Microscopia de barrido

Objetivos:

se ha empleado el microscopio electrnico de barrido (MEB)

para estudiar superficies de microorganismos con mayor detalle.
diferenciar de otros microscopios electrnicos en que produce
una imagen a partir de electrones emitidos por la superficie de un
objeto, en lugar de a partir de electrones transmitidos.

Historia:
El primer microscopio electrnico de barrido fue desarrollado en 1930
en Alemania y en 1949 [en Estados Unidos y finalmente 'en inglaterra
en 1950. Ei1 primer modelo comercial fue presentado en 1964 por "The
Cambridge Scientific Instrument Company"; posteriormente muchos
otros fabricantes han desarrollado nuevos modelos.

Concepto:

El MEB proporciona imgenes y datos fsico-qumicos de la superficie

de cuerpos generalmente opacos a los electrones, por medio de un
delgadsimo haz de electrones que recorre dicha superficie y de
detectores que transducen las seales que de ella emanan,
trasformandolas en corrientes elctricas que se emplean en formar una
imagen en un monitor de televisin. Para realizar estas funciones los
MEB cuentan con las siguientes partes: a) ptica electrnica, b) cmara
de espcimen, c) crculos de alimentacin de la ptica electrnica de
generacin de alto voltaje y de produccin de barrido, d) detectores de
electrones secundarios emitidos por la muestra, de electrones
retrodispersos y otros tipos de detectores que se describirn ms
adelante, e) dispositivos para observacin y registro de las imgenes.
En esta tcnica se aprovechan las seales que resultan de la interaccin
entre el haz electrnico y la muestra; las que mas comnmente se
utilizan en el SEM son las de electrones secundarios y/o
retrodispersados y los rayos X.

El MEB se utiliza para estudiar superficies de microorganismos con

mayor detalle; normalmente, tienen una resolucin de 7 nm o inferior.
Se diferencia de otros microscopios electrnicos en que produce una
imagen a partir de electrones emitidos por la superficie de un objeto, en
lugar de a partir de electrones transmitidos, esta compuesto por:
Los componentes principales del microscopio de barrido SEM son los
siguientes:

Puente de energa

La fuente de energa del microscopio electrnico de barrido depende de

varios factores, siendo los ms importantes el voltaje de aceleracin, la
intensidad de la corriente y al dimetro de haz. Para usos prcticos debe
asegurarse una alta estabilidad de la corriente. En unos puntos el haz de
electrones es desviado 1, 2, 3 ... n veces por los campos magnticos
controlados por el generador de barrido. Como] consecuencia el haz es
movido sobre la. superficie de la muestra y la seal detectada por el
colector de electrones (1 1). Se puede ajustar el colector para detectar
cualquier emisin como rayos X, luz infrarroja, ultravioleta, etc.

Porta muestras

La muestra montada sobre un soporte puede moverse en tres

direcciones, ser calentada, enfriada, estirada, etc. dentro del
instrumento. Para d estudio de ciertos tipos de muestras tales como,
metales, minerales, semiconductores se requiere calefaccin de la
muestra. La calefaccin puede conseguirse por medio de un hilo-
incandescente o calentando la muestra en un crisol aplicando
directamente a la muestra una corriente elctrica (12).
Los mtodos de enfriamiento se usan principalmente en la preparacin
de muestras biolgicas. Para Ja deformacin mecnica en el estudio de
muestras tales como , polmeros o fibras, es necesario determinar una
escala de fuerzas ya que la fuerza requerida vara considerablemente
segn el tipo de material.

El sistema de amplificacin

recoge las seales y procesa la informacin procedente de la muestra,

al mismo tiempo que el haz de electrones de la muestra. El generador
de barrido est conectado al tubo de rayos catdicos (CRT) para que el
haz de electrones en este tubo sea barrido en la misma forma que, el haz
principal. Sin embargo, la potencia de la corriente suministrada a la
columna principal para d barrido puede ser atenuada mientras que el
tubo de la pantalla es barrido sobre una rea constante. Como
consecuencia de ello, cualquier reduccin en el rea de la muestra
barrida da lugar a un aumento de la imagen. Este aumento viene
determinado por la relacin del rea de la pantalla del tubo (constante)
respecto al rea de la muestra barrida (variable).

CAMARA DEL ESPECIMEN

Es una cmara muy amplia para dar cabida a objetos de varios

centmetros o an decmetros de dimetros y est situada en la parte
inferior de la columna de ptica electrnica. La cmara de objeto cuenta
con un soporte para la muestra y aloja los detectores de electrones y est
formado por una plataforma metlica mvil. Los movimientos de esta
platina deben permitir exponer al haz que incide verticalmente, todas la
posibles infractuosidades de las superficies de objetos de las ms
diversas formas. Por ello la platina no solo se mueve como la de los
microscopios de luz en dos ejes perpendiculares al haz, sino que adems
las platinas de los MEB giran, se inclinan en todas las direcciones,
suben y bajan acercndose o alejndose del lente objetivo. La platina de
soporte del objeto esta siempre en conexin directa o a travs de una
resistencia, con la masa metlica del aparato y por lo tanto est a tierra.
Los detectores sern descritos ms adelante.

CIRCUITOS DE ALIMENTACIN

Los circuitos de alimentacin de las lentes, as como el generador y

regulador de alta tensin son similares a los del MET. El generador de
barrido permite que el rastreo de la superficie del objeto y el barrido del
monitor de observacin sean sincrnicos. La sincrona de los dos
barridos hace que cada punto del rengln que se dibuja al mismo
tiempo sobre el monitor de observacin y el monitor de fotografa-
dicha sincrona da lugar tambin a que cada rengln sobre el objeto se
corresponda a un rengln del monitor y de esta forma la imagen del
monitor corresponda punto a punto con las caractersticas del
objeto. Esta correspondencia se ajusta a la definicin de imagen y
objeto en ptica. Dicho de otra manera, gracias a la sincrona podemos
tener una imagen del objeto en los monitores. Utilizamos comillas en la
palabra punto debido a que en realidad no son infinitamente pequeos,
sino reas muy pequeas, pero de diferente tamao en el objeto y en el
monitor, dependiendo del aumento. Las lneas horizontales (renglones)
del monitor tienen la longitud fija-el ancho de la pantalla- mientras que
la longitud de los barridos sobre el objeto es mayor a bajos aumentos.
De esta manera la relacin de la longitud de los barridos no dar el
aumento lineal de la imagen:
Aumento= longitud de barrido del monitor/longitud del barrido sobre el
objeto

DETECTORES

Los detectores ms empleados en el estudio de muestras biolgicas son:

a) los de electrones secundarios emitidos, b) los de electrones de haz
retro dispersados por la muestra, c) los de rayos x emitidos por la
muestra, d) los de electrones transmitidos por la cara del espcimen
contraria a la irradiada por el haz ( barrido de transmisin), e) los de
ctodo lumiscecia.
DETECTORES DE ELECTRONES SECUNDARIOS EMITIDOS
POR LA MUESTRA
los electrones secundarios emitidos por la muestra se producen en un
volumen relativamente pequeo de espcimen muy cercano al lugar
donde incide el haz electrnico en ese instante, por lo que proporcionan
una imagen de mayor resolucin que la sumistrada por otros detectores.

Las interacciones de los electrones de haz con los electrones de atomos

de la muestra causan que algunos de estos ltimos sean expulsados
fuera del aotomo en cualquier direccin. La energa de estos electrones
ser igual a la energa de los electrones de haz menos la energa
necesaria para la ionizacin, por lo cual los electrones secundarios
tendrn siempre menor energa que los del haz. Los electrones
expulsados hacia a cara superior de la muestra que lleguen a la
superficie con suficiente energa para cruzarla y salir al espacio de la
cmara del objeto podrn ser detectados.
El detector consiste en una pieza de metal cargada positivamente,
generalmente entre 200 a 400 voltios, para atraer a los electrones de
baja energa.
DETECTORES DE ELECTRONES TRANSMITIDOS POR LA
CARA DEL ESPECIMEN CONTRARIA A LA IRRADIADA
(BARRIDO TRANSMISIN)
La direccin de los electrones que atraviesan una muestra delgada, por
el lado contrario al barrido por el haz, da lugar al procedimiento llamado
microscopia electrnica de barrido-transmisin. El portaobjeto tiene un
orificio para permitir pasar a los electrones y si la muestra no es de un
espesor mucho mayor a una micra, el detector recibir los electrones no
dispersados as como los dispersados elstica e inclsticamente.
Los electrones no dispersados inclsticamente se distribuyen cerca del
eje ptico del micrscopio, y los electrones dispersados elsticamente
ocupan posiciones alejadas del eje, pues salen de la muestra con ngulos
mayores que los otros. Por ello si se utilizan dos detectores uno en forma
de un disco situado en el eje y otro como un anillo perifrico, se podrn
obtener imgenes de fondo claro ( con el detector central) y el fondo
oscuro de alto contraste, formadas por electrones inclasticamente
dispersados ( con el detector perifrico). En general el sistema de
barido-transmisin proporciona imgenes de corte de un espesor de
media micra o ms, de mayor nitidez que el microscopio de transmisin
convencional, pero no aport informacin muy importante al
conocimiento biolgico. Actualmente este sistema se encuentra
desplazado con mucha ventaja por el microscopio de transmisin
provisto de fitro de energa de electrones.
DETECTORES DE COTODOLUMINISCENCIA
La ctodo liminecencia es la emisin de la luz producida por el
bombardeo de rayos catdicos, nombre antiguo de un haz de
electrones. Se produce cuando se excitan electrones pi y luego se ocupa
el lugar vacante desde orbitas con energas no mucho mayores a la
inicial. En estos casos el fotn que aporta la diferencia de energas esta
el rango visible, en lugar de ser un rayo X, como cuando se trata de
otras rbitas con mayores diferencias de energa. Las sustancias con
electrones pi dbilmente unidos como algunos compuestos orgnicos
polinsaturados son frecuentemente ctodo luminiscentes. El sulfuro de
zing de la pantalla donde se observa la imagen en los MET es ctodo
luminiscente.
 FUNCION:

El MEB realiza un escner con un estrecho haz de electrones en

forma de prisma, de adelante hacia atrs sobre la muestra.
Cuando el haz incide sobre una zona concreta de la muestra, los
tomos de la superficie emiten una nube tenue de electrones
denominados electrones secundarios, que son atrapados por un
detector especial.
Los electrones secundarios que entran en el detector inciden
sobre un centellador, causando la emisin por ste de centelleos
de luz que un fotomultiplicador transforma en una corriente
elctrica y la amplifica. La seal se enva a un tubo de rayos
catdicos y se produce una imagen como en la pantalla de
televisin, que puede verse y fotografiarse.
El nmero de electrones secundarios que alcanzan el detector
depende de la naturaleza de la superficie de la muestra. Cuando
el haz de electrones incide sobre un rea elevada, entra en el
detector un nmero grande de electrones; por el contrario, pocos
electrones podrn escapar de una depresin o valle llegando al
detector. En consecuencia, las reas elevadas aparecen ms claras
en la pantalla y las depresiones, ms oscuras.
Se produce una imagen tridimensional realista de la superficie de
un microorganismo con una gran profundidad de campo.
Tambin se puede examinar la localizacin real de los
microorganismos in situ, en nichos ecolgicos, como la piel
humana y la pared intestinal.

DESVENTAJAS:

Una desventaja del SEM es la imposibilidad de examinar muestras

que producen alta presin de vapor de agua cuando se colocan en el
ambiente de vaco que requiere este equipo. Por ello, para observar
muestras biolgicas deben secarse y prepararse previamente para
hacerlas conductoras.
 Preparacin de la muestra para la observacin en el microscopio
de barrido SEM

En el microscopio electrnico de barrido se observa la estructura

superficial de la muestra, por lo tanto, las fibras deben prepararse en
una seccin longitudinal. Las fibras deben de estar completamente
secas. Existen varios aparatos para secar las muestras. Una vez que se
hayan preparado las fibras deben colocarse sobre el porta muestras. Hay
varios tipos deporta muestras: porta muestras para la observacin de
muestras normales, para muestras voluminosas, por muestras con
posibilidad de seleccionar la superficie deseada de la muestra, porta
muestra con microcircuito y con posibilidad de ser calentada o enfriada,
etc. La 1distrihci6n de la intensidad de seales producidas en la muestra
es funcin de la composicin de sta y de la energa de los electrones.
La intensidad de las seales emitidas por la muestra viene determinada
por la distribucin de seales producidas y por su absorcin por la
propia muestra. La profundidad normal para que las seales sean
emitidas es de menos de 500 A para electrones secundarios. Las fibras
textiles por no tener capacidad de reflejar los electrones deben ser
cubiertas por plata u oro. Las fibras preparadas se fijan sobre el porta
muestras. Antes de introducir la muestra preparada en el microscopio
es necesario aislar la cmara del sistema y luego introducir aire seco o
nitrgeno antes de retirar todo el soporte del porta muestras.
La preparacin de muestras es sencilla y en algunos casos, se
puede examinar directamente material secado al aire. los
microorganismos deben primero fijarse, deshidratarse y secarse
para conservar la estructura de superficie y evitar el colapso de
las clulas cuando se expongan a alto vaco en el MEB.
Antes de la observacin, se montan las muestras secas y se
cubren con una capa fina de metal para evitar la formacin de
carga elctrica superficial, formndose una imagen de mayor
calidad.

Qu avances de las ciencias biolgicas se han obtenido por medio

de la microscopia electrnica de barrido?
Las aportaciones del MEB al conocimiento de la biologa animal y
vegetal, a la taxonoma a la medicina humana y veterinaria, as como a
muchas otras ciencias, han sido muy grandes. Con esta metodologa se
han podido conocer mucho mejor las superficies de clulas y tejidos,
las relaciones intercelulares y infinidades de detalles finos de las
superficies de las plantas y animales. Utilizando los electrones
restrodispersados por el espcimen y una disminucin muy moderada
de la presin de la cmara del objeto, se ha podido estudiar un gran
nmero de muestras biolgicas hmedas, sin capa conductora y sin
necesidad de largos procedimientos de preparacin. La obtencin de
imgenes de alta calidad a voltajes de aceleracin muy bajos mediante
el empleo de lentes compuestas electromagnticas y electrostticas, ha
capacitado a los investigadores para observar material biolgico muy
sensible, con haces de electrones con voltajes muy bajos que no causan
mayores daos por radiacin.
La altsima resolucin lograda por los MEB provistos de can de
emisin de campo ha facultado la localizacin de caractersticas
qumicas de la superficie mediante la inmulocalizacion con anticuerpos
con esferas de oro de menos de 10 nm de dimetro. La espectroscopia
de rayos x ha producido muchos avances en el conocimiento de la
localizacin ultraestructural de sustancias inorgnicas, ce sustancias
orgnicas unidas a tomos frecuentes en la composicin general de las
clulas y de contaminantes. La catodoluminiscencia est comenzando a
producir localizaciones finas de sustancias mediante el uso de
marcadores catodolunminicentes unidos a anticuerpos. Este mtodo se
asemeja a la inmunofluorescencia, pero ofrece mucho ms alta
resolucin.
Aplicaciones en Industria Alimenticia

Identificacin de elementos en extractos secos y cenizas.

Control de calidad de materiales de filtrado (ej. tierras de

diatomeas, carbn activado, filtros, etc.).

Evaluacin de contaminacin inorgnica en envases.

Observacin de espesor y tipo de recubrimiento en envases.

Identificacin de levaduras en industria del vino.

Observacin de microorganismos patgenos en alimentos.

 EJEMPLO DE APLICACIONES DEL MEB

Tcnica alternativa para estudios histolgicos de hueso sin descalcificar por

Microscopia Electrnica de Barrido

Los estudios histolgicos de hueso habitualmente se realizan mediante

la observacin de secciones finas de tejido seo por Microscopia ptica
(MO) o Microscopia Electrnica de Transmisin (MET). Dada la
dificultad que representa el corte de muestras duras para el estudio
histolgico por inclusin y corte por lo general, se requiere que
previamente el hueso sea descalcificado.
Esto se hace ms crtico cuando se trata de huesos implantados con
biomateriales de dureza similar o superior a la del hueso cortical, donde
es importante que se efecte el corte sin alterar el tejido que rodea al
biomaterial implantado. Por otra parte, no es aconsejable descalcificar
las muestras de estudio de crecimiento seo por bioinduccin, dada la
gran cantidad de artefactos que la descalcificacin introduce.
Tampoco debe realizarse la descalcificacin en huesos con implantes
de biomateriales, ya que podra causar la degradacin del biomaterial
de implante y la descalcificacin del nuevo tejido alrededor del
implante. Los materiales biocompatibles y osteoinductores ms usados
en la fabricacin de implantes osteoarticulares o de relleno de cavidades
resultantes de lesiones en el hueso son metales y cermicas de elevada
dureza. La hidroxiapatita densa sinttica es un biomaterial de implante
duro que ha sido empleado sistemticamente por ser muy similar al
constituyente del hueso.
El xido de titanio y los biomateriales metlicos en general, se utilizan
en aquellas aplicaciones clnicas que requieren soportar carga, por sus
propiedades mecnicas y por su resistencia a la corrosin en el
organismo humano.1La Microscopia Electrnica de Barrido (MEB)
brinda imgenes superiores a las del microscopio ptico por su mejor
resolucin y mayor profundidad de foco y constituye una buena
alternativa cuando se dificulta la tcnico preparativo para MET. Con
estos antecedentes, se decidi realizar el estudio histolgico de huesos
con implantes de hidroaxiapatita y de titanio por una tcnica alternativa
diseada al efecto, en la cual se combin la preparacin tradicional para
MET (tcnica de inclusin en resinas) con el montaje y recubrimiento
de muestras que se realizan para MEB omitiendo el paso inicial de
descalcificacin.
Se emplearon fragmentos de fmur de conejos que contenan implantes
y se mantuvieron congelados durante varios das. Se realiz un corte de
las muestras con sierra diamantada en una zona lo suficientemente
alejada de la regin de inters para evitar daos en las estructuras y
tejidos a estudiar. Las muestras se fijaron en glutaraldehdo 5 % en una
disolucin reguladora de fosfato de sodio 0,1 mol/L, pH 7,4, se
postfijaron en tetrxido de osmio 1 % diluido en la misma disolucin
reguladora, se deshidrataron en disoluciones de acetona de
concentracin creciente desde 30 % hasta acetona pura, se infiltraron
en xido de propileno y se incluyeron en resina Spurr.
Los pasos de fijacin, deshidratacin e infiltracin se realizaron a
presiones negativas, haciendo un vaco en el recipiente para eliminar el
aire ocluido en las muestras o encerrado en burbujas en las disoluciones.
Los bloques de inclusin polimerizados se cortaron con una sierra
diamantada y se pulieron usando papel de esmeril en gradacin
ascendente y pao con pasta de diamante para pulido fino. El desbaste
de la muestra hasta la zona de inters se realiz puliendo por etapas en
papeles de esmeril de granos cada vez ms finos hasta el grado 600, sin
aplicar gran presin contra el esmeril y usando agua como lquido
refrigerante y limpiador. El pulido fino se hizo en pao cargado con
pasta de diamante para pulido metalogrfico fino, usando un lubricante
oleoso. Los bloques pulidos se montaron en portaobjetos metlicos
pegndolos mediante pintura de plata coloidal y se recubrieron con una
fina capa de oro (40 nm). Las muestras se observaron en un
Microscopio Electrnico de Barrido Tescan Vega TS 5130 SB mediante
las modalidades de electrones secundarios y electrones
retrodispersados. Se obtuvieron imgenes digitales de las muestras que
fueron procesadas con fines cosmticos. En esta tcnica alternativa la
muestra se incluye en una resina epxica de gran poder de infiltracin
(Spurr) a presiones inferiores a la atmosfrica para lograr extraer el aire
contenido en el tejido durante este proceso y llenar con resina todos los
espacios resultantes. El pulido final con pasta de diamante brinda una
superficie lisa del corte transversal de la muestra y sirve de ataque
preferencial a las zonas ms blandas de ella resultando en una
extraccin selectiva de material. Esto permite conformar un relieve en
funcin de la dureza de las partes presentes en cada lugar de la muestra.
La muy fina capa conductora de oro, con que se recubre la zona pulida
para la observacin al MEB, hizo posible la buena definicin de las
estructuras histolgicas en las imgenes por emisin secundaria de
electrones y permiti hacer el estudio contando con una buena
resolucin. Las micrografas muestran imgenes de la seccin
transversal del hueso en la que aparecen muy bien definidos el hueso
duro cortical y el canal medular con grnulos de hidroxiapatita
implantados (Fig. 1). La figura 2 muestra un fragmento de hueso de
conejo con el implante de un pedazo de varilla de titanio. Esta tcnica
permite adems, hacer anlisis de las muestras por energa dispersiva
de rayos X (EDX) y es aplicable a huesos provenientes de necropsias o
a biopsias de hueso que contengan cualquier biomaterial implantado,
incluyendo biomateriales metlicos de alta dureza.

de las propiedades osteoconductoras y osteoinductoras de los materiales

de implante, ya que permite analizar la integracin sea lograda en
implantes de diferentes biomateriales tan o ms duros que el propio
hueso sin necesidad de descalcificar. No se conocen antecedentes de
esta variante preparativa para MEB en la que el estudio morfolgico se
lleva a cabo analizando la superficie atacada por el propio pulido. En
esta tcnica se produce, de acuerdo con la dureza y disolucin relativa
de los componentes de la muestra, un grabado selectivo mediante el
pulido en pao con pasta de diamante, el cual descubre el relieve de la
muestra que permite su estudio morfolgico.
EVALUACIN IN VITRO DEL TAMO DE ARROZ,
DEGRADADO POR PLEUROTUS OSTREATUS PARA LA
ALIMENTACIN EN RUMIANTES

El tamo de arroz es un material altamente lignificado que puede ser

usado alternativamente como alimento para rumiantes; sin embargo
la despolimerizacin de los hidratos de carbono en este material
celulsico se ve obstaculizada por el alto contenido de lignina, por
tanto se plantea como objetivo hacer un tratamiento al tamo de arroz
con Pleurotus ostreatus y evaluar su uso potencial en la alimentacin
de rumiantes, mediante la tcnica de produccin de gas in vitro y
composicin qumica; se encontr un importante efecto a los 20 das
de tratamiento con el hongo sobre la calidad nutricional del tamo,
reflejada en el aumento de protena cruda (PC) hasta un 37 % ms,
as como en la reduccin del contenido de lignina (LDA) y fibra
detergente neutra (FDN) de 54 % y 27 % respectivamente.
Finalmente la modificacin de estos compuestos por el hongo, se vio
manifestado en un 40 % ms de produccin de gas frente al testigo.
De esta manera el tratamiento del tamo de arroz con el hongo
lignolitico, se constituye en una alternativa viable para mejorar el
valor nutricional de este tipo de subproductos y poder aprovechar
mejor este material, especialmente en poca de escases forrajera.
Gracias al MEB se logro ver:
La microscopa electrnica de barrido (anlisis cualitativo), muestra
de forma general la biomasa modificada despus de la colonizacin
del hongo durante 20 das; en la figura 1A se puede apreciar las
nervaduras paralelas de la hoja, quienes sufrieron una degradacin
por parte del hongo, y su contraste 1B; as mismo en la figura 1C
se observan los tricomas de la superficie de la hoja cuyas
caractersticas de estos es que presentan paredes celulsicas,
recubiertas de cutcula, o paredes secundarias la cual pudo ser
degradada por el complejo enzimtico de P. ostreatus al ser
colonizado como se muestra en la figura 1D y de este modo
contribuir a la disminucin de LDA. Por ltimo el cambio de las
caractersticas morfolgicas despus del tratamiento es evidente, con
lo que se puede soportar el porcentaje de deslignificacin tan eficiente
conseguido (54%). Estudios han demostrado que la variacin en la
textura observados bajo microscopia electrnica de material vegetal
expuesto a hongos lignoliticos, facilita la penetracin microbiana
ruminal al tejido lignificado y en consecuencia aumenta la
digestibilidad del mismo.
Conclusion:
Bibliografa:
1. Vsquez Nin Gerardo- Echeverra Olga : introduccin a la microscopia elctrica
aplicada a las ciencias biolgicas
2. Revista CENIC Ciencias Biolgicas, Vol. 39, No. 3, 2008 .Tcnica alternativa
para estudios histolgicosde hueso sin descalcificar por Microscopia Electrnica
de Barrido
3. LIMENTECH CIENCIA Y TECNOLOGA ALIMENTARIA-ISSN 1692-7125.
Volumen 14 No. 1, p. 5 -12, ao EVALUACIN in vitro DEL TAMO DE ARROZ,
DEGRADADO POR Pleurotus ostreatus PARA LA ALIMENTACIN EN
RUMIANTES