INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BITICOS

Departamento de Biotecnologa

EXPRESIN TRANSITORIA DEL GEN uidA EN CLULAS DE

Tagetes erecta

T E S I S

Que para obtener el grado de Maestra

en Ciencias en Desarrollo de
Productos Biticos

P R E S E N T A

Minerva Garca Chavarra

D I R E C T O R

Dra. Alma Anglica Del Villar Martnez

Yautepec, Morelos, Mxico

El Presente trabajo se llev a cabo en el
Laboratorio de Biologa Molecular del
Departamento de Biotecnologa del Centro de
Desarrollo de Productos Biticos (CeProBi) del
Instituto Politcnico Nacional, Bajo la direccin del
Dra. Alma A. Del Villar Martnez. Para la
realizacin de los estudios se tuvo el apoyo
econmico de una beca CONACYT (No. de
registro 188678 y del Programa de Institucional de
Formacin de Investigadores (PIFI). La
investigacin fue realizada con el financiamiento
econmico de los proyectos SPI y CONACyT
(43862-Z).
 DEDICATORIAS

A mis padres porque Gracias a su cario y apoyo he llegado a realizar

. uno de los anhelos ms importantes de mi vida, fruto del inmenso amor
y confianza, con lo cual he logrado terminar una meta mas y darme la
fortaleza en cada momento, siendo impulsores de inspiracin con su
dedicacin y comprensin en la lucha por este camino

A mi hermana Arita por ser mi amiga incondicional y brindarme

su plena confianza y por todo su apoyo y amor, que siempre me ha
demostrado.
.

A mi hermana Maricarmen por estar presente en mi vida, y ser

parte importante de ella y por todos los momentos de alegra, por
estar siempre unidas y sobre todo por demostrarme su amor.
 AGRADECIMIENTOS

Al comit tutorial y revisor: Dra. Alma A. Del Villar Martnez, Dr. Pablo E. Vanegas
Espinoza, Dr. Antonio Jimnez Aparicio, Dra. Gabriela Trejo Tapia, Dra. Silvia
Evangelista Lozano, Dra. Martha L. Arenas Ocampo, por sus apreciables
comentarios y correcciones que permitieron enriquecer el trabajo.

A la Dra. Alma A. Del Villar Martnez, por su accesoria y direccin en la

realizacin de este trabajo de tesis.

A la Dra. Gabriela Trejo Tapia y al Dr. Pablo Emilio Vanegas Espinoza, por su
apoyo desinteresado, sus consejos tan afortunados y sugerencias, con cario y
admiracin.

Al Dr. Arturo Bello Prez y a la Dra. Kalina Bermdez por sus observaciones
durante la realizacin de la tesis.

A la familia Muoz Luna por su confianza, en especial a Nora; por creer en mi a

pesar de los obstculos de la vida, por todas las veces que me vi vencida y ellos
estaban ah. Gracias por todo.

A mi amiga Denisse por que fue parte importante del apoyo brindado en todo
momento, por su amistad y sobre todo por todas las chocoaventuras que
pasamos juntas.

A mis compaeros de generacin de la maestra: Den, Assael, Lore, Ariana, Juan,

Gabriel y Rub, por los momentos compartidos buenos y malos durante la
maestra.

A mis compaeros y amigos de maestra: Pame, Paul, Alivajn, Karolita, Dante,

Dennise Ubaldo, Lety, Eneida, Vero Ramos, Vero Prez, Juan Carlos, Mara
Luisa, Rita, Margarito, Arnold, Mario, Juan Torruco, por todos los momentos
compartidos.
CONTENIDO
NDICE DE TABLAS iv
NDICE DE FIGURAS v
ABREVIATURAS vii
RESUMEN 1
ABSTRACT 2

I. INTRODUCCIN 3
II. ANTECEDENTES 4
2.1 Pigmentos naturales 4
2.1.1 Clorofilas 5
2.1.2 Pigmentos fenlicos 5
2.1.3 Betalanas 7
2.2 Carotenoides 7
2.2.1. Ruta de biosntesis 9
2.2.2 Distribucin de los carotenoides en la naturaleza 11
2.2.3 Importancia econmica de los carotenoides 13
2.2.4 Funcin y usos de los carotenoides 13
2.3 Cultivo de tejidos vegetales 14
2.3.1 Principios bsicos del cultivo de tejidos vegetales 15
2.3.2 Tipos de cultivos de tejidos vegetales 15
2.3.3 Reguladores de crecimiento vegetal 16
2.4.Transformacin gentica 18
2.4.1 Mecanismos para la transferencia de genes 18
2.4.1.1 Agrobacterium tumefaciens 18
2.4.1.2 Biobalstica 20
2.5 Mtodos de seleccin de transformantes 20
2.6 Marcadores de seleccin 21
2.7 Expresin transitoria 21
2.8 Modelo de estudio: Tagetes erecta L. (cempaxchil) 23
2.8.1 Generalidades y distribucin del cultivo 23
2.8.2 Descripcin de la planta 23

ii
 2.8.3 Importancia econmica 24
2.8.4 Usos y aplicaciones 26
III. JUSTIFICACIN 27
IV. OBJETIVOS 28
4.1 Objetivo general 28
4.2 Objetivos particulares 28
V. MATERIALES Y MTODOS 29
5.1 Material vegetal 29
5.2 Vector 29
5.3 Establecimiento del cultivo in vitro 29
5.3.1 Induccin de callo 31
5.4 Cintica de crecimiento 33
5.5 Determinacin de la sensibilidad del tejido a kanamicina 35
5.6 Ensayos por biobalstica 38
5.6.1 Preparacin de las muestras para el bombardeo 39
5.6.2 Uso del equipo de biobalstica 39
5.7 Anlisis histoqumico de - glucuronidasa (GUS) 42
VI. RESULTADOS Y DISCUSIN 43
6.1 Establecimiento del cultivo in vitro de Tagetes erecta L. 43
6.2 Cintica de crecimiento 46
6.3 Determinacin de la sensibilidad del callo a kanamicina 53
6.4 Ensayos de biobalstica 60
6.4.1 Anlisis histoqumico de - glucuronidasa (GUS) 60
VII. APORTACIONES 64
VIII. CONCLUSIONES 65
IX. PERSPECTIVAS 66
BIBLIOGRAFA 67

iii
NDICE DE TABLAS

Tabla 1. Combinacin de las diferentes concentraciones de los reguladores

2,4-D y BA 34

Tabla 2. Distancias y presiones evaluadas en las pruebas de biobalstica 41

Tabla 3. Efecto de las concentraciones de 2,4-D y BA en la induccin de 47

callos de cempaxchil

Tabla 4. Sensibilidad de clulas desdiferenciadas de cempaxchil en medio

MS adicionado con las diferentes concentraciones de kanamicina 56

iv
NDICE DE FIGURAS

Figura 1. Estructura general de los pigmentos naturales; clorofila, betalanas,

Flavonoides 6

Figura 2. Ejemplos de estructuras de diferentes carotenoides 8

Figura 3. Ruta de biosntesis de carotenoides en plantas 10

Figura 4. Micrografas de las estructuras que acumulan carotenoides en callo

y lgulas de cempaxchil 12

Figura 5. Respuestas generadas en el cultivo in vitro por la combinacin

de auxinas y citocininas 17

Figura 6. Reaccin del reactivo X-GLUC 22

Figura 7. Tipos de inflorescencias en Tagetes erecta 25

Figura 8. Representacin del plsmido pBI426 30

Figura 9. Proceso de seleccin y siembra de explantes de cempaxchil 32

Figura 10. Esquema que ilustra el rea proyectada de callo 37

Figura 11. Equipo de bombardeo de alta presin 40

Figura 12. Induccin de callo de cempaxchil con diferentes tratamientos

de reguladores de crecimiento 44

Figura 13. Induccin de callo de cempaxchil en los diferentes tratamientos

de reguladores de crecimiento 45

v
Figura 14. Callo producido a partir de explantes de hojas de cempaxchil 48

Figura 15. Apariencia de los callos de Tagetes erecta en los das 0, 5, 7, 9,

11, 13, 15 y 18 durante el crecimiento celular 49

Figura 16. Cintica de crecimiento en base al peso fresco (PF) de clulas 51

desdiferenciadas de Tagetes erecta

Figura 17. Cintica de crecimiento en base al peso seco (PS) de clulas

desdiferenciadas de Tagetes erecta 52

Figura 18. Callo de cempaxchil en medio MS adicionado con kanamicina 54

Figura 19. Imgenes del rea proyectada del callo de cempaxchil 57

Figura 20. ndice de crecimiento del callo de cempaxchil por efecto del
antibitico 59

Figura 21. Apariencia del callo bombardeado con el plsmido pBI426 61

Figura 22. Expresin transitoria de la -glucuronidasa en callo de cempaxchil

bombardeado con el plsmido pBI426 62

vi
ABREVIATURAS

2,4-D cido 2,4-diclorofenoxiactico

DNA cido desoxirribonucleico
-1
d Por da
BA Benciladenina
bmp Mapa de bits
CaMV Virus del mosaico de la coliflor
GGPP Geranilgeranil pirofosfato
PSY Fitoeno sintasa
ZDS -caroteno desaturasa
LCYb licopeno ciclasa
LCYe licopeno ciclasa
CHYb - caroteno hidroxilasa
uidA Gen que codifica -glucuronidasa
GUS -glucuronidasa
cm Centmetro
CTV Cultivo de tejidos vegetales
C Grado centgrado
g Gramo
H Horas
kPa Kilopascales

L Litros
NaOH Hidrxido de sodio
NOS Nopalina sintetasa
g Microgramos
mg Miligramos
ml Mililitros
mM Milimolar
MS Medio de cultivo Murashige y Skoog
L Microlitro

vii
vii
m.s.n.m Metros sobre el nivel del mar
PF Peso fresco
PS Peso seco
RCV Reguladores de crecimiento vegetal
rpm Revoluciones por minuto
tdc Tiempo de duplicacin celular
Velocidad especfica de crecimiento
v/v Volumen/volumen

viii
RESUMEN

El cempaxchil (Tagetes erecta L.) es una planta originaria de Mxico. Su principal

caracterstica es la presencia de carotenoides en sus flores. Los carotenoides se
han utilizado como aditivo en alimentos de aves de corral para potenciar la
pigmentacin de su piel y la yema de huevo. El inters por los carotenoides se ha
incrementado debido a que son precursores de la vitamina A y se consideran
compuestos antioxidantes. La importancia de estos compuestos ha motivado la
realizacin de estudios, sobre la expresin de genes carotenognicos. En este
trabajo se logr el establecimiento de cultivos celulares de cempaxchil a partir de
explantes de hojas cultivadas en invernadero. Los explantes se incubaron en
medio MS adicionado con diferentes combinaciones de cido 2,4-
diclorofenoxiactico (2,4-D: 1.0, 2.0 y 3.0 mg/L) y benciladenina (BA: 0.5, 1.0 y 1.5
mg/L) y se observ que la combinacin de 2.0 mg/L de ambos reguladores
promueve la desdiferenciacin celular. Adicionalmente se realiz una cintica de
crecimiento de los callos y se determin el peso fresco y el peso seco. Se
estableci que los callos alcanzan la fase exponencial al quinto da con un tiempo
de duplicacin de 4.8 d-1. Para establecer un sistema de transformacin se
requiere conocer la sensibilidad del tejido a un antibitico que ser utilizado como
marcador de seleccin; para lo cual se analiz la sensibilidad del callo a diferentes
concentraciones de kanamicina. Se determin que la concentracin adecuada a
utilizar en la seleccin de callo es de 100 mg/L. Se observ, mediante la reaccin
del reactivo de GUS, que la expresin transitoria del gen que codifica para la -
glucuronidasa (uidA), fue mayor al bombardear los explantes a una distancia de 11
cm y una presin de 6201.0 kPa. Este trabajo sienta las bases para establecer las
condiciones para la transformacin estable del tejido analizado.

1
ABSTRACT

Marigold (Tagetes erecta L.) is native of Mexico the high carotenoid accumulation
in its flowers is the main characteristic of this plant. Carotenoids have been used
as additive in poultry feed in order to increase sking and egg yolk pigmentation.
Many carotenoid have antioxidant effect and some are vitamine A precursors, for
these reasons it have had an increasing interest in them. Because of that,
carotenogenic genes expression studies is a growing field of research. In this study
marigold callus culture from leaf explants obtained from greenhouse developed
plants was established. Explants were incubated in MS media supplemented with
the combination of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (1.0, 2.0 and 3.0 mg/L) and
benzyladenine (0.5, 1.0 and 1.5 mg/L). Undifferentiated cells were observed in
explants developed in 2.0 mg/L of both regulators media. In addition, callus growth
kinetics was performed in base of fresh and dry weight. Exponential phase was
observed at fifth day with a duplication time of 4.8 days. For the establishment of a
transformation system is necessary to know the tissue sensibility to an antibiotic
that would be used as selection marker. After calli incubation in increasing
kanamycin concentration added media, 100 mg/L was the best concentration to
select possible transformants. Best transient uidA gene expression was observed
in callus bombarded at 11 cm of distance with a pressure of 6201.0 kPa. This study
sets the basic conditions for the stable genetic transformation of marigold calli for
the possible carotenoid content modification.

2
 I. INTRODUCCIN

El cempaxchil (Tagetes erecta L.) es una planta vascular perteneciente a la

familia Asteraceae; los colores de sus flores van desde el amarillo hasta el
anaranjado. El cempaxchil es originario de Mxico y se distribuye desde el
suroeste de los Estados Unidos hasta el sur de Argentina. En Mxico el
cempaxchil es utilizado tradicionalmente en ceremonias religiosas y como
ornamental; tambin se ha utilizado en la medicina tradicional como antiparastico,
antiespasmdico y en el tratamiento de enfermedades del estmago, el bazo y el
hgado. Los pigmentos de sus flores han sido utilizados como aditivo en el
alimento de aves de corral y peces para potenciar la pigmentacin de su piel.
Debido al contenido de carotenoides, el cempaxchil representa un modelo de
estudio importante de la ruta de biosntesis de estos compuestos. Los
carotenoides son pigmentos liposolubles que se encuentran aportando coloracin
roja, anaranjada y amarilla, a flores y frutos en diferentes etapas de desarrollo de
las plantas. El estudio de la expresin de genes carotenognicos en diversos
sistemas, ha aportado las herramientas y el conocimiento necesario para proponer
el mejoramiento gentico a travs de la transformacin gentica; con la finalidad
de mejorar la calidad y la cantidad de los pigmentos en los sistemas donde se
acumulan. La biobalstica es una tcnica que ha demostrado ser un mecanismo
eficiente para la introduccin de genes a las clulas mediante el uso de
microproyectiles acelerados a una alta velocidad, para atravesar la pared y
membrana celular. Las partculas aceleradas a una velocidad determinada, tienen
la funcin de acarrear el material gentico que se va a introducir en el genoma del
material a transformar. El presente trabajo plantea como objetivo establecer las
condiciones de bombardeo para lograr la expresin transitoria del gen uidA en el
callo de cempaxchil. El conocimiento derivado de este trabajo ser aplicado al
sistema para llevar a cabo la transformacin gentica estable.

3
II. ANTECEDENTES

2. 1 Pigmentos naturales

Los pigmentos son compuestos qumicos que absorben energa luminosa en la

regin visible, adems de ser parte esencial en el metabolismo de las plantas y
son importantes para el hombre debido a que le aportan nutrientes (Hari y col.,
1994). La principal funcin de los pigmentos vegetales es la atraccin de animales
que actan como vectores en la distribucin de semillas. En el mismo sentido, en
la industria alimentaria, se utilizan para hacer a los alimentos ms atractivos a
travs del color (Mnguez Mosquera y col., 2004).

Segn la FDA (Administracin de Alimentos y Frmacos de los Estados Unidos)

un pigmento es cualquier material que imparte color el cual puede ser obtenido por
sntesis, extrado o derivado, a partir de un vegetal, animal, mineral u otra fuente y
que cuando es aadido a alimentos, medicamentos o cosmticos, es capaz de dar
color por s mismo (Vaca y Santana, 1999).

Los pigmentos se dividen en sintticos y naturales. Los principales pigmentos

sintticos son: Azoicos: producen casi todos los colores, se caracterizan por tener
un grupo cromforo N=N-; de stos, los de mayor demanda son los amarillos 5 y
6, los rojos 2, 4 y 40 y el naranja B. Entre los pigmentos naturales se encuentran
las antraquinonas: cuya estructura contiene uno o ms grupos carboxilo en un
sistema de anillos conjugados, con al menos tres anillos condensados (Thorngate,
2002).

Los pigmentos son generados por microorganismos, vegetales y animales. Es

importante mencionar que el mercado mundial de pigmentos crece alrededor de
4% al ao y representa cerca de 940 millones de dlares al ao en ventas, debido
a la preocupacin del consumidor por adquirir productos que no alteren su salud

4
(Britton, 1999). Los pigmentos difieren ampliamente en su estructura qumica y su
origen, los ms utilizados en los alimentos pueden agruparse en las siguientes
categoras: (Figura 1), clorofilas, pigmentos fenlicos (flavonoides, antocianinas y
taninos), betalanas, y carotenoides (Badui, 2006).

2.1.1 Clorofilas

Se encuentran en todas las plantas que realizan fotosntesis, la clorofila es el

principal agente capaz de reabsorber la energa lumnica y transformarla en
energa qumica para la sntesis de los compuestos orgnicos que necesita la
planta. Las hojas de la mayora de las plantas tienen un color verde debido a la
clorofila, aunque sta va desapareciendo al acercarse a la senescencia, para dar
paso a otros pigmentos. Este mismo proceso ocurre en frutos inmaduros que de
color verde se tornan amarillos y rojos; el cambio es debido a la prdida de la
clorofila y la sntesis de otras sustancias en la etapa de maduracin (Badui, 2006).

2.1.2 Pigmentos fenlicos

Los pigmentos fenlicos son sustancias con uno o ms anillos aromticos y por lo
menos un sustituyente hidroxilo. Existen dos grandes grupos: los cidos fenlicos
(benzoico y cinmicos) y los flavonoides (antocianinas y taninos), (Figura 1). Hay
13 subclases de flavonoides, lo que da un total de ms de 5000 compuestos que
proporcionan colores amarillos y naranjados a frutos como peras, fresas,
manzanas, cerezas, duraznos, limones (Stewart, 1980) as como a hortalizas y
otros alimentos. Otros flavonoides proporcionan el color rojizo de las hojas de
otoo (Stintzing y col., 2002).

5
 Clorofila a Clorofila b

Betalanas Betacianinas y betaxantinas

cidos fenlicos Flavonoides

Figura 1. Estructura general de los pigmentos naturales; clorofila, betalanas,

flavonoides (Carretero, 2000; Grotewold, 2006).

6
2.1.3 Betalanas

Son pigmentos hidrosolubles, con glucsidos en su estructuras, se dividen en dos

grandes clases: los rojos o betaciacinas, y los amarillos o betaxantinas (Francis,
1999). Estos pigmentos se encuentran en algunas familias como: Amaranthaceae,
Cactaceae, Didiereaceae, Nyctaginaceae y Portulaceae. Las betalanas son uno
de los pigmentos autorizados como aditivos por la FDA que no necesitan
certificacin, algunas de ellas se comercializan como polvo, que incluye el
pigmento y estabilizantes como azcares, protenas y antioxidantes. Existen
restricciones de tipo legal en el uso de colorantes rojos sintticos, por lo que se ha
sugerido emplear las betalanas en diversos alimentos como gelatinas, bebidas y
postres en general (Franco, 2004).

2.2 Carotenoides

Los carotenoides estn constituidos por una estructura bsica polinica de hasta
40 tomos de carbono, formada por ocho unidades de isopreno, unidas de tal
forma que el arreglo de isoprenoides es reversible desde el centro de la molcula.
Debido a que un isopreno es una estructura repetitiva, se produce un gran
nmero de ismeros geomtricos de configuraciones cis y trans, la gran mayora
de los carotenoides en la naturaleza son compuestos trans (Chandler y Schwartz,
1987). Los carotenoides existen, formando complejos con protenas, unidos a
carbohidratos o como steres de cidos grasos, la asociacin con protenas los
hace ms estables e incluso les cambia el color que tienen de manera individual
(Armenta y col., 2002). Qumicamente los carotenoides se dividen en dos grupos
(Figura 2): los carotenos, que son hidrocarburos y las xantfilas, sus derivados
oxigenados (Badui, 1999).

7
 A

Figura 2. Ejemplos de estructuras de diferentes carotenoides; A) Carotenos; B)

Xantfilas (Rodrguez-Amaya, 1999).

8
2.2.1 Ruta de biosntesis

La ruta de biosntesis de isoprenoides en plantas se realiza mediante dos vas, la

clsica del mevalonato, que ocurre en el citoplasma para la sntesis de esteroles y
sesquiterpenos y la va no mevalnica para la produccin de carotenoides que se
sintetizan en plastidios. Esta va forma una unidad de cinco tomos de carbono
denominada isopentil pirofosfato IPP, que es el precursor de los isoprenoides
(Lichtenthaler, 1999).

En la va no mevalnica, el gliceraldehdo 3-fosfato y el piruvato actan como

precursores del IPP, condensndose por accin de una transcetolasa d-1-
desoxixilulosa, para formar IPP (Mc Caskill y Croteau, 1998). Posteriormente, se
lleva a cabo la condensacin del dimetilalil pirofosfato con el IPP para formar
geranil pirofosfato GPP el cual se condensa con otra molcula de IPP para
generar farnesil pirofosfato FPP y la adicin de una tercera molcula de IPP da
origen al geranilgeranil pirofosfato GGPP, la condensacin de todas estas
molculas son catalizadas por un grupo de enzimas llamadas preniltransferasas
(Chappell, 1995).

La biosntesis de los carotenoides (Figura 3), ocurre a partir de la condensacin de

dos molculas de GGPP por accin de la enzima fitoeno sintasa (PSY). La
reaccin enzimtica da lugar a la formacin del fitoeno; el fitoeno es un producto
incoloro, que consta de 40 tomos de carbono. Las etapas posteriores conducen a
la sntesis de los carotenoides con color, se presentan cuatro desaturaciones del
fitoeno, por accin de la enzima fitoeno desaturasa (PDS) la cual cataliza las dos
primeras desaturaciones de fitoeno y fitoflueno a -caroteno, mientras que la
conversin de -caroteno a neurosporeno y posteriormente a licopeno es
realizada por la accin de la enzima -caroteno desaturasa (ZDS).

9
 IP I
DM APP

IP P
PT
G PP PT

IP P
FPP
G GPP

PPPP

F IT O E N O F itoen o sin ta sa

F itoen o d esa tura sa

F IT O F L U E N O

F itoen o d esa tura sa

-C A R O T E N O

NEU ROSPOREN O -ca roten o d esa tur a sa

L IC O P E N O -ca roten o d esa tur a sa

R
LICOPENO

LCY-E
LCY-B

R R
-CAROTENO LCY-B -CAROTENO
LCY-E
LCY-B LCY-E

R
R
-CAROTENO
-CAROTENO
R
-CAROTENO

Figura 3. Ruta de biosntesis de carotenoides en plantas (Del Villar-Martnez y col.,

2007).

10
La ciclacin de licopeno en ambas partes terminales de la cadena da como
resultado la formacin de -caroteno, -caroteno y -caroteno, estas reacciones
son catalizadas por las enzimas - y -licopeno ciclasa. El siguiente paso en la
ruta es la adicin de grupos hidroxilos a los anillos de la cadena, para formar
xantfilas, que dan origen a la lutena en la serie de los carotenoides y
zeaxantina en la serie de los carotenoides (Van den Berg y col., 2000 y
Sandmann, 2001).

2.2.2 Distribucin de carotenoides en la naturaleza.

Los carotenoides son un grupo de pigmentos que estn ampliamente distribuidos

en diferentes organismos, tales como bacterias, hongos, algas, plantas y
animales, stos ltimos no los sintetizan de manera que los adquieren a travs de
la dieta. Sus colores varan desde rojos, amarillos hasta anaranjados. Se han
identificado en la naturaleza ms de 600 carotenoides; algunos de ellos son
esenciales para que las plantas realicen la fotosntesis (Badui, 2006).

En los plstidios se localizan y sintetizan los carotenoides en plantas, los cuales

tienen diferentes formas, tamaos y funciones. El nmero de plstidios en los
diferentes rganos pueden variar con las diferentes etapas de desarrollo de las
clulas (Bonora y col., 2000). Estas estructuras se han identificado en clulas
desdiferenciadas de cempaxchil y en las lgulas de sus flores (figura 4), mediante
microscopia electrnica de barrido, se han descrito las estructuras denominadas
liposomas; dichas estructuras se han definido como el sitio de acumulacin de los
carotenoides en el interior de los pltidios (Del Villar-Martnez y col., 2005; Ramos
Viveros, 2007).

11
 A

B C

Vesculas
lpidicas Cloroplasto

Cromoplasto

Vescula
lpidica

Cromoplasto
Vacuola

Figura 4. Micrografas de las estructuras que acumulan carotenoides en callo y

lgulas de cempaxchil A); B) y C) Presencia de vesculas lpidicas de diferentes
dimensiones (Ramos- Viveros, 2007).

12
Los carotenoides se encuentran en frutos, tejidos verdes, en algunos animales
como crustceos, camarn, langosta y cangrejo, estos organismos obtienen los
carotenoides por la dieta que ingieren, as como microalgas (Haematococcus
pluvials), levaduras (Phaffia rhodozyma) y bacterias (Corynebacetrium poinsettiae)
(Arad y Yaron 1992; Wrolstand, 2000). En la naturaleza se producen alrededor de
108 tons/ao de carotenoides y la mayora se encuentra en algas marinas
(fucoxantina) y en hojas verdes (lutena, violaxantina y neoxantina) (Delgado-
Vargas y Paredes-Lpez, 2003). La mayor parte de los carotenoides utilizados
provienen del ocano producidos por algas (Meja y col., 1988; Lpez-Hernndez
y col., 2001)

2.2.3 Importancia econmica de los carotenoides

Los carotenoides son importantes en la industria de los alimentos, farmacutica y

cosmetolgica. En el rea de la biotecnologa existe inters en las propiedades
nutricionales y anticancergenas de los carotenoides. En el ao de 1996 la
demanda fue de 240 millones de dlares la cual fue incrementando, para el ao
2002 sta fue de 1000 millones de dlares, esto ha dado la pauta para el
desarrollo de la investigacin relacionada con la produccin de estos pigmentos
(Delgado-Vargas y Paredes-Lpez, 2003)

2.2.4 Funcin y usos de los carotenoides

En muchos organismos y especficamente en plantas, la coloracin que imparten

los carotenoides al igual que otros compuestos tiene una implicacin ecolgica, les
permiten atraer insectos polinizadores y animales dispersores de semillas
(Krinsky, 1994; Armstrong y Hearst, 1996; Eskling y col.,1997). Los carotenoides
se han utilizado contra agentes generadores de radicales libres en el humano,
estos compuestos son introducidos al organismo a travs de los alimentos y
transportados a la sangre (Argawl y Rao, 1998). Los carotenoides con un anillo -

13
ionona presentan actividad biolgica de provitamina A; su potencial
anticancergeno aun es objeto de investigaciones, y se han utilizado en la
prevencin de enfermedades cardiacas (Simpson, 1983). Estudios
epidemiolgicos demuestran una relacin directa entre la ingesta de xantfilas
(lutena y zeaxantina) y la reduccin en el riesgo de padecer ciertos tipos de
cncer, especialmente el pulmonar (Van den Berg y col., 2000).

Dentro de la industria alimentaria los carotenoides o productos ricos en estos

compuestos han sido utilizados como colorantes desde tiempos ancestrales, en la
actualidad, entre los carotenoides de uso comercial estn principalmente
caroteno, licopeno, lutena y zeaxantina; existen en las formas de extractos,
concentrados o harinas de plantas con altos contenidos de carotenoides; algunas
de sus fuentes son: achiote (Bixa orellana), chile (Capsicum annuum), tomate
(Lycopersicon esculentum) y cempaxchil (Tagetes erecta L.) (Francis, 1999;
Delgado-Vargas y Paredes-Lpez, 2003). Los carotenoides se utilizan en
productos alimenticios como jugos, refrescos, sopas, gelatinas, postres, pastas,
productos de repostera y panadera, margarinas, mantecas vegetales,
mantequilla, quesos y productos lcteos, tambin es utilizado como aditivo en
alimento de aves de corral para pigmentar su piel y la yema de huevos. Adems
del uso que se le da para pigmentar peces y potenciar el color de su piel
(Hinostroza y col., 1997).

2.3 Cultivo de tejidos vegetales

El cultivo de tejidos vegetales CTV, se define como el conjunto de tcnicas que

permite el establecimiento, mantenimiento y desarrollo de cualquier parte de la
planta, desde una clula hasta un organismo completo, bajo condiciones
artificiales, axnicas y controladas. El cultivo de tejidos vegetales se utiliza para
resolver problemas aplicados a la biologa vegetal, ofrece diferentes modelos
ideales para la investigacin fisiolgica, bioqumica, gentica y estructural, as

14
como la aplicacin prctica en la clonacin, conservacin y manipulacin in vitro
de cualquier material vegetal (Prez-Molphe y col., 1999).

2.3.1 Principios bsicos del cultivo de tejidos vegetales

El CTV se basa principalmente: en la eleccin del explante, la eleccin del medio,

las condiciones del cultivo y las condiciones aspticas. Se llama explante al
rgano, tejido o segmento de tejido vegetal que se va a utilizar para iniciar el
cultivo. ste puede ser una semilla, embrin, un segmento de hoja, tallo, raz u
rganos reproductores. Pero se debe tomar en cuenta que el tipo de explante que
se elija ser determinante para la obtencin de la respuesta deseada, ya que cada
uno de ellos, responder de manera particular. Para la respuesta exitosa del
cultivo es necesaria la eleccin del medio y las condiciones adecuadas. Adems
de la formulacin del medio, es importante considerar las condiciones fsicas
como: luz, fotoperodo, temperatura y humedad, ya que stas participan en la
respuesta favorable del explante; as como las condiciones aspticas. Para que el
cultivo de cualquier tejido vegetal prospere de manera deseada debe excluirse
cualquier tipo de organismo contaminante; por lo que, el material vegetal debe
desinfestarse y el medio de cultivo esterilizarse previamente para evitar cualquier
tipo de contaminacin (Prez-Molphe y col., 1999).

2.3.2 Tipos de cultivos de tejidos vegetales

Existen diferentes tipos de cultivo in vitro, estos son:

1.- Cultivo de plantas completas: en el cual se trabaja con individuos completos,
aunque cultivados en condiciones artificiales.
2.- Cultivo de rganos: se cultivan in vitro rganos aislados, se pueden distinguir
diferentes tipos de cultivo de rganos como el cultivo de races, meristemos,
pices y cultivo de anteras.

15
3.- Cultivo de segmentos de rganos: este tipo de tejido tiene importantes
aplicaciones en estudios de tipo fisiolgico, bioqumico, gentico, produccin de
compuestos secundarios y para la generacin de variacin gentica en los
cultivos.
4.- Cultivo de clulas: consiste en el crecimiento de clulas individuales, obtenidas
de un tejido, callo o cultivo en suspensin.
5.- Cocultivo: es el cultivo en el cual crece juntos el tejido vegetal y un
microorganismo (Mateo-Sagasta, 1990; Prez-Molphe y col., 1999).

2.3.3 Reguladores de crecimiento vegetal

El papel principal en la integracin de los fenmenos del desarrollo de las plantas

lo desempean las hormonas de crecimiento o mejor conocidos como los
reguladores de crecimiento vegetal; por lo tanto, es importante conocer sus
mecanismos de accin. Los reguladores de crecimiento vegetal estn agrupadas
en siete clases: auxinas, giberelinas, citocininas, brasinoesteroides, etileno, cido
abscsico y jasmonatos. Generalmente cada uno de los reguladores influye en
fenmenos del desarrollo, mientras que los efectos biolgicos que observamos por
lo general resultan de la accin conjunta de diferentes reguladores de crecimiento
(Davies, 1995 y Barba-lvarez, 2001).

Los reguladores de crecimiento vegetal ms utilizados en los cultivos in vitro son

los que pertenecen a los grupos de las auxinas y de las citocininas, ya que son los
que regulan los procesos de crecimiento y desarrollo en los cultivos de tejidos
vegetales. El balance entre las auxinas y citocininas en el cultivo in vitro es de
importancia para la respuesta en el desarrollo del tejido (Figura 5). En conjunto
las auxinas y citocinas permiten la induccin y el establecimiento de los cultivos de
clulas vegetales y determinan sus caractersticas de los cultivos in vitro. Las
auxinas son compuestos derivados del triptfano, sintetizado en clulas de pices

16
Concentracin de Concentracin de
AUXINAS CITOCININAS

RESPUESTA
ALTA NULA

Produccin de races
Embriognesis
Tejido calloso
Brotes adventicios
Proliferacin de yemas

NULA ALTA

Figura 5. Respuestas generadas en el cultivo in vitro por la

combinacin de auxinas y citocininas (Prez- Molphe y col.,
1999).

17
que estn implicadas en eventos relacionados con el crecimiento y diferenciacin
celular, participan en procesos como el crecimiento celular, la acidificacin de la
pared celular, el inicio de la divisin celular, la formacin de tejidos no
diferenciados, la diferenciacin del tejido vascular y la formacin de rganos. Las
citocininas: Son compuestos derivados de la adenina y son sintetizados en tejidos
jvenes y races. Posen dos caractersticas importantes para el cultivo de tejidos,
estimulan la divisin celular y rompen la latencia de las yemas axilares
hacindolas brotar (Prez-Molphe y col., 1999).

2.4. Transformacin gentica

El avance de la biotecnologa ha encontrado alternativas para el mejoramiento de

cultivos a travs de la manipulacin directa de genes de inters comercial sin
afectar otras caractersticas. La transferencia de DNA especfico a clulas
vegetales ha sido importante en la investigacin, mediante esfuerzos encaminados
a la produccin de materiales transgnicos con caractersticas particulares; por
ejemplo, la obtencin de plantas con resistencia a virus, hongos y bacterias, as
como tolerancia a herbicidas (Christou, 1996; Vergunst y Hooykaas, 1999).

2.4.1 Mecanismos para la transferencia de genes

Mediante el uso de tcnicas de biologa molecular es posible la transferencia de

informacin gentica entre clulas. Los mtodos ms comunes para llevar a cabo
la manipulacin gentica en plantas son:

2.4.1.1 Agrobacterium tumefaciens

Es una bacteria fitopatgena que causa la enfermedad conocida como agalla de la

corona, sta ataca naturalmente a un gran nmero de especies dicotiledneas. La

18
enfermedad se caracteriza por producir una tumoracin o crecimiento celular
descontrolado de la zona basal de los tallos.

El mecanismo de accin de Agrobacterium para la transferencia de la informacin

gentica de la bacteria hacia la planta es mediante dos elementos importantes, el
plsmido llamado Ti, inductor de tumor y el T-DNA que es la parte de DNA en la
cual se transfiere el material gentico a la planta. Este DNA codifica para varias
enzimas involucradas en la sntesis de reguladores de crecimiento como auxinas y
citocininas. Los reguladores de crecimiento generados por la introduccin de
dichos genes son los causantes del crecimiento desmedido de los tumores. El T-
DNA est limitado por secuencias bien caracterizadas llamadas secuencias borde,
las cuales son esenciales para que se realice la transferencia de la informacin
gentica. Los genes codificados en el T-DNA no son indispensables ya que la
transferencia del DNA ocurre an cuando estos genes hayan sido cambiados, esta
caracterstica permite usar cepas de Agrobacterium modificadas con algn gen de
inters. Para que la transferencia ocurra se requiere la participacin de los
productos de la regin vir o de virulencia, tambin codificada dentro del plsmido,
dentro de esta regin se encuentran los genes vir A, vir B, vir C, virD, vir E, vir G y
vir H (Hooykaas y Schilperoort, 1992; Vergunst y Hooykaas, 1999). Los sistemas
para la transformacin gentica mediada por Agrobacterium tienen algunas
desventajas, como la baja eficiencia en plantas monocotiledneas y alto
porcentaje de combinacin de dos individuos de la misma especie o de distintas
especies (quimeras) (Pea y col., 1995; Cevera y col.,1998) a pesar de estas
desventajas el proceso que emplea Agrobacterium se utiliza principalmente en
especies dicotiledneas por su facilidad y alto porcentaje de transformacin
(Blanco y col., 2003).

19
2.4.1.2 Biobalstica

La biobalstica es una tcnica que se utiliza para el mejoramiento gentico a travs

de manipulacin directa de genes de inters comercial (Vanegas-Espinoza, 2003).
Esta metodologa fue ideada y refinada por John Sanford, Theodore Klein,
Edward Wolf y Nelson Allen en la Universidad de Cornell en la dcada de los 80.
Mediante este mtodo, el DNA de inters es introducido en las clulas por medio
de partculas microscpicas aceleradas a velocidades altas, que atraviesan la
pared y la membrana celular, por medio de microproyectiles de tungsteno u oro, a
las que se adhiere el DNA que se desea transferir a las clulas vegetales
(Christou, 1996). Las desventajas de este mtodo son principalmente el dao que
pueden causar las partculas al tejido bombardeado, las distribucin de las
partculas que pueden provocar la muerte del tejido (Vanegas-Espinoza, 2003),
aunque bsicamente cualquier tipo de tejido es susceptible de ser utilizado como
blanco para la transformacin gentica por este mtodo; con esta tcnica se ha
logrado solucionar algunos problemas que presentan otros mtodos de
transformacin (Birch, 1997).

2.5 Mtodos de seleccin de transformantes

Todos los sistemas de transformacin desarrollados hasta el momento requieren

seleccionar aquellas plantas que contengan el transgn. El sistema ms sencillo
es incorporar al transgn otro gen que confiera resistencia a un antibitico o a un
herbicida, de forma que, al realizar el cultivo in vitro en presencia del agente de
seleccin (antibitico o herbicida), se garantiza que nicamente sobrevivirn
aquellas clulas que hayan sido transformadas. El gen marcador otorga a las
clulas transgnicas una ventaja, con respecto a las clulas no transgnicas, al
permitirles crecer en un medio selectivo que contiene el agente selectivo
especfico (Daz-Maiana y col., 2004).

20
2.6 Marcadores de seleccin

La combinacin de los antibiticos y genes que confieren resistencia son una

herramienta importante en la ingeniera gentica. Los genes marcadores tienen la
cualidad de inactivar selectivamente ciertos antibiticos y en consecuencia
proteger las clulas contra su actividad (EFB, 2001).

2.7 Expresin transitoria

Se han utilizado genes para evaluar la etapa previa a la transformacin gentica

estable. Los genes marcadores o reporteros ayudan a la observacin directa de
las clulas que los expresan. Estos genes codifican para protenas que no estn
presentes en las clulas vegetales y producen un fenotipo caracterstico de fcil
identificacin.

El gen reportero uidA que codifica para la enzima -glucuronidasa, puede ser
detectado cualitativamente por tincin histoqumica, en presencia de un sustrato
especfico, por la produccin de un precipitado azul ndigo como resultado de la
actividad de la enzima, y se muestra en el tejido al expresar el gen. La expresin
transitoria, permite evaluar el tejido a las 24-48 horas despus de la transferencia
del DNA. El reactivo X-gluc, est asociado al cido glucurnico y la enzima -
glucuronidasa rompe los enlaces para producir cido glucurnico ms cloro
bromondigo, y al llevarse a cabo una dimerizacin se produce 5,5 dibromo 4,4-
dicloro- ndigo que se visualiza como un precipitado azul (Figura 6) (Karcher y
Gelvin, 2007).

21
Figura 6. Reaccin del reactivo X-GLUC o 5-bromo-4-cloro-3-indolil- -D-
glucurnido, es hidrolizado por la -glucuronidasa para formar el cido glucurnico
y cloro-bromondigo. El cloro-bromondigo se dimeriza para producir un precipitado
azul insoluble llamado 5,5-dibromo-4, 4dicloro-indigo (Karcher y Gelvin, 2007).

22
2.8 Modelo de estudio Tagetes erecta L. (cempaxchil)

Cempaxchil (Tagetes erecta L.) es una planta originaria de Mxico, algunas

especies se emplean con fines ceremoniales por ello, se le conoce comnmente
como flor de muerto (Cdice Florentino, 1980). En diversas regiones de Mxico a
esta planta se le ha denominado con diferentes nombres: aptsicua, cempaxchil,
cempaschil, cimpual, zempoalxchil, flor de muerto y en la pennsula de Yucatn
se le llama xpujuc (Chi- Manzanero y col., 2002).

2.8.1 Generalidades y distribucin del cultivo

Es una planta herbcea pertenece a la familia Asteraceae, nativa del continente

americano, cuya principal caracterstica son sus flores agrupadas en cabezuelas o
inflorescencias, estructuras de donde se extraen los pigmentos. Mxico es el rea
de mayor diversidad de especies del gnero Tagetes (Tun Surez, 1990). Es una
especie que crece en los bosques de encino, pino, pino-encino a una altitud de
2450 m.s.n.m. Mxico es un centro de radiacin de muchas de las tribus que
conforman la familia Asteraceae. Ubicado en la tribu Tageteae, el gnero Tagetes
se compone de 30 especies (Turner, 1996). De las cuales cerca de la mitad habita
en Mxico. Las especies relacionadas con la diversidad de cempaxchil son: T.
erecta, T. lunulata, T. patula y T. tenuifolia. La especie ms popular es T. erecta
(Serrato-Cruz,1999). La cual se distribuye a lo largo del continente americano,
desde el suroeste de los Estados Unidos hasta regiones de Argentina. En Mxico
se cultiva en los estados de Veracruz, Mxico, Tabasco, Chiapas, Hidalgo,
Guanajuato y Sinaloa (Mendieta y Del Amo, 1981).

2.8.2 Descripcin de la planta

El cempaxchil, es una planta con hojas principalmente opuestas enteras o

pinatisectadas, tallos estriados, cabezuelas grandes o pequeas radiadas,

23
amarillas (Kearney y Puebles, 1960). Es una planta anual de crecimiento recto
que alcanza una altura aproximada de 1 a 1.5 metros. Las inflorescencias estn
agrupadas en captulos que a su vez pueden estar agrupados o solitarios en los
extremos de las ramas con pednculos alargados, provisto de brcteas. Los
captulos son radiados con flores dimorfas, el gnero Tagetes presenta dimorfismo
sexual con representantes hembras (inflorescencias dobles con flores pistiladas) y
hermafroditas (captulos con flores liguladas hembras y flores tubuladas
hermafroditas) (Serrato- Cruz, 1994).

El invlucro es campanulado. Las flores liguladas tienen coloraciones vistosas de

color amarillo claro hasta naranja intenso (Rzedowski y Rzedowski, 1985). Es una
planta algama que se propaga por semilla, sin embargo tambin se puede
propagar vegetativamente por medio de esquejes (Tun Surez, 1990). De acuerdo
con Serrato- Cruz y col. (2000), las poblaciones silvestres de Tagetes erecta L.
son algamas, pero las cultivadas, adems de ser algamas tambin se
comportan como autgamas, este origen reproductivo no modifica la morfologa
floral de estas poblaciones. Las inflorescencias se clasifican en tres categoras
(Galicia, 1994), dependiendo de la morfologa de sus flores individuales (Figura 7):

a). El tipo pompn o doble con flores 100% liguladas

b). El tipo intermedio con flores liguladas y tubulares
c). El tipo sencillo o margarita con mas del 90% de flores tubulares.

2.8.3 Importancia econmica de Tagetes erecta L.

En agricultura las plantas de cempaxchil se utilizan en variadas formas, T. erecta

y T. patula se utilizan para extraer abono orgnico para la tierra de cultivo,
mejorar la calidad del suelo y controlar nemtodos en cultivos de pia, fresa,
papa, gladiola y, en general, en reas hortcolas y florcolas afectados por ese tipo
de plagas donde se utilizan extractos acuosos y polvos de diferentes partes de la

24
 (a)

(b)

(c )

Figura 7. Tipos de inflorescencias en T.

erecta, a) tipo pompn, b) tipo intermedio
con flores liguladas y tubulares, c) El tipo
sencillo o margarita.

25
planta (races, tallos y hojas, inflorescencias o toda la planta). Los agricultores
utilizan esta planta en la rotacin de cultivos para controlar, diversos patgenos,
repeler o matar insectos y como nematicida (Serrato-Cruz, 2004). Adems, se
obtienen pigmentos de la flor, que se utilizan como aditivo en la alimentacin de
los pollos, para pigmentar la carne de las aves de engorda (Delgado-Vargas,
1997).

2.8.4 Usos y aplicaciones

El cempaxchil se utiliza como planta de ornato, a la venta en macetas o como

semillas, se ha utilizado tradicionalmente en ceremonias religiosas del da de
muertos. Desde la poca prehispnica, se han utilizado las plantas en la medicina
tradicional, en las comunidades indgenas para atacar diversos padecimientos,
existen pocas evidencias cientficas sobre la efectividad de los tratamientos
tradicionales, se tiene informacin de que T. tenuifolia controla enfermedades
relacionadas con el sistema respiratorio causado por bacterias, T. patula es
efectiva contra infecciones dermatomucosas causadas por hongos y T. erecta se
ha empleado para atender algunos tipos de lceras (Turner, 1996). Tambin se
utiliza como antiparastico, antiespasmdico y en enfermedades relacionadas con
el estmago, bazo e hgado (Delgado-Vargas, 1997; Guzmn-Maldonado y
Paredes Lpez, 1998).

26
III. JUSTIFICACIN

La importancia econmica de los carotenoides y los estudios relacionados con el

anlisis de la expresin de genes involucrados en la sntesis de carotenoides,
aportan informacin importante acerca de los puntos susceptibles de modificacin
gentica de la ruta de biosntesis de carotenoides en cempaxchil, por lo que la
evaluacin de la expresin transitoria es necesaria, para establecer las
condiciones ptimas, que aplicadas al sistema ayudarn a obtener la
transformacin gentica estable.

27
IV. OBJETIVOS

4.1 Objetivo general

Establecer las condiciones de bombardeo para lograr la expresin transitoria del

gen uid A en clulas desdiferenciadas de Tagetes erecta L.

4.2 Objetivos particulares

Establecer cultivos in vitro de Tagetes erecta L. e inducir la formacin

de clulas desdiferenciadas (callo).

Evaluar el crecimiento del cultivo de clulas desdiferenciadas de

Tagetes erecta L.

Determinar la sensibilidad del callo de cempaxchil al antibitico

kanamicina y evaluar los cultivos, por medio de un anlisis digital de
imgenes.

Establecer las condiciones adecuadas para la integracin de genes

exgenos al genoma del callo de cempaxchil por biobalstica.

Determinar la expresin del gen uidA en callo de cempaxchil,

mediante la reaccin de gus.

28
V. MATERIALES Y MTODOS

5.1 Material vegetal

Se utilizaron plantas y semillas de cempaxchil (Tagetes erecta L.), obtenidas del

genotipo experimental de porte bajo cosecha 1999, donadas por el Dr. Miguel
ngel Serrato Cruz de la Universidad Autnoma Chapingo. Este material se
mantuvo en invernadero.

5.2 Vector

Se utiliz el plsmido denominado PBI426, que se deriva del pUC9 (Figura 8).
Este plsmido contiene el gen uidA que codifica para la enzima -glucuronidasa y
el gen nptII que codifica para la enzima neomicina fosfotransferasa, ambos bajo el
control de un promotor doble 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y
terminador de la nopalino sintasa (NOS) (Dalta y col., 1991). El gen nptII aporta
resistencia al antibitico kanamicina lo que permite la seleccin de posibles
transformantes; aquellas clulas que sobreviven en un medio con el antibitico
han integrado el gen que les confiere resistencia. La actividad de la enzima -
glucuronidasa permite identificar visualmente clulas posiblemente transformadas.

5.3. Establecimiento del cultivo in vitro

Se desinfestaron semillas de cempaxchil del material porte bajo previamente

seleccionadas en lotes de 20 a 30 semillas, a las cuales se les realizaron
diferentes lavados con etanol absoluto durante 1 minuto, etanol al 70% (v/v) por 5
minutos, y dos lavados con hipoclorito de sodio a una concentracin del 2% (v/v) y
1% (v/v) durante 15 minutos, entre cada uno de los lavados se hicieron enjuagues
con agua destilada estril, al menos tres veces entre cada lavado para eliminar los

29
 Sac I
BgII
35s . 35s uidA . npt II Nos Ter

NcoI BamHI EcoRI

HindIII
XbaI

Figura 8. Representacin del plsmido pBI426 (Dalta y col.,1991).

30
residuos del hipoclorito de sodio. Todo esto se llev a cabo en condiciones
aspticas, en una cmara de flujo laminar (Vanegas-Espinoza, 2003). Las semillas
previamente desinfestadas se colocaron en una charola con papel absorbente
completamente hmedo con agua estril y se incubaron por 2 semanas
aproximadamente hasta que las plantulas alcanzaran una altura de 3 a 4 cm
aproximadamente.

Las plntulas de la charola se pasaron con unas pinzas a macetas con sustrato
estril, compuesto de una mezcla de Turba (sustrato orgnico), vermiculita
(mediana) y agrolita (perlita mineral inerte) en una relacin 3:1:1. Las plntulas se
llevaron al invernadero para finalizar su desarrollo (Evangelista- Lozano y col.,
2005).

5.3.1 Induccin de callo

Se cortaron hojas jvenes completas de plantas cultivadas en invernadero. Se

realizaron diferentes lavados, primero en una solucin de detergente agitndolas
ligeramente, seguido de un enjuague en agua corriente. Las hojas se remojaron
en agua destilada estril y se transportaron a una campana de flujo laminar. stas
se lavaron con etanol al 50% durante 1 min, posteriormente con cloro comercial al
2% por 3 min y al 1% por 5 min, en agitacin constante, entre cada uno de los
lavados se hicieron enjuagues con agua destilada estril (Vanegas, 2003).

Una vez desinfestadas las hojas, se seleccionaron los foliolos y se cortaron

porciones de aproximadamente 0.25 cm2 en una caja petri con papel filtro
humedecido con agua estril. Para la induccin de callo, se evalu la respuesta
del explante frente a las combinaciones de tres concentraciones (2,4-D) y (BA) lo
cual se puede observar en la Figura 9. Estos explantes se cultivaron en un medio
que contena 20 mL de medio MS (Murashige y Skoog, 1962) adicionado con la
combinacin de 2,4-D (1.0, 2.0, 3.0 mg/L) y BA (0.5, 1.0, 2.0 mg/L) 30 g/L de

31
Figura 9. Proceso de seleccin y siembra de explantes de cempaxchil en
medio de cultivo MS con diferentes concentraciones de reguladores de
crecimiento vegetal (2,4-D y B A).

32
sacarosa, 3 g/L de agente gelificante Phytagel (SIGMA) pH de 5.8; cada uno de
los medios se marc con una letra diferente para identificar las diferentes
concentraciones de reguladores de crecimiento adicionadas al medio de cultivo
(Tabla 1). De acuerdo con lo presentado en la tabla se obtuvo un total de 9. Las
condiciones de incubacin fueron 25 2 C y fotoperiodo de 16 h luz y 8 h
oscuridad (lmparas de luz fluorescente).

Los explantes de hoja de cempaxchil se incubaron en el medio MS suplementado

con la combinacin de 2,4-D (1.0, 2.0 y 3.0 mg/L) y BA (0.5, 1.0 y 2 mg/L). Para la
evaluacin durante la induccin de callo, se tomaron en cuenta los siguientes
parmetros: tamao, color, consistencia y necrosis del tejido. Esta evaluacin se
realiz durante 30 das con muestreos semanales y se continu con el
mantenimiento de estos cultivos mediante resiembras subsecuentes cada 15 das
en medio MS con las diversas concentraciones de reguladores de crecimiento
establecidas, con los datos obtenidos se realizo un diseo completamente al azar.

5.4 Cintica de crecimiento

Para analizar el crecimiento del callo de cempaxchil se llev a cabo una cintica
de crecimiento. La cual consisti en evaluar el peso fresco (PF) y peso seco (PS)
del callo. El inculo inicial fue de 0.5 g de peso fresco en frascos tipo gerber, con
20 mL de medio previamente seleccionado para el mantenimiento del cultivo. Las
condiciones de incubacin fueron a 25 + 2 C en completa oscuridad. El callo fue
colocado sobre papel filtro, previamente pesado y el PF fue registrado mediante la
diferencia de peso entre el papel filtro y el papel con la muestra. Para el PS, el
papel filtro con la muestra se llev a peso constante en un horno a 50 C durante
72 h.

33
Tabla 1. Combinacin de las diferentes concentraciones de los reguladores
de crecimiento (2,4-D y BA) para la induccin de clulas desdiferenciadas
de cempaxchil.

Tratamiento BA mg/L 2,4-D mg/L

A 2.0 1.0
B 2.0 2.0
C 2.0 3.0
D 1.0 1.0
E 1.0 2.0
F 1.0 3.0
G 0.5 1.0
H 0.5 2.0
I 0.5 3.0

34
Lo anterior se evalu cada tercer da durante 18 das, analizando las muestras por
triplicado y se realizaron las grficas correspondientes al PF y PS con respecto al
tiempo, obtenindose as las cinticas de crecimiento. A partir de ellas se calcul
el tiempo de duplicacin celular y la velocidad de crecimiento, mediante las
siguientes ecuaciones:

a) Tiempo de duplicacin celular vegetal (Brown, 1990)

n 2
tdc =
m
b) Velocidad especfica de crecimiento (), a partir del tdc con:
1
=
tdc

Donde:
tdc: tiempo de duplicacin celular
m = pendiente de la recta

5.5 Determinacin de la sensibilidad del callo a kanamicina

Para establecer un mtodo de transformacin gentica se requiere tener el cultivo

en condiciones controladas y posteriormente conocer la sensibilidad natural del
tejido al antibitico que ser utilizado como marcador de seleccin de posibles
transformantes. Se utiliz callo producido y mantenido en un medio de
regeneracin al que se le adicionaron diferentes concentraciones de kanamicina
(50, 100, 250, 500 mg/L). Posteriormente se realiz un diseo completamente al
azar con tres repeticiones por cada tratamiento. Se evalu la sensibilidad de los
callos al antibitico, se prob la tolerancia del tejido al antibitico, en relacin a su
crecimiento durante 30 das. Con los resultados que se obtuvieron del experimento
se estableci la dosis letal mnima, para el callo de cempaxchil.

35
Para ello se sigui una metodologa por anlisis digital de imgenes (Sanchez-
Segura y col. 2007), para ello se obtuvieron fotografas (cuatro para cada
tratamiento) para el anlisis digital de imgenes del callo con el antibitico
kanamicina al inicio del cultivo y a los 30 das, para observar el efecto del
antibitico en el crecimiento del tejido. Es importante sealar que las muestras a
las que se les tomaron las imgenes al inicio y final del experimento fueron las
mismas. Las imgenes fueron capturadas con una cmara fotogrfica digital
Nikon, Coolpix E900 de 2.1 Mpixeles acoplada a un tripi fotogrfico;
posteriormente las imgenes obtenidas se procesaron en el programa Corel
PhotoPaint-ll (V11.0, Corel Corporation, USA), donde se transformaron,
principalmente pasndolas a escala de grises de 8 bits segmentndolas para
extraer el objeto de inters (callo) y finalmente binarizndolas para ser
almacenadas digitalmente en mapa de bits (*.bmp); y una resolucin de 1280 por
980 pixeles por pulgada.

Las muestras posteriormente se analizaron morfomtricamente en el programa

Sigma Pro 5 (Sigma SPSS-USA) utilizando un referente conocido de medicin
para la calibracin del sistema, con este programa se obtuvo el valor del rea
proyectada en mm2 (Figura10). Finalmente el ndice de crecimiento se calcul con
los datos de rea proyectada al inicio y al final del tratamiento (hasta los 30 das),
utilizando la siguiente ecuacin:

x 100

Donde:
I.C. = ndice de crecimiento adimensional

Af = rea proyectada final

Ao= rea proyectada inicial

36
Figura 10. Esquema que ilustra el rea proyectada del callo
(Isaza, 2006)

37
5.6 Ensayos por biobalstica

Para la introduccin del gen uidA se utiliz una pistola de aceleracin de partculas
de alta presin. Los bombardeos se realizaron con partculas de oro, las cuales se
prepararon previamente. Se pesaron 60 mg de partculas de oro, a las cuales se
les agreg 1 mL de etanol absoluto, seguido de agitacin en vrtex por espacio
de tres minutos, posteriormente se centrifugaron las partculas a 13000 rpm por
tres minutos, eliminando el sobrenadante. Adicionalmente a la muestra se le
agreg 1 mL de etanol al 70%, y se agit en el vrtex por dos minutos. Pasado el
tiempo las partculas se incubaron 15 minutos, la muestra se volvi a centrifugar
durante tres min, se elimin el sobrenadante y se le agreg 1 ml de agua
destilada estril y se le aplic vrtex por un minuto, se dejaron reposar las
partculas por un min a temperatura ambiente, adicionalmente se centrifugaron las
partculas a una velocidad mxima durante dos minutos y se le aadi 50% (v/v)
de glicerol, y se almacenaron a -20 C.

Una vez que se tuvieron partculas estriles se contino con la precipitacin del
DNA a una concentracin menor a 1g/L. Las partculas de oro fueron
resuspendidas mediante agitacin en vrtex por un minuto, en un tubo limpio se
agregaron 50 L de las partculas, adicionando 12 L del plsmido pBI426 y 50 l
de cloruro de calcio (2 M), y se mezcl en vrtex, posteriormente se le agregaron
20 L de espermidina (5 M) mezclando una vez ms en vrtex en hielo.
Posteriormente la muestra se centrifug a 12000 rpm durante 20 seg. Se elimin
el sobrenadante y se lav la pastilla con 50 l de etanol al 70%.
Subsecuentemente se sonificarn las partculas durante un min y se centrifug a
12000 rpm por 20 seg eliminando el sobrenadante. Por ltimo se resuspendieron
en 50 L de etanol absoluto. Todo lo anterior se llev a cabo en una campana de
flujo laminar.

38
5.6.1 Preparacin de las muestras para el bombardeo

Para iniciar los ensayos de bombardeo, se expuso el tejido a un tratamiento

osmtico, ste se realiz exponiendo el callo a un medio con maltosa (15%),
como agente osmtico durante cuatro horas previas al bombardeo.

5.6.2 Uso del equipo de biobalstica

Para el bombardeo se utiliz un equipo de biobalstica de alta presin (Figura 11),

inicialmente se lavaron las membranas con alcohol absoluto y se dejaron secar.
Se prosigui a limpiar el equipo con alcohol al 70%. De una solucin de 1
g/L de DNA se pusieron 7.5 l de DNA en cada membrana y se colocaron en el
interior del equipo, en un carrier de acrlico. Se colocaron la muestra a bombardear
a la distancia requerida, las presiones estn dadas por el nmero de membranas
que se utilicen, cada membrana resiste una presin de 3100.5 kPa, el equipo se
cerr, se aplic vaco y se abri el gas de helio. Se dispararon las partculas con
DNA hacia el callo. Por ltimo se liber el vaco al permitir la entrada de aire. Se
retir la muestra y se coloc la siguiente muestra. Se evaluaron las muestras
sometidas a diferentes combinaciones de presin y distancia que se muestran en
la Tabla 2, para evaluar la expresin transitoria del gen uidA.

39
Figura 11. Equipo de biobalstica de alta presin, para realizar las pruebas de
bombardeo (CINVESTAV-IPN. Unidad Irapuato, Mxico).

40
Tabla 2. Distancias y presiones evaluadas en las pruebas de
biobalstica en un sistema de bombardeo de alta presin en
clulas ce cempaxchil.

Distancia (cm) Presin (kPa)

9 3100.5

9 6201

11 3100.5

11 6201

41
5.7 Anlisis histoqumico de - glucuronidasa (GUS)

La expresin del gen uidA se evalu mediante un ensayo histoqumico de la

enzima - glucuronidasa, en el cual se evalu el callo tratado en diferentes
combinaciones de presin (3100.5 y 6201 kPa) y distancia (9 y 11 cm). El anlisis
se bas en transferir el callo previamente bombardeado a cajas petri, al cual se le
adicionaron 2 mL de buffer de reaccin el cual contena una concentracin de
500 mg/L del sustrato X- Gluc (cido 5-bromo-4-cloro-3-indolil glucurnico);
adems contena fosfato de potasio 100 mM pH 7.0, EDTA 10 mM pH 8,
ferriocianuro de potasio 0.5 mM, ferrocianuro de potasio 0.1 mM y el X-Gluc
previamente disuelto en tritn 0.1%.

El callo con el buffer se incub a 37 C en total oscuridad durante toda la noche,

posteriormente, se retir la solucin y se llevaron a cabo tres lavados con metanol
para remover los pigmentos del explante. Una vez realizados los lavados al callo,
se le agreg glicerol al 50% para conservar la muestra. Las clulas que
expresaron el gen uidA mostraron un precipitado de color azul, lo que se considera
una respuesta positiva por la presencia de puntos azules en el callo.

42
VI. RESULTADOS Y DISCUSIN
6.1 Establecimiento del cultivo in vitro de Tagetes erecta L.

Para la evaluacin de la induccin del callo, se indujo a partir de explantes de

hojas de cempaxchil; el callo se seleccion por apreciacin visual, tomando en
consideracin la formacin del callo, tamao, color, consistencia, y necrosis del
tejido. Posteriormente se hicieron resiembras del material cada 15 das para el
mantenimiento del cultivo, con las diversas concentraciones de reguladores de
crecimiento evaluadas. Con los datos obtenidos se prosigui a ser el anlisis
estadstico.

Las observaciones mostraron que las dos primeras semanas de incubacin los
explantes cambiaron su coloracin de verde a verde oscuro y el tejido se fue
desdiferenciando paulatinamente en la mayora de los tratamientos. Las
evaluaciones mostraron que en los tratamientos con 2,4-D (1.0, 2.0 y 3.0 mg/L)
combinado con BA (0.5 mg/L) se observ necrosis en algunos de los explantes,
aproximadamente un 10% del total de los explantes en el tratamiento para la
formacin del callo, este mismo comportamiento lo present el tratamiento con
2,4-D (1.0 mg/L) combinado con BA (1.0 mg/L) (Figura 12).

Para los tratamientos con 2,4-D (1.0, 2.0 y 3.0 mg/L) combinado con BA (2.0 mg/L)
y los tratamientos con 2,4-D (2.0 y 3.0 mg/L) combinados con BA (1.0 mg/L), se
present la desdiferenciacin (Figura 13). Sin embargo, se observ una tendencia
a la oxidacin en todos los tratamientos excepto en el tratamiento 2,4-D (2.0 mg/L)
combinado con BA (2.0 mg/L), el cual present completamente la
desdiferenciacin del explante, con una coloracin verde y consistencia friable,
tras la resiembra durante el periodo de evaluacin.

43
A) B)

C) D)

Figura 12. Induccin de callo de cempaxchil con diferentes

tratamientos de reguladores de crecimiento; A) 2,4-D/ BA (1.0 /0.5
mg/L); B) 2,4-D/ BA (2.0 /0.5 mg/L); C) 2,4-D/ BA (3.0 /0.5 mg/L); D)
2,4-D/BA (1.0/1.0 mg/L).

44
 A) B)

C) D)

Figura 13. Induccin de callo de cempaxchil con diferentes

tratamientos de reguladores de crecimiento; A) 2,4-D/ BA (1.0 /2.0
mg/L); B) 2,4-D/ BA (3.0 /2.0 mg/L); C) 2,4-D/ BA (2.0 /1.0 mg/L); D)
2,4-D/BA (3.0/1.0 mg/L).

45
Se han realizado diferentes trabajos encaminados al desarrollo de un sistema de
obtencin de callo con explantes de hojas de Tagetes erecta L.; Belarmino y col.
(1992) reportaron que el uso de ANA/BA (5/2 mg/L) produjo callos con color
amarillo, Bespalhok y Hattori (1998) obtuvieron la misma respuesta utilizando
nicamente 2,4-D (2 mg/L) a partir de explantes de cotiledones. La concentracin
de 2,4-D corresponde con la obtenida en este reporte. El uso de 2,4-D/BA ha sido
reportado por Vanegas y col. (2002) para la produccin de callo, logrando callos
friables y de color amarillo plido a verde.

La desdiferenciacin celular se evalu por comparacin entre las diferentes

combinaciones de reguladores mediante un anlisis estadstico completamente al
azar para conocer si hay diferencias significativas entre los nueve tratamientos
(tabla 3). De la observacin anterior se defini la combinacin de 2,4-D (2.0 mg/L)
y BA (2.0 mg/L) como el tratamiento ms adecuado para la produccin de callo ya
que el material obtenido, adems de tener mejor tamao y color que la
combinacin de 2.0 g/L de BA y 1.0 g/L de 2,4-D, presentaron una consistencia
friable, caracterstica muy importante para experimentos subsecuentes (Figura
14).

6.2 Cintica de crecimiento

Los callos de cempaxchil subcultivados cada 15 das, como se mencion

anteriormente presentaron una coloracin amarillo-verde. Se realiz una cintica
de crecimiento celular, usando un inculo inicial de PF del callo, en 20 mL de
medio de cultivo MS con los nutrientes necesarios para el desarrollo del cultivo. El
cual, se mantuvo en total oscuridad a lo largo de las diferentes etapas de
crecimiento, durante los 18 das de evaluacin de crecimiento (Figura 15).

46
 Tabla 3. Efecto de las concentraciones de 2,4-D y B A en la induccin
de callos de cempaxchil.

Concentracin Concentracin Porcentaje de induccin

BA mg/L 2,4-D mg/L de callo (%)
2.0 1.0 19.5 ab
2.0 2.0 32.0 a
bc
2.0 3.0 6.0
bc
1.0 1.0 8.0
1.0 2.0 8.2 bc
bc
1.0 3.0 8.0
0.5 1.0 10.0 bc
0.5 2.0 10.0 bc
0.5 3.0 4.0 c

Los valores seguidos por la misma letra no difieren estadsticamente a p=0.05 de acuerdo
a la prueba de diferencias mnimas significativas (dms).

47
Figura 14. Callo producido a partir de explantes de hojas de
cempaxchil con 2 mg/L de 2,4-D y B A.

48
 Da 0 Da 3 Da 5

Da 7 Da 9 Da 11

Da 13 Da 15 Da 18

Figura 15. Apariencia de los callos de cempaxchil en los das: 0, 3, 5, 7, 9,

11, 13, 15, 18 durante el crecimiento celular en condiciones de oscuridad
en medio MS con 2 mg/L de 2,4-D y B A.

49
Para medir el crecimiento, puede recurrirse a evaluar el incremento en peso de los
callos, con respecto al tiempo, mediante una cintica de crecimiento, para esto se
determin el peso fresco (PF) y el peso seco (PS). En la Figura 16 se presentan
los resultados de la cintica de crecimiento celular en base al peso fresco (PF), en
la cual se observ una fase lag (etapa de adaptacin) al inicio del cultivo del da 0
al da 5.

Posteriormente el cultivo alcanz una fase exponencial en la cual se observ un

crecimiento acelerado durante los das 5 al 14 aproximadamente que representa la
mayor divisin celular, en esta etapa las clulas aumentan su volumen y peso
debido a la acumulacin de agua en las vacuolas (Cosgrove, 1997), y del da 14
al da 15 el cultivo present una fase estacionaria con da de crecimiento mximo
representado por el da 15, finalmente a partir de los das 16 al 18 la divisin
celular disminuyo hasta llegar a la fase de muerte celular.

Por otro lado en la Figura 17 se muestra la cintica de crecimiento del da 0 al da

18, en base al peso seco (PS). Se observaron cuatro fases de crecimiento celular,
la grfica present un perfil tipo sigmoidal. Al igual que en el PF, el cultivo tuvo una
fase de adaptacin (lag) del da 0 al da 3, las clulas inician el crecimiento, a
partir del da 3 al da 12 las clulas presentaron (la fase exponencial) mayor
velocidad en el crecimiento, con un tiempo de duplicacin celular (tdc) de 4.8 das
y una velocidad especfica de crecimiento () de 0.144 d-1.

Para los das 12 al 15 el cultivo present una fase estacionaria, donde la velocidad
de divisin celular disminuy, pero las clulas continuaron creciendo hasta llegar a
un da de crecimiento mximo representado por el da 15 como se observ para el
PF, despus del da 15 la divisin celular disminuyo hasta dar inici a la fase de
muerte. Los valores obtenidos fueron similares a los reportados por Jimnez-
Junca (2005), En clulas en suspensin de Beta vulgaris , los valores mostraron
un comportamiento similar a lo aqu reportado y distantes a los reportados por

50
 Lag Exponencial estacionaria muerte

Figura 16. Cintica de crecimiento en base al peso fresco (PF) de callo de

Tagetes erecta L. Los valores representan la media de tres muestras + el error
estndar.

51
 Lag exponencial estacionaria muerte

Figura 17. Cintica de crecimiento con base al peso seco (PS) del callo de
Tagetes erecta L. Los valores representan la media de tres muestras + el error
estndar.

52
Martnez- Bonfil (2003). En el cual muestra los valores del cultivo de callo de Beta
vulgaris con de 0.086 d-1 y un tdc de 8.04 das y los reportados por Gmez-
Aguirre, (2005) en callo de Ipomoea intrapilosa con de 0.096 d-1 y un tdc de 7
das, estas condiciones posiblemente se deban a la diferencia en el tamao del
inculo, a la edad del cultivo y a la especie (Jimnez-Junca, 2005). Un aspecto
importante, son las resiembras dependiendo de cada especie, es el desarrollo y
crecimiento del cultivo.

El tiempo de duracin de cada fase de crecimiento puede variar conforme a

diversos factores como son la especie de la planta, la edad de las clulas, las
condiciones de estrs durante el cultivo, los componentes y concentraciones de
los nutrientes en el medio de cultivo, as como los factores fsicos como la
intensidad luminosa y fotoperiodo durante el cultivo (Bhm y Rink, 1988; Jimnez
y Gutirrez, 1999).

6.3 Determinacin de la sensibilidad del callo a kanamicina

Para establecer un sistema de transformacin de plantas es necesario contar con

un marcador que permita la seleccin de posibles transformantes, por lo que es
necesario determinar la sensibilidad de los tejidos a un antibitico (Mathews y Litz,
1990). En callo de cempaxchil se observ que el tejido es tolerante a las
concentraciones de 50 mg/L, ya que los explantes sobrevivieron a esta
concentracin. Al aumentar la concentracin a 100 y 250 mg/L, se observ una
disminucin en el crecimiento del callo, con una coloracin verde oscuro,
finalmente la exposicin del callo a la concentracin a 500 mg/L de kanamicina,
provoc la inhibicin total del crecimiento y ste present una coloracin caf
(clulas necrosadas)( Figura 18).

53
 50 mg/mL 100 mg/mL

250 mg/mL 500 mg/mL

Figura 18. Callo de cempaxchil en medio MS adicionado con

kanamicina.

54
En la Tabla 4 se muestra la supervivencia de los callos en las diferentes
concentraciones de kanamicina.

Se han realizado diferentes trabajos encaminados a la utilizacin de genes de

resistencia para la transformacin gentica como el gen nptII que confiere
resistencia al antibitico kanamicina. Por ejemplo Chvez-Vela y col. (2003)
utilizaron este gen al transformar genticamente el naranjo agrio, ellos reportaron
que 50 mg/L de kanamicina fu la concentracin adecuada. Blanco y col. (2003),
utilizaron del gen nptII para transformar genticamente zanahoria y determinaron
que los explantes transformados mostraron un crecimiento normal a una
concentracin de 100 mg/L de kanamicina. El marcador de resistencia antibitica
ms ampliamente utilizado para la seleccin de clulas vegetales transformadas
es el gen nptII, este gen est presente en diferentes plantas genticamente
modificadas a las que se les integraron genes marcadores de resistencia a los
antibiticos.

Se han reportado trabajos en los cuales se utiliza el anlisis digital de imgenes

para obtener informacin cuantitativa en tiempo real de los cultivos y obtener la
morfologa y el tamao de los agregados (Lira 2000). Yokota y col. (1998)
trabajaron con clulas desdiferenciadas de Daucus carota, ellos estimaron el
cambio del volumen celular y estimaron la velocidad especfica de crecimiento a
partir de las imgenes fotogrficas de las clulas

En este trabajo se utiliz el anlisis digital de imgenes para determinar el ndice

de crecimiento del callo de cempaxchil expuesto al antibitico kanamicina. En la
figura 19 se muestran las imgenes binarizadas al inicio y final del tratamiento
durante los 30 das que dur el tratamiento, con las concentraciones de
kanamicina evaluadas. El anlisis de imgenes revel que las clulas mostraron
diferencias en el rea proyectada, particularmente se tom en cuenta que se inicia
con los callos de tamaos celulares similares. Se observ de manera general que

55
Tabla 4. Sensibilidad de clulas desdiferenciadas de
cempaxchil en medio MS adicionado con las diferentes
concentraciones de kanamicina.

Concentracin de Porcentaje de
kanamicina (mg/L) supervivencia (%)

0 100 a

50 100 a

100 66.6 b

250 50 b

500 0 c

Los valores seguidos por la misma letra no difieren estadsticamente

a p=0.05 de acuerdo a la prueba de diferencias mnimas
significativas (dms).

56
 Inicio del tratamiento (da 0) Final del tratamiento (da 30)

Figura 19. Imgenes del rea proyectada del callo de

cempaxchil al inicio y a los 30 das con las concentraciones
probadas de kanamicina.

57
el rea proyectada final de los callos, present una tendencia a disminuir en su
crecimiento conforme se increment la concentracin del antibitico.

En la figura 20 se muestra el efecto del antibitico sobre el ndice de crecimiento

del callo al inicio y final del experimento por 30 das, con las concentraciones del
antibitico. Se confirm que el crecimiento de las clulas a partir de una
concentracin de 100 mg/L del antibitico se inhibi; tal comportamiento se
evidencia, para la concentracin de 500 mg/L en donde el crecimiento fue menor
comparado con las concentraciones anteriores. De aqu se eligi la concentracin
de 100 mg/L como la adecuada para la seleccin de posibles transformantes, ya
que el antibitico inhibe el crecimiento de las clulas (Mathews y Litz, 1990). Hasta
el momento, no existen reportes en los que se haya analizado cuantitativamente y
especficamente por anlisis digital de imgenes, el efecto de la kanamicina en
callo de cempaxchil.

En este trabajo se determin que la concentracin de 100 mg/L es la adecuada,

para la seleccin de posibles transformantes, debido a que los callos detuvieron
su crecimiento. Este dato coincide por lo reportado por Vanegas-Espinoza (2003)
ya que el observ que 100 mg/L del antibitico en explantes de hojas de
cempaxchil, fu la mejor concentracin para determinar posibles transformantes.

58
 50 100 250 500

Figura 20. ndice de crecimiento del callo por efecto del antibitico
kanamicina. Los valores representan la media de cuatro muestras + el
error estndar.

59
6.4. Ensayos de biobalstica
6.4.1. Anlisis histoqumico de - Glucuronidasa (GUS)

Se evalu la distancia y presin de bombardeo, para llevar a cabo los

experimentos de expresin transitoria. Los callos al ser bombardeados con el
plsmido PBI426, con una pistola de alta presin a una distancia de 9 cm entre la
muestra y la zona de disparo a una presin de bombardeo de 3100.5 kpa, (Figura
21), se observ que las clulas no resistieron el tratamiento, de manera que
presentaron muerte celular y por lo tanto no se mostraron la coloracin azul. Al
bombardear el callo a 11 cm y 3100.5 kPa, mostraron el mismo comportamiento
que a 9 cm y la misma presin. Chavarri y col. (2004) observaron datos similares
al bombardear embriones somticos de mango donde la muerte de todos los
embriones se present a una distancia de 10 cm.

Posteriormente se realizaron otros bombardeos al callo a una presin de 6201.0

kPa y una distancia de 9 cm, logrando la sobrevivencia del material. Similar a lo
reportado por Quoirim y col. (1997) quienes utilizaron el plsmido PBI426 en callo
de Racoperma mangium, para la expresin de GUS; despus de 24 h, se observ
un nmero bajo de puntos azules. Finalmente se realiz otro bombardeo al callo
de cempaxchil a una presin de 6201.0 kPa y una distancia de 11 cm en el cual
se observ la coloracin azul ndigo, esto confirma la expresin del gen GUS en
el interior de las clulas (Figura 22). Con el estudio histoqumico que se hizo al
callo de cempaxchil, bombardeado a una distancia de 11 cm y una presin de
6201.0 kPa, con una pistola de alta presin, se confirma que la mayora de los
agregados celulares expresaron el gen y se observ la reaccin positiva al
reactivo de GUS, por la presencia del gen en el interior de las clulas por los
puntos azules que presenta.

60
Figura 21. Apariencia del callo bombardeado con el plsmido pBI426 a una
distancia de 9 cm y una presin de 3100.5 kPa despus del anlisis histoquimico
de la - glucuronidasa.

61
 Precipitado
azul

Precipitado
azul

Figura 22. Expresin transitoria de la -

glucuronidasa en callo de cempaxchil
bombardeado con el plsmido pBI426 a una
distancia de 11 cm y una presin de 6201.0 kPa.

62
Se han reportado diversos trabajos interesantes sobre la utilizacin de GUS para
diferenciar el tejido transformado del no transformado. La expresin transitoria de
la - glucuronidasa en callo de cempaxchil bombardeado a una distancia de 11
cm y una presin de 6201.0 kPa, como la mejor condicin; difiere con lo reportado
por Cruz-Hernandez y col. (2000) en el cual sealan las condiciones de
bombardeo en el tejido embriognico de mango usando una distancia de 15 cm y
una presin de 861.85 kPa con una pistola de baja presin, indicando la
transformacin estable del tejido por incorporacin del gen GUS. Vanegas-
Espinoza (2003) realiz experimentos con el vector PBI426, para expresin
transitoria en hojas de cempaxchil, donde mostr que 551.6 kPa y una distancia
de 10.5 cm con una pistola de baja presin, fueron las mejores condiciones para
observar la expresin transitoria del gen GUS.

63
VII. APORTACIONES

En este trabajo se aporta informacin relevante que servir para transformar callo
de cempaxchil. En el cual, se obtuvieron datos originales de la induccin de
callo, a partir de hojas cultivadas en invernadero; se determin que 2 mg/L de 2,4-
D y BA es la concentracin adecuada para el desarrollo de callo; as mismo, se
obtuvo la velocidad especfica de crecimiento de 0. 144 d-1 y un tiempo de
duplicacin de 4.8 d durante el desarrollo del cultivo.

Una vez que ya se tena el cultivo bajo condiciones controladas y la cintica de

crecimiento, los datos sirvieron para determinar la sensibilidad del callo al
antibitico para la seleccin de posibles transformantes, en el cual se determin
que el callo es suceptible a una concentracin de kanamicina de 100 mg/L, a estos
resultados se obtuvieron por medio de un anlisis digital de imgenes; finalmente
se establecieron las condiciones para la transformacin por medio de biobalstica
determinndose que una presin de 6201 kPa y una distancia de 11 cm de
bombardeo son las adecuadas para la expresin transitoria del gen uidA.

64
VIII. CONCLUSIONES

Se establecieron las condiciones adecuadas para generar callo de

cempaxchil a partir de explantes de hojas de plantas cultivadas en
invernadero.

Mediante el anlisis de una cintica de crecimiento celular de los cultivos de

cempaxchil, se determin la velocidad especfica de crecimiento y el
tiempo de duplicacin de las clulas cultivadas in vitro.

Se determin la concentracin de kanamicina que, adicionada al medio de

cultivo, reduce el crecimiento celular de manera considerable. La utilizacin
de kanamicina en el medio de cultivo ser de utilidad para la seleccin de
posibles transformantes despus del proceso de bombardeo e integracin
del transgen al genoma de las clulas.

Se logr observar la expresin del gen uidA mediante la deteccin del

producto del gen. La actividad enzimtica de la - glucuronidasa se apreci
mediante la reaccin positiva con el reactivo de gus en callo de
cempaxchil en las que se logr expresar el gen.

65
IX. PERSPECTIVAS

Con los resultados obtenidos, al establecer las bases para la

transformacin gentica expresando el gen uidA en el callo de cempaxchil,
se plantea la posibilidad de manipular genticamente clulas de
cempaxchil para establecer lneas celulares productoras de pigmentos, as
como la alternativa de regenerar plantas de cempaxchil con un alto
contenido de carotenoides.

Con los trabajos previos de anlisis de expresin de genes que codifican

para las enzimas que participan en el proceso de biosntesis de los
carotenoides y con las condiciones para la transformacin gentica en callo
de cempaxchil reportadas en este trabajo, se plantea la posibilidad de
modificar genes especficos en la ruta de biosntesis y desarrollar
protocolos de transformacin gentica para obtener pigmentos diferentes a
los que produce cempaxchil.

66
BIBLIOGRAFA

Agarwal, S. y Rao, A. V. 1998. Tomato lycopene and low density lipoprotein

oxidation: A human dietary intervention study. Lipids 33:981-984.

Arad, S. y Yaron, A. 1992. Natural pigments from red microalga for use in foods
and cosmetics. Trends in Food Science Technology 3: 92-96.

Armenta, A.; Guerrero, I. y Huerta, S. 2002. Astaxanthin extraction in from shrimp

waste by lactic fermentation and enzymatic hydrolysis of the caroprotein
complex. Journal of Food Science 67: 1002-1009.

Armstrong, G. y Hearst, J. E. 1996. Genetic and molecular biology of carotenoid

pigment biosynthesis. The FASEB Journal 10: 228-237.

Badui, S. 1999. Qumica de los Alimentos. Facultad de Qumica. Universidad

Nacional Autnoma de Mxico Edit. Alhambra Mexicana 380-383.

Badui, S. 2006. Pigmentos. En: Qumica de los Alimentos. Person Educacin.

Mxico 401-444.

Barba-lvarez, B. 2001. Reguladores del crecimiento vegetal. En: Cultivo de

Tejidos vegetales. Ed. Hurtado, D. V.; Merino, M. E. Trillas, Mxico 48-68.

Belarmino, M. M.; Abe, T. y Sasahara, T. 1992. Callus induction and plant

regeneration in african marigold (Tagetes erecta L.). Japanese Journal of
Breeding 42:835-841.

67
Bespalhok, J. C. y Hattori, K. 1998. Friable embryogenic callus and somatic
embryo formation from cotyledon explants of African marigold (Tagetes
erecta L.). Plant Cell Reports 17:870-875.

Birch, K. G.1997. Plant transformation: problems and strategies practical

application. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular
Biology 48: 296-326.

Blanco, M.; Valverde, R.; Gmez, L. 2003. Optimizacin de la transformacin

gentica con Agrobacterium rhizogenes. Agronoma Costarricense 27:
19-28.

Bhm, A. y Rink, E. 1990. Establishment and characterization of a betaxanthin

producing cell culture from Portulaca grandiflora. Plant Cell Tissue and
Organ Culture 26:75-82.

Bonora, A.; Pancaldi, S.; Gualandri, R. y Fasula, M. 2000. Carotenoid and

ultrastructure variations in plastids of Arum italicum Miller fruit during
maturation and ripening. Journal of Experimental Botany 346:873-884.

Britton, G. 1999. Pigments in food. More than just colours, Proc. 1er. Congres,
Pigments in Food. Sevilla, Espaa.

Brown, J. T. 1990. The initiation and maintenance of callus cultures En: Plant Cell
and Tissue Culture. Ed. Pollar J.W. y Walker, J. M. Human Press 6: 57-63.

Carretero-Accame, M. E. 2000. Compuestos fenlicos: flavonoides. Panorama

Actual Medica 24: 525-528.

68
Cervera, M.; Pina, J. A.; Jurez, J.; Navarro, L. y Pea L. 1998. Agrobacterium-
mediated transformation of citrange: factors affecting transformation and
regeneration. Plant Cell Reports 18: 271-278.

Chandler, L. A. y Schwartz, S. J. 1987. HPLC separation of cis-trans carotene

isomers in fresh and processed fruits and vegetables. Journal of Food
Science 52: 669 672.

Chvez-Vela, N.; Chvez-Ortiz, L. y Prez-Molphe, E. M. 2003. Transformacin

gentica del naranjo agrio usando Agrobacterium rhizogenes. Agrociencia
37: 629-639.

Chappell, J. 1995. Biochemistry and molecular biology of the isoprenoid

biosynthetic pathway in plant. Annual Reviews in Plant Physiology and
Plant Molecular Biology 46:521-547.

Chavarri, M.; Vegas, A.; Zambrano, A. y Demey, J. 2004. Transformacin de

embriones somticos de mango por biobalstica. Interciencia 29(5): 261-
266.

Chi-Manzanero, B.; Flores P. D. y Rivera M. R. 2002. Cempaschil fuente

importante de carotenoides. Ciencia y Desarrollo 165: 20-25.

Christou, P. 1996. Particle bombardment for genetic engineering of plants.

Biotechnology Intelligence Unit. Academic Press, U.K.

Cdice Florentino. 1980. Edicion facsmil del manuscrito. 218-220 de la Coleccin

Palatina de la Biblioteca Medicea Laurenzina. 3 tomos, Gobierno de la
Repblica Mexicana.

69
Crosgrove, D. 1997. Assembly and enlargement of the primary cell wall in plants.
Annual Reviews of Cell and Development Biology 13:171-201.

Cruz-Hernndez, A.; Town, L.; Cavallaro, A. y Botella J. R. 2000. Transient and

stable transformation of mango by particle bombardment. Acta Horticulture
509: 237-242.

Dalta, R. S. S.; Hammerlind, J. K.; Pelcher, L. E.; Crosby, W. L. y Selvaraj, G.

1991. A bifunctional fusion between - glucuronide and neomycin
phophotransferase: a broad-spectrum marker enzyme for plants. Gene
101: 239-246.

Davies, P. J. 1995. The Plant Hormones. Their nature, occurrence and functions.
En: Davies, P. J. Plant Hormones. Physiology Biochemistry and Molecular
Biology. Kluwer Academic Publishers Dordrecht 1-11.

Del Villar-Martnez, A. A.; Serrato-Cruz, M. A.; Solano-Navarro, A.; Arenas-

Ocampo, M. L.; Quintero-Gutirrez A. G.; Snchez-Milln, J. L.;
Evangelista-Lozano, S.; Jimnez- Aparicio, A.; Garca-Jimnez, F. A. y
Vanegas-Espinoza, P. E. 2007. Carotenoides en Tagetes erecta L. la
modificacin gentica como alternativa. Revista Fitotecnia Mexicana 2
(30): 109-118.

Del Villar-Martnez, A. A.; Garca-Saucedo, P. A.; Crabez-Trejo, A.; Cruz-

Hernndez, A. y Paredes-Lpez, O. 2005. Carotenogenic gene
expression and ultrastructural changes during development in marigold.
Journal Plant Physiology 162: 1046-1056.

70
Delgado-Vargas, F. y Paredes-Lpez O. 2003. Chemicals and colorants as
nutraceuticals. En: Natural Colorants for Food and Nutraceuticals Uses.
CRC. Press. Boca Raton, Florida U.S.A 257 305.

Delgado-Vargas, F. 1997. Pigmentos de flor de campaxchil (Tagetes erecta)

caracterizacin fisicoqumica, procesamiento y eficacia pigmentante. Tesis
Doctoral. CINVESTAV-IPN. Unidad Irapuato, Mxico.

Daz, M. L.; Zappacosta, D. C.; Franzone, P. M. y Ros, R. D. 2004.

Transformacin gentica. En: Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal.
Consejo Argentino para la Formacin y Desarrollo de la Biotecnologia,
Argentina 109-123.

EFB: Federacin Europea de Biotecnologa. 2001. Marcadores de resistencia a los

antibiticos en los cultivos genticamente modificados (GM). No.10.

Eskling, M.; Arvidsson, P. O. y kerlund, H. E. 1997. The xanthophyll cycle, its

regulation and components. Physiologia Plantarum 4: 806-816

EvangelistaLozano, S.; Manzanares C. Y.; Escobar, A. S. y Ventura- Zapata, E.

2005. Propagacin de tres cultivares de Bougainvillea glabra Choise
mediante esquejes en diferentes sustratos. Proceding of the Interamerican
Society of Tropical Horticulture 48: 161-163.

Francis, F. J. 1999. Colorants. Eagan Press Handbook Series. ST. Paul

Minnesota, U.S.A.

Franco, M. 2004. Caracterizacin parcial del pigmento rojo del fruto de jiotilla
(Escontria chiotilla) una cactcea subexplotada. Tesis de Maestra.
Universidad Autnoma Metropolitana-Iztapalapa, Mxico D. F.

71
Galicia, F. 1994. La ofrenda floral del da de muertos como fuente de
germoplasma de cempoaxchil. Memorias del XV Congreso de
Fitogentica. Monterrey, Nuevo Len 25-30.

Gmez Aguirre, Y. A. 2005. Establecimiento de un cultivo in vitro de Ipomoea

intrapilosa y evaluacin de su actividad insecticida contra Trialeurodes
vaporariorum. Tesis de Maestra. CEPROBI-IPN. Yautepec, Mxico.

Grotewold, E. 2006. The genetics and biochemistry of floral pigments. The Annual
Review of Plant Biology 57:761-780.

Guzmn-Maldonado, S. H.; y Paredes-Lpez, O. 1998. Functional products of

plants indigenous to Latin America: Amaranth, quinoa, common beans and
botanicals. En: Functional Foods. Biochemical and Processing Aspects. G.
Mazza, Ed. Technomic Publishing Lancaster, Pennsylvania, U. S. A

Hari, R. K.; Patel, T. R. y Martn, A. M. 1994. An overview of pigment production in

biological systems: functions, biosynthesis, and applications in food
industry. Foods Reviews International 10: 49-70.

Hinostroza, G. C.; Huberman, A.; De la Lanza, G. y Monroy-Ruiz, E. 1997.

Pigmentation of the rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) with oil extracted
astaxanthin from the langostilla (Pleuroncode planipes). Archivos
Latinoamericanos de Nutricin 4 (3): 237-240.

Hooykaas, P. J. J. y Schilperoort, R. A. 1992. Agrobacterium and plant genetic

engineering. Plant Molecular Biology 19: 15-38.

Isaza, E. C. 2006. Dinmica no lineal del crecimiento de clulas vegetales

cultivadas in vitro, caracterizadas mediante anlisis digital de imgenes

72
 (ADI) y la dimensin fractal (ADF). Tesis de Ingeniera de Produccin
Agroindustrial. Universidad de la Sabana. Colombia.

Jimnez-Junca, C. A. 2005. Aplicacin de la geometra fractal a agregados

celulares de Beta vulgaris L. crecidos en suspensin (matraces y
biorreactor tipo tanque agitado). Tesis de Maestra. CEPROBI-IPN.
Yautepec, Mxico.

Jimnez, A. y Gutirrez, G. 1999. Production of food related colorants by culture of

plants cells. The case of betalains. Advances in Experimental Medicine
and Biology 462: 195-210.

Karcher, S. J. y Gelvin, S. B. 2007. Blue plants: Transgenic plants witch the Gus
reporter gene for the under graduate biology curriculum. Purdue University.
http:www.bio.purdue.edu/

Kearney, T. y Peebles R. H. 1960. Arizona Flora. Second Ed. University of

California Press. Los Angeles. USA.

Krinsky, N. I. 1994. The biological properties of carotenoids. Pure and Applied

Chemistry 66: 1003 -1010.

Lichtenthaler, H. K. 1999. The 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate pathway of

isoprenoid biosynthesis in plant. Annual Reviews of Plant Physiology and
Plant Molecular Biology 50: 47-65.

Lira, C. J. 2000. Introduccin al tratamiento digital de imgenes. Fondo de Cultura

Econmica, Mxico.

73
Lpez-Hernndez, E.; Ponce-Alquicira, E.; Cruz-Sosa, F. y Guerrero-Legarreta I.
2001. Characterization and stability of pigments extracted from Terminalia
catappa leaves. Journal Food Science 66: 832-836.

Mateo-Sagasta L. A. 1999. Cultivo in vitro de las plantas superiores. Ed. Mundi-

Prensa. Madrid, Espaa.

Mathews, H. y Litz R. E. 1990. Kanamycin sensitivity of mango somatic embryos.

Hort Science 25: 965-966.

Martnez- Bonfil, B. P. 2003. Identificacin de las betalanas producidas por cultivo

de clulas de Beta vulgaris L. Crosby Egyptian en diferentes sistemas
(callo y suspensin celular). Tesis de Maestra. CEPROBI-IPN. Yautepec,
Mxico.

Mc Caskill, D. y Croteau, R. 1998. Some caveats for bioengineering terpenoid

metabolism in plants. Trends Biotechnology 16: 349-355.

Meja, L. A.; Husdson, E.; Gonzlez de Meja, E.; y Vzquez, F. 1988. Carotenoid
content and vitamin A activity of some commmon cultivars of Mexican
peppers (Capsicum annum) as determined by HPLC. Journal of Food
Science 53: 1448- 1451.

Mendieta, R. M. y Del Almo, S. R. 1981. Plantas Medicinales del Estado de

Yucatn. 1ra ed. Instituto Nacional de Investigacin Sobre Recursos
Biticos. CECSA. Mxico.

Mnguez-Mosquera, M. I.; Prez-Glvez, A. y Hornero-Mndez, D. 2004.

Pigmentos carotenoides en frutos y vegetales; mucho ms que simples

74
 colorantes naturales. Instituto de Agroqumica y Tecnologa de
Alimentos, Consejo Superior de Investigaciones Cientficas. Sevilla 4: 2-7.

Murashige, T. y Skoog, F. A. 1962. Revised medium for rapid growth and

bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum 15: 472-
497.

Pea, L.; Cervera, M.; Jurez, J.; Navarro, A.; Pia, J. A.; Durn- Villa, N.;
Navarro, L. 1995. Agrobacterium- mediated transformation of sweet
orange and regeneration of transgenic plants. Plant Cell Reports 14: 616-
619.

Prez-Molphe, E. M.; Ramrez-Malagn, R.; Nez-Palenius, H. G. y Ochoa-Alejo

N. 1999. Introduccin al Cultivo de Tejidos Vegetales. Universidad
Autnoma de Aguascalientes. Aguascalientes, Mxico.

Quoirim, M.; Aragao, F.; Reach E. y De Orveira, D. E. 1997. Transient expression

of a reporter gene introduced by bioballistic bombardment into Racoperma
mangium (leguminosae family) tissues. Brazilian Journal of Genetic 203:
507-510.

Ramos- Viveros, V. 2007. Anlisis ultraestructural de clulas desdiferenciadas de

cempaxchil (Tagetes erecta). Tesis de Licenciatura. Benemrita
Universidad Autnoma de Puebla. Puebla, Mxico.

Rodrguez-Amaya, D. B. 1999. Carotenoides y preparacin de alimentos: La

retencin de los carotenoides provitamina A en alimentos preparados,
procesados y almacenados. Tesis de Doctorado. Universidade Estadual
de Campinas, Brasil.

75
Rzedowski, J. y Rzedowski, G. C. 1985. Flora Fanerogmica del Valle de Mxico,
Vol. II. 1ra. Ed. Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas IPN, Instituto de
Ecologa, Mxico D. F.

Snchez-Segura, L; Chanona-Prez, J.; Arenas-Ocampo, M., Alamilla-Beltrn, L.;

Gutirrez-Lpez, G. y Jimnez-Aparicio R. A. 2007. Dinmica descriptiva
del crecimiento de callos de Beta vulgaris l. cultivadas in vitro mediante
anlisis fractal de imgenes. Revista Alimentos Ciencia y Ingienieria 16
(3): 33-38.

Sandmann, G. 2001. Genetic manipulation of carotenoid biosynthesis: strategies,

problems and achievements. Trends in Plant Science 6:1417.

Serrato-Cruz, M. A. 2004. Cempoalchilt: diversidad biolgica y usos. Ciencia y

Desarrollo. www.conacyt.mx/comunicacion/revista/185/Articulos/C_Solar

Serrato-Cruz, M. A.; Miranda-Coln, S.; Castillo-Gonzlez, F. y Garca- Velzquez,

A. 2000. Cruzamiento intraespecfico en el cempoalxchil (Tagetes erecta
L.) Revista Fitotecnia Mexicana 23: 69-78.

Serrato-Cruz, M. A. 1999. Variabilidad gentica de plantas de cempoalxchitl

(Tagetes spp). Tesis Doctoral. Colegio de Postgraduados en Ciencias
Agrcolas, Montecillo, Mxico.

Serrato-Cruz, M. A. 1994. Variabilidad de autoincompatibilidad en Tagetes erecta

L. En: Memorias del II Congreso Latinoamericano de Gentica y XV
Congreso de Fitogentica. Sociedad Mexicana de Fitogentica, Chapingo,
Mxico.

76
Simpson, K. L. 1983. Relative value of carotenoids as precursors of vitamine A.
Proceding of the Nutrition Society 42: 7-17.

Stewart, J. 1980. Color as related to quality in citrus. En: Citrus Nutrition and
Quality, American Chemistry Society, Washington, D.C.

Stintzing, C. F.; Sintzing, S. A.; Carle, R.; Frei, B. y Wrolstad, R. 2002. Color and
antioxidant properties of cyanidin-based anthocyanin pigments. Journal of
Agricultural and Food Chemistry 50: 6172-6180.

Thorngate, H. J. 2002. Synthetic food colorants. En: Food Additives. Ed. L.A.
Branen. Marcel Decaer, Nueva York.

Tun-Surez, J. M. 1990. Evaluacin de las condiciones ptimas para el

establecimiento in vivo de Tagetes erecta (cempaxchil). Tesis de
Licenciatura. Instituto Tecnolgico Agropecuario 2. Conkal, Yucatn.

Turner, B. L. 1996. The Comps of Mexico. Tageteae and Anthemideae. Phytologia

Memoirs 6(10): 51-69.

Vaca, R. M. y Santana, A. K. 1999. Principales requisitos para la importacin de

colorantes en Estados Unidos. Gerencia de Desarrollo de Productos de
Informacin. Banco de Comercio Exterior, Mxico.

Van den Berg, H.; Faulks, R.; Granado, H. F.; Hirschberg, J., Olmedilla, B.;
Sandmann, G.; Southon S.; Stahl W.; Lindsay D. G. y Clifford M. N. 2000.
The potential for the improvement of carotenoid levels in foods and the
likely systemic effects. Journal of the Science of Food and Agriculture 80:
880-912.

77
Vanegas, P. E.; Cruz-Hernndez, A.; Valverde, M. E. y Paredes-Lpez, O. 2002.
Plant regeneration via organogenesis in marigold. Plant Cell, Tissue and
Organ Culture 69: 279-283.

Vanegas-Espinoza, P. E. 2003. Establecimiento de un sistema de regeneracin y

transformacin gentica de plantas de cempaxchil. Tesis Doctoral.
CINVESTAV-IPN. Unidad Irapuato, Mxico.

Vergunst, A. C. y Hooykaas, P. J. J. 1999. Recombination in the plant genome and

its application in biotechnology. Critical Reviews in Plant Sciences 18: 1-
31.

Wrolstand, R. E. 2000. Colorants. En: Food Chemistry and Applications, Ed.

Christen, G. L. y Smith, J. S. Science Technology System, West
Sacramento California.

Yokota, T.; Tutumi, N. y Takahashi, K. 1998. Growth rate estimation of in vitro

primarily induced carrot callus by a fractal based model. Biochemical
Engineering Journal 3: 231-234.

78