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TEXTOS

ACADMICOS

CULTURA DE TECIDOS

Renato Paiva
Patrcia Duarte de Oliveira Paiva
CURSO DE PS-GRADUAO
LATO S E N S U " (ESPECIALIZAO) A DISTNCIA
BIOTECNOLOGIA: FUNDAMENTOS TCNICOS,
APLICAES E PERSPECTIVAS

CULTURA DE TECIDOS

Renato Paiva
Patrcia Duarte de Oliveira Paiva

UFLA - Universidade Federal de Lavras


- Fundao de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Extenso
Lavras - MG
SUMRIO

1. CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS 7

2. LABORATRIO DE CULTURA DE TECIDOS 9

2.1. INTRODUO 9
2.2. ESTRUTURA FSICA 10
2.2.1. Sala de limpeza 11
2.2.2. Sala de preparo 12
2.2.3. Sala de transferncia 12
2.2.4. Sala de cultura ou sala de crescimento 12
2.2.5. Instalaes de apoio 12
2.3. EQUIPAMENTOS NECESSRIOS 12
2.4. VIDRARIAS UTILIZADAS 18

3. MEIOS DE CULTURA 22

3.1. INTRODUO 22
3.2. COMPOSIO DOS MEIOS DE CULTURA 22
3.2.1. gua 23
3.2.2. Nutrio mineral 23
3.2.3. Nutrio orgnica 25
3.2.4. Materiais de suporte 30
3.2.5. Qualidades fsicas do meio de cultura 31
3.2.6. pH 31
3.2.7. Quantidade de meio 31
3.2.8. Condies de incubao 32
3.2.9. Esterilizao do meio de cultura 34

4. TCNICAS DE ESTABELECIMENTO IN VITRO 36

4.1. INTRODUO 36
4 2. CALOGNESE 36
4.2.1. Aplicao da cultura de calos 38
4.2.2. Tcnicas para estabelecimento de calos 38
4.2.3. Tipos de calos 38
4.2.4. Tamanho, tempo de repicagem e manuteno de calos na subcultura 38
4.3. SUSPENSO CELULAR 39
4.3.1. Aplicaes da suspenso celular: 39
4.3.2. Mtodos mais utilizados para medir o crescimento celular: 39
4.3.3. Importncia da curva de crescimento 41
4.4. CULTURA DE ANTERAS 41
4.4.1. Protocolo para a obteno de haploides 42
4.4.2. Fatores que influenciam a andrognese 42
4.4.3. Identificao de haploides 43
4.4.4. Problemas 43
4.4.5. Utilizao de plantas haplides 43
4.5.; CULTURA DE ESTRUTURAS ORGANIZADAS 44
4.5.1.,Cultura de Meristemas 44
4.5.2. Cultura de Embries 46

5. MULTIPLICAO 50

5.1. INTRODUO 50
5.2. FASES DA MICROPROPAGAO 51
5.2.1. Fase preparativa (Estdio 0) 51
5.2.2. Incio do cultivo (Estgio 1) 52
5.2.3. Multiplicao (Estgio 2) 53
5.2.4. Alongamento de brotaes e induo de raiz (Estgio 3): 54
5.2.5. Transferncia para as condies de casa de vegetao (Estgio 4): 55
5.3. PRODUO DE MUDAS LIVRES DE ENFERMIDADES 55
5.3.1. Termoterapia 55
5.3.2. Cultura de meristema 55
5.3.3. Termoterapia seguida de cultura de meristema 56
5.3.4. Microenxertia 5 6

6. ENRAIZAMENTO 58

6.1. INTRODUO 5 8

6.2. ENRAIZAMENTO IN VITRO 59


6.3. ENRAIZAMENTO EX VITRO 62

7. ACLIMATIZAO 64

7.1. INTRODUO 6 4

7.2. ESTRESSE HDRICO 64


7.3. FOTOSSNTESE 65
7.4. ABSORO DE NUTRIENTES 65
7.5. FITOSSANIDADE 66
7.6. CONDIES PARA A ACLIMATIZAO 66

8. FOTOMORFOGNESE IN VITRO 68

8.1. INTRODUO 68
8.2. LUZ E LMPADAS 68
8.3. RESPOSTAS DA PLANTA LUZ 69
8.4. FOTOMORFOGNESE E CULTURA DE TECIDOS 69
8.4.1. Comprimento de onda 70
8.4.2. Intensidade de luz (irradincia) 70
8.4.3. Comprimento do dia (fotoperodo) 71

9. PROBLEMAS NO CULTIVO IN VITRO 72

9.1. INTRODUO 72
9.2. OXIDAO 72
9.3. DECLNIO NO VIGOR 74
9.3.1. Declnio na taxa de proliferao 74
9.3.2. Habituao 75
9.4. NECROSES 75
9.4.1. Necrose apical em brotaes 75
9.4.2. Como evitar a necrose 76
9.5. VITRIFICAO (HIPERHIDRICIDADE) 76
9.5.1. Ocorrncia 77
9.5.2. Fatores que influenciam a vitrificao 77
9.5.3. Preveno da vitrificao 78

10. PRINCIPAIS APLICAES DA CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS 80

10.1. INTRODUO 80
10.2. APLICAES DA CULTURA DE TECIDOS NA PROPAGAO ASSEXUADA 80
10.3. APLICAES EM FITOPATOLOGIA 81
10.4. APLICAES NO MELHORAMENTO GENTICO 81

11. ALGUNS CONCEITOS EM CULTURA DE TECIDOS 84

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 92
\ <s \\i VTV. r> 4 o OVO XA\-0>-CL<? m - 5 M ' - s d - t rTKX^CX* ^-CU^L
1
CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS

Renato Paiva 1

Patrcia Duarte de Oliveira Paiva2

O desenvolvimento de tcnicas de cultura de tecidos tem sido,


indubitavelmente, uma das contribuies mais significativas para as possibilidades
de manipulao dos biolgica. A cultura de tecidos um processo atravs do qual &~
pequenos fragmentos de tecido vivo (explantes) so isolados de um organismo e
cultivados assepticamente por perodos indefinidos em um meio nutritivo semi-
definido ou definido. Esta definio original deve ser, no entanto, ampliada no caso
das plantas, para incluir toda uma gama de explantes como plntulas e rgos (tais
como culturas de vulos ou de embries), clulas isoladas e protoplastos. Tais
avanos tm aumentado as perspectivas de operaes possveis de serem
utilizadas, em diversos campos da biotecnologia de plantas. Wtav>O0 J j ^ ^ P
Um marco importante nesta area ocorreu em 1958 atravs de dois grupos
independentes de pesquisadores, os quais conseguiram induzir embries somticos ^^0^
a partir do calo de cenoura, com subsequente desenvolvimento de plantas. Nos anos
seguintes, foi observado em outras espcies a capacidade de formar embries
somticos in vitro.
Os fenmenos morfogenticos observados in vitro resultam da diferenciao,
desdiferenciao ou rediferenciao do explante inicial e podem ser agrupados,
conforme a sua natureza, de duas formas diferentes: morfogenese por via direta ou
por via indireta. As tcnicas por via indireta podem ser empregadas, quando so
desejadas variaes genticas nos descendentes, em virtude da possibilidade de
obteno de variantes em clulas provenientes do calo. Em contrapartida, a tcnica
direta pode ser empregada quando se deseja manter a identidade gentica do
gentipo propagado.

1 Professor Adjunto, PhD, Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras


(UFLA)
2 Professora Adjunto, Dra., Departamento de Agricultura, UFLA.
EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

A utilizao da cultura de tecidos para fins de propagao de plantas


comumente dividida nos seguintes estgios: estgio 0 (seleo e preparo da planta
matriz), estgio 1 (estabelecimento de uma cultura assptica), estgio 2 (produo
de propgulos adequados), estgio 3 (preparao para o crescimento em meio
natural) e estgio 4 (aclimatizao).
> Normalmente, explantes retirados de plantas jovens ou plntulas, apresentam
melhores respostas de crescimento in vitro em relao a explantes obtidos de plantas
adultas.
O desenvolvimento de clulas individuais em complexos rgos e tecidos
multicelulares um processo comum a todas as formas superiores de vida. Isto
significa que todo um espectro de desenvolvimento conhecido como diferenciao,
se constitui em uma srie de processos altamente coordenados e determinados
geneticamente, atravs dos quais, gmetas isolados ou fundidos (esporos e zigotos,
respectivamente, em plantas) e primrdios somticos derivados de clulas
individuais se desenvolvem em plantas inteiras. As vias de diferenciao envolvidas
na maturao da planta so, em ltima anlise, determinadas pela natureza
constitutiva dos genes herdados, sendo que a expresso dos mesmos modulada
por interaes celulares e ambientais. Os padres de desenvolvimento da planta so
razoavelmente consistentes dentro de limites definveis de gentipo, ou seja, grupos
taxonmicos, de maneira que os constituintes genticos da clula germinativa
original teoricamente contm todos os elementos determinantes dos padres de
diferenciao.
O conceito de totipotncia surgiu baseado neste contexto. Os tecidos somticos
de uma planta so essencialmente os produtos de divises mitticas, sendo que
cada clula dentro do organismo capaz de regenerar novas rplicas do mesmo
organismo, sob condies apropriadas. Por definio, totipotncia a capacidade de
uma clula regenerar o fentipo do organismo completo e diferenciado, do qual ela
derivada. Nas plantas, a maioria das divises celulares coordenadas ocorrem em
reas concentradas conhecidas como meristemas os quais esto distribudos em
vrios pontos do organismo, durante o seu desenvolvimento. O funcionamento dos
meristemas pode ser ativado ou suprimido, de acordo com os padres de
diferenciao ditados por mecanismos de controles gentico ou ambiental.

^t^o 0 i^^o f^^o fito fJ^Jm$ t


2
LABORATRIO DE CULTURA DE
TECIDOS

Gustavo de Arajo Soares 1

Renato Paiva 2

Patrcia Duarte de Oliveira Paiva 3

Jos Raniere Ferreira de Santana 4

Edson Jos Artiaga de Santiago 5

2.1. INTRODUO

As atividades em um laboratrio de cultura de tecidos devem ser realizadas e m \ ^ Q ^ y


um ambiente assptico, com'temperatura e iluminao controladas. Dependendo do <tf cf
tipo de trabalho que se pretende realizar, tanto a luz quanto a temperatura so ..^
fatores importantes, que podem alterar os resultados. Deste modo, a padronizao
das condies ambientais em um laboratrio proporciona uma maior confiabilidade
nos resultados obtidos e uma menor porcentagem de perda de material, j que estes
fatores podem ser regulados para que se obtenha uma condio tima, onde ocorre
rpido crescimento e melhor desenvolvimento do material.
A assepsia outro fator muito importante que deve ser considerado no trabalho
de cultura de tecidos. Como o meio de cultura possui nutrientes essenciais para o
crescimento de clulas, ele est sujeito a contaminao por fungos e bactrias
presentes no ar, nos materiais utilizados nos procedimentos ou, at mesmo, no corpo Q 4,

da pessoa que est executando a inoculao. Geralmente esses microrganismos *^ 3 !<oJ,k

contaminantes proliferam mais rapidamente que o material de interesse, levando


morte do mesmo.

1 Mestrando em Fisiologia Vegetal, Universidade Federal de Lavras (UFLA)


2 Professor Adjunto, PhD, Departamento de Biologia, UFLA
3 Professora Adjunto, Dra., Departamento de Agricultura, UFLA
4 Professor Assistente, Departamento de Cincias Biolgicas, Universidade Estadual de
Feira de Santana (UEFS)
5 Pesquisador, EMBRAPA Amaznia Oriental, Belm/PA.

...
10 EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

Para evitar a contaminao importante se ter no laboratrio instalaes com


caractersticas apropriadas, trabalhar somente com equjpamentos_JjmQ_e
-
esterilizados e seguir normas de trabalho que possibilitem a criao de um ambiente
com elevado nvel de assepsia.
A compartimentalizao das atividades dentro do laboratrio um dos cuidados
que deve ser tomado para se evitar a contaminao. Atividades que lidam com
material contaminado e sujo devem ser separadas das atividades com materiais
esterilizados e que necessitam de ambiente assptico. Assim, as atividades no
laboratrio devem seguir uma sequncia natural pelas instalaes, de tal forma que
procedimentos sucessivos sejam realizados lado a lado. Dessa forma, economiza-se
tempo e trabalho, resultando tambm em economia financeira.

2.2. ESTRUTURA FSICA

Recomenda-se que as atividades dentro de um laboratrio de cultura de tecidos


vegetais sejam distribudas em salas, na ordem em que forem realizadas. Assim, a
sala de limpeza o primeiro cmodo, destinado limpeza e esterilizao de
materiais. Em seguida, vem a sala de preparo, onde todo material e solues
utilizadas e os meios de culturas so preparados.
Na sala de transferncia, ocorre a manipulao assptica e inoculao do
tecido vegetal nos meios de cultura e na sala de cultura, todo material inoculado
incubado em condies ambientais controladas. As salas de preparo, transferncia e
cultura podem ficar juntas. A sala de transferncia, por exigir condies
extremamente asspticas, no pode ser dividida com nenhuma outra.
Existe basicamente duas maneiras de se distribuir o espao fsico do
laboratrio. Na primeira, as salas so dispostas de acordo com a sequncia de
atividades em forma de um crculo imaginrio. Assim, a ltima fase fica
espacialmente prxima primeira. Na segunda, as salas tambm so dispostas de
acordo com a sequncia de atividades, porm em linha reta (Figura 1).
r
Laboratrio de Cultura de Tecidos 11

Sala de Transferencia

3 i ~<\<XJJ$LQJJ>** cj

Sala de Limpeza Condicionador


de ar

n Sala de Preparo
fede rciOJ<Aj.GX.

JUuH tfjpodXJi. -ftO


TJ

Figura 1: Exemplo de uma planta baixa de um laboratrio de cultura de tecidos


vegetais.

2.2.1. Sala de limpeza


o local para descarte de meios de cultura, lavagem de vidraria, utenslios
diversos e autoclavagem de gua. Deve ser dotada de bancada, armrios e
prateleiras para estocagem de material, pias fundas, autoclave, destilador,
deionizadori lavador de pipetas, forno de microondas, estufa de secagem de
vidrarias, escorredor de vidrarias e eletricidade para 110 e 220 volts. A assepsia
desta sala baixa, devido as suas atividades. Por isso, recomenda-se que esta sala
fique distante da sala de transferncia.
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2.2.2. Sala de preparo


Local para preparo de meios de cultura e de solues. a sala de maior
circulao de pessoal, por ser onde se realizam as principais atividades do
laboratrio. Deve estar equipada com armrios, estante para estocagem de vidraria,
pia, geladeira, freezer, balana, peagmetro, agitador magntico, autoclave e
eletricidade para 110 e 220 volts.

2.2.3. Sala de transferncia


Local onde se manipula assepticamente o material vegetal, sendo exclusivo
para a capela de fluxo laminar e estantes que auxiliam na estocagem temporria dos
meios de cultura e outros materiais j autoclavados, destinados ao uso imediato. A
circulao de pessoas deve ser restrita, sendo que uma pequena janela de vidro na
porta interessante para visualizao, evitando sua abertura frequente por motivos
diversos.

2.2.4. Sala de cultura ou sala de crescimento


Local destinado ao crescimento in vitro do material inoculado. Necessita de
estantes com prateleiras (uma sugesto que possuam 50 cm de largura,
distanciadas entre si de 40-45 cm, num total de 5 prateleiras por estante). Cada
prateleira deve ser iluminada individualmente por 2 fileiras de lmpadas
fluorescentes. Um armrio ou um simples pano preto til, tambm, para as culturas
que precisam se desenvolver no escuro.

2.2.5. Instalaes de apoio


O ltimo passo na cultura de tecidos vegetais a adimatizao das plantas, ou
seja, a etapa na qual as plantas tm de se adaptar ao ambiente externo ao
laboratrio. Para isso, necessrio uma rea externa, como cmara de nebulizao^
ou telado apenas, onde as plantas tero um ambiente controlado e que pode ser
modificado, para que o material vegetal se adapte vagarosamente ao ambiente
natural.

2.3. EQUIPAMENTOS NECESSRIOS

a) Autoclave: utilizada para esterilizao de meios de cultura, vidraria, gua e


outros materiais. Este aparelho pode produzir calor seco ou calor mido, que
mais eficiente para esterilizao. A temperatura ideal de trabalho fica em
121C. Pode ser horizontal ou vertical. Em laboratrios menores, pode ser
substituda por panelas de presso domsticas dotadas de manmetro
(Figura 2).
Laboratrio de Cultura de Tecidos 13

Figura 2: Autoclave horizontal.

b) Destilador: utilizado para eliminao de sais minerais da gua. Para uma


maior pureza da gua, recomenda-se sua utilizao juntamente com o
deionizador.
c) Deionizador: deve ser instalado logo aps o destilador. Auxilia na
eliminao de ons.
d) Estufa de secagem: destina-se a secagem de vidraria e outros materiais.
Funciona como um forno eltrico comum, produzindo calor seco. Estes
podem tambm ser utilizados para esterilizao desde que produzam
temperaturas de no mnimo 160C (Figura 3).
14 EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

Figura 3: Estufa de secagem de materiais.

e) Forno de microondas: usado para fuso de gar. Este equipamento pode


ser substitudo por um ebulidor..

f) Mquina de lavar vidraria: Funciona como uma mquina de lavar pratos e


utilizada para lavagem mecnica de vidrarias.

g) Aparelho de banho-maria: substitui o forno de microondas para a fuso


de gar.

h) Aquecedor de gua: utilizado para lavagem de frascos com meio de


cultura.

i) Lavador de pipetas: destina-se lavagem de pipetas.

j) Geladeira: armazenamento de solues-estoque, reagentes e reguladores


de crescimento.

k) Freezer: armazenamento de reagentes que necessitem temperaturas


abaixo de zero graus centgrados.

I) Balana: imprescindvel para pesagem de reagentes, no preparo de


solues e dos meios de cultura. Para quantidades menores h a
Laboratrio de Cultura de Tecidos 15

necessidade de uma balana de preciso. Um laboratrio de cultura de


tecidos vegetais, mesmo que pequeno, necessita de uma balana de
preciso (Figura 4).

Figura 4: Balana analtica.

m) Medidor de pH: extremamente til na determinao do pH de solues e


dos meios de cultura. Pode ser substitudo por papis-indicadores, porm
apresentam menor preciso (Figura 5).

Figura 5: Medidor de pH.


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n) Agitador magntico: auxilia no processo de dissoluo de reagentes


(Figura 6).

Figura 6: Agitador magntico.

o) Capela de fluxo laminar: utilizada para realizar trabalhos de manipulao


assptica. Funciona forando a passagem de ar por meio de um filtro
bacteriolgico, de modo que seja criado um ambiente estril no interior da
capela. No deve ser colocada em frente de porta, ventilador ou aparelho de
ar condicionado, para evitar entrada de ar contaminado durante o uso.
Algumas capelas possuem lmpadas ultravioleta, que, ligadas cerca de 20
minutos antes de se iniciar o trabalho, esterilizam o ambiente (Figura 7).

Figura 7: Capela de fluxo laminar.


Laboratrio de Cultura de Tecidos 17

p) Dispensador de meios de cultura: bomba aspirante que auxilia na


distribuio do meio de cultura nos frascos, de uma s vez, no volume
desejado. muito til quando se trabalha com grandes quantidades de meio
de cultura, aumentando o rendimento da operao.

q) Bico-de-bunsen: equipamento essencial no interior da capela de fluxo


laminar, pois esteriliza os instrumentos cirrgicos (pinas e bisturis)
utilizados e a boca dos frascos. Produz uma chama de fogo pela queima de
gs. Pode ser substitudo por lamparina a lcool (Figura 8).

Figura 8: Aspecto visual de um bico-de-bunsen.

r) Microscpio estereoscpio: muito utilizado em laboratrios que realizam


limpeza clonal.

s) Desumidificador ou umidificador. aparelhos utilizados para controlar a


umidade relativa do ar dentro do laboratrio, diminuindo-a ou aumentando-
a respectivamente.

t) Agitador orbital: necessrio para cultivos em meios lquidos que


necessitem ficar sob agitao constante.

u) Esterilizadores de ar: reduz a populao de microorganismos nos


ambientes.

v) Mquina para lavagem de vidrarias.


18 EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

2.4. VIDRARIAS UTILIZADAS

Alm dos equipamentos e da infra-estrutura citada acima, outros utenslios


como vidrarias e materiais so muito utilizados dentro de um laboratrio de cultura de
tecidos vegetais.
Os frascos para o cultivo in vitro so essenciais para a manuteno das
condies asspticas do ambiente. Esses frascos tm que ser transparentes e
autoclavveis, de vidro ou plstico. Podem ser utilizados desde tubos de ensaio e
frascos prprios para a cultura de tecidos (250 a 500 mL) at frascos de alimento e
conserva, reutilizados, de tamanhos e formatos variados. importante que os
frascos possuam tampas que permitam trocas gasosas entre o ambiente interno e o
externo ao tubo de ensaio. Porm, deve-se certificar de que as tampas no permitam
a contaminao do meio nutritivo (Figura 9).

Figura 9: Aspecto visual de um tubo de ensaio (A) e um frasco de vidro (B) para
cultivo in vitro.

w
Para o preparo das solues, so utilizados beckers, erlenmeyers, provetas,
buretas, pipetas, placas de Petri e bastes de vidro. aconselhvel que se tenha
beckers e erlenmeyers com capacidade variando entre 25 a 2000 mL e provetas de
10 a 1000 mL (Figura 10).
w
Laboratrio de Cultura de Tecidos 19

As buretas so usadas para despejar o meio nutritivo nos recipientes de cultura,


porm laboratrios maiores utilizam dispensadores automticos de meio de cultura
para este fim (Figura 11).
20 EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

Figura 11: Aspecto visual de uma bureta.

As pipetas graduadas e as provetas so usadas para medies mais precisas


de volumes. O laboratrio deve dispor de um bom nmero de pipetas de 1, 2, 5, 10 e
25 mL. Existem ainda as pipetas automticas, que, apesar de mais caras, facilitam e
agilizam o trabalho. Depois do preparo das solues-estoque, estas devem ser
guardadas em frascos de vidro de capacidade de 250 a 500 mL, de boca estreita e
de cor mbar para os reagentes sensveis luz (Figura 12).

Figura 12: Aspecto visual de frascos de vidro para armazenamento de


solues.
Laboratrio de Cultura de Tecidos 21

Para facilitar o manuseio e o trabalho com os tubos de ensaio, utiliza-se um


suporte, geralmente de plstico autoclavvel, onde os tubos de ensaio so mantidos
em posio inclinada de 45, para aproveitarem a melhor a luz na sala de cultura.
Ainda na sala de cultura, termmetros de mxima e mnima so indispensveis para
o eficaz controle da temperatura neste ambiente.
Bandejas de material autoclavvel, funil, papel-toalha, algodo, papel alumnio,
filmes plsticos, pinas, bisturis com lminas, etiquetas, vasos para plantas, sacos
plsticos de mudas, detergentes e caixas gerbox para aclimatizao so apenas
mais alguns utenslios usados em um laboratrio de cultura de tecidos vegetais.
MEIOS DE CULTURA

Edson Jos Artiaga de Santiago 1

Renato Paiva 2

Patrcia Duarte de Oliveira Paiva 3 w

Jos Raniere Ferreira de Santana 4

Guilherme Augusto Canela Gomes 5

3.1. INTRODUO

Os meios nutritivos fornecem as substncias essenciais para o desenvolvimento


dos tecidos e controlam, em grande parte, o padro do desenvolvimento in vitro. A
constituio do meio baseada nas exigncias das plantas quanto aos nutrientes ^
minerais, com algumas modificaes para atender em necessidades especficas.
Um dos primeiros meios de cultura desenvolvidos foi o de White. Esse meio
apresenta baixo nvel de nitrognio e de potssio, restringindo assim o seu uso para
muitas clulas; entretanto, esta formulao baixa em sais, usada em muitas
situaes. O meio MS foi uma das primeiras formulaes melhoradas usadas em
cultura de tecidos de plantas, apresentando altos nveis de nitrato, potssio e
amnio. Atualmente o meio de cultura amplamente utilizado em trabalhos de
cultura de tecidos vegetais.

3.2. COMPOSIO DOS MEIOS DE CULTURA

Os meios nutritivos so formados de mltiplos componentes, sendo bastante


variveis em funo da espcie vegetal e da origem do explante.

1 Pesquisador, EMBRAPA Amaznia Oriental, Belm/PA


2 Professor Adjunto, PhD, Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras
(UFLA)
3 Professora Adjunto, Dra., Departamento de Agricultura, UFLA
4 Professor Assistente, Departamento de Cincias Biolgicas, Universidade Estadual de
Feira de Santana (UEFS)
5 Doutorando em Fitotecnia, Departamento de Agricultura, UFLA.
Meios de Cultura 23

O meio de cultura constitudo de componentes essenciais e opcionais. Os


essenciais compreendem a gua, os sais_inprjgnjps a fonte de carbono e energia,
L

vitaminas e substncias reguladoras de crescimento. Entre os componentes


adicionais esto includos osjaminocidos e_amjdas, cidoj orgnicos e substncias
naturais complexas. Os componentes bsicos do meio nutritivo o fazem um substrato
excelente para o crescimento de bactrias e fungos. Para evitar a contaminao dos
meios por impurezas minerais, todos os sais utilizados na sua preparao devem ser
de qualidade analtica ("p.a"). A incluso de fungicidas e bactericidas no meio no
aconselhvel, podendo ter efeito txico para o explante.
Os principais componentes de uso mais frequente nos meios de cultura so:

3.2.1. gua
A qualidade da gua muito importante em cultura de tecidos vegetais, uma
vez que este o componente que entra em maior proporo na preparao do meio.
Para melhor controle deve-se usar gua destilada, bidestilada e deionizada. A
utilizao de gua de torneira pode comprometer o desenvolvimento da cultura.

3.2.2. Nutrio mineral


Os nutrientes empregados nos meios de cultura so os mesmo estabelecidos
para a nutrio mineral bsica das plantas no campo. So eles:
a) Nitrognio um dos nutrientes mais estudados da constituio dos meios de
cultura, pois pode ser suplementado na forma d e ^ m n j c ^ j ^ o n ^ nitrato
(nion), ou ainda na forma de compostos orgnicos, dependendo do material em
cultura. constituinte de aminocidos, nucleotdeos e coenzimas, tendo importncia
na sntese proteica. Meios enriquecidos com nitrognio fundamental para a induo
de embriognese somtica, bem como diferenciao de parte area.
b) Fsforo adicionado ao meio, principalmente, como fosfato de potssio
monobsico (H P0 ). absorvido pelas plantas na forma de ons H P0 ".
2 4 2 4

Desempenha papel importante no metabolismo energtico, na regulao de


processos enzimticos e na ativao de enzimas. Necessrio para a sntese do ATP;
na organognese est envolvido na diferenciao da parte area, pois reverte o
efeito das auxinas.
c) Potssio usado na forma de nitrato, fosfato ou cloreto. Ativador de vrias
enzimas do metabolismo de carboidratos e protenas. Uma das mais importantes a
quinase do piruvato, enzima envolvida nos processos de gliclise e respirao.
necessrio para a embriognese somtica. Esta necessidade distinta daquela para
o crescimento de clulas. Enquanto que 1mM suficiente para proliferao celular,
uma concentrao de 20mM utilizada para a produo tima de embries
somticos em cenoura, A deficincia no meio de cultura conduz, segundo alguns
autores, a hiperhidricidade e decrscimo na taxa de absoro de fosfato.
24 EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

d) Enxofre incorporado ao meio, principalmente, na forma de sulfato, outra


possibilidade na forma de aminocidos (cistina, cistena e metionina). Envolvido no
metabolismo energrtico na formao do fosfosulfato de adenosina, constituinte da
tiamina, biotina e coenzima A. Sua absoro relacionada assimilao do
nitrognio e, independentemente do pH. v
e) Clcio adicionado, principalmente, na forma de cloreto ou nitrato. Possui
papel importante no metabolismo da planta. Envolvido na diviso celular, uma vez
que um dos componentes da lamela mdia o pectato de clcio, m a n t m " ^
integridade da membrana celular e importante para a germinao de gros de
plen. um agente quimiotrfico para o direcionamento do tubo polnico. Altas
concentraes de clcio (6 a 9 mM) so necessrias para controle da necrose do
pice caulinar.
f) Magnsio mais usado na forma de sulfato de magnsio. um dos
componentes da clorofila; co-fator importante para vrias reaes enzimticas que
atuam sobre substratos fosforilados.
g) Hidrognio exerce papel importante no metabolismo da planta. Com
exceo do C0 , todos os compostos orgnicos tm hidrognio. Na sua forma
2

oxidada um prton.
h) Carbono forma o esqueleto de todos os compostos orgnicos.
i) Oxignio similar ao carbono, tambm um dos componentes de todos os
compostos orgnicos do organismo vivo: carboidratos, lipdios, cidos nuclicos,
produtos naturais. O papel do oxignio livre receptor de eltrons na respirao.
j) Ferro adicionado na forma de Fe-EDTA. Envolvido nas reaes de oxi-
reduo nos organismos vivos. H muitos matablitos contendo ferro. Essencial para
a sntese da clorofila, integrante do grupo proteico (heme) das porfirinas.
k) Boro usado na forma de cido brico. Envolvido no metabolismo de
carboidratos e cidos nuclicos. Importante na germinao de gros de plen e
crescimento do tubo polnico. s -

I) Molibidnio adicionado na forma de molibidato de sdio (Na Mo0 ). Co-


2 4

fator da redutase do nitrato.


m) Cobre usado como sulfato de cobre. Constituinte da enzima plastocianina
que importante componente do transporte de eltrons. _
n) Cloro essencial para a fotossntese, sendo requerido durante a reao de
Hill.
o) Zinco usado como sulfato de zinco. Importante nas reaes de oxi-reduo
das plantas. Co-fator de enzimas anidrase carbnica. w
p) Mangans adicionado como sulfato de mangans. Essencial para a reao
de Hill na fotossntese, quando a molcula de gua quebrada produzindo eltrons
e oxignio.
Meios de Cultura 25

q) Cobalto usado como cloreto de cobalto e est envolvido na expanso


foliar.

3.2.3. Nutrio orgnica


Os compostos orgnicos importantes so os carboidratos, substncias
reguladoras de crescimento, vitaminas, aminocidos e amidas, certas purinas e
pirimidinas, hexitis e cidos orgnicos.

a) Fonte de carbono e energia


Ao se excisar parte da planta e cultiv-la in vitro, as clulas no so
fotossinteticamente ativas e necessitam de carboidratos para crescimento e
desenvolvimento. A escolha de determinado acar depende do processo em
questo. Muitas vezes, acares que so inefetivos na manuteno do crescimento
^ do calo, sustentam a iniciao de brotaes adventcias e a embriognese somtica.
Os carboidratos mais usados so a sacarose, glicose e frutose nos nveis de 2_
a 5% (p/p). A concentrao de 3% a mais usada. Concentraes de sacarose entre ^_
6 a 12% podem ser usadas em determinadas situaes, por exemplo, em cultura de
embries, frutos e anteras, enquanto que o nvel de 1,5% usado em cultura de
protoplastos.
-<

O acar pode caramelizar se o tempo de autoclavagem for excessivo,


formando em sua degradao hidroxiacetonas, dihidroxiacetona, furano, 2-
metilfurano, 2,5-dimetilfurano e maltol. Estes compostos formam meladoidinas que
so compostos de colorao amarronzada, de alto peso molecular, podendo inibir o
crescimento celular. O acar purificado com acetato, para precipitar impurezas e
^ pode conter alto nvel de zinco que txico para o tecido.
Glicose e frutose devem ser esterilizadas a frio.

b) Substncias reguladoras de crescimento


O controle qumico da diferenciao da parte area foi primeiramente
w observado em cultura de calo de Nicotiana. Foi observado, inibio na formao de
gemas por auxinas, e reverso deste efeito estimulando brotaes utilizando-se
adenina bem como o fosfato inorgnico. Esta foi a constatao de que o processo de
organognese in vitro controlado por substncias hormonais sendo que o
desenvolvimento de parte area, raiz ou calo determinado pelo balano entre
auxinas e citocininas.
Concentraes relativamente altas de auxina e baixas de citocinina favorecem o
w enraizamento e o balano inverso promove a formao de parte area. No entanto,
concentraes iguais promovem a produo de calos. Por esta razo as auxinas e
citocininas so componentes importantes no controle da morfogenese in vitro.
26 EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

As concentraes das auxinas nos meios variam de 0,01 a 10 mg/L. As auxinas


mais usadas so AIA (cido indol-3-actico), AIB (cido indol-3-butrico), ANA, 2,4-D,
2,4,5-T, 4-CPA e picloran. A auxina 2,4-D bastante usada para a induo de calos
in vitro e tem o efeito de supresso da morfogenese. O 4-CPA uma das auxinas
menos txicas para o tecido e, talvez, a que tenha o efeito menos detrimental na
morfogenese. A auxina 2,4,5-triclorofenoxiactico (2,4,5-T) e o picloran induzem a
formao de calos em monocotiledneas. As auxinas so termo-estveis, no
decompondo quando autoclavadas. O AIA a auxina natural e a menos estvel,
sendo destrudo em pH baixo. As auxinas 2,4-D e ANA so sintticas e tm efeitos
semelhantes s auxinas de ocorrncias naturais, sendo mais estveis degradao.
As solues estoque de AIA no devem ser usadas aps uma semana de seu _
preparo, enquanto solues estoque de 2,4-D e ANA podem ser armazenadas at 12
meses sem ocorrer decomposio.
A dissoluo das auxinas feita em NaOH 1N. Utiliza-se 0,3 mL desta base
para dissolver 10 mg de auxina (3 gotas dessa base, em pipeta Pasteur).
As citocininas so derivadas da adenina (aminopurina) e tm um papel
fundamental na diferenciao e regenerao de plantas na maioria das espcies.
Induzem a diviso celular, proliferao e morfogenese da parte area. As citocininas
mais usadas em cultura de tecidos so a cinetina (CIN), benziladenina (BA), zeatina
(Zea), isopentenil adenina (2ip) e thidiazuron (TDZ). As concentraes
recomendadas destas substncias variam de 0,03 a 30 mg/L. Cinetina, zeatina e
isopenteniladenina so considerados termo-estveis, uma vez que nenhum produto
de sua decomposio foi observado aps sua autoclavagem a 120C, durante 1 hora.
A benziladenina permanece estvel quando autoclavada a 110C, durante 20
minutos, mas a degradao fotoqumica pode ocorrer.
A dissoluo das citocininas feita em HCI 1N, levemente aquecido. Utiliza-se _
0,3 mL deste cido para dissolver 10 mg de citocinina.
O cido gibelrico (GA3) usado, algumas vezes, em cultura de meristemas, na
recuperao de plantas livres de vrus. O GA3 deve ser dissolvido em gua com pH
ajustado a 5,7 ou em base (NaOH 1N). As solues de GA3 devem ser esterilizadas
em filtro bacteriolgico uma vez que esta substncia se decompe por autoclavagem.
As solues estoques devem ser preparadas na hora.
O cido abscsico (ABA) um fitormnio envolvido no processo de dormncia e
absciso de folhas e frutos. Na cultura de tecidos o papel deste composto ainda no
est bem definido, embora tenha efeito na embriognese somtica. Embora este
composto seja termo-estvel e fotossensvel, recomenda-se sua esterilizao a frio.
O ABA dissolvido em gua ou base. v_
Os hormnios e as substncias reguladoras de crescimento no devem ser
dissolvidas em lcool, pois este produto tem efeito inibidor na morfogenese.
Meios de Cultura 27

A relao de hormnios e substncias reguladoras de crescimento mais


comumente usados em cultura de tecidos so observados na Tabela 1.

Tabela 1: Hormnios e reguladores de crescimento mais utilizados em cultura


de tecidos.

AUXINAS ABREVIATURA PESO MOLECULAR


cido lndol-3-actico AIA 175,2
cido lndol-3-butrico AIB 203,23
cido naftalenoactico ANA 186,2
cido 2,4-diclorofenoxiactico 2,4-D 221,04
cido 4-clorofenoxiactico 4-CPA 184,5
cido 4-amino-3,5,6-tricloropicolnico Picloram 241,46
cido2,4,5-triclorofenoxiactico 2,4,5-T 255,49
cido-naftoxiactico NOA 202,21
CITOCININAS
6-Furfurilaminopurina ou Cinetina CIN 215,2
6-Benzilaminopurina ou 6-benziladenina BA, BAP 225,2
N -(4-hidroxi-3-metilbut-2enil) aminopurina ou
6

zeatina ZEA 219,2


(6-benzilamino)-9-(2-tetrahidrooiranil) 9H-
purina PBA 300
N -3-dimetil-2-butilaminopurina ou
6

Isopentenilladenina 2ip 203,3


Thidiazuron (1-fenil-3-(1,2,3-thiadi-azol-5yl))
ureia TDZ 220,2
GIBERELINAS
cido giberlico GA3 346,4
OUTROS
cido 2-(cloroetil) fosfnico ou Ethephon ou
Ethrel CEPA 144,5
cido abscsico ABA 264,31

c) Vitaminas
Vitaminas so compostos orgnicos que, em baixas concentraes,
desempenham funes reguladoras catalticas no metabolismo celular. A maioria das
plantas superiores so capazes de sintetizar a totalidade das vitaminas necessrias
para seu crescimento normal, embora os animais no apresentem esta propriedade.
A vitamina mais comumente usada em cultura de tecidos a tiamina (Bi). A
tiamina solvel em gua. Outras vitaminas utilizadas incluem cido nicotnico (B ) e
3
28 EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

piridoxina (B ). Embora as vitaminas sejam adicionadas ao meio antes da


6

autoclavagem, a esterilizao a frio recomendada para estudos especficos dessas


substncias.
O estudo dos efeitos das vitaminas em plantas dificultado uma vez que muitas
destas so produzidas pelos vegetais. (Nos animais, basta eliminar a vitamina da
dieta para observar seu efeito).
Vitamina A: ainda no foi ainda encontrada nas plantas.
^ Tiamina (Vit. Bi): sua importncia no metabolismo celular devido funo
como coenzima na descarboxilao dos cetocidos. Ex: Piruvato e
cetoglutarato.
\fh ' Riboflavina (Vit. B ): Constituinte da coenzima FMN (Flavina
2

mononucleotdeo) e o FAD (Flavina-adenina-dinucleotdeo) que atuam em


oxidaes biolgicas. Na fotossntese FMN participa do transporte de
eltrons.
1 cido nicotnico (Niacina ou Vitamina B ): um componente das coenzimas
3

NAD e NADP importantes na transferncia de hidrognio,


v Piridoxina, Piridoxal e Piridoxamina (complexo vit. B ): Fazem parte do
6 -~
piridoxalfosfato, coenzima importante no metabolismo de aminocidos. Estas
vitaminas tm papel importante nas reaes de transaminao e
descarboxilao.
cido pantotnico: No encontrado na sua forma livre. um dos ^
componentes da coenzima A e exerce papel importante no metabolismo de
lipdios. Esta substncia deve ser dissolvida em hidrxido de clcio.
Biotina: influncia no metabolismo do cido asprtico, especialmente, nas
reaes do ciclo de Krebs que levam formao do cido.
cido ascrbico (vitamina C): Catalisador de fosforilizao fotossinttica
devido ao poder de oxidar e reduzir facilmente.

d) Aminocidos e amidas
Os amonocidos e amidas tm importncia na amplificao das respostas ._
morfogenticas, proporcionando maior crescimento e facilitando a diferenciao no
sentido da regenerao. A necessidade de sua suplementao pode ser determinada
pela incluso de uma protena hidrolisada ao meio. Qualquer efeito benfico pode
ser avaliado pela substituio desta protena por uma mistura de aminocidos e
amidas. As formas "L" dos aminocidos so de ocorrncia natural.
ir* A L-trosina apresenta influencia na iniciao de parte area em cultura de
calos, L-arginina no enraizamento e L-serina na obteno de embries haploides
mediante o cultivo de micrsporo.
Meios de Cultura 29

As amidas L-glutamina e L-arpagarina so benficas na obteno de embries


somticos, e a cistena includa, s vezes, como agente redutor.

e) Outros suplementos orgnicos


- Hexitis:
O mais usado o inositol, myo-inositol a forma inativa e i-inositol a ativa. O
meso-inositol uma mistura das formas d e I. O inositol considerado estimulador de
processos de crescimento in vitro e pode servir jsomo fonte de carboidrato.
Desempenha papel importante na biossntese do ciclitol? rio armazenamento de
compostos polihdricos como reserva, na germinao de sementes, no transporte de
acar, na nutrio mineral, no metabolismo de carboidratos, na estrutura de
membranas, formao de parede celular, homeostase de hormnios e no estresse
fisiolgico.

- Purinas e Pirimidinas: de. btotAel^


A adenina ou o sulfato de adenina estimulam o crescimento de brotaes in
vitro. A concentrao mais usada varia de 40 a 160 mg/L.
As bases nitrogenadas citosina e guanina podem tambm promover o
crescimento de cultura de calo. C i T o S i N % PrM , r ) A ~ P f c f r > o U

- cidos orgnicos:
A adio de cidos de compostos intermedirios do ciclo de Krebs, tais como
malato ou citrato, comum em meio destinado cultura de protoplasto. Estes
compostos parecem estar envolvidos na minimizao do efeito inibitor da amnia. A
concentrao de at 10 mM de sais de potssio recomendada.
Ojicido ascrbico e o cido ctrico so usados para prevenir o escurecimento
de tecidos excisados de plantas. As solues antioxidantes so preparadas usando
uma mistura de 100 mg de cido ascrbico e 150 mg de cido ctrico, dissolvido em 1
litro de gua. Esta soluo no deve ser autoclavada e sua esterilizao feita em
filtro bacteriolgico de 0,22 ou 0,45 micras.
A incluso de 2000 mg/L de cido ascrbico estimula o crescimento de calo.!

- Compostos fenlicos: M O I M ^ *> &e&ft,ft O Pi j-o eAIft,


Muitos derivados fenlicos (mono-OH) promovem o desenvolvimento da parte
area enquanto que os derivados fenlicos (bi-OH) esto envolvidos com a iniciao
de razes. Estas substncias atuam na degradao oxidativa do AIA. Por outro lado,
compostos fenlicos (bi-OH) inibem a degradao oxidativa do AIA, tendo efeito
benfico no enraizamento.
30 EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

- Extratos naturais:
So preparaes obtidas de produtos naturais, de composio indefinida, que
servem para enriquecer o meio de cultivo. So fontes de fatores, at ento
desconhecidos, que estimulam o crescimento in vitro. A incluso destes extratos em
meio de cultura s feita, em ltimo caso, quando as tentativas de adequao no
forem suficientes para promover determinado processo morfogentico. Em trabalhos
de rotina, estas preparaes podem ser usadas caso estimulem respostas
desejadas.
Leite de coco: o endosperma de Cocus nucifera na fase gelatinosa. um
suplemento bastante usado. Recomenda-se que seja esterilizado a frio.
Suco de laranja, tomate e outros: O suco de laranja contm cido ctrico e
' outras substncias de crescimento no identificadas. Pode-se usar suco de
i laranja fresco ou congelado.
Polpa de Banana: Tem sido usada na suplementao do meio de cultura de
orqudeas. O seu efeito depende da cultivar e da quantidade, bem como, se
originar de frutos verdes ou maduros.
Extrato de leveduras: extrado com lcool, contendo em sua composio
produtos solveis neste solvente. fonte de aminocidos e vitaminas.
Protenas hidrolisadas: Tambm so fontes de aminocidos. Dentre estas,
incluem: casena hidrolisada; lacto-albumina hidrolisada, triptona, peptona,
etc. Protena de digesto enzimtica tais como a K-Z-amina Tipo A
recomendada, em virtude dos aminocidos se manterem intactos. A hidrlise
cida destri os aminocidos.

3.2.4. Materiais de suporte


a) gar
gar um polissacardeo obtido pela purificao de algas marinhas. O gar
deve ser de boa qualidade, por exemplo, TC agar, ou Taiyo agar. A concentrao
usada varia de 0,6% a 1% (de 6 a 10 g/L). O gar impuro constitudo de
polissacardeos, aminocidos, sais, acar, etc, devendo ser lavado em gua
destilada antes de ser usado. O gar alcalino, lquido temperatura de 80C e se
solidifica 40C.
Outros produtos gelificantes so Gelrite (Calbiochem) e Phytagel (Sigma). So
mais puros que o gar e provenientes de fermentaes bacterianas. Usados na
concentrao de 0,2% (2 g/L). Citam-se que estes produtos podem causar
vitrificao em algumas espcies.
Alguns laboratrios sugerem o uso de polvilho de mandioca ou de milho
(maizena) como gelificantes.
Meios de Cultura 31

b) Carvo ativado
um p bastante fino e de cor escura. utilizado para eliminar substncias
txicas produzidas pelo explante in vitro. A concentrao em torno de 0,3%.
usado quando ocorre o escurecimento do tecido in vitro, descolorao de meio de
cultura, formao de calo na fase de enraizamento de propgulos, ou quando o
crescimento do tecido inibido. O carvo adsorve produtos provenientes do
metabolismo, bem como substncias hormonais e vitaminas. Sugere-se, em alguns a
casos, aumento da concentrao de auxina, quando na presena de carvo ativado. ,
A pureza deste produto varivel.

c) Outros produtos: Poliacrilamida, slica gel e papel de filtro.

3.2.5. Qualidades fsicas do meio de cultura


As qualidades fsicas do meio de cultura, semelhana da composio
qumica, podem desempenhar um papel importante no sucesso ou falha do
estabelecimento da cultura in vitro. H espcies cujos explantes se desenvolvem
melhor em meio lquido (gemas de bromeliceas, pices caulinares de batata e
batata-doce); outras em meio slido (pices caulinares de alho, embries de tomate,
diferenciao de brotaes em cotildones de alface e tomate) e, um terceiro grupo
que responde melhor em meio lquido com suporte de papel de filtro (ovrios de
tomate, morango e fumo).
Na utilizao de meio slido, deve-se considerar a concentrao e pureza do
agente gelificante. ^ ^J^H^^^
3.2.6. pH CN A to'uwc. ou a * H ^ > p ^ ^ A c * ti ta* o
O crescimento do tecido in vitro melhor em torno de pH 5,0. Recomenda-se
este valor para formulaes lquidas. Em meios gelificados com gar, o pH deve ser
ajustado em 5,7, pois em pH 5,0, ocorre a hidrlise de polissacardeos, enquanto que
em pH 6,0-6,2 verifica-se a precipitao de sais.
No ajustamento de pH, lava-se primeiramente o eletrdo e, em seguida, faz-se
a leitura em tampo 4,0. Posteriormente lava-se o eletrdo e desta maneira o
potencimetro estar calibrado para uso.
O pH varia durante o perodo de incubao.

3.2.7. Quantidade de meio


Como regra geral, quanto menor o explante, menor a quantidade de meio a ser
utilizado. Para pices caulinares de batata e batata-doce, 4 mL de meio lquido so
suficientes para a diferenciao e crescimento inicial, entretanto, em culturas
estabelecidas, a taxa de crescimento diretamente proporcional quantidade de
meio.
32 EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

3.2.8. Condies de incubao


Devem ser considerados principalmente as exigncias de luminosidade,
temperatura, trocas gasosas e acmulo de produtos txicos no meio.

3.2.8.1. Luminosidade
No acorre diferenciao de parte area em culturas mantidas no escuro. As
caractersticas intensidade luminosa, perodo de exposio e qualidade da luz, so
fundamentais.

a) Intensidade Luminosa
A fase inicial Ide desenvolvimento do explante in vitro (estgio I) requer baixa
intensidade luminosa (at 1000 lux). Na fase de multiplicao de parte area (estgio
II) as exigncias so de 1000 a 3000 lux, e no estgio III (pr-transplante,
aclimatizao), recomenda-se de 3000 a 10.000 lux, Nesta fase o propgulo se
prepara para a fotossntese.

b) Qualidade da luz
_
A qualidade do espectro da lmpada utilizada de suma importncia na
iniciao de parte area e raiz em cultura in vitro. As lmpadas recomendadas so
fluorescentes brancas fria, Gro-lux ou outros tipos de lmpadas com emisso nas
regies do vermelho (430 nm) e azul (660 nm). Estas regies do espectro influenciam
os processos morfogenticos. As lmpadas incandescentes no so recomendadas,
pois emitem faixas do vermelho e vermelho distante e, este ltimo no adequado.
A regio do azul critica para induo de parte area e a iniciao de razes
adventcias estimulada por luz vermelha. Em Heliantus tuberosus, a iniciao de
razes adventcias em sees de tubrculos, efetiva quando as culturas foram
expostas a luz emitida prximo a 600 nm.
A luz vermelha tambm pode inibir a iniciao de razes laterais, enquanto que
a infra-vermelha pode reverter este efeito. A diferenciao de razes laterais e
adventcias parecem ter exigncias diferentes. Assim, em cultura de tecidos, quando
se objetiva a multiplicao de plantas, as lmpadas devem conter emisses
adequadas nas regies do luz azul e vermelho, pois ambas esto envolvidas na
iniciao de parte area e raiz.
Muitas das lmpadas disponveis foram desenhadas para serem utilizadas em
casa de vegetao, onde a fotossntese importante, mas em cultura de tecidos a
fotossntese no to limitante. As lmpadas fluorescentes devem ser trocadas a
cada seis meses.
Meios de Cultura 33

c) Perodo de exposio diria luz


- Fotoperodo
As exigncias em fotoperodo devem ser satisfeitas. O incio de determinado
processo morfogentico s se manifesta quando as culturas esto expostas
adequado comprimento do dia. Em geral, 16 horas de iluminao e 1000 lux de
intensidade luminosa, tm se mostrado satisfatrio para determinadas espcies,
utilizando lmpadas fluorescentes branco fria ou Gro-lux. A manuteno das culturas
sob iluminao constante no recomendada.

d) Quantidade total de energia


Deve considerar a intensidade luminosa e o nmero de horas de exposio por
dia. Podemos citar que, em fumo no h exigncias de fotoperodo, mas, mxima
formao de parte area ocorre com 16 horas de fotoperodo e, 1000 lux de
intensidade luminosa (50-60 umol.m" .s" ).
2 1

3.2.8.2. Temperatura
Devem ser considerados os aspectos de flutuao diurna. As plantas em seu
habitat natural no desenvolvem sob temperatura constante. Em cultura de tecidos o
uso de temperatura constante deve-se a manuteno se diferentes espcies
cultivadas numa mesma cmara de crescimento. Entretanto, alguns processos
morfolgicos exigem flutuaes diurnas de temperaturas. o caso de cultura de
ovrio de tomate, onde o nmero mximo de sementes formadas in vitro, ocorre em
culturas submetidas a um regime diurno/noturno de 22/17C. Menor nmero de
sementes foi observado em cultura mantida sob temperatura constante de 27C.
As exigncias de temperatura para o desenvolvimento da planta em condies
naturais devem ser consideradas como ponto de partida para estabelecer cultivo in
vitro da espcie em questo. Espcies oriundas de habitat tropical, temperado e
desrtico tm diferentes temperaturas timas para o crescimento e desenvolvimento.
Outro aspecto importante que, algumas vezes, obtm-se um bom
desenvolvimento de plantas in vitro, mas quando transplantadas para o solo morrem
porque esto dormentes, ou seja, ser necessrio uma boa aclimatizao para que
sejam quebradas as dormncias antes de serem transplantas ao solo.

3.2.8.3. Umidade relativa


Em condies de clima seco pode ser pode usar tampas algodo, pois estas
permitem boa troca gasosa, entretanto, o meio pode secar mais rpido em condies
de baixa umidade relativa.
Quando em clima mido cuidados devem ser tomados com relao as
contaminaes. As tampas de algodo podem ser usadas com cautela, e o uso de
um desumidificador na cmara de crescimento recomendado.
34 EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

3.2.8.4. Trocas gasosas


As plantas produzem oxignio, gs carbnico, etileno, aldedo e outros volteis.
Na natureza estes compostos so dissipados na atmosfera. O etileno acelera a
senescncia, absciso foliar e amadurecimento. lcool em alta concentrao induz a
formao de calos.
A cultura de tecidos um sistema fechado. A acumulao de C 0 em altas
2

concentraes conduz anaerobiose, fermentao e produo de lcoois. Em


alguns casos, altas concentraes de gs carbnico induzem distrbios no
crescimento e desenvolvimento da planta in vitro. Deve-se observar a sensibilidade
da planta a volteis. A maneira de fechar o frasco bastante importante.
Em cultura de tecidos de Solanum tuberosum, nunca se deve vedar os frascos
com parafilm, devido ao acmulo de altas concentraes de C 0 e etileno, fazendo
2

com que os propgulos apresentem anomalias caracterizadas pelo entumescimento


do caule, folhas ausentes ou pequenas, iniciao de razes adventcias em vrios
pontos do caule, e o efeito indireto da necrose do pice caulinar (deficincia nas
trocas gasosas reduz a transpirao e a translocao do clcio dificultada). Em
laboratrios comerciais de produo de batata-semente livre de viroses no
recomendado o vedamento das culturas.
Em locais onde h muita poluio ambiental recomenda-se o uso de filtro de
carvo ativado.

3.2.9. Esterilizao do meio de cultura


O tempo mnimo recomendado para esterilizao de meio para cultura de
tecidos de plantas apresentado na Tabela 2.

Tabela 2: Perodo mnimo recomendado para esterilizao de meio para cultura


de tecidos de plantas. (Extrado do Catlogo da Sigma, 1990).

Volume do meio por recipiente (mL) Tempo mnimo de autoclavagem (minuto)


25 20
50 25
100 28
250 31
500 35
1000 40
2000 48
4000 63
121C e 1,05kg/cm/cm = 105kPa.
2

Os desinfestantes mais comumente usados em cultura de tecidos de plantas


esto apresentados na Tabela 3.
Meios de Cultura 35
Tabela 3: Desinfestantes mais comumente usados em cultura de tecidos de
plantas. (Extrado do Catlogo da Sigma, 1990).

Desinfestante Concentrao (%) Tempo de exposio (minuto)


Hipoclorito de Clcio 9-10 5-30
Hipoclorito de Sdio 0,5-5,0 5-30
gua Oxigenada 3-12 5-15
lcool etlico 70-95 5-15
Nitrato de prata 1 5-30
Cloreto de mercrio 0,1 - 1,0 2-10
o5 ieto:S OC co-^o?..*

,-><a>c*2os>e ,w,oo5e iP ft.oio-ej ^ - > ^^. _ .

UnA ^ ^ ^ ^ ^ A ^ O ^ T O
4
TCNICAS DE ESTABELECIMENTO
IN VITRO

Jos Raniere Ferreira de Santana 1

Renato Paiva 2

Edson Jos Artiaga de Santiago 3

Patrcia Duarte de Oliveira Paiva 4

Luciano Vilela Paiva


5

4.1. INTRODUO

Vrias tcnicas tem sido utilizadas no estabelecimento in vitro de tecidos


vegetais. Dentre estas destacam-se a calognese, suspenso celular, cultura de
anteras, meristemas e de embries. A escolha do tipo de tcnica a ser empregada
varia com a espcie estudada e com o tecido utilizado como explante.

Calos so tecidos que se desenvolvem em resposta a injrias fsicas ou


qumicas. As clulas tem certo grau de diferenciao e so desorganizadas podendo
apresentar algumas reas com tecido organizado. Apresentam tecido indiferenciado
mas as clulas esto diferenciadas.
A cultura de calos pode ser iniciada in vitro colocando uma pequena parte de
uma planta (explante) no meio de cultura, em condies asspticas. Sob o estmulo
de substncias de crescimento endgenas ou de reguladores de crescimento
adicionado no meio, o metabolismo celular, que se encontra no estdio quiescente,

1 Professor Assistente, MS, Departamento de Cincias Biolgicas, Universidade Estadual de


Feira de Santana (UEFS)
2 Professor Adjunto, PhD, Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras
(UFLA)
3 Pesquisador, EMBRAPA Amaznia Oriental, Belm/PA
4 Professor Adjunto, Dra., Departamento de Agricultura, UFLA
5 Professor Adjunto, Dr, Departamento de Qumica, UFLA.
Tcnicas de Estabelecimento In Vitro 37

modificado iniciando-se uma diviso ativa. Durante o processo, a diferenciao e a


especializao celular so revertidas e o explante origina um novo tecido que
composto de clulas meristemticas e no especializadas (Figura 13).

Suspenso celular A suspenso decantada ou filtrada

Figura 13: Etapas da iniciao de culturas de calo e suspenso celular


(Modificado de George, 1993).

Durante-a diferenciao, novos meristemas so formados no tecido e esses


originam clulas parenquimosas no diferenciadas, sem nenhuma estrutura
organizada, caracterstica do rgo ou tecido do qual elas foram derivadas. Embora
o calo permanece no organizado, o crescimento continua e, algumas tipos de
clulas especializadas podem ser formadas. Tal diferenciao pode ocorrer em
locais aleatrios ou associados a centros de morfogenese que originam rgos como
razes, brotaes e embries. A produo de novas plantas de culturas no
organizadas frequentemente referida como regenerao.
38 EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

4.2.1. Aplicao da cultura de calos


A cultura de calos tem vrias aplicaes como permitir o estudo do
desenvolvimento celular, explorao de produtos secundrios (metablitos de
plantas medicinais), obteno de suspenses celulares (evitando o extrativismo da
planta), propagao de espcies onde a via direta difcil sendo neste caso,
recomendada a sua utilizao mesmo existindo risco de variao somaclonal. A
cultura de calos permite tambm estudar a citodiferenciao e a morfogenese, alm
da induo de mutao atravs de tcnicas qumicas ou radiao.

4.2.2. Tcnicas para estabelecimento de calos

a) Induo
Nesta fase, a seleo do explante bem como meio adequado e condies
ambientais favorveis (baixa luminosidade, temperatura normal) so decisivas para a
induo. Tem-se nesta etapa um metabolismo ativo com clulas de tamanho
constante e ocorrendo sntese de protenas e DNA e a preparao da clula para
diviso.

b) Diviso Celular
As clulas revertem para um estdio meristemtico (desdiferenciao). uma
fase de sntese onde ocorre decrscimo do tamanho da clula.

c) Diferenciao
Nesta fase h a expresso de certas rotas metablicas. O explante utilizado
pode no requer regulador de crescimento, pode requer somente auxina ou
citocinina ou ambos.

4.2.3. Tipos de calos


Os tipos de calos usados variam de acordo com o objetivo do trabalho. Calos
'firmes' por serem altamente lignificados e de textura dura, so indicados para
organognese. Por outro lado, calos 'friveis' (mole), que so frgeis e separam-se
facilmente, constituem o tipo mais utilizado em suspenso celular. A colorao dos
calos tambm varivel podendo ser amarelo, verde, branco, etc.

4.2.4. Tamanho, tempo de repicagem e manuteno de calos na subcultura


O tamanho dos calos deve ser suficiente para assegurar o crescimento. O
inCUO deve possuir de 5 a 10 mm de dimetro ou 20 a 100 mg. O tamanho
fundamental para que acontea o efeito comunidade, onde uma clula dependente
da outra para se multiplicar.
Tcnicas de Estabelecimento In Vitro 39

Aps um certo tempo de cultivo, os calos envelhecem e devem portanto serem


repicados, ou seja, divididos (quando o tamanho permitir) e transferidos para outro
meio. O tempo de repicagem varivel e dependente da taxa de crescimento. Em
muitas espcies pode ser realizada em intervalos de 28 dias de cultivo.
Na manuteno do calos, o mais comum usar o mesmo meio de cultura bsico
da induo. Algumas caractersticas bsicas do calo com sinal de 'velhice':
desacelerao do crescimento (pode ser avaliado pesando-se os calos de 3 em 3
dias, construindo-se uma curva de crescimento); necrose do tecido; escurecimento
do tecido; secamento, que pode ser devido a exausto de nutrientes, inibio do
crescimento, etc.

4.3. SUSPENSO CELULAR

Consiste de clulas ou agregados de clulas dispersas crescendo em meio


lquido em movimentao (agitao).
O incio da suspenso celular a utilizao de calos friveis em agitao. O
incuo na faixa de 2 g / 25 ml constitui uma quantidade suficiente para um bom efeito
de comunidade.
As suspenses celulares so obtidas transferindo-se calos friveis para meio
lquido sob agitao. Em geral, a composio do meio de cultura para a obteno de
suspenses celulares igual do meio utilizado para o cultivo de calo.
O conhecimento das fases de crescimento de uma suspenso celular dentro de
cada subcultivo bastante importante, uma vez que o potencial embriognico das
clulas em suspenso pode ser mantido atravs da utilizao de subcultivos nas
fases de crescimento logartmica das clulas.

4.3.1. Aplicaes da suspenso celular:


usada para obteno de sementes sintticas (embriognese somtica),
isolamento de protoplastos, isolamento de mutantes, obteno de resistentes a
certos elementos (Alumnio, toxinas, herbicidas, sal), produo de metablitos
secundrios e nos processos de transformao de plantas.

4.3.2. Mtodos mais utilizados para medir o crescimento celular:


Para quantificar o crescimento de clulas em suspenso, so utilizados
principalmente os mtodos baseados no nmero de clulas, peso de matria seca,
peso de matria fresca, volume de clulas e protena total da clula.
Um calos tpico iniciado de um explante passa por trs estgios de
desenvolvimento, que compreende a induo da diviso celular, um perodo de
diviso celular ativa durante o qual as clulas diferenciadas perdem as
caractersticas especializadas para tornarem-se desdiferenciada e um perodo no
40 EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

qual a diviso celular reduzida ou mesmo cessa, iniciando ento a especializao


celular. Esses estdios podem ser acompanhadas numa curva de crescimento
caracterizadas por seis fases (Figura 14).
Fase lag: caracterizada por no ter ganho em nmero de clulas, pelo
inicio da mobilizao de metablitos sem ocorrer qualquer diviso celular,
pela sntese de protenas e sntese de metablitos especficos. A ateno
deve ser dada densidade do incuo que afeta o comprimento da fase lag.
Quanto menor o peso do calos utilizado, maior a fase lag.
Fase exponencial: caracterizada por diviso celular intensa, aumento no
nmero de clulas, porm clulas de tamanho pequeno com formao de
agregados de clulas.
Fase linear, a fase exponecial seguida pela fase linear. O crescimento
celular ativo e as clulas adquirem competncia para proceder a
repicagem.
Fase de desacelerao: ocorre uma reduo na diviso celular. no final
dessa fase que se deve iniciar o processo de repicagem.
Fase estacionria: a repicagem deve ser terminada ainda no incio dessa
fase quando no h diviso celular. As culturas no podem ser mantidas
nessa fase por um perodo longo.
Fase de declnio: as clulas comeam a morrer, culminando com a lise
celular.

Fase
Fase de estacio-
desacele- nria
rao do
N 2 cresci-
clulas mento

Fase de
crescimento Fase
exponencial de
declnio
Fase
lag Fase
de
cresci-
Incuo mento
inicial linear

Tempo -+
Figura 14: Curva de crescimento de uma suspenso celular.
Tcnicas de Estabelecimento In Vitro 41
4.3.3. Importncia da curva de crescimento
A curva de crescimento de calos calculada com o objetivo de se obter a poca
de repicagem (subcultura), para determinar onde h a maior produo de metablitos
(quando o estudo objetiva o metabolismo secundrio). Esta fase de desacelerao,
pois os metablitos secundrios no constituem prioridade no metabolismo celular.

4.4. CULTURA DE ANTERAS

A cultura de anteras uma tcnica para a obteno de plantas haploides a


partir de plantas normalmente diplides. A descoberta que o gro de plen poderia
desenvolver embries foi feita por acaso na dcada de 60. Atualmente, muitas
plantas so produzidas a partir do gro de plen imaturo ou calo que desenvolve a
partir do micrsporo (Figura 15).

Figura 15: Cultura de anteras de Nicotiana tabacum. A flor excisada quando


as ptalas esto emergindo do boto [superiora esquerda). A antera
imatura removida assepticamente e inoculada em um meio padro
sem reguladores. Embries somticos desenvolvem do calo
derivado do micsporo haplide. Os embries haploides (1n) para
formar plntula (extrado de Hartmann et a/., 1997).
42 EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

A cultura de anteras tem grande potencial para o melhoramento de plantas e


usada para a obteno de plantas haploides. A palavra haplide refere-se a plantas
que possuem o nmero gametoftico de cromossomos em seus esporfitos, ou seja,
so originrias de um esporfito e contm metade do nmero de cromossomos da
espcie.
Plantas haploides podem ser obtidas in vivo atravs de polinizao com plen
irradiado, polinizao com plen abortivo (estril), tratamento do plen com choques
trmicos, hibridao distante. In vitro pode ser obtido pelo desenvolvimento da
oosfera no fertilizada, pela cultura de anteras e ou gros de plen (diretamente por
embriognese e indiretamente via formao de calos).
As fontes de explantes usadas so anteras imaturas, que fornecem plen

-
uninucleado (por ocasio da primeira mitose) se constituindo no material mais
promissor para induo de andrognese e botes florais fechados.

4.4.1. Protocolo para a obteno de haploides


O protocolo para cultura de anteras pode ser descrito resumidamente como
segue:
a) os botes florais fechados so desinfestados;
b) faz-se uma inciso de um dos lados do boto floral e estames so
delicadamente removidos. O filamento do estame removido (com bastante
cuidado para no danificar as anteras) e
c) as anteras so inoculadas em meio de cultura.

4.4.2. Fatores que influenciam a andrognese


1) Gentipo da planta doadora: tem sido observado que gneros, espcies e
cultivares apresentam diferentes respostas na cultura de anteras.
2) Condies fisiolgicas e idade da planta: flores das plantas relativamente
novas, no incio da florao so mais adequadas do que botes florais de
plantas velhas e em final de seu perodo de crescimento.
3) Estdio de desenvolvimento do plen: o micrsporo no estgio uninucleado
o mais adequado (antes ou logo aps a primeira antese). Existe correlao
entre o tamanho do boto floral e o estdio do desenvolvimento do plen
(importante ao se considerar a plidia do embrio produzido). O estgio do
desenvolvimento do plen na antera pode ser determinado pelo corante
acetocarmicma ou reagente de Schiff.
4) Pre-tratamento dos botes ou anteras:
a) Tratamento trmico: deve ser feito em baixa temperatura (3 a 5 C). Assim se
o

retm a viabilidade do plen por mais tempo, retardando a senecncia,


sincronizando as clulas e previnindo o aborto do plen.
Tcnicas de Estabelecimento In Vitro 43

b) Tratamento qumico: aplicaes de qumicos como o etrel (paclobutrazol),


hidrazida maleica, carvo ativado, podem induzir as anteras a formar em
embries.
c) Tratamento fsico: radiaes ionizantes, presses atmosfricas reduzidas
(uso de dissecador); centrifugao.
5) Composio do meio de cultura: os meios mais utilizados so o MS, White,
Nitsch. A sacarose a fonte de carbono mais efetiva de carboidratos e sua
concentrao varia com as espcies.
A necessidade de reguladores de crescimento, tambm varivel. Suplementos
orgnicos como casena hidrolizada, gua de coco, extrato de leveduras,
aminocidos, cido ascrbico tem sido utilizados com sucesso.

4.4.3. Identificao de haploides


A identificao de haplides pode ser feita com genes marcadores, que
produzem cor, cuja manifestao possa ser mostrada na semente ou plntulas.
Marcadores morfolgicos e por contagem de cromossomos, atravs de tcnicas
citolgicas.

4.4.4. Problemas
Alguns problemas relacionados cultura de anteras podem ocorrer quando so
usadas tcnicas inadequadas para se produzir plantas dipides a partir de haploides
regenerados de cultura de anteras; uso de tcnicas inadequadas de regenerao;
ocorrncia de elevada taxa de mutao (anormalidades); desdiferenciao de calo a
partir de clulas dos tecidos somticos da antera e; alta incidncia de plantas albinas
(principalmente em gramneas).

4.4.5. Utilizao de plantas haplides


A tcnica da andrognese permite:
a) Obteno de homozigose. Em programas de melhoramento, onde
necessrio a obteno de linhagens, a homozigose destas pelos processos
tradicionais s ocorre aps 6 a 8 geraes de autofecundao ou retrocruzamento.
Atravs da cultura de anteras, plantas haploides so obtidas imediatamente, pois
uma vez duplicado seu nmero de cromossomo, originam plantas diplides que
apresentam homozigose em 100% dos loci, reduzindo o tempo.
b) Produo de supermachos. Tomando-se com exemplo o aspargo, que
diica, as plantas masculinas so mais produtivas. H interesse na determinao de
um mtodo que produza por sementes todas as plantas hbridas F^ heterticas
masculinas.
A partir de plantas femininas ( XX - homogamticas) e plantas masculinas (XY -
heterogamticas), por cultura de anteras, pode-se obter plantas haploides tanto X
44 EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

como Y, pela duplicao: XX (plantas femininas) e YY (supermachos). Usando estes


supermachos na produo de hbridos, toda a prognie de plantas ser masculina
(XY) e portanto, mais produtiva e menos fibrosa.
A obteno de haploides in vitro pela cultura de anteras j uma realidade em
solanaceaes, gramneas e crucferas.

4.5. CULTURA DE ESTRUTURAS ORGANIZADAS

O termo cultura de rgos usado para todas os tipos de cultura nos quais uma
forma organizada de crescimento pode ser continuamente mantida. Inclui o
isolamento assptico de estruturas definidas como primrdio foliar, flores imaturas e
frutos, e seu crescimento in vitro. Para a propagao vegetal, os mais importantes
tipos de culturas de rgos so:

a) Cultura de meristema
Consiste no estabelecimento do domo meristemtico apical sem os primrdios
foliares. A brotao apical tipicamente cresce, originando um nico broto.

b) Cultura de pices caulinares


o estabelecimento in vitro a partir de brotaes apicais maiores do que
aquelas utilizadas para iniciar a cultura de meristema, tendo alguns primrdios
foliares. Essas brotaes apicais podem produzir mltiplas brotaes.

c) Cultura de segmentos nodais


Os segmentos nodais so constitudos de gemas laterais isoladas, segmentos
de caule com uma ou mltiplas gemas. Cada gema desenvolve para formar uma
nica brotao.

d) Cultura de embries
iniciada a partir de embries zigticos extrados de sementes. Os embries
germinam originando brotos.
A cultura de* meristema e a cultura de embries so descritos com mais
detalhes a seguir.

4.5.1. Cultura de Meristemas


U'lffTRt, cultura de meristema refere-se ao crescimento do domo apical
da brotao, excluindo as folhas primordiais..
Tcnicas de Estabelecimento In Vitro 45

O meristema no apresenta fololos (Figura 16) sendo constitudo por duas


regies diferentes, tnica e corpus. A tnica constituda de uma a trs camadas de
clulas, a mais interna forma a epiderme e as outras duas restantes do origem a
folha ou somente a epiderme foliar. O corpus a camada mais interna, responsvel
pela formao do restante da planta. O plano de diviso da tnica anticlinal e do
corpus periclinal.

4.5.1.1. Aplicaes da cultura de meristema


A cultura de meristemas utilizada para estudos do efeito de fitorreguladores
na iniciao foliar e no estudo do florescimento, na propagao vegetativa para
obteno de plantas livres de patognos e, na multiplicao clonal rpida.
Os meristemas so amplamente ultilizados na limpeza pois estes materiais so
livres de vrus. Isto explicado pelos seguintes fatos:
a) Crescimento contnuo do tecido. A diviso celular intensa, o que aumenta a
competio por metablitos e desta forma o vrus no tem energia suficiente para
sua multiplicao.
b) Ausncia do tecido vascular (floema e xilema) no meristema. muito difcil a
passagem do vrus clula a clula (o DNA do vrus maior que o plasmadesmata).
Vrios fatores so determinantes para se obter sucesso na limpeza. Dentre
estes, pode-se detacar:
Tamanho ideal do meristema: de 0,1 a 1 mm. Menor tamanho implica num
maior sucesso na limpeza, mais a sobrevivncia menor;
Localizao do explante. explantes retirados da ponta do broto esto em um
estdio mais jovem de desenvolvimento do que explantes da base;
poca de colheita: os explantes devem ser de fase de crescimento ativo.
46 EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

Figura 16: Localizao de explantes no pice caulinar (modificado de George,


1993).

4.5.2. Cultura de Embries


A cultura de embries pode ser definida como o isolamento estril e
crescimento de um embrio imaturo ou maturo in vitro, com o objetivo de se obter
uma planta vivel.
Embries zigticos ou de sementes so frequentemente usados vantajosamente
como explantes em cultura de tecidos, por exemplo, para iniciar a cultura de calo. Em
cultura de embries, entretanto, os embries so retirados das sementes e so
individualmente isolados e "germinados" in vitro desenvolvendo uma planta por
explante. A cultura de embries isolados pode ajudar na produo rpida de
plntulas de sementes que apresentam dormncia embrionria ou embrio imaturo.

4.5.2.1. Tipos de cultura de embries:

a) Cultura de.embrio imaturo


Originado de sementes imaturas, usado para evitar o abortamento natural. E
mais difcil, devido a exciso e meio de cultura mais complexo.

b) Cultura de embries maturos


Originado de sementes maturas, usado para evitar a inibio de germinao
de semente.
Tcnicas de Estabelecimento In Vitro 47

4.5.2.2. Estdios de desenvolvimento do embrio


Quanto mais imaturo for o embrio maior ser o requerimento nutricional. No
estdio globular h requerimento de meios mais complexo (fitormnios, altas
concentraes de acares, gua de coco, etc). Antes do formato de corao, os
embries so bastante heterogneos, no sintetizando fitormnio ou mobilizando
compostos de carbono.
No estdios heterotrficos, os embries requerem sais, acares, vitaminas,
nitrognio, citocininas, auxinas, gua de coco (algumas substncias podem ser
opcionais). Quando aumentam de tamanho, tornam-se autotrficos e neste estdio
requerem um meio mais simples.
Os embries geralmente requerem alta taxa de acar (fonte de carbono e
agente osmtico), pois tm um potencial hdrico muito negativo (contedo alto de
slidos). Uma alternativa para resolver a dificuldade imposta pelo potencial hdrico
do embrio fixar a sacarose e elevar o teor de de manitol (agente osmtico).

4.5.2.3. Fatores que afetam o sucesso da cultura de embrio


1) Gentipo: em algumas espcies o embrio cresce facilmente enquanto que
em outras muito difcil (h tambm diferenas entre cultivares de uma
espcie).
2) Estdio de desenvolvimento do embrio no isolamento: muito difcil
desenvolver embrio muito pequeno in vitro.
3) Condio de crescimento da planta-me. crescer a planta-me em
condies controladas resulta em um melhor desenvolvimento do
endosperma, portanto melhora o crescimento do embrio isolado.
4) Composio do meio: embries imaturos requerem uma composio mais
crtica do que embries maturos. Em ambos (maturo e imaturo) os macro e
microelementos so importantes.

Os meios usados so slidos: MS, White e B , em uma faixa de pH entre 5 a 6.


5

Carboidratos (sacarose, usada na concentrao de 2-3% e 8-12% para embries


maturos e imaturos, respectivamente) so fontes de energia e tambm agem
abaixando o potencial osmtico, especialmente em embrio jovens.
O gar usado em concentraes entre 0,6 a 0,8% (valores abaixo resultam
em inibio de crescimento). Os reguladores de crescimento auxinas e citocininas
geralmente no so usados. As vezes se utiliza giberelina. Substncias de
contribuio complexa como a gua de coco so bastante utilizadas, especialmente
para embries imaturos.

5) Luz: fator pouco estudado. Algumas vezes mantm-se o embrio isolado


no escuro por 7 a 14 dias.
48 EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

6) Temperatura: a temperatura tima dependente da espcie, variando,


geralmente entre 22 e 28C).

4.5.2.4. Aplicaes prticas da cultura de embries

a) Eliminao da inibio (dormncia) da germinao de semente


Em algumas espcies absolutamente impossvel obter a germinao in vivo
devido a caractersticas genticas ou fisiolgicas. v

b) Recuperao de hbridos de cruzamentos incompatveis


No melhoramento, cruzamentos interespecficos e intergenricos para transferir
genes de interesse da espcie selvagem para a cultivada (aumenta a variabilidade
gentica) podem produzir embries abortivos devido a incompatibilidade.
Isto ocorre tambm em cruzamentos onde existam barreiras pr ou ps-
zigticas (sementes murchas e embries abortivos). Os embries hbridos so salvos
e removidos antes que ocorra o aborto e, posteriormente cultivados in vitro.

c) Superao da dormncia das sementes


Em algumas sementes ocorrem inibidores qumicos endgenos ou h
requerimentos especficos de luz e temperatura ou ainda a resistncia fsica presente
nas estruturas que recobrem o embrio. A cultura de embries uma alternativa para
superar estes problemas.

d) Superao da esterilidade das sementes.


As causas de ocorrncia de sementes estreis em algumas espcies podem ser
o desenvolvimento incompleto do embrio, mutaes das estruturas que cobrem o
embrio ou algum tipo de dormncia recalcitrante para a qual nenhum mtodo tem
N'
sido desenvolvido.

e) Germinao de sementes de parasitas obrigatrios.


Sem o hospedeiro, impossvel a ocorrncia in vivo. Assim tambm a retirada
dos embries e cultivo in vitro pode suprir esta necessidade, permitindo o
desenvolvimento de plantas.

f) PVIO 00 mbrO abortivo que ocorre com o amadurecimento precoce


c
de frutos carnosos
Tcnicas de Estabelecimento In Vitro 49

Em cruzamento dos frutos (pssego, ameixa, cereja) o transporte de gua e


nutrientes para o embrio imaturo algumas vezes cortado muito cedo, ocorrendo o
aborto.

g) Propagao vegetativa
Devido a sua natureza juvenil com alto potencial regenerativo, embries so
excelentes explantes para propagao clonal in vitro. Especialmente para conferas e
gramneas.
5
MULTIPLICAO

Edson Jos Artiaga de Santiago 1

Renato Paiva 2

Patrcia Duarte de Oliveira Paiva 3

Cntia Guimares dos Santos 4

Guilherme Augusto Canela Gomes 5

5.1. INTRODUO
_
Nos ltimos anos, a cultura de tecido tornou-se importante tcnica na tentativa
de estabelecimento de metodologias de propagao de vrias espcies. Por ser uma
tcnica que possibilita resultados bastante prticos, a cultura de tecido ainda
necessita de informaes bsicas para seu perfeito entendimento. _
Os mtodos mais econmicos e disponveis para propagao de plantas de
uma determinada espcie podem mudar com o tempo. Maiores avanos podem vir de
um melhor conhecimento dos fatores que controlam a morfogenese e a estabilidade
gentica in vitro.
Os laboratrios de micropropagao comercial utilizam quatro mtodos bsicos
para multiplicar plantas in vitro: aumento de brotaes axilares; segmentos nodais;
brotaes adventcias e embriognese somtica.
A reduo nos custos de produo e a identificao de produtos, os quais so
diferenciados pelo seu valor econmico, so estgios crticos para que a
micropropagao possa ser expandida comercialmente.
A totipotncia celular (capacidade da clula em formar um indivduo idntico ao
indivduo de onde esta foi extrada), associada aos efeitos do balano hormonal, tem
tornado possvel o estudo da morfogenese in vitro e sua aplicao mais prtica, a

1 Pesquisador, EMBRAPA Amaznia Oriental, Belm/PA


- PfdfSf Adjunto, PhD, Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras
(UFLA)
3 Professora Adjunto, Dra., Departamento de Agricultura, UFLA
4 Mestre em Fisiologia Vegetal, Departamento de Biologia, UFLA
5 Doutorando em Fitotecnia, Departamento de Agricultura, UFLA
Multiplicao 51

micropropagao, tcnica amplamente utilizada para a propagao de frutferas de


clima temperado.
A micropropagao o desenvolvimento de novas plantas em um meio artificial
sob condies asspticas, a partir de pequenos propgulos (explantes). Para as
espcies lenhosas, as partes mais empregadas so pices caulinares, micro-
estacas, embries, calos celulares, entre outras.
A cultura de tecidos difere dos mtodos tradicionais, principalmente nas
condies sob as quais a propagao efetuada, mas no difere destes quanto a
seus princpios. As diferenas bvias referem-se ao fato de a micropropagao
empregar propgulos pequenos, controle assptico, controle do meio ambiente e
rpida multiplicao, quando comparada com os mtodos tradicionais.

5.2. FASES DA MICROPROPAGAO

5.2.1. Fase preparativa (Estdio 0)


Esta fase compreende o cultivo das matrizes em condies especial de higiene.
Isto redundar posteriormente em obteno de propgulos com menor incidncia de
fungos e bactrias. As plantas matrizes devem estar crescendo em vasos ou outros
recipientes, em casa de vegetao com cobertura de vidro ou plstico. Ser til
qualquer dispositivo que fornecer gua para as plantas diretamente no vaso ou por
capilaridade, como, por exemplo, irrigao por gotejamento. A durao mnima do
regime de gua deve ser testada para cada espcie.
O impacto deste estdio inicial aparentemente no limita somente a condio
sanitria da planta, mas tambm a percentagem de sobrevivncia na fase seguinte.
Assim, empregando-se esta fase, pode-se desinfestar o material sem a retirada das
folhas que contero um menor nmero de inculos, o que, consequentemente,
redundar em uma maior sobrevivncia.
Alguns parmetros afetam sensivelmente a planta matriz de onde ser coletado
o propgulo. Entre eles, podem ser citados:

a) Luz
Os segmentos foliares provenientes de plantas estoques (matrizes) tratadas
com luz vermelha produzem mais brotaes por explante do que plantas no-
tratadas.

b) Temperatura
plantas" lgflhOa podem Ser induzidas a surtos de novos crescimenus
quando colocadas em temperaturas de 4 a 5C por um perodo de tempo equivalente
quele necessrio para a quebra natural de dormncia.
52 EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

A reatividade do explante logo aps o estgio 0, ou seja, no estgio 1, pode ser


controlada por um tratamento apropriado com reguladores de crescimento da planta
estoque, das fontes de explantes ou do prprio explante.
Manipulaes podem mudar a fisiologia das estacas de rvores velhas, de tal
forma que elas se tomam propcias para uma propagao clonal comercial.

5.2.2. Incio do cultivo (Estgio 1)

Nesta fase, deve-se prestar a ateno no seguintes fatores:


a) Tipo de explante
A escolha do explante recai, geralmente, nas gemas apicais ou axilares. O
estgio de desenvolvimento do explante de suma importncia. A idade da planta
matriz, a idade fisiolgica do explante e seu estgio de desenvolvimento, assim como
_
seu tamanho pode determinar o sucesso deste procedimento.

b) Reaes de hipersensibilidade
Quando os tecidos so expostos a condies de estresse, tais como dano _
mecnico, que ocorre ao se isolar o explante da planta estoque, o metabolismo de
compostos fenlicos estimulado. Isto leva a reaes de hipersensibilidade, tais
como a liberao do contedo nas clulas danificadas, as reaes nas clulas
vizinhas, mas, sem mostrar sintomas de danos, e/ou a morte prematura de clulas
especficas no lugar do ferimento ou o lugar de infeco.
De um modo geral, existem trs tipos possveis de resposta ao estresse ou
dano mecnico: -
1) oxidao de compostos fenlicos pr-formados, ocorrendo a formao de
quinonas e material polimerizado;
2) sntese de monofenis e;
3) sntese de derivados de polifenis.

A sntese de monofenis pode levar ao acmulo de maiores quantidades de


produtos pr-formados nos tecidos no danificados ou ao aparecimento de novos
produtos que desempenham um papel no mecanismo de proteo do tecido contra a
contaminao (fitoalexinas). O papel destes produtos j mencionados pode ser o de
formar uma barreira fsica contra a invaso (lignina), ou um inibidor de crescimento
microbiano (quinonas, fitoalexinas). W
Um grupo especial de compostos fenlicos so as auxinas protetoras
c
(antioxidantes que inibem a oxidao do AIA catalizado pelas peroxidases). Numa
planta intacta, h um gradiente na inibio da degradao enzimtica do AIA que
inversamente proporcional idade do tecido. Isto mostra que a inibio diminui em
direo base do caule, ou a concentrao de auxinas protetoras maior nas folhas
mais novas e nos intendios. De um modo geral, os fenlicos so produtos
Multiplicao 53

facilmente oxidados. Tais produtos podem ser fitotxicos, ou mesmo aumentar os


processes de oxidao, pois aps a ocorrncia da oxidao, estes se tornam
oxidantes muito fortes.
Alguns passos bsicos para evitar o escurecimento do tecido e do meio na fase
de incio de cultivo incluem a:

> remoo dos compostos fenlicos produzidos (lixiviao, adsoro com


carvo ativado ou polivinilpirrolidona);
> modificao do potencial redutor (agentes redutores ou menos oxignio
disponvel);
> inativao das enzimas fenolases (agentes quelantes);
> reduo da atividade da fenolase (baixo pH, escurido, entre outros).

Nem todo antioxidante eficaz nesta fase. Alguns so at mesmo recomendado


por um curto espao de tempo, porque rapidamente eles se tornam fortes oxidantes,
como, por exemplo, o cido ascrbico.
Alguns micronutrientes, tais como o mangans (co-fator de peroxidases) e o
cobre (parte da complexa enzima fenolase), podem estimular a oxidao de fenis.
Desta forma, conveniente usar estas formulaes de sais em baixas
concentraes.

5.2.3. Multiplicao (Estgio 2)


Nesta fase, cultivam-se brotaes com a finalidade de aumentar o nmero de
estacas. Nesta fase, inmeros subcultivos podem ocorrer at atingir um nmero de
brotaes que sero enraizadas. Objetiva-se, nesta fase, a obteno de brotaes
alongadas e aptas para a fase de enraizamento.
O mtodo mais usado o da formao adventcia de caules, pois facilita e
acelera o aumento dos propgulos. Para cada espcie, no entanto, tem-se que
determinar se este sistema produz plantas com as mesmas caractersticas genticas
da planta-me. A calognese axilar tambm empregada na micropropagao e
garante a obteno de indivduos com idntica composio gentica da planta matriz
(Figura 17).
54 EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

REMOO DAS GEMAS


APICAIS E LATERAIS

INICIAO
DO CULTIVO

ENRAIZAMENTO
_JN VITRO
(OPCIONAL PARA
ALGUMAS CULTURAS)

Figura 17: Diagrama da produo de mudas advindas da micropropagao de


gemas terminais e axilares (adaptado de FACHINELLO et al., 1995).

Na fase de multiplicao, uma dosagem excessiva ou escolha inadequada de


citocinina pode ser responsvel pelo aparecimento de plantas epigenticas (plantas
que apresentam modificaes fenotpicas, mas sem alterao na carga gentica) que W
s podero ser avaliadas no final do processo. Elevado nmero de subcultivos in
vitro de morangueiro resulta em srios distrbios, tais como ausncia ou fraco
enraizamento, formao excessiva de flores, frutos pequenos e deformados e plantas
heterogneas.

5.2.4. Alongamento de brotaes e induo de raiz (Estgio 3)


Nem sempre o alongamento das brotaes necessrio. s vezes, a simples
transferncia das brotaes para um meio com ausncia de citocininas o suficiente
para causar o alongamento.
A auxina o regulador de crescimento utilizado na fase de induo de razes.
Aps a induo radicular, no h necessidade da brotao permanecer na presena
de auxina para a iniciao radicular. 0 emprego de auxina nesta fase geralmente c
leva formao excessiva de calos na base das brotaes. Razes adventcias
podem ser formadas, porm nem sempre estas apresentam conexo vascular.
Multiplicao 55

5.2.5. Transferncia para as condies de casa de vegetao (Estgio 4):


Esta , sem dvida (juntamente com a etapa anterior) uma das mais crticas em
todo o processo da micropropagao. As plntulas que durante todo o tempo
cresceram em condies totalmente artificiais (temperatura variando de 25 2C;
irradincia em tomo de 2000 lux e fotoperodo de 16 horas), passam para condies
naturais.
As folhas das plantas micropropaga.das apresentam uma menor quantidade de
ceras epicuticulares que, associada a pouca funcionabilidade dos estmatos, as
torna suscetveis a grandes perdas de gua por transpirao. Assim, todo o material
deve permanecer por 1 a 2 semanas em um ambiente com luz solar indireta
(sombrite) e alta umidade relativa, que poder ser suprida com o emprego de
nebulizao em casa de vegetao ou telado.

5.3. PRODUO DE MUDAS LIVRES DE ENFERMIDADES

A propagao vegetativa permite a produo de plantas idnticas planta-me.


Porm, esse processo de clonagem propicia nestas plantas o acmulo de vrus, o
que leva a uma queda continua na produtividade.
A limpeza clonal ocorre com o emprego de tcnicas tais como:

5.3.1. Termoterapia
As plantas matrizes ou estoques so colocadas em ambiente com temperatura
elevada, geralmente acima de 30C; nesta temperatura, que varivel de acordo
com a espcie e variedade, as plantas devem permanecer por um perodo de tempo
mnimo de 20 dias, mas, preferivelmente, acima de 40 dias. Este tempo necessrio
para inativar o vrus ou micoplasma presente na planta. Concomitantemente, ocorre
crescimento das brotaes da planta estoque, que provavelmente no acusaro a
presena do vrus. Estas brotaes so ento retiradas e podero, aps o
enraizamento, servir de fonte de material vegetativo livre de vrus.

5.3.2. Cultura de meristema


Faz-se a retirada do meristema, tecido contido nas gemas vegetativas,
terminais ou> axilares. Este tecido transferido para um meio de cultura contendo
reguladores de crescimento, onde, atravs do processo de diferenciao, ocorrer a
formao de brotaes que seguiro as etapas j mencionadas anteriormente
(Figura 18).
56 EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

EXTRAGAQ
SEGMENTOS DO PICE
NODAIS MERISTEMTICO

CULTURA
DE MERISTEMA

MULTIPLICAO
IN VITRO DAS
PLANTAS INDEXADAS
INDEXAO
i
REGENERAO DA PLANTA
A PARTIR DO MERISTEMA APICAL

SINTOMA

MULTIPLICAO DA PLANTAS - PLANTA VfDtCADORA


INDEXADAS EM TE LADO
- MICROSCOPIA ELETRtHCA
- T E S T E S SEROLGICO

Figura 18: Diagrama da cultura de meristema (adaptado de FACHINELLO et al.,


1995).

5.3.3. Termoterapia seguida de cultura de meristema


Este processo um dos mais seguros para se obter a limpeza clonal. As
plantas passam por um perodo de termoterapia que se sucede retirada do
meristema, o qual inoculado em meio de cultura semelhante ao anterior.

5.3.4. Microenxertia
Este processo empregado para aquelas espcies que no podem ser
submetidas a temperaturas elevadas e, principalmente, para as espcies que, ao
Multiplicao 57

serem multiplicadas in vitro, apresentam uma reverso ao estgio de juvenilidade.


Neste caso, o meristema coletado enxertado em porta-enxerto crescido in vitro
(Figura 19). Este processo apresenta um baixo rendimento. comumente
empregado para os citros, podendo tambm ser usado para a cultura da ameixeira e
pessegueiro.

C O L E T A DO B R O T O

C O R T E E DESINFESTAO

SEPARAO DO PICE C A U L I N A R
COM 2 O U 3 PRIMRDIOS F O L I A R E S

Figura 19: Diagrama da tcnica de microenxertia para obteno de plantas


isentas de vrus e micoplasmas (adaptado de FACHINELLO et al.,
1995).
ENRAIZAMENTO
--y

Gustavo de Arajo Soares 1

Renato Paiva 2

Edson Jos Artiaga de Santiago 3

Jos Raniere Ferreira de Santana 4

Patrcia Duarte de Oliveira Paiva


5

6.1. INTRODUO

O enraizamento a etapa onde ocorre a formao de razes adventcias nas


partes areas. Pode ser dividido em induo, iniciao e alongamento das razes. w.
Essa fase a ltima do processo de propagao in vitro, realizada antes da
CflW.t\lO S muS f) ambiente externo. 0 enraizamento pode tambm ser
realizado fora do tubo de ensaio, em condies de menor assepcia, j fazendo parte
do processo de aclimatizao. A opo por um dos sistemas depende da qualidade
da estaca, da espcie de trabalho, das condies do laboratrio e dos recursos
disponveis. Pode-se tambm criar um terceiro sistema, onde as estacas so ^y
mantidas in vitro at a induo da rizognese e, posteriormente, so transplantadas
em um substrato ex Wfro para desenvolvimento das razes (Figura 20).
Geralmente, necessrio que j se tenham formados estacas da espcie de
trabalho, com folhas e outros tecidos diferenciados, para que se induza a formao
das razes. A capacidade de enraizamento dos explantes varia muito entre espcies

1 Mestrando em Fisiologia Vegetal, Departamento de Biologia, Universidade Federal de


Lavras (UFLA)
2 Pf8MG[ Mjuntu, PtlD, Departamento s Biologia, UFLA
3 Pesquisador, EMBRAPA Amaznia Oriental, Belm/PA
4 Professor Assistente, Departamento de Cincias Biolgicas, Universidade Estadual de
Feira de Santana (UEFS)
5 Professora Adjunto, Dra., Departamento de Agricultura, UFLA
Professor Adjunto, Dr, Departamento de Qumica, UFLA.
^y
Enraizamento 59

e de acordo com o tratamento hormonal aplicado. Normalmente, o uso de auxinas


favorece a induo e a iniciao radicular e inibe o alongamento, porm
concentraes elevadas podem levar formao de calos. Espcies herbceas e
regies jovens das plantas geralmente enrazam mais facilmente que espcies
lenhosas e regies mais maduras.

IN VITRO EX VITRO

Brotaes Transferncia para o solo


enraizadas
espontaneamente
em culturas

Brotaes em
meio de Estacas enraizadas
, enraizamento
movidas para o solo

A induo do
enraizamento
Brotaes
usualmente
sem
envolve
razes *\
Estacas transferidas Estacas tratamento das
diretamente para o solo enraizadas estacas com
auxina

Ambiente mido fechado (sombreamento


parcial + nebulizao o ideal)

Figura 20: Etapas para enraizamento de brotaes micropropagadas


(modificado de George, 1993).

6.2. ENRAIZAMENTO IN VITRO

A vantagem deste tipo de enraizamento o melhor controle das condies em


que se trabalha e, com isso, a obteno de um alto percentual de enraizamento. Este
mtodo o mais empregado nos laboratrios de cultura de tecidos vegetais.
Por outro lado, a desvantagem do mtodo que as razes formadas in vitro nem
sempre so eficientes na absoro de gua e de nutrientes, no momento da
Pg/D UluS p O substrato. Razes produzidas in \,itro podem poaou.v
r

poucos pelos radiculares e conexes vasculares, e s comearem a desenvolver o


cmbio secundrio quando so removidas do frasco de cultura. Algumas vezes, elas
no se desenvolvem o suficiente para suportar o crescimento da muda, levando a
60 EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

morte ou reduo do crescimento da planta. Pode acontecer tambm a formao de


um nmero pequeno de razes longas e pouco ramificadas ao invs de um nmero
grande de razes mais curtas e ramificadas. Em alguns casos, foi observado que
razes de plantas formadas em tubo de ensaio, morrem depois de um certo tempo de
transplantio para o solo e novas razes ento, so formadas. Esta situao no
entanto no regra pois, cada espcie reage de uma maneira ao processo de
enraizamento.
O enraizamento in vitro pode ocorrer de duas formas: quando as razes so
formadas a partir de brotaes sendo chamado de processo direto, e quando so
formadas a partir de calo, denomina-se de processo indireto. Em ambos os casos, se
no houver uma ligao vascular eficiente entre a parte area e a parte subterrnea,
a aclimatizao da muda dificultada, podendo comprometer sua sobrevivncia.
A rizognese est associada ao de reguladores de crescimento (internos e
externos), principalmente nas fases iniciais da induo da formao das razes.
Algumas espcies, contudo, j possuem um nvel endgeno de fitormnios suficiente
e s enrazam na ausncia de qualquer tipo de regulador, podendo ou no
necessitarem apenas de uma pequena leso na base da estaca.
Auxinas como o AIB (cido indolbutrico), AIA (cido indolactico) e ANA (cido
naftalenoactico) so os principais reguladores envolvidos no processo de
enraizamento in vitro. Normalmente, o nmero de razes formadas aumenta com a
concentrao de auxina utilizada, at o momento em que sua concentrao fica
excessivamente elevada, ocorrendo ento inibio da formao das razes,
favorecendo o surgimento de calos.
Em alguns casos, a concentrao de auxina que promove bom enraizamento
no a mesma que promove uma alta sobrevivncia ex vitro. As concentraes mais
utilizadas para induzir rizognese normalmente esto entre 1,0 - 10,0 mg.L" para
1

AIA, 0,05 - 1,0 mg.L" para ANA e 0,5 - 3,0 mg.L" para AIB. Estas substncias
1 1

podem ser misturadas de vrias maneiras para se encontrar a frmula ideal para o
enraizamento de cada espcie. A avaliao dos resultados encontrados utilizando-se
diferentes concentraes e misturas de auxinas no deve considerar apenas a
porcentagem de estacas enraizadas, mas tambm a qualidade, o tamanho e o
nmero de razes formadas. A auxina deve ser aplicada no meio de cultura ou
anteriormente inoculao do explante (no caso de enraizamento ex vitro), levando-
se em conta que a sua concentrao inversamente proporcional ao tempo de
permanncia com o regulador.
Associadas s auxinas, outras substncias tambm interferem de forma direta
* )M'.
u r enraizamento dos explantes. Poliaminas, cido sulfrico, cloreto de
1 1 0

magnsio e compostos fenlicos, como o floroglucin, atuam, por exemplo,


estimulando a sntese de AIA ou liberando a auxina existente no explante. J as
citocininas, geralmente utilizada para estimular a formao de brotaes, costumam
inibir 0 enraizamento. Existem poucos casos em que uma citocinina no interfere ou
Enraizamento 61

estimula a formao das razes. As giberelinas funcionam como as citocininas,


inibindo, na maioria das vezes, a rizognese.
Alguns fatores ambientais, tais como tamanho dos recipientes de inoculao,
meio de cultura, gases, substratos, luz, temperatura e o prprio explante, tambm
afetam a formao de razes. O tamanho dos frascos onde os explantes so
colocados ajuda ou dificulta a formao e o crescimento das razes, no momento em
que se tornam uma barreira fsica. Logicamente, em frascos maiores se torna mais
fcil conseguir o enraizamento. A concentrao de sais no meio de cultura pode ser
regulada de acordo com cada espcie, de forma que a reduo da concentrao
inica dos meios (50% ou 75% da fora total do meio) pode favorecer esta etapa do
processo de micropropagao.
A falta de oxignio e o excesso de dixido de carbono no recipiente de cultura
dificultam a induo e o crescimento das razes. Para melhorar a aerao e o
desenvolvimento de razes, recomenda-se o uso de substratos mais porosos
alternativos ao gar. Os substratos desse tipo mais utilizados atualmente so o papel
de filtro esterilizado em forma de ponte, para evitar que o explante se afogue no meio
lquido, a areia grossa autoclavada, a vermiculita tambm autoclavada, a perlita e as
bandejas de espuma.
Quanto luminosidade, o escuro, que normalmente estiola as brotaes
favorece o enraizamento das mesmas. Posteriormente, um perodo de luz estimula o
alongamento das razes formadas no escuro. A provvel explicao a esse fato que
no escuro as auxinas so degradadas mais lentamente. Assim, auxinas exgenas
devem ser fornecidas para os explantes antes ou depois deste perodo, pois nestes
dois momentos a metabolizao das auxinas ser mais rpida. Formas alternativas
d fUltt frf(dd d luz na regio formadora da raiz so o carvo ativaao
misturado no meio de cultura ou um simples sombreamento com material escuro na
parte externa do frasco.
A temperatura ideal para enraizamento varia muito de espcie para espcie,
mas, geralmente, obtm-se razes em temperaturas mais altas que as das outras
fases da micropropagao.
Finalmente, a qualidade do explante muito importante para o sucesso do
enraizamento. Explantes grandes ou pequenos demais dificultam o processo, o ideal
que eles possuam cerca de 2 centmetros. Explantes velhos e lignificados tambm
apresentam eficincia menor de rizognese, por serem tecidos j muito
especializados. Em contra partida, um corte em sua base pode auxiliar na absoro
do regulador e na remoo de barreiras morfolgicas que impeam a diferenciao
do tecido.
Deve-se ressaltar que em cultura de tecidos vegetais, cada espcie ou at
mesmo cada parte da planta utilizada como explante responde de uma forma. Todos
esses fatores, internos ou externos, analisados podem ou no afetar a formao e o
desenvolvimento das razes e de maneiras completamente diferentes.
62 EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

6.3. ENRAIZAMENTO EX VITRO

A principal vantagem do enraizamento ex vitro o menor custo financeiro que


esta tcnica proporciona. As estacas brotadas, ao invs de serem inoculadas em
meios de cultura com reguladores propcios ao enraizamento, so enraizadas fora
das condies asspticas dos frascos de cultura, j fazendo parte da etapa seguinte,
a aclimatizao.
Calcula-se que os recursos economizados por esta tcnica, cheguem a 75%
dos gastos totais, o que corresponde justamente aos gastos com mo-de-obra e
materiais apenas para esta etapa da micropropagao. Como um dos grandes
problemas da cultura de tecidos de plantas so os gastos com a produo, esta
alternativa muito importante para obter uma produo com baixos custos.
Alm disso, o enraizamento ex vitro reduz o tempo de cultivo e de
comercializao da muda, pois elimina uma etapa do processo de micropropagao,
misturando as etapas de enraizamento e aclimatizao. Por estrem substrato mais
poroso e melhor arejado, as razes formadas so mais funcionais e eficientes na
absoro de gua e nutrientes. Isso aumenta o nmero de sobreviventes na
aclimatizao e tambm diminui o tempo de formao da muda.
No entanto, o enraizamento ex vitro no possui apenas vantagens. Em algumas
espcies, a taxa de enraizamento ex vitro to baixa, que a utilizao deste
processo invivel. Em outras, a estaca, antes do enraizamento, necessita de
passar por uma etapa chamada de "endurecimento", para conseguir sobreviver ao
ambiente adverso da fase de aclimatizao. A alta sensibilidade das estacas requer
cuidados especiais para enraizar.
9 "gndurSmgn9" D mais do que alterar algumas caractersticas da
estaca para que ela consiga sobreviver fase de aclimatizao, ou seja, transformar
uma estaca fraca e frgil em uma forte e resistente aos estresses ambientais do meio
externo. Para isso, existem algumas tcnicas que proporcionam o "endurecimento"
da estaca para que ela possa enraizar sem problemas. A resistncia perda de
gua, que ocorre em plantas em ambiente externo, pode ser conseguida atravs da
reduo do potencial hdrico e do aumento da deposio de ceras epicuticulares e da
formao de estmatos funcionais. Isso obtido aumentando-se, gradativamente, a
concentrao de sais, sacarose ou gar no meio de cultura ou reduzindo-se, tambm
gradativamente, a umidade nos frascos de cultura. O aumento da intensidade
luminosa no laboratrio e do suplemento de dixido de carbono nos tubos e a
diminuio da concentrao de sacarose no meio de cultura pode intensificar o
desenvolvimento e aprimorar o aparelho fotossinttico das plantas, deixando-as
KIJfiSf fX$$ p enfrentar gs condies de autotrofismo ria fasp rip
aclimatizao.
A tcnica de enraizamento ex vitro consiste em destacar brotaes e plant-las
no substrato desejado. As estacas no podem ser nem muito grandes, nem muito
Enraizamento 63

pequenas, pois esses extremos so de difcil manuseio, dificultam o enraizamento e


demandam mais tempo para formar mudas. Estacas de tamanho entre 2 e 5
centmetros so as ideais. Se possvel, o plantio deve ser em grupos, ao invs de
isoladas, o que favorece o enraizamento, que, geralmente, ocorre em 2 a 5 semanas.
Existem vrios substratos nos quais se pode realizar o plantio. Turfa, areia,
vermiculita, perlita, bandejas de espuma, substratos comerciais como o Plantmax* e
o Agromix e solo esterilizado so os mais utilizados. O importante que todos
sejam submetidos a um processo de esterilizao por calor ou irradiao, para
garantir a assepsia do solo e evitar o aparecimento de pragas, fungos e bactrias. Se
necessrio, pode-se enriquecer o substrato com sais, do meio de cultura nutritiva ou
reguladores de crescimento como auxinas, que aumentam a intensidade e a
velocidade do enraizamento. Estes reguladores podem ser aplicados diretamente no
substrato ou na passagem das estacas do tubo de cultura para o substrato.
ACLIMATIZAO

Edson Jos Artiaga de Santiago 1

Renato Paiva 2

Breno Rgis Santos 3

Patrcia Duarte de Oliveira Paiva 4

Guilherme Augusto Canela Gomes 5

7.1. INTRODUO

O termo aclimatizao definido como a adaptao climtica de um organismo,


especialmente uma planta, que transferida para um novo ambiente, sendo todo
esse processo realizado artificialmente. O termo aclimatao tem um significado
similar, mas um processo no qual as plantas ou outros organismos se tornam
ajustados a um novo clima ou situao, como resultado de um processo
essencialmente natural.
Muitas pesquisas tm sido realizadas para resolver o problema referente
aclimatizao. Um grande nmero de planta micropropagada no sobrevive quando
so transferidas das condies in vitro para o ambiente externo.
Esta passagem crtica se deve basicamente aos seguintes fatores:

7.2. ESTRESSE HDRICO

O estresse hdrico causado pela transpirao excessiva de partes da planta,


principalmente nas folhas, ou absoro inadequada de gua pelas razes e, em
geral, o maior problema no processo de transplantio e aclimatizao. Nas
condies in vitro, as plntulas se desenvolvem com baixa luminosidade e elevada

1 Pesquisador, EMBRAPA Amaznia Oriental, Belm/PA


2 Professor djuht, PhD, Departamento de Sofogia, Universidade Federaf ae Lavras
(UFLA)
3 Doutorando em Fisiologia Vegetal, Departamento de Biologia, UFLA
4 Professora Adjunto, Dra., Departamento de Agricultura, UFLA
5 Doutorando em Fitotecnia, Departamento de Agricultura, UFLA.
Aclimatizao 65

umidade relativa com consequente reduo do fluxo respiratrio. Ao serem expostas


a um ambiente com alta luminosidade e baixa umidade relativa, a taxa de
transpirao aumenta, surgindo um dficit hdrico na planta.
A cutcula e o estmato so as causas primrias de perda de gua pelas folhas.
A cutcula uma membrana composta por uma cutina matriz, juntamente com ceras
internas e superficiais que protegem os tecidos das plantas. A funo principal da
cutcula limitar a perda de gua por transpirao. As plantas obtidas atravs da
micropropagao possuem uma camada mnima ou inexistente de cera protetora
sobre as folhas.
Outra causa da perda de gua pela superfcie das folhas o controle ineficiente
dos estmatos que no so funcionais e respondem lentamente ao estresse hdrico.
A estrutura dos estmatos de plantas micropropagadas pode variar entre as
espcies, porm todas apresentam estmatos muito mais abertos nas condies in
vitro do que em estufa ou campo.
A morfologia e a densidade dos estmatos podem ser alteradas mudando-se as
condies ambientes. Em plntulas de rosa, por exemplo, um aumento na
luminosidade e uma diminuio na umidade relativa de 100 para 75%, resultou em
estmatos semelhantes s plantas cultivadas em estufa.
N

7.3. FOTOSSNTESE

A estrutura e a morfologia interna das plantas micropropagadas so,


inicialmente, muito diferentes daquelas cultivadas em condies de campo. Esta
variao na anatomia ou ultra-estrutura pode afetar o processo de fotossntese.
No proeSSO convencional de micropropagao, os explantes ou plntulas, nos
estgios de diferenciao, multiplicao e enraizamento, desenvolvem-se
heterotroficamente.
No estgio de aclimatizao as plntulas sofrem uma mudana drstica quando
so removidas dos frascos onde a luz e as trocas gasosas so limitadas e existe
grande disponibilidade de acar. Essa passagem faz com que mudem de
heterotrficas para autotrficas, com grande gasto de energia.

7.4. ABSORO DE NUTRIENTES

As plntulas in vitro ao serem aclimatizadas, passam de um meio onde tm


disposio alta concentrao de nutrientes para um substrato no qual so foradas a
iniciar 0 processo de absoro de sais para seu desenvolvimento. A emisso de
novas razes muito importante, pois as formadas in vitro tm pouca capacidade de
absoro e no respondem imediatamente ao momento do transplante, alm de
serem pouco funcionais, delicadas e propensas ao ataque de microorganismos.
66 EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

7.5. FITOSSANIDADE

A fragilidade da plntula in vitro aliada alta umidade relativa, na qual


aclimatizada, favorece o crescimento de fungos e bactrias. essencial, portanto,
que se faa uma preveno de doenas para o sucesso do transplante, durante e
aps a aclimatizao.

7.6. CONDIES PARA A ACLIMATIZAO

1) As plntulas devem apresentar aspecto sadio com sistema radicular e parte


area proporcionais, a fim de garantirem maior taxa de sobrevivncia;

2) A manuteno da alta umidade relativa, por alguns dias aps o transplante,


considerada ponto crtico para a sobrevivncia das plntulas. Um nmero significante
de laboratrios comerciais tem evitado o uso de um sistema automtico de irrigao
para este propsito, por tornar o meio excessivamente mido, favorecendo o
crescimento de fungos e algas. O sistema preferencial o "fogging" ou nebulizao,
que pode evitar muitos dos problemas encontrados com sistemas de irrigao.
Outros mtodos incluem o uso de umidificadores ou o uso de reas fechadas que
retm o vapor d'gua;
O uso de antitranspirantes, para reduzir a perda de gua durante a
aclimatizao, tem conseguido resultados controversos e deve ter seu uso limitado
para algumas espcies;

3) As plntulas in vitro requerem baixa luminosidade relativa e quando


submetidas ao aumento de luz sofrem um processo de destruio das molculas de
clorofila, tomando-se clorticas e queimadas. Para evitar esses problemas, as
plntulas podem ser removidas.gradualmente, para uma intensidade de luz sob a
qual manter seu crescimento;
O controle de fotoperodo tambm importante para prevenir dormncia ou
controlar o ciclo de reproduo vegetativa em algumas espcies e o seu ajuste deve
ser feito considerando-se a espcie, a estao do ano e os custos econmicos.

4) A temperatura do ar no qual as plntulas devem ser mantidas, durante a fase


de aclimatizao, deve estar na faixa entre 13 e 30C e determinada, primeiramente,
pela espcie da planta em questo;

5) O solo deve ter pH apropriado para cada espcie, ser tampo, frtil e
lOlflTlflt PQTQSQ Dat promover drenagem adequada e aerao. Algune
produtores aquecem o solo atravs de serpentinas de gua quente, para maior
atividade da raiz, promovendo o crescimento mais rpido da planta;
Aclimatizao 67

6) As plntulas desenvolvem-se melhor e crescem mais rapidamente em


recipientes mais espaosos. Existem vrios tipos de recipientes como bandejas
plsticas ou de isopor com clulas de diversos tamanhos, caixas de polietileno,
sacos, copos plsticos, etc;

7) Para a fertilizao muitos laboratrios adicionam, periodicamente, macro


e/ou micronutrientes no substrato em que as plntulas so transplantadas;

8) Para o controle fitossanitrio, necessrio que se tome alguns cuidados


essenciais. Normalmente, antes do transplantio, as plntulas so lavadas, de
preferncia, com gua morna para retirada total do meio de cultura e plantadas em
substrato esterilizado. Alguns autores recomendam a lavagem das plntulas com
soluo fungida, enquanto outros, no aconselham seu uso durante as primeiras
duas semanas depois do transplante, pois podem ser fitotxicos nesta fase. Outros
mtodos usados para garantir sanidade incluem o uso de desinfetantes no meio de
cultura, nos recipientes e bancadas ou mesmo coberturas novas de polietileno ou
tratadas para controle de patgenos. Mos limpas e instrumentos limpos e
desinfectados tambm so imprescindveis.
8
FOTOMORFOGNESE IN VITRO

Jos Raniere Ferreira de Santana 1

Renato Paiva 2

Breno Rgis Santos 3

Gustavo de Arajo Soares 4

Patrcia Duarte de Oliveira Paiva 5

8.1. INTRODUO

O estudos dos efeitos da luz na morfologia e desenvolvimento em plantas


regeneradas a partir de cultura de tecidos so bastante escassos na literatura. Sabe-
se que a luz pode induzir mltiplas respostas sendo isto importante sobretudo no
processo de micropropagao onde as plantas so crescidas em condio de luz
artificial.
Quando a luz do dia completamente substituda, o'espectro da fonte de luz
artificial torna-se particularmente importante e ainda, na maioria dos casos, isso
largamente ignorado em instalaes de micropropagao comercial.

8.2. LUZ E LMPADAS

Todas as fontes de luz artificial que esto atualmente disponveis diferem do


espectro da luz do dia, o que traz implicaes para a micropropagao. A energia da
luz absorvida pelas plantas encontra-se numa faixa de frequncia com comprimento
de onda entre 400 e 700 nm, aproximadamente.

1 Professor Assistente, Departamento de Cincias Biolgicas, Universidade Estadual de

2 Professor Adjunto, PhD, Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras


(UFLA)
3 Doutorando em Fisiologia Vegetal, Departamento de Biologia, UFLA
4 Mestrando em Fisiologia Vegetal, Departamento de Biologia, UFLA
5 Professora Adjunto, Dra., Departamento de Agricultura, UFLA
Fotomorfognese In Vitro 69

Para produzir uma resposta, a luz deve primeiramente ser absorvida por um
pigmento fotorreceptor. Nos vegetais, os dois pigmentos mais importantes so o
fitocromo e o criptocromo. O criptocromo absorve luz na faixa do azul (400-500 nm) e
prximo da regio do ultravioleta (320-400 nm) do espectro. O fitocromo, em
contraste, absorve principalmente nas regies do vermelho (600-700 nm) e
vermelho-distante (700-760 nm).
A maioria das instalaes de micropropagao utilizam lmpadas fluorescentes
tubulares (brancas) como nica fonte de luz. Entretanto, existem diferentes tipos
destas lmpadas no mercado, o que pode influenciar profundamente o processo de
fotomorfognese.
A baixa quantidade de comprimento de onda na faixa do azul que certas
lmpadas fluorescentes fornecem pode afetar algumas respostas morfognicas
Toda lmpada fluorescente emite alguma radiao na faixa do ultravioleta sem efeito,
no entanto morfogentico.

8.3. RESPOSTAS DA PLANTA LUZ

Os vegetais so inteiramente dependentes da fotossntese e consequentemente


da luz para sobreviverem. A fotossntese requer a absoro de considerveis
quantidades de energia luminosa para atingir um crescimento satisfatrio. Em
contraste, o sistema fotomorfogentico requer pequena quantidade de luz.
A transferncia de plantas obtidas pelo cultivo in vitro para o solo um estgio
em que muitas perdas ocorrem durante a micropropagao. Razo para isso o
pequeno desenvolvimento das plantas in vitro e a baixa atividade fotossinttica.

8.4. FOTOMORFOGNESE E CULTURA DE TECIDOS

As trs qualidades da luz que mais claramente influenciam o crescimento e


morfogenese in vitro so: o comprimento, a intensidade e a durao da exposio
luz ou o fotoperodo. Cada um desses atributos tem efeito sobre a fotomorfognese e
a fotossntese. A influncia pode ser direta, atravs de uma ao sobre o tecido j
estabelecido in vitro, ou indireto, consequente da influncia da luz nas plantas
matrizes. No ltimo caso, o crescimento ou morfogenese observado in vitro
modificado pelos tratamentos de luz aplicados na planta matriz antes dos explantes
serem removidos. Os efeitos da luz sobre a fotossntese no so de grande
importncia em cultura de tecidos, a menos que o crescimento autotrfico seja
requerido.
9 Sf9Ff)nt9 /1 Vitm 03 tecidos Vegetais organizados gereimentc
pela luz, que frequentemente requerida para se obter timos resultados. Por outro
lado, a diviso celular inicial dos explantes e o crescimento de tecido de calos so,
s vezes, impedidos pela luz.
70 EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

8.4.1. Comprimento de onda

8.4.1.1. Crescimento, regenerao e morfogenese de calos.


Calos de algumas espcies podem ser induzidos e crescidos no escuro,
enquanto que tecidos de outras plantas podem crescer melhor em luz contnua ou
em um fotoperodo irregular. Calos induzidos no escuro so frequentemente
transferidos para a luz quando a morfogenese indireta desejada. A regenerao a
partir de calos influenciada pela luz, mas a condio tima varia com a espcie.

8.4.1.2. Induo de razes adventcias


A induo de razes adventcias tambm um estgio crtico na microprogao
influenciado pela luz. Dependendo da espcie, o enraizamento pode ser induzido na
ausncia de luz, ou mesmo sob baixo nvel de irradincia, principalmente luz
vermelha.

8.4.1.3. Inibio do crescimento de calos


A inibio do crescimento de calos pode ocorrer quando estes so expostos
luz na faixa do azul. Possveis causas desta inibio so devido ao aumento na
produo de compostos fenlicos, que interferem na atividade de regulao do
crescimento; destruio da enzima citocromo oxidase envolvida em processos
respiratrios, inibio da sntese de citocinina natural, ou produo de acido
abscsico cujo efeito mostra-se antagonstico para citocinina.

8.4.1.4. Formao de brotaes


Em algumas espcies, reduzida exposio luz na faixa do vermelho (655 nm)
pode induzir a formao de brotaes a partir de gemas laterais.

8.4.1.5. Desenvolvimento dos cloroplastos


Os cloroplastos originados em cultura de tecidos tendem a serem mais variveis
em estrutura do que aqueles presentes em tecidos foliares da planta matriz. Podem
apresentar desenvolvimento inadequado e tilacides com formas anormais.

8.4.2. Intensidade de luz (irradincia)


Alm de apresentarem espectro diferente, as culturas in vitro so tipicamente
desenvolvidas em intensidade luminosa 10 vezes menor que a luz do dia.
Existem vrias razes para explicar porque baixa intensidade luminosa usada:
a) a proviso de altos nveis de iluminao artificial onerosa e gera calor no
desejado;
b) os frascos de culturas so selados, o que contribui para aumentar o calor no
inferior do rasco em aita'intensidadeluminosa devido ao "efeito estufa";
Fotomorfognese In Vitro 71

c) a tecnologia da cultura de tecidos de plantas envolve o uso de tecidos no


autotrficos suplementado com um carboidrato.

8.4.2.1.Crescimento e proliferao de brotos


O nvel ideal de iluminao para os estgios I e II da cultura de tecidos deve ser
entre 7-120 umol m' s' . Entretanto, o cultivo inicial sob baixa irradincia pode ajudar
2 1

a prevenir o escurecimento nas culturas de espcies sensveis a este processo.


Muitos gneros (ex. Aster, Chrysanthemum e Caryphyllaceae, dentre outros)
requerem irradincia relativamente alta para a multiplicao das brotaes, e cultivo
em baixas irradincias pode causar brotaes vitrificadas.
Uma intensidade luminosa de 40-150 Ltmol m" .s" sugerida no estgio III para
2 1

atingir taxas mximas de sobrevivncia quando se for transferir as plntulas para um


ambiente externo.

8.4.3. Comprimento do dia (fotoperodo)


Os efeitos fotoperidicos nas plantas so energizados por luz de relativa baixa
irradincia e so geralmente associados com o fitocromo. O comprimento do dia
pode influenciar o crescimento natural dos nveis de substncias dentro do tecido da
planta. Dias longos tm o mesmo efeito de exposies luz vermelha; longas noites
(dias curtos) promovem respostas do fitocromo ao vermelho-extremo. Geralmente
plantas que crescem em fotoperodos longos mostram maior contedo endgeno de
auxina do que em dias curtos.
PROBLEMAS NO CULTIVO IN VITRO

Breno Rgis Santos 1

Renato Paiva 2

Patrcia Duarte de Oliveira Paiva 3

Jos Raniere Ferreira de Santana 4 _

9.1. INTRODUO

No processo de cultivo in vitro alguns problemas podem ocorrer tornando


limitante a propagao. Dentre estes problemas pode-se citar a oxidao, o declnio
no vigor e a vitrificao.

9.2. OXIDAO

Os explantes ao serem inoculados no meio de cultura podem apresentar


escurecimento e liberar exudatos que tornam o meio de cultivo escuro. Este tipo de
escurecimento consequncia dos ferimentos ocasionados no processo de extrao
dos explantes. Nem todas as substncias liberadas no meio causam inibio no
desenvolvimento do explante, mas frequentemente esta inibio de crescimento
ocorre, podendo levar morte dos tecidos.
O processo de oxidao como sendo a mudana de colorao no explante e
no meio de cultura causado por compostos fenlicos liberados pelo prprio explante.
As substncias encontradas em meio de cultura no cultivo de algumas espcies
lenhosas foram identificadas como sendo taninos, flavonides e fenis. Ferimentos
normalmente provocam oxidao, sendo que discos foliares apresentam maior
oxidao do que segmentos nodais por sofrerem ferimentos em maior rea. O efeito

1 Doutorando em Fisiologia Vegetal, Departamento de Biologia, Universidade Federal de


Lavras (UFLA)
2 Professor Adjunto, PhD, Departamento de Biologia, UFLA
3 Professora Adjunto, Dra, Departamento de Agricultura, UFLA
4 Professor Assistente, Departamento de Cincia Biolgicas, Universidade Estadual de Feira
de Santana (UEF5).
Problemas no Cultivo In Vitro 73

inibitrio no desenvolvimento dos explantes atribudo presena de taninos e


fenis, sendo a autotoxidade dos exudatos varivel com as cultivares, espcies e
gneros.
A ocorrncia de oxidao pode ser geneticamente correlacionada, ou seja, em
gneros cujas plantas apresentam maiores teores de tanino ou hidroxifenis a
oxidao ocorre de forma mais intensa como o exemplo de Quercus,
Rhododendron, Sorghum e das conferas. Numa mesma espcie, diferentes
cultivares podem apresentar variaes de tolerncia oxidao. Produo de
pigmentos de diferentes coloraes podem ser vermelho, marron claro e
avermelhado, azul e lils. Variaes de intensidade na ocorrncia dos pigmentos e
na formao de necrose do explante tambm so observadas.
Pesquisas indicam que compostos como a cistena, o carvo ativado, PVP,
cido ascrbico e cido ctrico tm sido adicionados ao meio de cultura com o
objetivo de controlar o processo de oxidao. A maioria destes compostos age
adsorvendo os exudatos liberados pelos explantes os quais causam a oxidao. Uma
tcnica eficiente a lavagem do explante com antioxidantes como cido ctrico e
cido ascrbico antes da inoculao e a adio de carvo ativado ao meio.
O carvo ativado tem sido adicionado ao meio de cultura em concentraes que
variam de 0,3 a 2,0%, e a sua ao consiste em adsorver os fenis presentes no
meio de cultura, alm de atuar induzindo os processos de morfogenese e rizognese.
Em alguns casos, a adio de carvo ativado no eficiente para controlar a
oxidao, mas estabiliza o processo, evitando-se o acmulo de fenis.
A poliamina PVP possui tambm a capacidade de adsorver os compostos
fenlicos evitando que estes oxidem e polimerizem. Alm de estimular a
embriognese, o PVP pode tambm reagir com fenis oxidados e prevenir a
ocorrncia de oxidao por enzimas fenolases. Esta substncia geralmente
adicionada ao meio de cultura em concentraes que variam de 0,01- 4,0 %. A
eficincia no uso de PVP e/ou carvo ativado, no entanto, varia de acordo com a
espcie.
Modificaes na composio dos meios de cultura tais como variaes na
concentrao do meio MS, sacarose, excluso ou diminuio em concentrao de
ferro e cobre, uso de reguladores de crescimento (variaes em tipo e
concentraes) alm da adio de antioxidantes tambm podem ser eficientes para
controle da oxidao.
O cido ctrico atua como agente quelante de metais mas no muito eficiente
em retirar ferro da soluo. J o cido ascrbico normalmente acrescido ao meio
de cultura, possuindo a propriedade de estimular a atividade metablica dos tecidos.
, ^?yyidade destes cidos s tem sido observada, quando
A adicionado*,ao m&ic &m
concentraes entre 10 e 140 mgL" , podendo reduzir a oxidao em 50%.
1
74 EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

Em alguns casos, os explantes podem apresentar oxidao apenas no incio da


cultura, a qual diminuda medida que ocorre desenvolvimento. A idade dos
explantes tambm influencia na ocorrncia de oxidao; de modo geral, explantes
mais jovens so menos propcios oxidao do que explantes mais maduros.
A preveno da ocorrncia de oxidao pode ser feita minimizando os danos
causados ao explante, removendo os compostos fenlicos produzidos ou atravs da
alterao da composio do meio de cultura e a concentrao ou tipo de reguladores
de crescimento empregados. A remoo dos compostos pode ser feita ainda pela
utilizao de meios lquidos (facilitam a difuso dos compostos), de diferentes
agentes de solidificao, alm da adio ao meio de substncias de adsoro.
Para a solidificao do meio de cultura de modo geral utiliza-se o gar, mas
existem indicaes de que este tambm possa causar oxidao. O gar o agente
solidificante mais utilizado em cultura de tecidos. constitudo de acares,
galactose e uma frao neutra, a agarose, que possui forte capacidade de geleificar.
O gar possui graus variveis de pureza, o que influencia na sua capacidade de
solidificar e provocar reaes com outros agentes no meio de cultura. Contm grande
quantidade de sulfatos, os quais so bastante reativos e tambm j se identificou a
presena de cobre, elemento capaz de acelerar o processo de oxidao. Alguns
tipos de gar - dependendo do fabricante, alm do enxofre, podem ainda conter
substncias fenlicas. A utilizao de outros produtos mais puros como agarose e
phytagel tem sido bastante eficiente para permitir a ocorrncia de oxidao.

9.3. DECLNIO NO VIGOR

m algumas situaes as brotaes, depois de um certo tempo de cultivo,


diminuem ou cessam o crescimento, sendo este processo denominado de declnio no
vigor. O declino est associado com a produo de substncias fenlicas ou a outros
fatores como vitrescncia, habituao ou maturidade dos explante.
A perda de vigor pode ser tambm afetado por erros no balano nutricional do
meio de cultura, utilizao de fitorreguladores inadequados ou falta de repicagem do
material vegetal.
A ocorrncia de clorose, absciso foliar e reduo do processo de crescimento
so sintomas tambm relacionados perda de vigor.

9.3.1. Declnio na taxa de proliferao

A taxa de proliferao de brotos axilares bastante varivel com as espcies


ff,', 5, 5 S StmpTS 99mtni, Mgumas vezes a iaxa cte mu>HpSio a*
m m n a

aumenta at um mximo e depois decresce nas sucessivas subculturas.


O declnio na taxa de formao de brotos tambm ocorre frequentemente em
culturas que no so repicadas.
Problemas no Cultivo In Vitro 75

9.3.2. Habituao
No cultivo in vitro de algumas plantas tem sido observado a habituao pela
citocinina, que consiste em uma excessiva multiplicao de brotos em meio livre de
citocinina, mas os brotos produzidos so pequenos, e do origem a poucas radculas
adventcias dificultando o estabelecimento ex vitro.

9.4. NECROSES

Necrose pode ser descrita como sendo a morte de uma parte de um organismo
vivo. Isto ocorre com explantes colocados in vitro, podendo ter uma perda parcial ou
a de toda a cultura.

9.4.1. Necrose apical em brotaes

9.4.1.1. Causas

9.4.1.1.1. Deficincia de clcio


Necrose apical ocorre em culturas de brotos, principalmente os de plantas
lenhosas. Embora exista outras causas, a mais comum a necrose ocasionada pela
deficincia de clcio no pice dos brotos cultivados, fator este atribudo a absoro
inadequada de nutrientes do meio, ou falta de translocao. Em cultivo in vitro, a alta
umidade limita a transpirao e consequentemente a translocao no xilema de ons
e compostos, assim como o clcio pode no alcanar os tecidos da regio apical.

9.4.1.1.2. Substncias de crescimento


Alguns fitorreguladores podem induzir a necrose apical, principalmente em
subculturas.

9.4.1.1.3. Intervalo de subculturas


O amarelecimento e necrose foliar pode ser observado quando no so feitas
subculturas com a frequncia necessria. Quando estes sintomas so observados, o
intervalo entre as subculturas deve ser reduzido; como prtica pode manter um alta
taxa de proliferao das brotaes. O tempo entre uma subcultura e a outra deve ser
ajustado de acordo com a espcie que est sendo cultivada.

9.4.1.1.4. Gases poluentes


O gs ou lcool queimado opera com um limitado suplemento de ar, emitindo
grandes quantidades de gases como o metano, butano, entano, propano, etileno,
metanol e etanol. Quando se utiliza chama para flambar instrumentos e as bordas
dos vasilhames utilizados para o cultivo, o acmulo de gases pode ser alto. Esses
76 EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

gases provocam a absciso foliar, podendo causar a paralisao da cultura, ou ainda


ocasionar a morte das brotaes.

9.4.2. Como evitar a necrose


Permitir que o clcio fique mais disponvel uma prtica que pode evitar o
aparecimento de necroses. Pode ser feito ainda incremento na concentrao de
clcio no meio de cultivo; ou alterao no ambiente fsico no qual a cultura est
crescendo, permitindo assim um aumento na transpirao. O incremento de clcio
no meio pode ser feito adicionando-se nitrato de clcio.
Outra prtica que pode auxiliar a reduo dos gases txicos. Neste caso
deve-se evitar as chamas amarelas quando for flambar os instrumentos e os frascos
na Gamara de fluxo laminar, o idear regular a chama para que fique com a
colorao azul.
A utilizao de algodo para o tamponamento dos tubos de ensaio onde se est
cultivando os brotos permite uma troca gasosa mais efetiva com o meio externo,
reduzindo a concentrao dos gases txicos no recipiente de cultivo. Tambm pode
ser utilizado outras formas tamponamento que permitam esta troca de gases.

9.5. VITRIFICAO (HIPERHIDRICIDADE)

A vitrificao ou hiperhidricidade definida como o processo no qual os


explantes apresentam anatomia, morfologia e fisiologia atpicas em comparao com
outras plantas cultivadas in vitro. As alteraes na estrutura das plantas cultivadas in
vitro so sintomas bastante prematuros de uma complexa sndrome de
caractersticas anormais.
Em algumas condies de cultivo, pode-se detectar tecidos e rgos altamente
anormais aps um certo perodo, os quais apresentam propagao reduzida quando
transferidos para outro meio de cultivo, ou quando transferidos para o meio externo.
Isto pode levar a perda de 60% da cultura de brotos ou plntulas em trabalhos de
micropropagao comercial.
A "sndrome do broto de vidro" como tambm chamado pode ocorrer em
vrios nveis de severidade. Inicialmente, apenas uma parte do broto, ou uma ou
duas folhas podemser afetadas. As brotaes de culturas que demonstram sintomas
leves frequentemente crescem mais rapidamente do que o normal e pode mostrar
altas taxas de brotaes axilares. Esta vantagem perdida em condies mais
severas de vitrificao.
1191 !J} &tW, Bf9t9 Vitrificados tem interndios curtes o o
m ;^ F

aparece fasciculado. Os brotos afetados frequentemente apresentam-se inchados e


com uma colorao verde claro e suas folhas so translcidas, aquosa e com
aparncia de vidro; as folhas se apresentam tambm alongadas, trgidas e frgeis,
Problemas no Cultivo In Vitro 77

com uma colorao verde azulada. Algumas vezes a folhas de brotos afetados
apresentam-se grossas e enroladas, e podendo aparecer regies de colorao verde
escuro, devido a superposio de clulas. Brotos altamente anormais produzem
razes adventcias ou alguma fraca radcula.

9.5.1. Ocorrncia
A vitrificao pode ocorrer em culturas de brotos e ns, em regenerao de
brotos a partir de calos, em todos as espcies. mais frequente em massa de calos
de plantas lenhoas, mas tambm ocorre em plantas herbceas. Por exemplo, plantas
da famlia Caryophyllaceae, so particularmente vulnerveis.
O grau de susceptibilidade e o aparecimento dos sintomas no est apenas
vinculado espcie das plantas, mas tambm depende da natureza da cultura.
Pode-se encontrar vrios graus de vitrificao em um mesmo meio de cultivo ou em
meios diferentes para uma mesma espcie.
A vitrificao pode ser consequncia da difuso passiva da gua dentro dos
tecidos ou um fenmeno ativo relacionado a um distrbio no processo metablico da
planta.

9.5.2. Fatores que influenciam a vitrificao


Os sintomas da vitrificao ocorrem com menas frequncia em culturas que se
desenvolvem mais rapidamente. Quando se busca melhores condies de cultivo
para cada espcie, diminui-se expressivamente o risco de ocorrer a vitrificao; ao
se utilizar condies de cultivo que limitam o crescimento, a hiperhidricidade ocorre
com mais facilidade. Os brotos apresentam sintomas de vitrificao mais frequentes
quando se utiliza concentraes de BAP acima de 2,0 mg.L" , suplementado com
1

sacarose e baixas concentraes de sorbitol.

A vitrificao tende a ser promovida por altas temperaturas, baixa irradincia


luminosa ou em culturas mantidas no escuro.
Brotos que se desenvolvem em condies contnuas de alta umidade relativa
apresentam maior susceptibilidade vitrificao, pois este provavelmente o
ambiente mais favorvel para ocasion-la. Culturas mantidas em meio lquido,
incluindo aquelas realizadas com suportes (ponte de papel) geralmente desenvolvem
a vitrificao mais facilmente do que aquelas que so cultivadas em meio slido.
Em algumas plantas, brotaes normais cultivadas em meio slido ficam
totalmente vitrificadas quando so transferidas para um meio de cultivo lquido.
A condio de vitrificao geralmente ocorre quando se utiliza meio MS com a
concentrao mxima de seus sais; entretanto se reduzir as concentraes dos
macronutrientes no se observa a ocorrncia da vitrificao. Outros fatores do meio
como concentrao de sacarose, pH e potencial hdrico tambm influenciam a
78 EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

ocorrncia de vitrificao. Condies de cultivo como por exemplo luminosidade e


trocas gasosas constituem outros fatores de influncia.
Em vrias culturas a induo da vitrificao pode ser tambm influenciada pelo
tipo e concentrao dos reguladores de crescimento utilizados. As citocininas so
particularmente responsveis pela induo da vitrificao em brotos quando estes
esto sendo cultivados em meios que possuam deficincia em sua composio. A
citocinina BAP tem sido observada como indutor da vitrificao quando utilizada em
altas concentraes. Isto pode ser evitado transferindo a cultura para um meio que
no possua BAP. As auxinas podem s vezes induzir a vitrificao entretanto, a
adio de auxinas no meio contendo citocininas, frequentemente aumenta a w

proporo de vitrificao. O cido giberlico pode ser utilizado no controle deste


problema,

9.5.3. Preveno da vitrificao


Existem vrios fatores que podem auxiliar na preveno da vitrificao, dentre
estes pode-se destacar:

1) Reduo da umidade relativa no ambiente in vitro.


2) Aumento da concentrao de agar no meio semi-solido.
3) Controle da concentrao de sacarose.
4) Utilizao da tcnica de duas fases (meio lquido e slido) no meio de
cultura.
5) Em meio lquido, utilizar suportes porosos para sustentao dos explantes
(ponte de papel).
6) Em meio lquido pode adotar a tcnica de submerso temporria, onde o
material vegetal periodicamente mergulhado no meio de cultura.
7) Reduo da concentrao de ons de amnio no meio de cultivo.
8) Ajuste correto do pH do meio de cultivo.
9) Adio ao meio de cultivo um ou mais cidos orgnicos como o citrato,
succinato ou malato para auxiliar a assimilao do N H . 4+

10) Reduo da concentrao de micronutriente no meio de cultivo.


11) Substituio da sacarose por frutose ou galactose.
12) Transferncia da cultura para um meio de cultivo ausente de
fitorreguladores. Isto possibilita a formao de novos brotos sem os
sintomas da vitrificao.
13} DlFRRUIG OUW citocininas ou restrio do uso do B A P cm copooir^,
substituindo-o por outros compostos com atividade similar. Pode-se tambm
aumentar o nmero de subcultivos.
Problemas no Cultivo In Vrtro 79

14) Utilizao de um balano mais adequado entre auxina / citocinina para a


espcie estudada.
15) Utilizao de alta de luminosidade.
10
PRINCIPAIS APLICAES DA
CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS

Jos Raniere Ferreira de Santana1

Renato Paiva2

Patrcia Duartt
Luciano Vilela Paiva*

10.1. INTRODUO

As tcnicas de cultura de tecidos tm sido empregadas de diferentes formas no


desenvolvimento de novas cultivares de plantas. A cultura de tecidos pode oferecer
novas alternativas aos programas de melhoramento em suas diferentes fases e,
muitas vezes, oferecem solues nicas.
_
10.2. APLICAES DA CULTURA DE TECIDOS NA PROPAGAO ASSEXUADA

a) Limpeza de material: As espcies que so propagadas assexuadamente


ficam expostas a problemas fitossanitrios, especialmente viroses, as quais, por
serem de natureza sistmica, podem permanecer por tempo indeterminado nas
plantas. A cultura de meristema tem-se mostrado bastante eficiente na obteno de
plantas livres de vrus, considerando-se que a distribuio das partculas virticas na
planta segue um gradiente decrescente em direo ao pice. Outra vantagem do uso
de meristema a conexo vascular incipiente desta regio com o restante dos
tecidos. A associao da cultura de meristema com a termoterapia proporciona uma
melhor eficincia no controle de certas viroses. Posteriormente, a limpeza das

1 Professor^Assistente^pepartamento de Cincias Biolgicas, Universidade Estadual de


Feira de Santana (UEFS)
2 Professor Adjunto, PhD., Departamento de Biologia, Universidade Federal de Lavras
(UFLA)
3 Professor Adjunto, Dra., Departamento de Agricultura, UFLA
4 Professor Adjunto, Dr., Departamento de Qumica, UFLA. ^
Principais Aplicaes da Cultura de Tecidos Vegetais 81

plantas obtidas dever ser comprovada por indexao, seja ela por plantas
indicadoras, tcnicas imunolgicas ou marcadores moleculares.
b) Recuperao do vigor e da produtividade: Fatores biolgicos (doenas e
pragas) podem diminuir a qualidade do material vegetal e, consequentemente, sua
produtividade. Um declnio gradual no vigor e na produtividade contribui para o
desenvolvimento de doenas, que podem expressar sintomas ou permanecer
latentes.
c) Multiplicao de cultivares: Uma das principais vantagens do uso da
propagao in vitro a alta taxa de multiplicao que pode ser obtida. Neste caso,
um conjunto de indivduos geneticamente idnticos so produzidos partir de um
nico explante. Este processo de propagao de um indivduo selecionado
conhecido como clonagem. Alm do mais, pode ainda constituir uma fonte de
material juvenil para o caso de variedades ou linhas promissoras que se encontram
atacadas por doenas sistmicas.
d) Germinao de sementes in vitro: Em espcies com germinao lenta ou
desuniforme, a germinao in vitro de sementes uma importante alternativa para
superar a fase inicial do desenvolvimento vegetal.

10.3. APLICAES EM FITOPATOLOGIA

As tcnicas de cultura de tecidos tm oferecido contribuies importantes na


rea da fitopatologia. Sistemas de co-cultura de patgenos com os tecidos de plantas
hospedeiras permitem o estudo das relaes entre os dois organismos em condies
controladas, levando descoberta de mecanismos de patogenicidade e de
resistncia a nvel celular. Como mencionado anteriormente, a recuperao de
plantas livres de vrus e de outros agentes causadores de doenas uma outra
grande contribuio da cultura de tecidos fitopatologia. As tcnicas de cultura de
tecidos tambm tm sido utilizadas com sucesso na manuteno de nematides e de
outros parasitas obrigatrios, seleo de plantas resistentes a toxinas e no estudo do
efeito mutagnico de toxinas.

10.4. APLICAES NO MELHORAMENTO GENTICO

Coles de plantas que asseguram variabilidade gentica so parte essencial


de qualquer programa de melhoramento gentico. A necessidade de preservao
dos recursos genticos existentes assume uma importncia enorme face a eroso
gentica que se verifica em muitas espcies.
s pcaos da cur de tecidos em programas de melhoramento gentico
podem ser:
82 EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

aj Aumento da variabilidade gentica para fins de seleo: Pesquisadores


podem explorar a variabilidade gentica mediante o uso de variantes somaclonais,
que so plantas com caractersticas morfolgicas distintas da planta matriz obtida
atravs do cultivo in vitro.
b) Introgresso de genes de interesse para espcies-alvos: A quebra de
barreiras de incompatibilidade gentica pode ser obtida mediante a polinizao in
vitro, cultura de embries e fuso de protoplastos.
A cultura de embries tem sido utilizada visando estender as possibilidades de
hibridao interespecficas e evitar o abortamento dos embries. Pode ser utilizada
tambm em programas de melhoramento onde o nmero de sementes resultantes
dos cruzamentos baixo, onde no ocorre formao de endosperma e ou
desenvolvimento dos cotildones ou quando as sementes perdem rapidamente a
viabilidade durante o armazenamento. A cultura de embries tambm proporciona a
obteno de plntulas sadias in vitro, que podem ser propagadas rapidamente e
avaliadas antes dos ensaios de campo.
A cultura de protoplastos (clulas sem a parede celular) constitui um sistema
apropriado para a realizao de estudos fisiolgicos e bioqumicos e para diferentes
manipulaes genticas. A fuso de protoplastos (hibridao somtica) envolve a
fuso de duas clulas somticas fundindo o citoplasma de ambos os pais, diferindo,
portanto, dos cruzamentos sexuais, onde apenas a planta-me contribui com o
citoplasma.
c) Acelerao de programas de melhoramento: Atravs da germinao de
sementes in vitro das plantas melhoradas, clonagem de gentipos para testes de
capacidade de combinao, cultura de anteras e micrsporos para a obteno de
haploides e limpeza clonal.
d) Banco de germoplasma in vitro: As colees de germoplasma so,
normalmente, mantidas em campo, o que ocasiona altos custos de manuteno, alm
do material ficar exposto a pragas e doenas. A conservao de material vegetal in
vitro, seja por criopreservao (manuteno em baixas temperaturas) ou sob
condies de crescimento lento oferecem como vantagens o pouco espao ocupado,
a possibilidade de contaminao por doenas e pragas praticamente nula e a taxa
de propagao elevada. Com isto, reduz-se os custos de manuteno de colees
de germoplasma e -evita-se a transmisso de patgenos sistmicos de uma gerao
outra. Alm disto, a alta organizao do explante permite que as plantas
assegurem um grau considervel de estabilidade gentica, mantendo suas
caractersticas varietais.
e) Obteno de plantas transgnicas: Os mtodos de transformao
utilizados para gerar plantas geneticamente modificadas exigem que estas plantas
passem pelo cultivo in vitro. No processo de transformao via bactria
Agrobacterium tumefaciens ou Agrobacterium rhyzogenesis, tecidos alvos de
transformao so mantidos na presena de bactrias contendo genes de interesse.
Principais Aplicaes da Cultura de Tecidos Vegetais 83

durante o cultivo in vitro, conhecido como co-cultivo, que a bactria transfere o


gene de interesse para o tecido alvo. Posteriormente, atravs do uso de meios de
cultura seletivos faz-se a identificao das clulas eficientemente transformadas. O
cultivo seletivo tambm utilizado para identificar as clulas que forma
transformadas mediante o processo transformao por biobalstica, que se baseia no
bombardeamento do tecido alvo por partculas de ouro ou tungstnio contendo
aderidos a essas, plasmdeos com os genes de interesse.
11
ALGUNS CONCEITOS EM CULTURA
DE TECIDOS

Breno Rgis Santos 1 w


Patrcia Duarte de Oliveira Paiva 2

Renato Paiva 3

Luciano Vilela Paiva 4

ABA: (cido abscsico): Hormnio vegetal pertencente classe de


sesquiterpenos, ou seja, constitudo de trs unidades de isopreno. Est envolvido
no fechamento de estmatos, tolerncia dessecao e manuteno da dormncia
de sementes.
cido Abscsico: fitohormnio inibidor de germinao. Tambm atua no
mecanismo de fechamento do estmatos.
Aclimatao: Ajuste de uma planta a um novo clima ou situao como
, !SJ9 de um processo essencialmente natural.
r u

Aclimatizao: Adaptao climtica de um organismo, especialmente uma


planta, o qual transferido para um novo ambiente, sendo todo esse processo
realizado artificialmente.
Adventcio: rgo vegetal formado em posio diferente daquela onde se
origina no curso normal de desenvolvimento. Por exemplo, raiz desenvolvida em um
segmento de caule ou diferenciao de uma gema a partir da raiz. _
gar: Polissacardeo extrado de algas marinhas. utilizado como agente
gelificante, principalmente, em culturas bacterianas, cultura de tecidos de plantas e
gis de eletroforese.
Agente desinfestante: Substncia capaz de eliminar ou inibir o crescimento de
um microrganismo na superfcie de explante.
[O
1 Doutorando em Fisiologia Vegetal, Departamento de Biologia, Universidade Federal de
Lavras (UFLA)
2 Professora Adjunto, Dra., Departamento de Agricultura, UFLA
3 Professor Adjunto, PhD., Departamento de Biologia, UFLA
4 Professor Adjunto, Dr., Departamento de Qumica, UFLA.
Alguns Conceitos em Cultura de Tecidos 85

gua deionizada: gua purificada de baixa condutividade, cujos ctions e


nions foram removidos, atravs da sua passagem por uma coluna de resina de
troca inica.
gua destilada: gua purificada pelo processo de destilao. A gua
aquecida e seu vapor condensado em uma coluna de destilao.
AIA: (cido indol-3-actico): Hormnio vegetal de ocorrncia natural
pertencentes a classe das auxinas. Induz o alongamento celular. Primeira auxina
indentificada.
AIB: (cido indol-3-butrico): Hormnio vegetal de ocorrncia natural
pertencentes a classe das auxinas. Induz o alongamento celular. Possui atividade
enraizante.
Ambiente: Conjunto de condies externas que podem afetar o crescimento, o
desenvolvimento e a reproduo de um organismo. Fatores fsicos e biolgicos
externos que influenciam a expresso dos genes de um indivduo.
ANA: (cido naftalenoactico): Hormnio pertencentes a classe das auxinas
que induz o alongamento celular. mais efetivo que o AIB e AIA.
Antibitico: Composto orgnico, geralmente produzido por microrganismos,
que mata ou inibe seletivamente o crescimento de outros microrganismos. Dentre os
antibiticos, tm-se as penicilinas, as cefalosporinas, os aminoglicosdeos e as
tetraciclinas.
pice caulinar: Segmento do pice do caule, composto pelo meristema apical
(0,05 - 0,1 mm) juntamente com os primrdios foliares e folhas em desenvolvimento.
A cultura de pices caulinares usada para eliminao de patgenos. Nesse caso,
os pices no devem exceder ao tamanho de 0,3 mm. Explantes de maior tamanho
so apropriados para propagao rpida.
Assepsia: Tcnica utilizadas para prevenir a introduo de fungos, bactrias,
vrus, micoplasma, ou outros microrganismos em cultura de clulas, tecidos ou
rgos. Esse procedimento pode no excluir a introduo de molculas infecciosas.
Autoclave: Equipamento utilizado, em geral, para esterilizao de vidrarias e
meios de cultura, empregando vapor de gua, alta presso (1,05 X 105 Kpa) e alta
temperatura (121C), por um determinado perodo de tempo.
Auxina: fitohormnio causador de expanso celular.
BAP: (6-benzilaminopurina): Hormnio pertencente a classe das citocininas
que promovem a diviso e a diferenciao celular.
Biorreator: Recipiente onde ocorre uma reao biolgica, em geral,
fermentao ou biotransformao.
Biotecnologia: Conjunto de tcnicas que utiliza seres vivos, ou parte desses,
para produzir ou modificar produtos, aumentar a produtividade de plantas e animais
de maneira eficiente ou, ainda, produzir microrganismos para uso especficos. A
86 EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

biotecnologia inclui as tecnologias de engenharia gentica, DNA recombinante,


manipulao de clulas e embries. Dentre os produtos biotecnolgicos destacam-se
a produo de insulina e de interferon a partir de genes humanos clonados e
expressos em bactrias ou outros organismos heterlogos e plantas transgnicas
resistentes a doenas.
Calos: Grupo ou massa de clulas com crescimento desordenado, as quais
podem apresentar certo grau de diferenciao.
Callus: forma em latim da palavra calos.
Cinetina: regulador de crescimento com propriedades citocininas.
Citocinina: fitohormnio associado a induo de diviso celular.
Clone: Populao de clulas ou organismos geneticamente idnticos,
produzidos assexualmente. Descendncia que, por propagao assexuai, se originou
de uma nica planta. Populao de clulas que possui um vetor de clonagem com o
mesmo inserto. Fragmento de DNA isolado do gene de um organismo ou de um
cDNA de um vetor de clonagem.
Crescimento: Aumento de massa seca ou protoplasma de um organismo,
associado ao desenvolvimento. Em muitas situaes, envolve diviso celular,
expanso, diferenciao e morfogenese.
Criopreservao: Conservao de materiais em baixas temperaturas, prximas
temperatura do nitrognio lquido (-196C).
Cultura de clulas: Cultivo em meio nutritivo de clulas isoladas ou de
pequenos grupos de clulas similares, em condies asspticas e controladas de
luminosidade e temperatura.
Cultura de embries: Refere-se aos processos de crescimento e
desenvolvimento do embrio zigtico in vitro, independentemente da idade, tamanho
e estdio de desenvolvimento em que o embrio excisado colocado em meio de
cultura.
Cultura de tecidos: Tcnicas de cultura de tecidos vegetais em meio nutritivo,
em condies controladas de luminosidade e temperatura.
Cultura Primria: Cultura estabelecida com um explante originado de uma
planta matriz que se encontra ex vitro.
Desdiferenciao: Processo no qual uma clula diferenciada perde suas
caractersticas especficas, reassumindo atividades meristemticas. Por exemplo, no
proCQSSO de organognese indireta a passagem para a fase de calos um processo
de desdiferenciao, no qual as clulas perdem sua identidade original e assumem
caractersticas mais simples.
Desenvolvimento: Crescimento integrado de um organismo pluricelular ou
parte dele, associado a mudanas na forma e na complexidade, por padres
sucessivos de diferenciao e morfogenese.
Alguns Conceitos em Cultura de Tecidos 87

Desinfestao: Eliminao de microrganismos superficiais presentes em um


explante com o uso de substncias como o hipoclorito de sdio ou clcio, lcool,
cloreto de mercrio, etc.
Diferenciao: Mudanas fisiolgicas, morfolgicas, bioqumicas e anatmicas
que ocorrem em um clula, tecido, rgo ou planta, durante o desenvolvimento do
estado meristemtico ou juvenil para o adulto. As clulas do embrio e do meristema
apical servem de exemplo do estado indiferenciado.
2ip (isopenteniladenina): Hormnio vegetal pertencente a classe das
citocininas, de ocorrncia natural. Foi descoberta na bactria Corynebacterium
fascians. A alta atividade fisiolgica est relacionada diviso e diferenciao
celular.
2,4-D (cido 2,4 diclofenoxiactico): Auxina sinttica altamente ativa que
promove a organognese, sendo mais frequentemente empregada para iniciar a
cultura de calos. Apresenta propriedade herbicida.
Dormncia: Condio em que o crescimento suspenso ou reduzido por
controle endgeno, mesmo quando as condies ambientais so favorveis. Ocorre
em rgos de reserva (bulbos e tubrculos), em gemas e em sementes, entre outros
rgos vegetais. Uma semente vivel considerada dormente quando no germina
ao ser submetida a condies favorveis de germinao (temperatura, gua,
oxignio e especficos que quebrem a dormncia.
Embrio: Planta rudimentar formada dentro do gametfito feminino, que possui
um eixo polar com um pice caulinar e um radicular em extremidades opostas.
Origina-se da unio do vulo com o ncleo espermtico.
Embrio somtico: Embrio formado a partir de clulas somticas seauindo
padres de desenvolvimento do embrio zigtico.
> Embriognese somtica: Processo de formao do embrio a partir de clulas
somticas, sem que ocorra fuso de gmetas, podendo ser direta e indireta.
Embriognese somtica direta: Processo de embriognese somtica que
ocorressem a passagem pelo estdio de calo.
Embriognese somtica indireta: Processo de embriognese somtica que
ocorre com a passagem pelo estdio de calo.
Embriide: Sinnimo de embrio somtico.
Explante: Segmento de tecido ou rgo vegetal retirado do seu stio natural e
utilizado para iniciar uma cultura in vitro.
Exsitu: Fora do lugar original
Ex vitro: Literalmente 'fora do vidro'. Termo normalmente utitizad yj ,a
a

contrastar com processos efetuados in vitro.


Etileno: Fitohormnio associado com o amadurescimento de frutos.
Fitohormnio: Substncia orgnica produzida pela planta, de baixa massa
88 EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

molecular que, em pequenas concentraes, promove, inibe ou modifica processos


fisiolgicos, geralmente em locais diferentes daquele onde foi produzida.
Flambagem: Ato de esterilizar intrumentos, expondo-os chama.
Fluxo laminar: Fluxo de uma massa contnua de ar ultrafiltrado (atravs de um
filtro HEPA), livre e constante, no sentido unidirecional e aerodinmico, ao longo de
linhas paralelas, sem criar turbulncia. Esse fluxo de ar toma a forma dos objetos ou
pessoas que encontra no trajeto, envolvendo-as em uma atmosfera estril,
carregando, ao mesmo tempo, as contaminaes geradas dentro da rea de
trabalho. O fluxo pode ser horizontal ou vertical.
Friabilidade: Capacidade das clulas vegetais se separarem uma das outras,
quando cultivadas in vitro. Por exemplo, calos mantidos em meios com altas
concentraes de auxinas, em geral, se tornam friveis.
Fuso de protoplastos: Unio de clulas desprovidas de parede celular
resultando em uma clula hbrida com material nuclear das diferentes clulas de
origem.
GA3 (cido giberlico): Hormnio pertencente a classe das giberelinas que
induz a germinao.
Germinao: Engloba todos os eventos que iniciam pela absoro de gua de
uma semente e, na maioria das vezes, termina com a emisso da radcula.
Germoplasma: Material hereditrio que determina a caracterstica de um
organismo ou de um grupo de organismos.
Giberelina: fitohormnio estimulador de germinao.
Habituao: Habilidade adquirida por uma populao de clulas de crescer e
de se dividir independentemente do suprimento exgeno de substncias reguladoras
de crescimento.
Hiperhidricidade: Veja vitrificao.
Hormnio: Mensageiro qumico que coordena diferentes atividades em
organismos multicelulares.
Indiferenciado: Em clulas vegetais, estado caracterizado por clulas de forma
isodiamtrica, com pouco ou nenhum vacolo e ncle grande. Como exemplo tem-se
as clulas meristemticas.
Induo: Desencadeamento de um processo morfogentico pela exposio do
explante a estmulos fsicos, qumicos ou biolgicos. Induo envolve o controle da
expresso gnica, sem alterao no patrimnio gentico de organismo, ou seja, esse
termo se refere somente expresso de genes preexistentes.
inoculao: introduo de bactria, fungo, parte da planta ou clulas animais
em meio nutritivo, para o estabelecimento da cultura. Introduo de microrganismos
em animais ou vegetais.
In situ: No lugar original.
Alguns Conceitos em Cultura de Tecidos 89

In vitro: Literalmente 'no vidro'. Termo aplicado para designar crescimento de


clulas, tecidos ou rgos vegetais em meio de cultura, em condies asspticas.
In vivo: Literalmente 'ao vivo'. Refere-se ao desenvolvimento de organismos
vivos, em condies naturais.
Juvenilidade: Estado fisiolgico do desenvolvimento caracterizado pela
incapacidade de florescimento mesmo quando a planta exposta a condies
indutoras. s vezes, acompanhado por diferenas morfolgicas (tamanho, forma ou
disposio de folhas; presena de espinhos etc.) e fisiolgicas (maior capacidade de
enraizamento de estacas). a fase do crescimento, aps a germinao da semente.
Meio nutritivo: Combinao de sais minerais (macro e micronutrientes),
carboidrato, vitaminas e reguladores de crescimento, quimicamente definido e
utilizado para o crescimento de clulas, tecidos ou rgos in vitro. Pode ser slido
(adicionando-se gar ou outro agente para a gelificao) ou lquido.
, Meristema: Tecido composto de clulas no diferenciadas, envolvido na
sntese protoplsmica e formao de novas clulas por diviso mittica. Quando no
h especificao, o termo se refere ao meristema apical do caule com tamanho
menor que 0,1 mm.
Microenxertia: Forma de propagao assexuada in vitro que consiste em
excisar parte de uma planta (pice caulinar ou gema lateral) e introduzi-la em outra
planta (porta-enxerto) tambm estabelecida in vitro.
Micropropagao: Refere-se s tcnicas para propagao de plantas in vitro,
incluindo-se, cultura de pices caulinares e segmentos nodais, embriognese
somtica e formao de gemas adventcias em explantes.
Mutagnese in vitro: Qualquer processo de mutao induzida realizado in
vitro.
Necrose: Morte de clulas ou tecidos, em totalidade ou em parte, resultante da
ao de agentes biticos ou abiticos.
Organognese: Processo de neoformao de parte area ou raiz a partir de
calo ou de outros explantes; contrasta com embriognese.
Organognese direta: Organognese em que no ocorre passagem pela fase
de calo.
Organognese indireta: Organognese que passa pela fase de calo.
Oxidao: Escurecimento do meio de cultura e ou explante ocasionado por
compostos (a maioria fenlicos) liberados pelo explante.
-4 Quiescncia: Inibio da germinao devido a algum fator ambiental
desfavorvel.
Propagao in vitro: Propagao de plantas em ambiente controlado, usando
frasco de cultura, tcnicas asspticas e um meio nutritivo adequado para o
crescimento e o desenvolvimento do explante inoculado.
90 EDITORA - UFLA/FAEPE - Cultura de Tecidos

Regenerao: Em cultura de tecidos de plantas, significa uma resposta


morfogentica de um explante a um estmulo, que resulta na formao de parte
area, embrio, propgulo ou planta. Nesse processo, clulas diferenciadas sofrem
desdiferenciao, assumindo caractersticas meristemticas e, em seguida, so
reprogramadas, diferenciando-se em rgos especializados (rediferenciao). A
regenerao pode ocorrer via organognese ou embriognese.
Regenerao adventcia: Regenerao de um rgo vegetal em uma regio
diferente daquela onde originalmente formado.
Regulador de crescimento: Substncias sintticas, no produzidas
naturalmente que, quando aplicadas planta em quantidades diminutas, estimulam,
inibem ou modificam o crescimento ou o desenvolvimento (efeitos semelhantes aos
dos fitohormnios). Muitas dessas substncias so quimicamente anlogas aos
fitohormnios.
Repicagem: Transferncia de calos ou material vegetal em cultivo, sem
subdividi-lo, para um novo meio nutritivo.
Resgate de embries: Processo de recuperao in vitro de embries
resultantes de cruzamentos incompatveis. Em geral, realizado mediante cultura de
embries.
Subcultura: Cultura de tecido constitudo na subdiviso de material j
estabelecido in vitro, suas transferncia para novo meio, e a incubao subsequente
em condies controladas.
Suspenso celular: cultura de clulas ou agregados celulares em meio lquido,
frequentemente sob agitao.
TX d multiplicao: Nmero de propgulos obtidos a partir de um explana
inicial, em um determinado perodo de tempo.
TDZ (thidiazuron): Hormnio pertencente a classe das fenilurias, ativamente
ligadas na promoo de crescimento de calos e morfogenese.
Totipotncia: Propriedade inerente s clulas vegetais de manifestar, em
momentos diferentes e sob estmulos apropriados, a potencialidade em iniciar um
novo indivduo multicelular.
Ultravioleta: Radiao eletromagntica com comprimento de onda entre 290 e
359 nm. Geralmente, empregada na induo de mutaes em microrganismos ou
na desinfestao de materiais utilizados em cultura de tecidos vegetais. Em biologia
molecular, utilizada para a visualizao de cidos nuclicos corados com brometo
de etdeo.
^Variao somaclonal: Variao expontnea ocorrida em plantas regeneradas
de cultivo in vitro de clulas ou tecidos.
4e Vitrificao: Refere-se a um processo no qual um propgulo se torna
quebradio, com aspecto de vidro, provavelmente ocasionado pela absoro
Alguns Conceitos em Cultura de Tecidos 91

excessiva de gua, processo esse atribudo a diversos fatores (gentipo, composio


do meio, etc). Anteriormente este processo era denominado de hiperhidricidade.
ZEA (zeatina): Hormnio vegetal pertencente a classe das citocininas, de
ocorrncia natural, especialmente, em gros imaturos de milho. [ Z J U X **SO*J/> )
5
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