Pesquisa

MELHORAMENTO GENTICO
DE MICRORGANISMOS PARA
ARTIGO

PRODUO DE BIOCOMBUSTVEIS
E QUMICOS RENOVVEIS:
INTEGRAO DE ABORDAGENS DE BIOLOGIA MOLECULAR, BIOLOGIA
SISTMICA, BIOLOGIA SINTTICA E ENGENHARIA METABLICA

Por: Lia Cecilia de Lima Fvaro*

O s microrganismos (bactrias, arquias, fungos)

so uma fonte prolfica de diversas molculas,
algumas das quais so usadas como combust-
veis, especialidades qumicas, polmeros, frmacos, nutra-
cuticos, antibiticos e enzimas industriais, apenas para
citar alguns exemplos. Em funo disso, os microrganis-
mos so cada vez mais considerados atores importantes
da bioeconomia. O interesse na produo de combustveis
e qumicos a partir de fontes renovveis tem catalisado
numerosas pesquisas que focam no desenvolvimento de
sistemas microbianos para produo de uma srie de bio-
produtos. Por exemplo, a Dupont desenvolveu um pro-
cesso de produo de 1,3 propanodiol (usado na produo
de polmeros), utilizando Escherichia coli recombinante;
a DSM desenvolveu uma rota biotecnolgica completa
para produo do antibitico cefalexina, em substituio
Foto: Lia Fvaro
a converso qumica da penicilina; a BASF desenvolveu
uma rota biotecnolgica completa para produo de ribo-
flavina, em substituio a sntese qumica; a ExxonMobil
e a Synthetic Genomics uniram-se para desenvolver um
processo baseado em microalgas para produo de bio-
diesel; a Novozymes e a Cargill uniram-se com o objetivo
de desenvolver uma rota biotecnolgica para produo de
cido 3-hidroxipropinico (usado na produo de acrila-
tos); a Gevo desenvolveu um processo bioqumico para
produo de isobutanol; a Amyris desenvolveu um pro-
cesso baseado em leveduras para produo de farneseno,
o qual pode ser convertido em farnesano (combustvel)
e em esqualeno (usado em cosmticos). Estes exemplos
demonstram que diversas empresas lderes de diferentes
setores esto utilizando solues biotecnolgicas baseadas

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em microrganismos para o desenvolvimento de proces- A importncia destas duas plataformas para a produo de
sos sustentveis de produo de combustveis e qumicos bioprodutos diversos (biocombustveis, qumicos renov-
diversos. veis, frmacos, etc.) tornou-se evidente nas ltimas dcadas,
Para o desenvolvimento de fbricas celulares microbia- especialmente em funo do desenvolvimento de linhagens
nas robustas e eficientes, necessrio escolher o micror- produtoras por meio do uso de estratgias de engenharia
ganismo que ser usado como base para a produo de metablica, e mais recentemente, de biologia de sistemas
determinado composto de interesse. A seleo do micror- e biologia sinttica, seja pela academia ou pela indstria.
ganismo pode ser baseada em diversos critrios, por exem- Embora sejam as plataformas mais utilizadas para a enge-
plo, seleo a partir da biodiversidade. Como comum na nharia de vias metablicas para produo de uma srie
rea de microbiologia industrial, muitas vezes o caminho de bioprodutos, a manipulao destas espcies apresenta
entre a seleo de um microrganismo e a produo indus- desafios intrnsecos tais como o balano adequado de ati-
trial de um bioproduto pode ser bastante longo e custoso. vidades enzimticas e de expresso gnica para maximizar
Nesse aspecto, muitas vezes so escolhidas espcies micro- o fluxo metablico em direo ao produto desejado.
bianas para as quais um grande corpo de conhecimento Diversos tipos de biocombustveis (ou precursores) e
de fisiologia, bioqumica, gentica e biologia molecular qumicos renovveis tm sido produzidos por microrga-
est disponvel. Exemplos de espcies microbianas geral- nismos geneticamente modificados. As linhagens geneti-
mente utilizadas como plataformas industriais (ou chassis) camente modificadas podem ser capazes de converter no
incluem a levedura Saccharomyces cerevisiae, as bactrias E. somente acares simples tais como glicose ou sacarose,
coli, Corynebacterium glutamicum e Bacillus subtilis, os fun- mas tambm os demais acares da biomassa lignocelu-
gos filamentosos Aspergillus niger, A. oryzae e Trichoderma lsica em compostos de interesse. Os combustveis (ou
reesei, entre outros. precursores) produzidos por microrganismos genetica-
De fato, na indstria existe interesse na utilizao de mente modificados so molculas derivadas de lcoois,
um nmero limitado de plataformas microbianas para a de cidos graxos, de isoprenides e de policetdeos. Entre
produo de diversos tipos de combustveis e qumicos, o os qumicos renovveis que tm sido produzidos por rota
que permite flexibilidade das linhas de produo, as quais microbiana, destacam-se uma srie de intermedirios qu-
demandam alto investimento. Um exemplo claro desta situ- micos (1,3-propanodiol; 1,2-propanodiol; cido 3-hidro-
ao a produo de enzimas industriais, as quais so pro- xipropinico; cido ltico; cido succnico; polihidroxial-
duzidas por um nmero limitado de espcies de bactrias canoatos, etc), os quais servem como blocos construtores
e fungos. De modo geral, entre as espcies microbianas para produo de compostos de alto valor agregado.
que so alvo constante de intensa modificao gentica Entre os combustveis derivados de lcoois, alm do
para produo de biocombustveis e qumicos renovveis etanol (2 carbonos), podemos citar a produo microbiana
podemos citar Escherichia coli e Saccharomyces cerevisiae. de lcoois de cadeia mais longa (3 a 5 carbonos), tais como

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isopropanol, 1-propanol, 1-butanol, isobutanol, 3-metil-1-
-butanol, 2-metil-1-butanol, isopentenol. Estes lcoois
podem ser misturados com a gasolina, ou modificados
de diversas maneiras para produo de compostos para uso
como combustveis, aditivos, ou qumicos diversos. Butanol
e isobutanol merecem destaque, pois tm alcanado as
fases mais avanadas de comercializao, por exemplo, por
empresas tais como Gevo, Butalco e Butamax Advanced
Biofuels. O butanol naturalmente produzido por bactrias
do gnero Clostridium, mas a produo nestes hospedeiros
nativos limitada, o que tem levado ao desenvolvimento
de novas fbricas celulares para produo desse lcool. O
organismo de escolha das trs empresas foi a levedura S.
cerevisiae, a qual tambm possui a capacidade natural de
produzir butanol. No entanto, as estratgias de engenharia
metablica empregadas por estas empresas para sntese de
butanol e isobutanol so distintas. Por exemplo, h casos
em que a via biossinttica de C3-C4 de Clostridium foi
transferida para Saccharomyces seguida de diversos ajustes,
e tambm h casos em que se optou pelo redirecionamento
de vias biossintticas de aminocidos especficos, uma vez
que lcoois de cadeia mais longa podem ser derivados de
intermedirios das vias de formao de aminocidos em
Saccharomyces.
Alm dos lcoois de cadeia longa, compostos deriva-
dos de isoprenides e de steres de cidos graxos esto
sendo desenvolvidos por rota microbiana, constituindo
alternativas ao petrodiesel e ao combustvel de aviao. Os
isoprenides constituem um grupo de compostos produ-
zidos por diferentes organismos e possuem grande valor
industrial como frmacos (artemisina, taxol) e nutracu-
ticos (carotenides). A aplicao como combustvel pode
ser exemplificada por compostos tais como farnesano e
bisabolano, os quais possuem caractersticas semelhan-
tes ao diesel. Biocombustveis derivados de isoprenides
podem ser produzidos a partir de precursores de 5 car-
bonos pelas vias do mevalonato ou 1-deoxi-D-xilulose-5-
-fosfato. As plantas so fontes naturais de isoprenides,
mas a produo das mesmas no suficiente para atender
as quantidades necessrias para uso como biocombust-
veis. Para aumentar as quantidades produzidas, as vias
de 1-deoxi-D-xilulose-5-fosfato e mevalonato podem ser
modificadas e expressas em E. coli e S. cerevisiae. Dos com-
bustveis derivados de isoprenides, o farnesano o que
est mais prximo da comercializao. Ele tem sido pro-
duzido tanto em E. coli quanto em S. cerevisiae. A empresa
Amyris Biotechnologies, Inc. utiliza a linhagem industrial
brasileira PE-2 de S. cerevisiae, a qual foi desenvolvida
por diferentes estratgias de engenharia metablica, para
produo de farneseno, que pode ser convertido quimi-
camente a farnesano. Bisabolano outro combustvel que
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pode ser produzido por processo hbrido, por meio de cat-
lise microbiana para obteno de bisaboleno, seguida de
catlise qumica para converso em bisabolano. Por meio
de uma srie de modificaes que envolveram expresso
heterloga de genes de plantas, otimizao de cdons e de
promotores, bem como modificaes da via do mevalonato,
foi possvel produzir bisaboleno em altas quantidades, tanto
em E. coli como em S. cerevisiae.
Em relao aos combustveis derivados de cidos gra-
xos, diversos compostos tais como steres de cidos graxos,
lcoois graxos, alcanos e olefinas, podem ser produzidos
diretamente em E. coli a partir de carboidratos. A empresa
LS9, Inc. escolheu E. coli para modificaes e utilizou uma
srie de estratgias de engenharia metablica, entre elas a
superexpresso e nocaute de genes das vias de biossntese e
degradao de cidos graxos, a introduo de vias de bios-
sntese de etanol, de enzimas modificadoras diversas, bem
como de xilanases. Todas estas modificaes culminaram
em uma linhagem de E. coli capaz de produzir steres et-
licos de cidos graxos a partir da fermentao de acares
resultantes da degradao de biomassa.
Estes exemplos foram escolhidos para ilustrar o poder
de estratgias de engenharia metablica de microrganis-
mos para produo de uma srie de compostos a partir
de fontes renovveis. No entanto, os exemplos tambm
demonstram que a otimizao de vias metablicas ou de
um fentipo uma tarefa rdua, geralmente acompanhada
de muitos ajustes (deleo ou superexpresso de vias bios-
sintticas, engenharia de protenas para aumento da ativi-
dade, remoo de mecanismos regulatrios que impedem
o fluxo metablico desejado, etc.), de modo a maximizar a
produo de um composto e diminuir o fluxo de carbono
para vias indesejadas. Com o advento de ferramentas de
biologia de sistemas e de biologia sinttica espera-se que a
engenharia metablica de microrganismos para produo
de compostos cada vez mais complexos seja feita de forma
mais direcionada e rpida. Ou seja, sem a necessidade de
tantos ajustes das vias metablicas (endgenas ou heter-
logas) de interesse.
Neste aspecto, o uso de ferramentas de biologia de sis-
temas tem tornado possvel o entendimento do impacto
que uma modificao ou insero de uma via biossinttica
pode ter no metabolismo global da clula microbiana, em
condies de fermentao em biorreatores. Uma maneira
de predizer o impacto da insero ou retirada de genes
ou vias inteiras sobre o crescimento ou formao de um
produto atravs do uso de modelos metablicos. Tais
modelos metablicos preditivos tm sido construdos com
base na integrao de dados de genmica, transcriptmica,
protemica, metabolmica e fluxmica. O uso de aborda-
gens de biologia de sistemas (p. ex. modelagem em escala
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Foto: Las Oliveira

genmica de microrganismos in silico) tem permitido
identificar alvos para melhoramento gentico de modo
mais racional e direcionado. Por meio do uso de mode-
los matemticos robustos do metabolismo tem sido pos-
svel identificar alvos in silico e validar estes alvos para
aumento da produo de etanol em S. cerevisiae, bem
como para otimizar as vias biossintticas de produo
de 1,4-butanodiol e 1,3-propanodiol em E. coli a partir
de fontes renovveis.
A biologia sinttica um campo multidisciplinar
emergente que envolve princpios de engenharia, tais
como modularizao, para o desenvolvimento e mani-
pulao de circuitos genticos. Um dos objetivos da Lia Cecilia de Lima Fvaro
biologia sinttica facilitar a engenharia da biologia
por meio da caracterizao e padronizao de partes pesquisadora da Embrapa Agroenergia, fez
biolgicas, reduzindo o tempo necessrio para fazer as Doutorado em Gentica e Melhoramento de Plantas
construes genticas e aumentando sua confiabilidade pela Universidade de So Paulo - Escola Superior
e previsibilidade. Seguindo alguns princpios bem defi- de Agricultura Luiz de Queiroz, Brasil(2009).
nidos, tais colees de partes biolgicas padronizadas e
reutilizveis podem ser teis para construo de dispo-
sitivos capazes de realizar funes biolgicas complexas
e previsveis (um dispositivo consiste de uma ou mais
partes combinadas para executar uma tarefa complexa).
Os dispositivos de biologia sinttica disponveis (pro-
motores ortogonais induzveis, bibliotecas de stio de
ligao de ribossomos, sensores de estado, controlado-
res espao-temporais, osciladores, portas lgicas, etc.)
devem facilitar os trabalhos de engenharia metablica de
microrganismos. De fato, alguns dispositivos de biologia
sinttica tais como sistemas sensores-reguladores din-
micos tm sido utilizados para aumentar a produo de
biocombustveis em microrganismos, tais como ster
etlico de cido graxo em E. coli.
Neste cenrio, fica evidente a existncia de um
estreito acoplamento entre biologia de sistemas, bio-
logia sinttica e engenharia metablica em prol do
desenvolvimento de rotas microbianas para produo
de biocombustveis e qumicos renovveis. Apesar des-
tas inovaes, a produo de biocombustveis e qu-
micos por rota microbiana deve ser competitiva com
os produtos existentes de origem fssil ou originados
por rotas qumicas convencionais. Fatores importantes
que devem ser considerados para a comercializao de
biocombustveis e qumicos renovveis incluem o desen-
volvimento de linhagens microbianas com altas taxas
de produtividade (o objetivo produzir os compostos
desejados essencialmente na eficincia mxima permi-
tida pela termodinmica), o escalonamento do processo
de produo sem perda do desempenho e a cadeia de
fornecimento de matria-prima para a indstria.

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