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10. PRTICA COLIFORMES TOTAIS E TERMOTOLERANTES (FECAIS - E.

COLI) PELA TCNICA DO NMERO MAIS PROVVEL (NMP)

10.1 FUNDAMENTAO

10.1.1 GRUPO COLIFORMES

As bactrias Gram negativas so de grande importncia, pois abrangem as


enterobactrias, e dentro deste grupo podemos citar dois subgrupos de grande destaque
na rea de alimentos: os coliformes fecais e totais, que indicam contaminao do
alimento por manipulao inadequada.
A famlia Enterobacteriaceae uma das mais importantes famlias bacterianas, a
ela pertencem muitos dos patgenos mais importantes para o homem e para os animais.
Estes patgenos esto entre os principais agentes de infeco hospitalar e constituem a
principal causa de infeco intestinal em muitos pases.
Os gneros de maior importncia so:
Escherichia *
Shigella
Salmonella
Yersinia
Enterobacter *
Citrobacter *
Klebsiella *

Os gneros sublinhados so enteropatgenos (causadores de doenas intestinais) e


os gneros assinalados compem o grupo dos coliformes fecais, indicadores de
contaminao fecal. Dentre estes s a E. coli tem como habitat primrio o trato gastro
intestinal (TI) do homem e de animais de sangue quente. Os demais tambm esto
presentes em outros ambientes como vegetais e solo, onde persistem por tempo superior
ao de bactrias patognicas de origem intestinal como Salmonella e Shigella.
A espcie E. coli to varivel que existem sorotipos patognicos e no
patognicos, e at da flora normal.

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Os principais micro-organismos utilizados para indicar a qualidade microbiolgica
de alimentos so os coliformes fecais e totais.
O grupo dos coliformes totais composto por bactrias da famlia
Enterobacteriaceae capazes de fermentar a lactose com produo de gs, quando
incubados a 35-37C, por 48 horas.
Deste grupo, apenas a E. coli tem como hbitat primrio o trato intestinal do
homem e de animais.
A presena de coliformes totais no alimento no indica, necessariamente,
contaminao fecal recente ou ocorrncia de enteropatgenos, j que outras espcies
(Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella) no so de origem fecal indicando que o
alimento foi produzido sem cuidados higinicos ou armazenamento de forma
inadequada.
O grupo dos coliformes fecais so micro-organismos pertencentes ao grupo dos
totais, diferenciando-se pela capacidade de fermentar lactose com produo de gs em
temperatura de 44-45C. Nessas condies, a maioria das cepas de E. coli so positivas,
enquanto as outras bactrias possuem apenas algumas cepas com essa caracterstica.
A pesquisa de coliformes fecais ou de E. coli nos alimentos fornece informaes
sobre as condies higinicas do produto e indicao da presena de patgenos. Quanto
maior a concentrao de coliformes fecais na amostra analisada, maior o risco de haver
patgenos entricos naquela amostra (gua, alimentos, etc.).
Em produtos vegetais (POV) frescos, o nico indicador vlido de contaminao
fecal a E. coli, j que os demais indicadores de contaminao fecal so encontrados
naturalmente nesse tipo de alimento. Em produtos de origem animal (POA), como j
mencionado anteriormente, a presena de coliformes indica manipulao sem cuidados
higinicos ou armazenamento inadequado. Em alimentos processados, a presena de um
nmero considervel de coliformes indica processamento inadequado ou
recontaminao ps processo, e a possvel presena de micro-organismos patognicos e
toxignicos.
importante ressaltar que os alimentos no so fonte de contaminao, e sim
veculos. A contaminao provm do TI do animal (POA) e do solo (POV - neste caso,
sendo apenas superficial), por isso diz que as enterobactrias causam DVAs (Doenas
Veiculadas por Alimentos).

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10.1.2 APLICAO DA TCNICA DO NMERO MAIS PROVVEL

A tcnica do NMP um mtodo de quantificao indireta de micro-organismos.


Na realidade, no podemos contar UFCs, j que a anlise realizada em meio lquido, o
que se faz comparar o resultado encontrado com tabelas pr-escolhidas, obtendo um
resultado aproximado da quantidade de micro-organismos na amostra analisada. Estas
tabelas so elaboradas a partir de dados estatsticos, com os respectivos intervalos de
confiana (95%) para diversas combinaes de nmero de tubos positivos em cada srie
de diluio.
Significa dizer que existe uma probabilidade de 95% de que o nmero
verdadeiro de bactrias presentes na amostra se encontre dentro dos intervalos
mnimos e mximos em torno do NMP. Muito embora o mtodo dos tubos mltiplos
apresente sensibilidade elevada, permitindo a deteco de baixas densidades de
bactrias, o NMP no um valor preciso, e a preciso do teste depende do nmero de
tubos utilizados e dos volumes de amostra inoculados.
Este mtodo muito usado para quantificar coliformes, mas pode ser utilizado
para micro-organismos em geral, pois o meio utilizado adaptado ao micro-organismo
que se deseja quantificar, com agentes seletivos e indicadores.

10.2 OBJETIVOS

Aps a realizao da atividade prtica voc ser capaz de:

Compreender o papel das enterobactrias como agentes de toxinfeces


alimentares;
A diferena entre coliformes totais e termotolerantes.
Aplicao da tcnica do nmero mais provvel
compreender a denominao NMP e UFC;
expressar o resultado de uma contagem direta e uma indireta.

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10.3 DETERMINAO DE COLIFORMES PELA TCNICA DOS TUBOS
MLTIPLOS NMERO MAIS PROVVEL (NMP)

A tcnica do nmero mais provvel consiste no exame de uma srie de tubos


onde foram inoculados volumes diferentes de amostra.
O valor obtido resulta da consulta a tabelas que foram estimadas com base em
frmulas de probabilidade. Consideraes tericas e determinaes repetidas em grande
escala, indicam que este tipo de tcnica tende a fornecer valores mais elevados do que o
nmero real. As disparidades tendem a diminuir quando adota-se sries com maior
nmero de tubos em cada diluio. Portanto, a sensibilidade do teste depende do
nmero de tubos adotados.
Existem vrias tabelas de NMP e a escolha da srie a ser adotada funo das
caractersticas microbiolgicas da amostra.
Na aula prtica, utilizamos o sistema de 3 sries de 3 tubos, com diluies
decimais sucessivas.
A colimetria consta de 2 etapas: teste presuntivo, onde verificamos a existncia
de coliformes na amostra analisada, atravs da fermentao de lactose com produo de
gs; e o teste confirmativo, onde podemos verificar se os coliformes da amostra so
totais ou fecais.

10.4 MATERIAL e REAGENTES

Tubos contendo Caldo lauril sulfato de sdio concentrao simples (6


tubos);
Tubos contendo Caldo lauril sulfato de sdio concentrao dupla (3
tubos);
Tubos contendo Caldo verde brilhante bile 2% lactose (VBBL) (9 tubos);
Tubos contendo Caldo E. coli (EC) (9 tubos);
Tubos contendo Soluo salina peptonada 0,1% (3 tubos).
Pipeta de 1 a 2 mL
Frascos com 225 mL de Soluo salina peptonada 0,1% (1 frasco).
Pipeta de 10 mL
Proveta estril de 50 mL
Ala de Platina
Agitador de Tubos

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10.5 DESENVOLVIMENTO

10.5.1 TESTE PRESUNTIVO

Inocular a amostra em 3 sries de tubos contendo Caldo Lauril Sulfato Triptose


ou Caldo Lactose, de modo que cada srie seja inoculada com um volume de
amostra 10 vezes menor que a srie anterior.
Os tubos devem conter tubos de Durhan invertidos.

Sequncia da prtica
I. Identificar os tubos;
II. Nos primeiros 3 tubos, (os que contm Caldo Lauril Sulfato Triptose de
concentrao dupla) inocular com pipeta esterilizada,1 ml da amostra a
ser examinada, em cada tubo (Diluio 10-1);
III. Nos 6 tubos restantes (os que contm Caldo Lauril Sulfato Triptose de
concentrao simples), inocular nos 3 primeiros, 1 ml da amostra
(Diluio 10-2) e nos 3 ltimos tubos, inocular 1 ml da amostra, em cada
tubo (Diluio10-3);
IV. Homogeneizar os tubos;
V. Aps, incubao a 35 - 37C por 24 - 48 horas.
VI. Se no final de 24/48 horas, houver a formao de gs dentro do tubo de
Durhan, significa que o teste Presuntivo foi Positivo. Neste caso, fazer o
teste confirmativo. Se no houver a formao de gs durante o perodo
de incubao, o exame termina nesta fase e o resultado do teste
considerado negativo.
VII. Leitura: A suspeita de coliformes totais indicada pela formao de gs
nos tubos de Durhan (mnimo 1/10 do volume total) ou efervescncia
quando agitado gentilmente.
VIII. Anotar o nmero de tubos positivos em cada srie de diluio.

Observaes: A leitura pode ser feita aps 24 horas de incubao, porm, s sero
vlidos os resultados positivos. Os tubos que apresentarem resultado negativo devero
ser reincubados por mais 24 horas, mas os tubos positivos com 24 horas j devem ser
inoculados nos meios de confirmao para se evitar que um crescimento muito
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abundante provoque o abaixamento do pH, o que pode provocar resultados falsamente
negativos.

10.5.2 TESTES DE CONFIRMAO

Para coliformes totais:

I. A partir dos tubos com formao de gs obtidos na aula anterior


(Positivos com formao de gs nas 3 diluies 1:10; 1:100 e 1:1000);
II. Identificar os tubos;
III. Com a ala de platina, previamente flambada e fria, retirar de cada tubo
positivo uma poro de amostra e inocular no tubo correspondente
contendo Caldo Verde Brilhante Bile 2% Lactose.
IV. Homogeneizar os tubos.
V. Aps incubao a 35 37 C por 24/48 horas. Se no final do perodo de
horas houver a formao de gs dentro dos tubos de Durhan o teste
considerado positivo. Caso no haja formao de gs, o teste
considerado negativo.

Para coliformes fecais:

I. A partir dos tubos com formao de gs obtidos na aula anterior


(Positivos com formao de gs nas 3 diluies 1:10; 1:100 e 1:1000);
II. Identificar os tubos;
III. Com a ala de platina, previamente flambada e fria, retirar de cada tubo
positivo uma poro de amostra e inocular no tubo correspondente
contendo caldo E. Coli.
IV. Homogeneizar os tubos.
V. Aps incubao a 44,5 - 45 C em banho maria por 24/48 horas. Se no
final do perodo de horas houver a formao de gs dentro dos tubos de
Durhan o teste considerado positivo, indicando contaminao de
origem fecal. A ausncia de gs, mesmo com evidncia de crescimento
indica a presena de coliformes de outra fonte que no intestinos de
animais de sangue quente.

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Para completar o teste, podemos estriar uma alada de cada tubo positivo na etapa
confirmativa (dos caldos VBBL e EC) para placas com gar EMB (Eosina Azul de
Metileno), incubando a 35-37C por 24 horas e analisar a morfologia atravs da
colorao de Gram e observao ao microscpio (bacilos pequenos, Gram negativos,
no esporulados). Muitas vezes, a colimetria seguida de provas bioqumicas para a
confirmao e caracterizao do coliforme em questo.

10.5.3 EXPRESSAR OS RESULTADOS

a) os resultados so expressos em N.M.P (Nmero Mais Provvel)/ml ou g de amostra.


b) para se determinar o N.M.P, verifica-se a combinao formada pelo nmero de tubos
positivos que apresentaram as diluies 1:10; 1:100 e 1:1000 no Teste Confirmativo e
Presuntivo.

EXEMPLO:
a) nos 3 tubos da diluio 1:10, obtiveram-se 3 tubos positivos;
b) nos 3 tubos da diluio 1:100, obtiveram-se 2 tubos positivos;
c) nos 3tubos da diluio 1:1000, obteve-se 1 tubo positivo;
d) formou-se, portanto, a combinao 3-2-1;
e) determina-se o NMP consultando a tabela 3.

10.6 Exerccios de fixao

1. Qual a finalidade da colimetria?


2. Qual a diferena entre os mtodos diretos e indiretos de quantificao de bactrias?
3. Qual a fundamentao da etapa confirmativa da colimetria?
5. Por que devemos realizar diluies para executar as tcnicas de contagem em placa e
do NMP?
6. Defina o grupo coliforme, caracterize-os em relao a sua fisiologia, condies de
crescimento e metabolismo. Identifique dentro deste grupo quais gneros so
englobados e como eles podem contaminar os alimentos.
7. Descreva as vantagens e as desvantagens de utilizar a metodologia.

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8. Existe algum outro mtodo convencional ou rpido que substitua a tcnica?
9. A Tcnica de NMP para coliformes pode ser utilizada para todos os tipos de
alimentos incluindo guas? Se sim, indique a diferena existente entre as metodologias.
Caso no, justifique.

ESQUEMA ILUSTRATIVO DO PROCESSO DE DETERMINAO DA


PRESENA DE COLIFORMES PELA TCNICA DO NMERO MAIS
PROVVEL.
Fonte: Adaptado de SILVA et al., 1997 e CERQUEIRA, 2007.

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Olhar sequncia
posterior do
fluxograma para
entender melhor
esta parte

55
Fonte: SILVA et al., 1997.

56
Fonte: SILVA et al., 1997.

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REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS:

1. BROWN, A. E. Benson. Microbiological Applications Laboratory Manual in


General Microbiology. 8th Edition. The McGrawHillCompanies, 2001.
2. CAPPUCCINO, J.G. & SHERMAN, N., 1983. Microbiology, a laboratory
manual, Addison-Wesley Publishing Company, Reading, 466 p.
3. CERQUEIRA, Aloysio de Mello Figueiredo; SANTANNA, Raquel de Souza.
Apostila de aulas prticas - disciplina bacteriologia Nutrio. Universidade
Federal Fluminense. Instituto Biomdico. Departamento de Microbiologia e
Parasitologia, 2007.
4. SILVA, N., JUNQUEIRA, V. C. A., SILVEIRA, N. F. A., 1997. Manual de
mtodos de anlise microbiolgica de alimentos. So Paulo.

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