TUGAS

KIMIA BAHAN MAKANAN

OPTIMASI METODE HPLC UNTUK MENGUKUR RESIDU

TETRASIKLIN DALAM MADU

Kelompok 9B:

Kamilia Qudsiani (08121006052)

Nur Afriani (08121006046)

Adani Adilarayani (08121006060)

Nila Yeni Ningsih (08121006074)

Fabiola Palasintia Permata (08121006064)

Ario Firana (08121006048)

JURUSAN FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS SRIWIJAYA

2015
Abstrak

Tetrasiklin digunakan untuk pengobatan atau pencegahan fouldbrood Amerika dan

Eropa pada koloni lebah yang disebabkan terutama oleh dua jenis bakteri: Paenibacillus larva
dan melissococcus pluton, masing-masing. dalam Penelitian ini dilakukan metode untuk
penentuan residu tetrasiklin dalam madu telah yang dioptimalkan dan divalidasi. Digunakan
kromatografi fase terbalik kinerja tinggi cair (HPLC) dengan deteksi UV. Tetrasiklin
diekstraksi dari madu dengan 0,01 M natrium suksinat sebagai penyangga. Langkah
membersihkan, ekstraksi fasa padat menggunakan resin kelat logam. Tetrasiklin dielusi
dengan buffer yang mengandung EDTA. Didapakan linearitas, presisi, pemulihan dan
sensitivitas yang memuaskan. batas deteksi estabilished pada 5 g/ kg.

Pendahuluan

Tetrasiklin secara kimiawi ditandai dengan konjugat struktur empat-cincin parsial

dengan kelompok fungsional carboxyamide. Chlortetracycline, oxytetracycline dan tetrasiklin
adalah golongan antibiotic kelas ini. Mereka memiliki kemampuan untuk membentuk
kompleks kuat dengan kation multivalent.

Untuk alasan ini, dalam metodologi ekstraksi dan analisis untuk penentuan tetrasiklin,
kami menggunakan larutan yang mengandung zat pengkelat untuk mengurangi
kecenderungan tetrasiklin untuk mengikat kation dalam matriks. Kelat logam kolom afinitas
digunakan untuk membersihkan solusi suksinat penyangga madu. Kolom Mini sebelumnya
telah diisi dengan ion tembaga. Tetrasiklin secara khusus diserap dari larutan madu karena
membentuk kelat dengan ion tembaga reversibel terikat, untuk Iminodiacetic asam resin
epoxy-diaktifkan. Analit dielusi dari kolom menggunakan zat pengkelat lain: mcllvaine
EDTA penyangga.

Madu umumnya dianggap sebagai produk alami dan sehat. Kecanduan zat adiktif atau
melestarikan agen untuk madu tidak diperbolehkan. Antibiotik terutama digunakan dalam
pemeliharaan lebah untuk pengobatan penyakit induk bakteri. Antibiotik yang digunakan
dalam koloni dapat mencemari juga madu dan royal jelly.

Akhir-akhir ini, di banyak publikasi masalah residu antibiotik dalam madu

disebutkan. Pada tahun 1990, komisi serikat Eropa meletakkan prosedur untuk menetapkan
residu maksimum batas obat hewan dalam bahan makanan yang berasal dari hewan. Namun,
tidak ada MRL telah diperbaiki untuk digunakan dengan produk-produk lebah. Antibiotik
seperti tetrasiklin memiliki MRL dikenakan untuk mereka gunakan dalam nutrisi hewan,
kelelawar adalah ilegal untuk digunakan dalam pemeliharaan lebah.

Negara serikat Eropa tidak mengizinkan madu mengandung obat di atas batas deteksi yang
sesuai, sementara yang lain, misalnya Swiss, Inggris dan Belgia telah menetapkan batas
tindakan, yang umumnya terletak antara 10 sampai 50 mg / kg untuk setiap kelompok
antibiotik.

Material dan Metode

1. Alat

Kromatografi menggunakan alat Shimadzu VP Series (Jepang). Alat ini terdapat

pompa biner LC-10AD, tekanan DGU-14A, sistem kontrol SLC-10A, wadah kolom CTO-
10AS, injeksi SIL-10AF dan detektor UV VIS pada panjang gelombang 360 nm SPD-10A.
Pemisahan dilakukan pada Nukleosil 100 RP-18, kolom berukuran 5 mikrometer. Fase gerak
yang digunakan adalah asam oksalat 10 mM, aseotinitril dan metanol dan didapatkan puncak
yang simetris. Kecepatan alir adalah 1 mL/menit, volume injeksi sebanyak 50 mikroliter
dengan temperatur kolom sebesar 35 derajat celcius. Untuk persiapan ekstraksi, alat
sentrifugasi bermerk Sigma 3KI8 (Jerman) digunakan untuk ekstrasi fase padat, vakum
bermerk Manifold dengan kolom polipropilen berukuran 3 mL dan wadah berukuran 10 mL,
yang berisikan campuran silika di dalamnya juga digunakan.

2. Reagen

Air murni, beberapa solven (metanol, asetonitril, dan etanol absolut) dan buffer
natrium suksinat untuk cairan pengekstraksi. 0,1 M asam suksinat disiapkan dan kontrol pH-
nya dengan 5 M natrium hidroksida. Larutan buffer stabil pada 4 derajat celcius. Dan juga,
resin sebagai agen pengkelat dicampurkan pada suspensi etanol 20% dan 10 mM tembaga
sulfat digunakan untuk mengekstraksi antibiotik dari madu. Eluen yang digunakan
mengandung buffer Mellvaine-EDTA-NaCl yang stabil pada suhu ruangan dlam dua minggu.
Larutan standar asli adalah garam hidroklorida pada tetraksiklin dan oksitetrasiklin. Larutan
stok tetrasiklin dan oksitetraksilin (100 mikrogram/mililiter) disiapkan sebagai fase gerak.
Larutan stok ini stabil pada suhu 4 derajat celcius ketika disimpan pada botol gelap.
3. Prosedur analisis dan metode validasi

Sampel madu ditimbang dan dilarutkan pada larutan ekstraksi. Larutan diaduk,
disentrifugasi dan dimasukkan ke mini kolom pengkelat yang sebelumnya sudah
dikondisikan. Kolom tersebut dicuci dan tetrasiklin dielusikan dengan buffer yang
mengandung EDTA. Larutan yang didapatkan di saring menggunakan filter kromatografi
nilon berukuran 0,45 mikrometer dan kemudian diinjeksikan ke sistem KCKT. Ekstrak
sampel harus dianalisis selama 4 jam preparasi dan harus didinginkan selama sehari.

Kurva kalibrasi dilakukan dengan menggunakan tetrasiklin yang berasal dari

kormatogram standar, dengan menandai konsentrasi pada area puncak. Nilai koefisien
korelasi adalah 0,99985 untuk kurva standar tetrasiklin dan 0,99995 untuk kurva standar
oksitetrasiklin.

Standar diinjeksikan secara terpisah, larutan standar yang dicampur (gambar 1), madu
bebas antibiotik (gambar 2) dan sampel madu spiked dengan standar (gambar 3).
Perbandingan antara sampel madu dengan sampel madu spiked ditunjukkan pada gambar 4.
Kedua standar telah dipisahkan. Waktu retensi dari residu bisa dikatakan stabil (7,19 menit
untuk oksitetrasiklin dan 8,65 menit untuk tetrasiklin). Kromatogram yang didapat bebas dari
pengotor. Tidak ada puncak pada daerah tetrasiklin selama melakukan sampel madu kosong
atau hanya dengan injeksi buffer. Linearitas dicek dengan rentang konsentrasi 5 sampai 500
mikrogram/kilogram (r2-0,999), nilai distribusi residual juga menunjukkan linearitas yang
bagus. Batasan deteksi dan kuantifikasi (LOD dan LOQ) telah dihitung menggunakan HPLC.
Nilai yang didapat telah ditunjukkan pada tabel 1.

Pengulangan dari metode telah dihitung dengan standar deviasi relatif untuk enal buah
sampel madu spiked pada tingkat konsentrasi 100 mikrogram/kilogram.

Reproduksibilitas telah dihitung dengan standar deviasi relatif untuk enal buah sampel
madu spiked pada tingkat konsentrasi 100 mikrogram/kilogram, diinjeksikan di lain hari.
 Untuk tes pembaruan, 6 buah sampel yang telah di-spiked dengan larutan standar
tetrasiklin pada tingkat konsentarsi 100 mikrogram/kilogram, sebelum prosedur ekstraksi lalu
sampel madu yang tanpa ditambahkan dengan antibiotik dibandingkan. Rata rata nilai
pembaruan adalah 83% untuk oksitetrasiklin dan 70% untuk tetrasiklin.

A. Metode analisis apa yang digunakan dalam penelitian tersebut?

Metode pemisahan : Kromatografi fase terbalik kinerja tinggi cair (HPLC) dengan
deteksi

Ultra violet.

Metode ekstraksi : Ekstraksi fase padat

SPE sebagai alat yang utama untuk pra-perlakuan sampel atau untuk clean-up sampel-
sampel yang kotor, misal sampel-sampel yang mempunyai kandungan matriks yang tinggi
seperti garam-garam, protein, polimer, resin,

B. Bagaimana prinsip kerja instrument yang digunakan?

Prinsip kerja :

Prinsip dasar dari HPLC adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya.

Adapun prinsip kerja dari alat HPLC adalah ketika suatu sampel yang akan diuji diinjeksikan
ke dalam kolom maka sampel tersebut kemudian akan terurai dan terpisah menjadi senyawa-
senyawa kimia ( analit ) sesuai dengan perbedaan afinitasnya. Hasil pemisahan tersebut
kemudian akan dideteksi oleh detector (spektrofotometer UV, fluorometer atau indeks bias)
pada panjang gelombang tertentu, hasil yang muncul dari detektor tersebut selanjutnya dicatat
oleh recorder yang biasanya dapat ditampilkan menggunakan integrator atau menggunakan
personal computer (PC) yang terhubung online dengan alat HPLC tersebut.
Fase terbalik ( fase diam kurang polar dari pada fase geraknya ). Fase gerak yang
digunakan adalah campuran asam oksalat 10 mM, metanol dan asetonitril. Fase diam
campuran silika .

C. Bagaimana pengolahan data hasil penelitian tersebut?

Madu yang telah di ekstraksi di injeksikan kedalam HPLC, kurva kalibrasi dilakukan
untuk setiap tetrasiklin dari kromatogram standar, dengan memplot konsentrasi terhadap
daerah puncak. Nilai efisien korelasi adalah 0,99985 untuk tetrasiklin kurva standar dan
0,9995 untuk oxytetracycline kurva standar. Setiap standar disuntikkan secara terpisah,
campuran larutan standar, madu bebas antibiotik dan sampel madu berduri dengan standar
perbandingan antara sampel madu dan sampel madu berduri adalah ditampilkan dalam
gambar 4

kedua standar itu dasar terpisah. waktu retensi residu yang stabil (7.19 menit untuk
oxytetracycline dan 8.65 menit untuk tetrasiklin). kromatogram yang diperoleh untuk ekstrak
bebas dari gangguan. Tidak ada puncak di wilayah tetrasiklin selama berjalan dibuat dengan
sampel madu kosong atau dengan hanya penyangga disuntikkan. Linearitas diperiksa pada
rentang konsentrasi 5-500 g/kg ( r2 = 0,999) nilai residu distribusi juga menunjukkan
linearitas yang baik. Batas deteksi dan kuantifikasi dihitung menggunakan software HPLC,
diperoleh nilai diberikan dalam tabel 1

Pengulangan metode dihitung menggunakan standar deviasi relatif selama enam sampel
madu berduri di tingkat 100 g/kg.

Reproduktifitas yang dihitung menggunakan deviasi relatif untuk sampel enam madu di level
100 g/kg, disuntikkan pada hari yang berbeda.
untuk tes pemulihan, 6 sampel madu yang dibubuhi standars tetrasiklin pada tingkat
konsentrasi 100 g/kg, sebelum prosedur ekstraksi dan kemudian sampel madu tanpa
ditambahkan antibiotik dibandingkan.Nilai rata-rata recovery adalah 83% untuk
oxytetracycline dan 70% untuk tetrasiklin.

Kesimpulan

1. Prosedur diterapkan untuk menganalisis tetrasiklin residu dalam berbagai jenis madu:
puncak kromatogram dihasilkan tidak bercampur untuk setiap matriks (akasia,
multifloral atau melon madu)
2. Langkah bersih-bersih menggunakan SPE dengan cartridge, yang dapat memisahkan
tetrasiklin dari kotoran, sangat penting. untuk ekstraksi SPE, beberapa kartrid, seperti
perairan oasis HLB 3cc (60 mg), penemuan DSC-Ph (500 mg), C18 dan kelat mini-
kolom diuji. Hasil terbaik diperoleh dengan menggunakan yang terakhir.
3. Beberapa madu yang berbeda dianalisis menggunakan metode ini dan tidak ada
tetrasiklin diidentifikasi di atas batas deteksi.
4. linearitas, presisi, pemulihan yang memuaskan dan dalam kesimpulan, metode ini
mampu untuk mendeteksi residu tetrasiklin bawah 10 g / kg tingkat konsentrasi.