MANUAL DE PRCTICA DE MICROBIOLOGA AMBIENTAL ING.

AMBIENTAL

Ao de la Diversificacin Productiva y del Fortalecimiento de la

Educacin

CURSO:

Microbiologa Ambiental

DOCENTE:

Mara Elena Geldres Vigil

SEMESTRE:

201602

TEMA:

MICROSCOPIA Y TINCIN CELULAR

INTEGRANTES:
Daz Ruiz, Abner Eli
Escobal Chavez, Flavio Ronaldo

Trujillo- Per
2016
MANUAL DE PRCTICA DE MICROBIOLOGA AMBIENTAL ING. AMBIENTAL

PRCTICA N3
MICROSCOPIA Y TINCIN CELULAR

I. OBJETIVOS
Conocer las partes y el funcionamiento de un microscopio, as como manipular
adecuadamente el microscopio de luz.
Comprender la importancia del cuidado, manejo y utilidad de un microscopio en el
Laboratorio de Microbiologa.
Interpretar el fundamento de las coloraciones en la prctica microbiolgica.
Ejercitar las tcnicas de coloracin simple y compuesta.

II. MATERIALES
Microscopio
Laminas porta y cubre objetos
Mechero de alcohol
Colorantes de cristal violeta, azul de metileno, solucin de lugol, solucin alcohol-
acetona, safranina y verde de malaquita.
Aceite de inmersin
Asa bacteriolgica
Muestra de sarro dentario
Muestra de agua estancada y hongos de pan.

III. FUNDAMENTO

El microscopio es un instrumento ptico que amplifica la imagen de un objeto pequeo. Es el

instrumento que ms se usa en los laboratorios que estudian los microorganismos. Mediante
un sistema de lentes y fuentes de iluminacin se puede hacer visible un objeto microscpico.

Los diferentes seres vivos que existen en la naturaleza presentan tamaos, formas y
composiciones distintas, la mayora de ellas pueden verse a simple vista, y otras mediante
instrumentos que pueden aumentar de 100 a cientos de miles de veces el tamao original de
un microorganismo.

Dentro de los instrumentos ms importantes tenemos al microscopio de luz y el microscopio

electrnico que sustentan la microscopa de luz y la microscopia electrnica,
respectivamente.

Como veremos en esta prctica, no podemos estudiar una muestra sin antes llevar a cabo
una preparacin de la misma para poder observarlo. No olvidemos que la preparacin del
objeto de estudio puede resultar un proceso simple o, por el contrario ser bastante complejo,
dependiendo de la naturaleza y caractersticas de aquello que queremos observar.

Considerando que una clula es transparente por su alta cantidad de agua (70%
aproximadamente) resulta casi imposible estudiarla en fresco, de all que el preparado en
seco y por ende la coloracin, constituyen tcnicas de laboratorio muy importantes dentro de
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la microscopa de luz compuesta para el estudio morfolgico-estructural de la clula o

simplemente para identificar un molcula o sustancia en ella.

Es por eso que la preparacin de una muestra para estudiarla al microscopio de luz es
diferente segn la naturaleza del material a estudiar, ya sea para observar sus propiedades
fisiolgicas que se dan es estado vivo, o si queremos observar su morfologa y estructuras,
que no se modifican cuando sobreviene la muerte celular.

3.1 MICROSCOPIO DE LUZ

El microscopio de luz puede ser simple (como la lupa) o compuesto (microscopio

convencional), que amplifica una imagen y permite la observacin de mayores detalles de
los posibles microorganismos a simple vista. El microscopio de luz compuesto usa dos
lentes: lente objetivo el cual est ubicada de forma directa con el objeto en estudio y nos
genera una imagen invertida, real, aumentada y el lente ocular el cual est ubicada
directamente al ojo del observador y nos genera una imagen derecha, virtual y aumentada.

El microscopio aumenta la imagen hasta el nivel de la retina, para captar la informacin. La

resolucin depende de la longitud de onda de la fuente luminosa, el espesor del
espcimen, la calidad de la fijacin y la intensidad de la coloracin. Tericamente la
mxima resolucin que se puede alcanzar es de 0,2 m dada por una luz con longitud de
onda de 540 nm, la cual pasa por un filtro verde (muy sensible por el ojo humano) y con
condensadores adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el objetivo, pero no
puede aumentar la resolucin.

Existen distintos microscopios pticos; generales y de investigacin, que se diferencian en

factores tales como la longitud de onda de la iluminacin del espcimen, la alteracin fsica
de la luz que incide en la muestra y procesos analticos que se aplican a la imagen final.

El microscopio de luz compuesto est formado por tres sistemas:

A. SISTEMA MECNICO

Est formado por una serie de engranes y botones que permiten realizar el movimiento y
cambio de las lentes as como el enfoque de la preparacin. Tambin proporciona
soporte a los sistemas de iluminacin y ptico. Est constituido por:

a. Pie o Base: componente slido que asegura estabilidad al microscopio.

b. Columna o Brazo: Sostiene la platina, tubo ocular, tubos porta objetivos, tornillo
macro y micromtricos.
c. Platina: Plancha metlica horizontal, perpendicular al brazo, presenta un orificio
central que permite el paso de la luz proveniente de iluminacin, presenta una pinza
para sujetar la lmina y un carro mvil (Charriot) para desplazar dicha lmina. Es
aquella donde se colocan las diferentes preparaciones que deseamos observar.
d. Tubo ocular: es metlico, ennegrecido interiormente para evitar la reflexin de la
luz, en su extremo superior se adapta al lente ocular.
e. Revlver: dispositivo metlico que gira sobre un eje central y que mediante un Clic
indica la posicin exacta de los tubos objetivos para la observacin.
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f. Tornillo macromtrico: permiten el movimiento rpido de la platina o el tubo

ptico.
g. Tornillo micromtrico: mueven lentamente a la platina o tubo ptico permitiendo
un mejor ajuste de la imagen del objeto al observar.

B. SISTEMA DE ILUMINACIN

El sistema de iluminacin corresponde a la fuente de luz y sus accesorios para iluminar

eficazmente la preparacin (el diafragma y el condensador)

a. Fuente de Luz: esta es muy importante ya que una correcta iluminacin de la

preparacin que deseamos observar es una condicin necesaria para poder realizar
una buena observacin. Podemos obtener la fuente de luz a travs de un espejo
bajo la platina, que recoge tanto la luz natural como la luz elctrica, o a travs de
lmparas incorporadas al pie del microscopio.
b. Diafragma: est situado debajo de la platina y del condensador, cuya funcin es de
regular la entrada de luz al condensador.
c. Condensador: es una lente o sistema de lentes situadas debajo de la platina y que
permite concentrar la luz en la muestra que se observa.

C. SISTEMA PTICO

Est formado por una serie de lentes de vidrio en los objetivos y oculares que permiten
agrandar la imagen y est formado por:

a. Lente ocular: lente plano convexo, de mayor distancia focal, sobre la cual se coloca la
vista para realizar la observacin, y forma la imagen virtual y derecha. El aumento del
ocular est sealado por un nmero y letra X, por ejemplo, 10X.
b. Lente objetivo: lente plano convexo, de corta distancia focal y gran poder de resolucin,
se incluye en el extremo del tubo porta objetivo, forma la imagen real e invertida. Existen
dos clases de objetivos:

Objetivos en seco: Son aquellos en los que entre la lente frontal y el objetivo a
observar no existe sustancia alguna, excepto el aire. Se usan en observaciones de
preparados en fresco. Se clasifican, a su vez en:
Objetivo de pequeo aumento desde 4x hasta 10x
Objetivo de mediano aumento, de 10x a 40x
Objetivos de gran aumento, entre 40x a ms.
Objetivos de inmersin: Son aquellos en los que entre la lente frontal y el objeto a
observar se interpone una sustancia liquida (aceite de cedro), cuyo ndice de
refraccin sea igual o muy cercana a la del vidrio. Se usa para observaciones de
preparados en seco.

3.2 CMO ILUMINAR CORRECTAMENTE EL CAMPO DEL MICROSCOPIO?

a. Verificar que los lentes y el espejo estn completamente limpios y que el diafragma este
abierto.
b. Ubicar la parte cncavo del espejo y orientarlo hacia la fuente de luz.
c. Colocar el objetivo 10x en posicin de uso y colocar el condensador a la altura respectiva
(es casi la misma que la distancia del objetivo).
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d. Con el o los ojos en el ocular maniobrar el espejo utilizando el dedo pulgar e ndice en los
bordes del mismo, evitando el contacto con la superficie del cristal, de tal manera que se
capte la mayor cantidad de luz.

1) Base
2) Botn de encendido
3) Diafragma de campo
4) Tornillo micromtrico
5) Tornillo macromtrico
6) Condensador
7) Diafragma de iris
8) Platina
9) Pinzas
10) Brazo o estativo
11) Objetivo de 4X
12) Objetivo de 10X
13) Objetivo de 40X
14) Revolver
15) Tubo del ocular
16) Ocular

3.3 TINCION CELULAR

Todos los microorganismos, excepto los virus, pueden ser observados mediante microscopios
pticos, por lo que nos vamos a limitar a describir las tcnicas ms comnmente usadas para
realizar preparaciones para microscopios pticos.

A. Preparacin en fresco
Para poder observar la movilidad de un microorganismo es preciso que no est fijado, ya
que en este las clulas estn muertas. Este mtodo es menos complejo y consiste en
suspender una gota del lquido a observar, tomada directamente de la muestra, sobre un
portaobjetos y cubrindola con el cubreobjetos con cuidado para evitar la formacin de
burbujas de aire.

B. Preparacin en seco
Consiste en la observacin de clulas y tejidos muertos. Para ello se realizan una
serie de pasos como son la fijacin y la tincin.

Fijacin mecanismo que consiste en matar a la clula de la forma ms rpida

posible, este evita que el material en estudio se pudra y se desintegre. Existen
diferentes tipos de fijador y entre ellos destacan los fsicos (calor hmedo y seco)
y qumicos (alcohol metlico, dicromato de potasio, etc.)
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Tincin significa simplemente colorear los microorganismos con un colorante que

destaque ciertas estructuras. Sin embargo antes de teir los microorganismos se
los debe fijar (adherir) al portaobjetos.

Limpieza de los portaobjetos y cubreobjetos

Es preferible utilizar material nuevo, pero en ocasiones presentan algo de grasa por lo
que debemos desengrasarlos con alcohol y secarlos con un pao fino que no deje
pelusa, si no se utilizan en el momento se deben de envolver con papel higinico, de
esta manera quedan protegidos del polvo y nicamente se abre el paquete en el momento
de hacerlos servir.

3.4 COLORACIONES
Los microorganismos permiten fcilmente el paso de luz a travs de sus cuerpos, lo que
los hace transparentes a la vista, a menos que contengan pigmentos que permitan su
observacin en el microscopio. Es por ello que debemos teir a los microorganismos
con compuestos que se fijen a sus estructuras y les confieran color, estos compuestos
son los colorantes.

Los colorantes son sales compuestas por un in positivo y un in negativo, uno de los
cuales esta coloreado y se conoce como cromforo. El color de los denominados
colorantes bsicos est en el in positivo, por ejemplo: el violeta de genciana, azul de
metileno, verde de malaquita y la safranina; en los colorantes cidos est en el in
negativo, por ejemplo: eosina, fucsina cida, cido pcrico, azul de anilina. Y la otra
parte denominado auxocromo, es un radical que imparte al compuesto la propiedad de
disociacin electroltica, permitiendo con esto la fijacin del compuesto a diferentes
materiales.
Para la tincin de las bacterias se pueden utilizar tinciones simples, diferenciales y
selectivas.

Coloracin Simple: son aquellas en las cuales se utiliza un solo colorante el cual tie
toda la clula, observndose sta de un solo color uniforme.

Coloracin de Gram: La observacin microscpica de las bacterias es ms fcil

cuando se tie. Sin embargo, es fcil confundir un punto o bastn sobre un fondo de un
mismo color. El problema fue resuelto por Hans Christian Gram, patlogo dans que en
1884 introdujo un colorante de contraste despus de la decoloracin. Originalmente la
coloracin de Gram se desarroll para visualizar las bacterias en los tejidos animales
pero pronto se advirti que era til para la diferenciacin de bacterias. Las bacterias
teidas por esta coloracin se dividen en dos grupos: las que retienen el violeta de
genciana o cristal violeta o Gram positiva y las que se decoloran con el decolorante y se
tien con el colorante de contraste (generalmente de color rojo como la safranina o la
fucsina bsica) o Gram negativas.

Coloracin neutra: es aquella que es utilizada generalmente para la observacin de

sangre y de improntas de tejidos. Los colorantes ms utilizados son: Wrights, Giemsa,
Lesihman, May Grunwald.
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IV. PROCEDIMIENTO

A. OBSERVACIN DE PREPARADOS EN FRESCO Y COLORACIN SIMPLE

Con un gotero u estilete, tomar una muestra de levaduras, hongos u otro. Luego
colocarla en una lmina portaobjetos.
Colorear la muestra con dos o tres gotas de colorante bsico (azul de metileno) o
cido (eosina) por 1 minuto.
Lavar la lmina en agua corriente a chorro tenue para eliminar el exceso de
colorante.
Secar la lmina al medio ambiente o al calor, agregar una gota de aceite de
inmersin y observar al microscopio.

Muestra:

Preparado:

Estructura que identifica:

Aumento:

Muestra:

Preparado:
Estructura que identifica:
Coloracin:
Aumento:
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Muestra:

Preparado:
Estructura que identifica:

Coloracin:
Aumento:

B. OBSERVACION DE UNA COLORACION DE GRAM

Con un mondadientes, tomar una muestra de sarro dentario y colocarla en una
lmina portaobjetos.
Extender la muestra sobre una lmina portaobjetos y fijar a calor, al aire, mechero,
etc.
Colorear la muestra con violeta de genciana por un minuto y luego lavarla con
agua a chorro tenue.
Cubrir la muestra con solucin yodada de lugol por tres minutos y lavar.
Decolorar la muestra con alcohol acetona hasta que cese el desprendimiento del
colorante.
Cubrir la muestra con el colorante de contraste safranina por un minuto y luego
lavar con agua a chorro tenue.
Secar la lmina al medio ambiente o al calor, agregar una gota de aceite de
inmersin y observar al microscopio.

Muestra:

Preparado
Estructura que identifica:

Coloracin:
Aumento:
Tipo Gram:
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V. INVESTIGAR
1. Cul es la diferencia entre colorantes cidos y bsicos. Dar ejemplos de cada uno.

Colorantes Bsicos: Colorantes cidos:

Asociacin de un cromgeno Productos de la unin de

de baja intensidad y de un cromgeno de baja
carcter dbilmente cido al intensidad dbilmente
que se le aade grupos bsico al que se le
auxocromos catinicos aaden grupos
fuertemente bsicos que son auxocromos fuertemente
los responsables de la carga acido lo que le dan dicho
global del colorante por eso se carcter al colorante tie
utilizan para teir estructuras estructuras bsicas
cidas. Ejemplo: laca de celulares en el citoplasma
hematoxilina - colorante celular: Eosina-C.
nuclear, Fucsina bsica y Citoplasmtica / Fucsina-
Galocianina cida.

2. Presentar un cuadro comparativo para diferenciar las caractersticas de la tincin simple,

diferencial y especial.

TINCIN TINCIN SIMPLE TINCIN ESPECIAL

DIFERENCIAL
Se utilizan varios Son 10, cada una tiene
colorantes combinados. Se utiliza un solo un uso ms profundo,
Las estructuras colorante, por lo que ms especial.
celulares se diferencian todas las estructuras
en funcin de los celulares se tien con la
diferentes colorantes misma tonalidad (Tinta
que fijan de acuerdo china, Azul Metileno de
con su con su propia Loeffler, Azul de
constitucin qumica( lactofenol).
Tincin Gram,
coloracin de acido
resistencia)
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3. Cul es el fundamento de la Tincin Gram? Graficar y describir el comportamiento qumico.

Los fundamentos de la tcnica se basan en las diferencias entre las paredes

celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas La pared celular
de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa peptidoglucano,
adems de dos clases de cidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la
pared celular y unido a la membrana plasmtica, se encuentra elcido
lipoteicoico, y ms en la superficie, el cido teicoico que est anclado
solamente en el peptidoglucano (tambin conocido como murena)Por el
contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se
encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior
(descomposicin distinta a la interna) por medio de lipoprotenas. Tiene una
capa delgada de peptidoglucano unida a una membrana exterior
por lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de protena, fosfolpido
y lipopolisacrido. Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se
tien diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de su pared.
La clave es el peptidoglucano, ya que es el material que confiere su rigidez a
la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor
proporcin que las Gram negativas.

4. Describe la diferencia entre la tincin Gram y la tincin de cido alcohol resistencia.

Las bacterias cido-alcohol resistentes no pueden ser clasificados segn la

tincin de Gram, la cual es la tcnica ms comn en la microbiologa
contempornea, sin embargo puede ser teido con algunas tinciones
concentradas combinadas con calor. Una vez teida tiene la capacidad de
resistir la decoloracin de una combinacin de alcohol- cido, el cual es el
decolorante ms comn en los protocolos de tincin de bacterias, de donde
viene el nombre Alcohol-cido resistente.

5. Describir los tipos de microscopios y su aplicacin a la ciencia

Microscopio compuesto

El microscopio compuesto es el microscopio ms utilizado

en la ciencia, el trabajo y el hobby. Consiste en dos partes
pticas: lentes oculares (el que est prximo a tus ojos) y los
lentes objetivos (el que est posicionado cerca de la prueba
observada). El microscopio compuesto fue el primero
introducido por inventor holands Zacaras Janssen (el tambin
es conocido por inventar el telescopio). Su aparato sofisticado
para el ao 1590, llevaba a cabo dos tareas: para ver estrellas
y pequeos objetos. El instrumento se convirti en una
invencin del primer microscopio compuesto y un telescopio al
mismo tiempo.
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Microscopio ptico : liviano

Un microscopio liviano es un microscopio ptico comn

utilizando las longitudes de las ondas de luz visibles. Los
microscopios livianos son muy utilizados como herramienta
para ver objetos pequeos en colores. El microscopio liviano
puede ser binocular o monocular, triocular para el uso de
aparatos de video. Los microscopios pticos o livianos usan
lentes refractivos y oculares hechas de vidrio para dirigir una
imagen magnificada hacia el ojo u otro aparato que captura la
imagen. La habitual magnificacin del microscopio liviano es
1500x pero tambin puede llegar a 2000x con menos calidad
de visin.

Microscopio digital: Microscopio USB

Microscopio digital. Un microscopio, un aparato de

captura de video y una pantalla de video formando una sola
unidad sin oculares es la definicin apropiada para un
microscopio digital. Por otro lado, si montas una cmara
digital en un microscopio triocular por ejemplo, tambin
har un buen microscopio digital o microscopio USB "no
oficial". Para una mejor imagen o resolucin de video y
mejor calidad general, es mejor utilizar un microscopio
digital apropiado ya que los lentes del microscopio digital
estn confeccionados especialmente para la cmara. El
microscopio digital ms comn tiene un monitor de 15
pulgadas y una cmara con alrededor 2 millones de pixels.

Microscopio fluorescente

Un microscopio fluorescente es igual al instrumento

comn de microscopios livianos con la excepcin que ilumina
el espcimen con la luz de una onda larga especial causando
que el objeto observado emita una luz con un color diferente
por la absorcin de fluorophores. Las ciencias de vida utilizan
de forma amplia microscopios fluorescentes, la mayora
llamados "microscopios epi-fluorescentes". El microscopio
fluorescente es muy til en todos los campos de la biologa,
haciendo posible estudiar mejor las protenas y molculas.
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VI.REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

MADIFAN, M.Martinko, J.y J. PARKER. Biologa de los microorganismos.10 Edicin.

ESPAA: Editorial Pearson educacin, S. A. 2006.

Koneman E. Diagnstico microbiolgico. 6a ed. Mxico DF: Editorial Mdica Panamericana

S.A.; 2006.

VII. REFERENCIAS LINKOGRAFICAS

https://es.answers.yahoo.com/question/index?qid=20080318173330AAnhY9T
http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf
http://es.scribd.com/doc/5368278/Fundamentos-de-la-tincion-de-Gram#scribd
http://www.leclinvet.com/tincionesespeciales.html