidamente. Tomar
una torunda de algodn, impregnarla en alcohol etlico de 70, pasarla
por el dedo pulgar. Dejar evaporar el alcohol y colocarlo nuevamente
sobre el agar.
10 Pasar un hisopo estril por la superficie hmeda del fregadero y
trazar lneas sobre la superficie de la placa
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FCBIT
RESULTADOS Y OBSERVACIONES
Pasadas las 48 horas de incubacin, observar a simple vista y con ayuda de la lupa del
contador de colonias la superficie del agar. Reportar caractersticas de cultivo.
Anotar sus observaciones y dibujar lo observado
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Observar las placas de sus compaeros

Discutir las observaciones y sacar conclusiones sobre los resultados de este trabajo
prctico.
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFIA
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FCBIT
PRCTICA NO. 4
OBTENCIN DE CULTIVOS PUROS

Ejecutar las tcnicas bsicas para el aislamiento de microorganismos en cultivo
puro a partir de una muestra que contiene una poblacin mixta.
INTRODUCCIN
Al diseminar sobre un medio de cultivo slido una muestra de bacterias, diluida
convenientemente, las clulas individuales quedarn lo suficientemente separadas unas
de otras y crecern en forma de colonias aisladas, a partir de las cuales se puede
obtener un cultivo puro.
METODOLOGA
A. Transferencias de medio lquido a medio slido

1. Marcar el tubo de agar nutritivo estril con su nmero equipo y fecha.
2. Agitar el cultivo para resupender la suspensin microbiana. Evitar mojar la tapa del
tubo con el cultivo.
3. Esterilizar el asa a la llama.
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FCBIT
4. Destapar el tubo que contiene el cultivo y flamear su punta. No dejar que la tapa se
contamine colocndola sobre la mesa.
5. Insertar el asa estril en el cultivo y tomar una asada para transferirla al otro tubo
que contiene el medio de cultivo estril.
6. Flamear nuevamente la boca del tubo que contiene el cultivo, tapar y colocar en la
gradilla.
7. Destapar el tubo que contiene agar nutritivo estril y flamear su punta. No dejar que
la tapa se contamine colocndola sobre la mesa.
8. Para inocular el medio slido estril introducir el asa que contiene el cultivo en el tubo
de agar nutritivo estril hasta el fondo del tubo donde comienza el bisel y diseminar el
inculo sobre la superficie del mismo moviendo de lado a lado y hacia arriba hasta
llegar a la punta del bisel.
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FCBIT
9. Flamear nuevamente la punta del tubo y tapar.
10. Esterilizar nuevamente el asa
.
9. Colocar los tubos en su gradilla e incubarlos a 37C por 24 horas.
B. Transferencias de medio slido a medio slido

1. Marcar el tubo de agar nutritivo estril con su nmero equipo y fecha.
2. Esterilizar el asa de platino a la llama.
3. Destapar el tubo que contiene el cultivo y flamear su punta. No dejar que la tapa
se contamine colocndola sobre la mesa.
4. Insertar el asa estril en el cultivo y transferir una porcin a otro tubo que
contenga el medio nutritivo estril.
5. Flamear nuevamente la boca del tubo que contiene el cultivo, tapar y colocar en
la gradilla.
6. Destapar el tubo que contiene el agar nutritivo estril y flamear su punta. No
dejar que la tapa se contamine colocndola sobre la mesa.
7. Para inocular el medio slido estril introducir el asa que contiene el cultivo en el
tubo de agar nutritivo estril hasta el fondo del tubo donde comienza el bisel y
diseminar el inculo sobre la superficie del mismo moviendo de lado a lado y
hacia arriba hasta llegar a la punta del bisel.
9. Esterilizar nuevamente el asa.
C. Transferencias de medio slido a medio lquido
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FCBIT
1. Marcar el tubo de caldo nutritivo estril con su nmero equipo y fecha.

2. Esterilizar el asa a la llama.
3. Destapar el tubo que contiene el cultivo y flamear su punta. No dejar que la tapa
se contamine colocndola sobre la mesa
4. Insertar el asa estril en el cultivo y tomar un asa llena para transferirla al otro
tubo que contiene el medio de cultivo estril.
5. Flamear nuevamente la boca del tubo que contiene el cultivo, tapar y colocar en
la gradilla.
6. Destapar el tubo que contiene el caldo nutritivo estril y flamear su punta. No
dejar que la tapa se contamine colocndola sobre la mesa.
7. Para inocular el medio lquido estril introducir el asa que contiene el cultivo en el
tubo de caldo nutritivo estril. Antes de sacar el asa del tubo tocar las paredes
del mismo para eliminar cualquier exceso de caldo.
9. Esterilizar nuevamente el asa.
D. Preparacin de las placas de aislamiento

(Cada estudiante preparar dos placas)
1. Marcar la tapa de cada placa estril con su nmero de equipo y la fecha.
2. Fundir en un bao de agua hirviendo los tubos con 20 mL de agar nutritivo, luego
de que estn completamente fundidos, colocar en un bao de agua a 50C.
3. Tomar el tubo de agar fundido y enfriado a 50C, secarlo bien por fuera, flamear
la boca del tubo y verter en la placa de Petri los 20 mL del agar.
4. Despus de verter el medio, si es necesario, rotar la placa cuidadosamente para

distribuir el agar en forma homognea, teniendo cuidado de no salpicar la tapa.
5. Dejar solidificar, lo cual ocurre en aproximadamente 10 minutos. Se puede dejar
la tapa ligeramente abierta.
E. Aislamiento
1. Tomar una gota de la suspensin microbiana con el asa de platino estril y fra, y
colocarla sobre el agar en el sitio marcado con una X en la figura siguiente.
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FCBIT
2. Diseminar la muestra haciendo estras con el asa sobre el agar en la direccin

indicada en la figura siguiente.
3. Esterilizar el asa y enfriarla en el centro de la placa, hacer estras en direccin

perpendicular a las estras anteriores como se indica en la figura siguiente.
4. Esterilizar el asa y enfriarla en el centro de la placa, hacer estras en direccin

perpendicular a las estras anteriores como se indica en la figura siguiente.
5. Incubar una de las placas en posicin invertida y en condiciones aerbicas a 37C

por 24 h.
6. Sobre la otra placa de cultivo trazar otro diseo de estras.
7. Observar el crecimiento obtenido en las placas y las caractersticas de cultivo.
F. Transplante
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FCBIT
1. Usando el asa de platino, transferir a un tubo con agar nutritivo inclinado, la colonia
que le indic el profesor, de la que ya anot las caractersticas de acuerdo con lo
indicado en la parte anterior.
2. Incubar a 37C por 24 horas.
RESULTADOS
Anotar lo observado y las caractersticas de cultivo
Dibujar lo observado.
Comparar los resultados con los de otros estudiantes que hayan utilizado
microorganismos diferentes.
CONCLUSIONES.
BIBLIOGRAFIA.
PRCTICA 5.
PREPARACIN DE FROTIS Y OBSERVACIN DE DIFERENTES
MICROORGANISMOS.
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FCBIT
OBJETIVOS. Al finalizar el trabajo prctico el estudiante estar en capacidad de:
Realizar la preparacin de clulas para observarlas al microscopio.

Realizar una tincin simple de bacterias procedentes de distintas muestras
naturales.
Realizar dos tipos de fijaciones bacterianas y saber en qu casos se recomienda
una u otra.
Observar la morfologa bacteriana y aprender a distinguir los distintos tipos de
agrupaciones que existen.
Practicar con el microscopio al mximo aumento y con el correcto empleo del
aceite de inmersin.
INTRODUCCIN.
La fijacin de una extensin bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y
adheridas al vidrio alterando lo menos posible la morfologa y bacteriana y las posibles
agrupaciones de clulas que pudiera haber.
METODOLOGA.
Preparacin del frotis.

Preparacin.
1. Colocar una pequea gota de agua en el centro de un portaobjetos limpio. Es
necesaria muy poca cantidad de agua, por lo que se puede usar el asa de
siembra, ya que en el extremo curvo de su filamento queda retenida una mnima
gota de agua, que resulta suficiente.
2. Flamear el asa de siembra, tomar, en condiciones aspticas, una pequea
cantidad del cultivo bacteriano en medio slido y transferirlo a la gota de agua.
Remover la mezcla con el asa de siembra hasta formar una suspensin
homognea que quede bastante extendida para facilitar su secado.
Si la muestra se toma de un cultivo en medio lquido, no es necesario realizar los
dos primeros pasos ya que basta con colocar y extender una gota de la
suspensin bacteriana, que se toma con el asa de siembra, directamente sobre
el portaobjetos.
3. Esperar hasta que el lquido se evapore o acelerar su evaporacin acercando el
porta a la llama del mechero. En este caso hay que tener mucha precaucin de
no calentar demasiado el porta pues las clulas pueden deformarse o romperse.
Fijacin.
4. Por calor: Pasar tres veces el portaobjetos por la llama durante unos segundos.
Dejar enfriar el porta entre los pases.
5. Con metanol (para bacterias procedentes de medio lquido). Aadir unas gotas
de metanol sobre la extensin completamente seca. Golpear el portaobjetos por
su canto con cuidado contra la mesa de trabajo para retirar de inmediato el
exceso de metanol. Esperar a que el metanol se evapore completamente. Una
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FCBIT
vez realizado el frotis y fijadas las bacterias, las preparaciones pueden ser
observadas al microscopio, aunque carecen de contraste. Lo normal es continuar
con el proceso de tincin.
Tcnicas de tincin.
Experimento 1. Tincin Simple
1. Cubrir el frotis con abundante colorante y dejarlos actuar durante el tiempo

que indique el protocolo de cada tincin concreta. Suele oscilar entre 1 y 5
minutos. En ocasiones el colorante tie slo en caliente, por lo que el tiempo
que dure su actuacin se deber sostener el portaobjetos con unas pinzas
sobre la llama del mechero para que humee el colorante, pero teniendo
mucho cuidado de que no llegue a hervir ya que se producira la destruccin
de las clulas.
2. Lavar la preparacin con agua para eliminar el colorante. Esta operacin se
realiza inclinando el portaobjetos y aplicando el chorro de agua en su parte
superior de manera que resbale sobre el frotis, pero sin que vaya dirigido
directamente sobre l, pues podra arrastrar parte del frotis consigo. Eliminar
la mxima cantidad de agua de los portaobjetos golpendolos por su canto
con cuidado contra la superficie de la mesa de trabajo.
3. Secar el porta presionando entre dos papeles de filtro, pero en ningn caso
se debe frotar el porta.
4. Observar la preparacin al microscopio llegando hasta el mximo aumento. Si
se quiere montar de forma definitiva no se debe usar ahora el aceite de
inmersin.
Experimento 2. Tincin Gram
1. Preparar los frotis bacterianos.

2. Teir con cristal violeta 1min.
3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
4. Cubrir con Lugol 1min.
5. Lavar con agua el exceso de Lugol.
6. Decolorar con alcohol-acetona o simplemente con alcohol hasta que la
preparacin deje de perder color (30seg)
7. Lavar con abundante agua para eliminar el resto de disolvente.
8. Teir con safranina 1min.
9. Lavar con agua para eliminar el colorante de contraste.
10. Secar la preparacin.
11. Examinar al microscopio fijndose sobre todo en el color de cada preparacin.
Los tiempos de exposicin a los colorantes son orientativos. Cada vez que se prepara
la batera de colorantes para realizar la tincin Gram presentan algunas diferencias
respecto a los preparados en otro momento, por lo que puede ser necesario ajustar los
tiempos.
22
___________________________________________________________
FCBIT
En un laboratorio de Microbiologa, cada vez que se preparan los colorantes, se suelen

hacer pruebas con cultivos patrn de los dos tipos (Gram+ y Gram-) para ajustar as los
tiempos y tener la certeza de que el resultado de todas las tinciones que se hagan
mientras duren esos colorantes son fiables.
Experimento 3. Tincin negativa de los microorganismos.
1. Con tcnica asptica coloca 2 o tres asas llenas de suspensin bacteriana sobre
el portaobjetos limpio.
2. Aade una gota llena de nigrosina, mezcla.
3. Extiende el material hasta formar una pelcula delgada (gris, no negra)
4. Seca al aire, no fijes con flama.
5. Examina al microscopio
Experimento 4. Tincin de esporas.
1. Preparar los frotis bacterianos indicados.

2. Teir con verde malaquita. Con unas pinzas de madera colocar la muestra
encima de la llama del mechero para que el colorante humee, pero sin que
hierva, durante 5 min. Aadir ms colorante si la muestra se seca.
3. Lavar con agua el resto de colorante.
4. Teir con safranina 1 min.
5. Lavar con agua el resto de colorante.
6. Secar la preparacin.
7. Observar la preparacin al microscopio
Experimento 5. Morfologa de las levaduras.
1. Preparar un frotis con suspensin de levaduras. Fija a la flama

2. Baa el portaobjetos durante un minuto con solucin de etanol al 40%
3. Lava en la llave.
4. Baa el frotis con solucin de KOH y deja reaccionar por una hora, si se empieza
a deshidratar agrega mas KOH.
5. Lava en la llave. Aplica azul de toluidina por dos minutos.
6. Lava con etanol al 10%, sacude el exceso, seca al aire.
7. Observa al microscopio.
Experimento 6. Preparacin en fresco de mohos.
1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solucin de lactofenol no demasiado

grande para evitar que el cubreobjetos flote y la preparacin quede demasiado
gruesa. Realizar la misma operacin en otro portaobjetos que se usar para lavar
la muestra.
2. Tomar el material a observar en una mnima cantidad con agujas finas o lancetas
procurando arrancarlo desde la base y disponerlo con cuidado sobre la gota de
uno de los portaobjetos. Con esta especie de lavado se consigue desprender el
23
___________________________________________________________
FCBIT
exceso de conidios que casi siempre llenan estas preparaciones y que impiden
ver lo que realmente interesa, los conidiforos.
3. Transportar el material con la lanceta a la gota del segundo portaobjetos que
ser ya el definitivo. Si se trata de hongos con picnidios (estructuras globosas
tapizadas en su interior por los conidiforos), se aplastarn stos ligeramente
sobre la gota o se seccionarn con un bistur.
4. Con agujas muy finas se distribuye el material en la gota de manera que no
quede amontonado.
5. Colocar el portaobjetos poco a poco y empezando por un lado para evitar que se
formen burbujas entre los dos vidrios.
Experimento 7. Preparacin en cinta adhesiva.
1. Colocar sobre un portaobjetos una gota de solucin de lactofenol no demasiado

grande para evitar que el cubreobjetos flote y la preparacin quede demasiado
gruesa.
2. Cortar un trozo de cinta adhesiva transparente de aproximadamente 2cm.
3. Tocar con el lado adhesivo de la cinta la superficie de la fruta o el pan
enmohecidos o el borde de una colonia de hongo de un cultivo. En la zona
central de una colonia puede haber una excesiva concentracin de esporas.
4. Pegar la cinta adhesiva sobre la gota del portaobjetos.
5. Eliminar el colorante sobrante con un papel de filtro.
RESULTADOS Y OBSERVACIONES.
Dibujar en los crculos lo observado, anotando el objetivo utilizado y el aumento
final.
Tincin: __________________
Objetivo: _______
Ocular: ________
Aumento: ______
_________________________
_________________________
_________________________
24
___________________________________________________________
FCBIT
Tincin: __________________ Tincin: __________________

Objetivo: _______ Objetivo: _______
Ocular: ________ Ocular: ________
Aumento: ______ Aumento: ______
Descripcin de lo observado: Descripcin de lo observado:
_________________________ _________________________
_________________________ _________________________
_________________________ _________________________
_________________________ _________________________
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFA
25
___________________________________________________________
FCBIT
PRCTICA 6
FACTORES QUE INFLUYEN EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO.
Comprender el efecto de la temperatura, el oxgeno, el pH y la concentracin de

sales sobre el crecimiento de los microorganismos.
INTRODUCCIN
Las diferentes especies de microorganismos pueden crecer en los ms diversos
ambientes. El tipo de microorganismo que se encuentra en un ambiente dado y la
velocidad a la que ellos pueden crecer puede ser influenciada por una variedad de
factores, tanto fsicos como bioqumicos.
METODOLOGA
A. Influencia de la temperatura
1. Inocular cuatro (4) tubos de agar nutritivo inclinado, utilizando el asa y haciendo
un solo trazo a lo largo del bisel, teniendo cuidado de que el inculo no sea muy
abundante porque dificultara la interpretacin de los resultados.
2. Incubar cada tubo a la temperatura correspondiente, por 24 horas: 4C, 25C,
37C y 55C
Resultados: Anote crecimiento y abundancia relativa
B. Requerimientos de oxgeno
1. Examinar los tubos de tioglicolato. Si ms de un tercio del medio est rosado,
colocar los tubos en un bao de agua hirviendo por unos minutos para expulsar
el oxgeno disuelto, enfriarlos en un bao de agua fra. Evitar agitar los tubos
despus del calentamiento para prevenir la reabsorcin de oxgeno.
2. Marcar los tubos con su nmero de equipo y la fecha e inocular hasta el fondo
del tubo, con el asa, tomando una pequea porcin del cultivo que le suministre
el profesor. Agitar cuidadosamente el tubo o rotarlo entre las palmas de las
manos para obtener una buena dispersin del inculo,
3. Incubar por 48 horas a 37C.
4. Despus de la incubacin, observar los tubos inoculados y comparar el
crecimiento en los tubos con la figura siguiente.
26
___________________________________________________________
FCBIT
C. Influencia del pH
1. Inocular con el asa de platino, usando como inculo el microorganismo que le
suministre el profesor, cada uno de los medios siguientes:
a. Caldo nutritivo pH 3.0
b. Caldo nutritivo pH 5.0
c. Caldo nutritivo pH 7.0
d. Caldo nutritivo pH 9.0
D. Influencia de la concentracin de sales.

1. Inocular con el asa de platino, usando como inculo el microorganismo que le
suministre el profesor, cada uno de los medios siguientes:
a. Agar nutritivo (normalmente contiene 0,8 % de NaCl)
b. Agar nutritivo (suplementado con 1 % de NaCl)
c. Agar nutritivo (suplementado con 5 % de NaCl)
d. Agar nutritivo (suplementado con 10 % de NaCl)
RESULTADOS
Microorganismo: ____________________________________________________
A. Influencia de la temperatura
Anotar el crecimiento y la abundancia relativa del cultivo, colocando un signo negativo
(-) para la ausencia de crecimiento y la presencia de crecimiento indicarla
con un signo positivo (+). La abundancia relativa ser indicada con el nmero de
signos positivos por ejemplo; +++ para el mximo crecimiento, ++ para el crecimiento
intermedio y + para el mnimo crecimiento.
T de incubacin 4C 25C 37C 55C

Crecimiento
relativo
B. Requerimientos de oxgeno
Anotar la zona de crecimiento de los microorganismos
27
___________________________________________________________
FCBIT
C. Influencia del pH
Anotar la presencia de turbidez en el medio como crecimiento + y la ausencia de
turbidez como crecimiento -
Medio de cultivo Crecimiento

Caldo nutritivo pH 3.0
D. Influencia de la concentracin de las sales.

Anotar el crecimiento como + o segn el caso.
Medio de cultivo Crecimiento
Agar nutritivo (0.8% NaCl)
Agar nutritivo (1% NaCl)
Dibujar lo observado.
microorganismos diferentes.
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFA
28
___________________________________________________________
FCBIT
Prctica No. 7
Obtencin de un antibiograma.
OBJETIVOS: Al finalizar el trabajo prctico el estudiante estar en capacidad de:
Realizar un ensayo de sensibilidad de un cultivo bacteriano a los antibiticos

usando el mtodo de Kirby Bauer
Interpretar los resultados y hacer el informe correspondiente.
INTRODUCCIN
En el mtodo de Kirby Bauer, el microorganismo es inoculado en la superficie de una
placa de agar, sobre el cual se colocan discos impregnados con una concentracin
conocida del antibitico. Las placas se incuban por 16-18 horas a 35-37C. Durante la
incubacin, el antibitico difunde radialmente desde el disco a travs del agar, por lo
que su concentracin va disminuyendo a medida que se aleja del disco. En un punto
determinado, la concentracin del antibitico en el medio es incapaz de inhibir al
germen en estudio. El dimetro del rea de inhibicin alrededor del disco puede ser
convertido a las categoras de sensible, intermedio o resistente (S, I, o R) de acuerdo a
tablas publicadas por los organismos encargados del control de tales mtodos, por
ejemplo el Comit Nacional de Estandar de Laboratorios Clnicos de los Estados Unidos
de Norteamrica (National Committee for Clinical Laboratories Standards).
METODOLOGA
Para obtener resultados confiables y reproducibles mediante este mtodo, es
imprescindible seguir fielmente las instrucciones que daremos a continuacin:
1. Funda el medio de cultivo y djelo enfriar a 45-50C.

2. Vierta aspticamente suficiente cantidad de medio de cultivo en una placa de
Petri, para obtener una capa de 4 mm de espesor. Para una placa de 10 cm. de
dimetro se requieren 30 mL de medio y para una de 15 cm se requieren 70 mL.
3. Deje solidificar el medio de cultivo y luego seque las placas durante 30 minutos
antes de usarlas para la inoculacin.
4. Inocule la placa mediante un hisopo estril utilizando una suspensin del germen
de 18 a 24 horas de incubacin con una turbidez equivalente a 1,5 x 106 bacterias
(Equivale al tubo No. 5 de la escala de Mc Farland). Para la inoculacin sumerja
un hisopo estril en el cultivo y elimine el exceso rotndolo firmemente contra la
pared interna del tubo. Frote el hisopo sobre la superficie del medio de cultivo.
5. Repita esta operacin por tres veces sucesivas, rotando la placa para obtener
una dispersin uniforme del inculo en toda la superficie.
6. Coloque la tapa a la placa y deje secar el inculo por 3 a 5 minutos.
29
___________________________________________________________
FCBIT
7. Coloque los discos con los antibiticos sobre el agar mediante pinzas estriles o
usando un aplicador de discos. Oprima los discos suavemente con una pinza
para asegurar un buen contacto con el medio de cultivo. Los discos deben estar
espaciados de manera que su distancia a la pared de la placa sea de 15 mm y
entre ellos de 30 mm.
8. Incube a 35 37C hasta el siguiente da (aproximadamente 18-19 horas). Si se
requieren los resultados con rapidez se pueden leer las zonas de inhibicin
despus de 6-8 horas de incubacin, pero estos resultados deben ser
confirmados mediante una nueva lectura despus de la incubacin por las 18 -19
horas.
9. La medida del dimetro de la zona de inhibicin se hace preferentemente desde
el exterior de la placa, sin quitar la tapa, esto puede hacerse con una regla
milimetrada, un vernier o cualquier otro Instrumento similar.
RESULTADOS
Antibiograma
Microorganismo ___________________________________
Dimetro de la zona
Antibitico Concentracin Interpretacin
de inhibicin
CONCLUSIONES.
microorganismos diferentes. Anotar sus conclusiones.
BIBLIOGRAFIA.
30
___________________________________________________________
FCBIT
Prctica No. 8
.
MICROORGANISMOS INDICADORES DE CALIDAD SANITARIA.
OBJETIVOS: Al finalizar el trabajo prctico el estudiante estar en capacidad de:
Ejecutar las tcnicas para el aislamiento e identificacin de microorganismos de

inters ambiental basado en normas.
NMX-AA-042-SCFI-2015.
ANLISIS DE AGUA. ENUMERACIN DE ORGANISMOS COLIFORMES
TOTALES, ORGANISMOS COLIFORMES FECALES
(TERMOTOLERANTES) Y Escherichia coli MTODO DEL NMERO
MS PROBABLE EN TUBOS MLTIPLES.
31

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NORMAS DE SEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

Llevar puesta la bata de laboratorio en todo momento. La misma debe permanecer

Limpiar y descontaminar las superficies de trabajo, antes de comenzar y al finalizar la

Trabajar cerca de la mesa, adoptando una buena postura y estando fsicamente

Mantener el rea de trabajo ordenada, limpia y desinfectada, antes, durante y despus

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Recoger el cabello largo.

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Regresar los reactivos y equipos empleados (microscopio, mechero, etc.), limpios y de

No devolver sustancias a sus envases originales.

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Reportar inmediatamente cualquier accidente al profesor (derrame de material

Reducir al mnimo la formacin de aerosoles durante la realizacin de cualquier trabajo

Extremar las precauciones cuando se utilicen agujas y jeringas para evitar la

Emplear tcnicas aspticas para el manejo de cultivos de microorganismos.

El microscopio es el instrumento ptico que permite apreciar clulas y estructuras

Experimento 1.Observacin de epidermis de cebolla

1. Separar una de las hojas interna de la cebolla y desprender la tenue membrana

Experimento 2. Observacin de bacterias del yogurth

Experimento 3. Observacin de levaduras del pulque

1. Extiende una gota de pulque sobre un portaobjetos limpio y seco.

Experimento 4. Observacin de clulas sanguneas.

1. Con la lanceta estril realizar una puncin en un pulgar.

4. Colocar el frotis de sangre sobre la cubeta de tincin y aadir unas gotas de

Experimento 5. Observacin de clulas de tejido adiposo.

Experimento 6. Observacin de microorganismos presentes en agua estancada.

1. Recolectar una muestra de agua estancada (charco, floreros, etc.)

Procedimiento para efectuar observaciones al microscopio.

Enfoque con el objetivo de inmersin.

Una vez realizadas las observaciones:

Dibujar en los crculos lo observado, anotando el objetivo utilizado y el aumento final

OBJETIVO: Al finalizar el trabajo prctico el estudiante estar en capacidad de:

I. Limpieza de mesas de trabajo

5. Repetir el procedimiento al finalizar el trabajo prctico.

II. Preparacin de material.

Todo el material preparado se esteriliza empleando calor seco o calor hmedo de

III. Preparacin de medios de cultivo.

Si se presenta algn inconveniente, antes de su esterilizacin, el medio se puede

Una vez preparado todo el material de vidrio se somete a esterilizacin.

Una vez que el material ha sido sometido al proceso de esterilizacin se pueden

IV. Almacenamiento del material estril.

Utilizar, preferiblemente, estantes cerrados para colocar el material.

V. Eliminacin de material contaminado.

No se debe descartar ningn material contaminado directamente al desage ni

Todo material reutilizable contaminado deber seguir la siguiente secuencia de

Todo material no reutilizable contaminado deber seguir la siguiente secuencia de

2. Eliminacin en bolsas plsticas resistentes bien anudadas. Se recomienda que

OBJETIVO. Al finalizar el trabajo prctico el estudiante estar en capacidad de:

Los microorganismos al ser colocados en medios de cultivo slido, se multiplicarn

Observar las placas de sus compaeros

OBJETIVO: Al finalizar el trabajo prctico el estudiante estar en capacidad de:

A. Transferencias de medio lquido a medio slido

3. Esterilizar el asa a la llama.

9. Flamear nuevamente la punta del tubo y tapar.

10. Esterilizar nuevamente el asa

B. Transferencias de medio slido a medio slido

C. Transferencias de medio slido a medio lquido

1. Marcar el tubo de caldo nutritivo estril con su nmero equipo y fecha.

D. Preparacin de las placas de aislamiento

4. Despus de verter el medio, si es necesario, rotar la placa cuidadosamente para

Tincin: Tincin: