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PRODUCCION DE ENZIMAS MICROBIANAS

CONTENIDO:

1. SISTEMA DE CULTIVO CELULAR POR LOTE O CONTNUO


2. CINTICA DE CULTIVO
3. CINTICA DE FORMACIN DE PRODUCTOS MICROBIANOS

CLCULO DE RENDIMIENTO Y PODUCTIVIDAD

4. TRASNDERENCIA DE OXIGENO EN FERMENTAIONES.

http://biorincon.blogspot.pe/2012/06/blog-post.html
http://biorincon.blogspot.pe/2012/06/biorreactor.html
MICROORGANISMOS COMO FACTORAS DE PRODUCCIN DE ENZIMAS

Las enzimas se pueden obtener de tres fuentes, tanto de origen animal, vegetal como microbiano
(levaduras, hongo y bacterias): la eleccin de una u otra fuente depende de varias factores como son
la estabilidad, especificidad de sustrato, temperatura y pH ptimo, coste, inocuidad, abundancias

Sin embargo la produccin de enzimas a partir de microorganismos presenta ciertas ventajas


econmicas y tcnicas, ya que permite su produccin a gran escala con un rendimiento predecible, hay
una disponibilidad continua y no hace falta diseccionar animales, por no olvidar que como hay gran
versatilidad de microorganismos se puede obtener un gran nmero de enzimas diferentes [1,2].
Adems hoy en da gracias a la ingeniera gentica se pueden desarrollar mutaciones en el metabolismo
de los microorganismos para que estos produzcan ms cantidad de enzima.

El primer paso para la produccin de enzimas es la eleccin del microorganismo adecuado, lo cual
depender de las caractersticas de la enzima a producir. Una vez elegido el microorganismo, se le
deja crecer en condiciones adecuadas de pH, temperatura y aireacin. A continuacin se debe extraer
la enzima, lo cual depende de si la enzima es extracelular, intracelular o periplasmtica (ver figura).
De manera que si es extracelular no hay que romper ninguna membrana, pero si es intracelular hay
que romper tanto la membrana externa como la interna, y si es periplasmtica slo la membrana
externa. Para estos dos ltimos casos existen diferentes mtodos de rotura celular tanto qumicos (con
disolventes orgnicos, detergente, choque osmtico) como fsicos (sonicacin, cizalla lquida o slida,
congelacin y descongelacin) [1,3].

Una vez extrada la enzima, esta se asla, es decir se eliminan todos los cidos nucleicos que han sido
liberados al medio tras la rotura celular, y partculas slidas como fragmentos de membrana y clulas
parcialmente rotas. Despus se concentra y enriquece y por ltimo se purifica.

La produccin de enzimas microbianas a nivel industrial se lleva a cabo por 2 mtodos:

a) Fermentacin en superficie (mtodo Koji): solo para obtener enzimas extracelulares

b) Cultivo sumergido: se lleva a cabo en grandes fermentadores o biorreactores que controlan


perfectamente las condiciones de cultivo [1,4].

En la actualidad se producen gran cantidad de enzimas microbianas utilizadas en mltiples reas:


industria alimentaria, textil, farmacutica y papelera.
Referencias

[1] J. D. Bulock; B. Kristiansen (1991) Biotecnologa bsica. Editorial Acriba, S.A.

[2] M. Garca, R. Quintero, A. Lpez-Mungua (2002) Biotecnologa alimentaria. Editorial Limusa.


Pp. 577-582.

[3] S.M. Robert; N.J. Turner; A.J. Willetts; M.K. Turner (1995) Introduction to Biocatalysis using
enzymes and microorganisms. Cambridge University Press.

[4] K. Aunstrup, O. Andresen, E.O. Falch, T.K. Nilsen (1979) Production of microbial enzymes in
Microbial Tecnology.Vol.1. Eds. Peppler, H.J., Pelman D. Academic Press, Nueva York.
1. SISTEMA DE CULTIVO CELULAR POR LOTE O CONTNUO

Cultivos celulares

Las clulas constituyen sistemas de produccin muy verstiles y altamente


especializados. Sin embargo, para expresar plenamente sus potencialidades, su
cultivo requiere de condiciones ambientales y nutricionales muy definidas,
tomando en cuenta tanto los factores fisiolgicos como los de ingeniera y
operacin.
En esta rea se estudia la interrelacin entre las condiciones de cultivo y la
respuesta fisiolgica de la clula, a travs del diseo de estrategias optimizadas
de cultivo, basadas en la mejora del medio, eleccin de la modalidad de cultivo
(cultivo por lote, cultivo por lote alimentado, cultivo continuo) y disposicin de
las clulas (libres o inmovilizadas), para la produccin de enzimas, protenas y
metabolitos, tanto primarios como secundarios.
Para ello se emplean principalmente clulas microbianas como bacterias,
levaduras y hongos filamentosos, que pueden ser cepas nativas como de
coleccin, mutantes y recombinantes. En los ltimos aos se han incorporado
cultivos de clulas animales recombinantes para la produccin de biofrmacos,
siendo la EIB pionera a nivel nacional en la investigacin en este campo.
Nuestra Escuela a partir de 1974 ha desarrollado diversos proyectos de
investigacin en aspectos relacionados con la fisiologa y cintica de los
microorganismos lixiviantes, la biolixiviacin de minerales de baja ley, de
relaves y de concentrados de flotacin y el uso de biorreactores con agitacin
mecnica y neumtica.
En la actualidad se trabaja en la biooxidacin de minerales y concentrados
refractarios de oro en reactores. Esta tecnologa, implementada a gran escala en
Australia, Sudfrica, Ghana y Brasil, permite una mejor recuperacin del oro
por el proceso de cianuracin, cuando el metal se encuentra recubierto de una
pelcula de sulfuros insolubles.
Se ha cuantificado el efecto de la adicin de CO2, la velocidad de transferencia
de oxgeno, el efecto de la concentracin de mineral en la pulpa, la aireacin y
la agitacin, tanto en la calidad de la suspensin como en la velocidad de
biooxidacin. Tambin se estudia la operacin continua y la configuracin de
reactores ms adecuada.

http://www.pucv.cl/uuaa/postgrados-ingenieria-bioquimica/cultivos-
celulares/2016-04-08/100920.html

https://w3.ual.es/~jfernand/ProcMicro70801207/tema-1---
generalidades/1-5-modos-de-cultivo.html
https://books.google.com.pe/books?id=2ctdvBnTa18C&pg=PA582&lpg=P
A582&dq=CIN%C3%89TICA+DE+CULTIVO+en+ENZIMAS+MICROBIANAS&s
ource=bl&ots=_rx51eyxye&sig=bQaVRm9q7NlYz-
1uLTF01pPO0AQ&hl=es&sa=X&ved=0ahUKEwiQwNKgg4bYAhVMxCYKHcK
HDYoQ6AEIZzAO#v=onepage&q&f=false
2. CINTICA DE CULTIVO

Definicin de crecimiento

Incremento en el nmero de clulas microbianas en una poblacin, ya que las tcnicas actuales
no permiten el estudio de clulas individuales

Procesos implicados en el crecimiento

1. Ingreso de los nutrientes bsicos a la clula.


2. Transformacin de estos compuestos en energa.
3. Replicacin del material gentico.
4. Incremento en tamao y masa de la clula.
5. Divisin de la clula en dos clulas hija, cada una conteniendo una copia del genoma y
otros componentesvitales

CINTICA DE CULTIVO
Describe el crecimiento y la formacin de productos, es decir:
Actividad de clulas en crecimiento,
Actividad de clulas en reposo.
Muchos productos de los cultivos microbianos de inters comercial se producen despus
que el crecimiento ha cesado. Es importante conocer la cintica de los cultivos
microbianos porque es necesario poder predecir cmo va a evolucionar un cultivo, cmo
va a ir consumindose el substrato y cmo se va a ir acumulando el producto de una
fermentacin.
Patrones de crecimiento de diferentes tipos de microorganismos

1. PATRN DE CRECIMIENTO DE BACTERIAS

Las bacterias se dividen por fisin binaria


Figura 1. Reproduccin por fisin binaria de bacterias

El tiempo que le lleva a una nueva clula dividirse se llama tiempo de generacin

(Tiempo de duplicacin), as se le llamar tambin al tiempo que tarda en dividirse la poblacin


bajo condiciones dadas de crecimiento, (medio, temperatura, pH, etc.). Cada especie bacteriana
tiene un tiempo de generacin determinado genticamente, se

realiza entre 15 y 60 min.

Cintica de crecimiento de cultivo en lote (batch):

Cultivo realizado en un sistema cerrado: volumen fijo de nutrientes cuya composicin se ve alterada en
forma continua como resultado del consumo de estos a causa del crecimiento microbiano y la produccin
de metabolitos. A lo largo del cultivo no se aaden nutrientes, solamente:

o Oxgeno, el cual se aade en forma de aire


o Antiespumantes
o cidos o bases para controlar el pH

Despus de la inoculacin de la solucin nutritiva estril con microorganismos y su cultivo en condiciones


fisiolgicas se observan cuatro fases tpicas de crecimiento.

Curva de crecimiento.
Fase lag, de latencia o induccin. Es cuando las clulas se transfieren de un medio a otro y no existe
inicialmente aumento en el nmero de clulas, aunque la masa microbiana puede cambiar. Es un perodo
de ajuste al nuevo ambiente. Puede ser larga o corta dependiendo de muchos factores:

Inoculo

o Estado fisiolgico
o Fase de crecimiento
o Tamao
o Tipo de microorganismos

Composicin del medio en el que se inocula

o Condiciones fisicoqumicas del medio

a) Fase Lag aparente: Es la que se observa con inculos pequeo

Cintica de la fase lag

(dX/dt) = 0
X = Concentracin de clulas (biomasa)
t = Tiempo
X = X0
X0 = Biomasa inicial

b) Fase exponencial, logartmica o trofofase. Fase en la que las clulas se han adaptado, se realiza la
reaccin en cadena de duplicacin de las clulas. Trofos= que se alimenta. Es la fase en la que se
producen los metabolitos primarios.(Etanol, cidos orgnicos (actico, ctrico), Protenas (fosfatasa,
proteasas, amilasas, protenas recombinantes-insulina, etc.), Biomasa (Transformaciones de metabolitos
intermedios).
Descripcin matemtica basica de la trofofase. El crecimiento puede ser descrito
cuantitativamente en funcin de la duplicacin del nmero de clulas por unidad de tiempo.

Otras velocidades usadas para describir el patrn de crecimiento microbiano:

Velocidad volumtrica (de crecimiento, de consumo de sustrato y de formacin de producto).

Velocidad especfica de consumo de sustrato (de formacin de producto)


Las ecuaciones anteriores describen perfectamente la duplicacin del nmero de clulas de bacterias y
levaduras que presentan crecimiento por divisin celular. Los tiempos de duplicacin oscilan entre 15 a
20 o incluso hasta 60 min para bacterias y de 45 a 90 o hasta 120 minutos para levaduras.

2. Patrn de crecimiento de actinomicetos, hongos y virus

En este caso lo que se considera es la duplicacin de la biomasa o del material gentico por unidad de
tiempo.
Aplicabilidad del modelo matemtico del crecimiento microbiano y constante especfica de
crecimiento explicados:

Es aplicable a la trofofase, fase exponencial o logartmica de la curva de crecimiento.


La constante especifica de la velocidad de crecimiento microbiano () se utiliza para
caracterizar el comportamiento de una poblacin microbiana.
Su valor depende de las condiciones ambientales en que se encuentra el microorganismo.
Existe una gran dependencia de la fuente de carbono y energa tanto en calidad como en
cantidad.

FACTORES FSICOS Y QUMICOS QUE INFLUYEN EN EL CRECIMIENTO.

1.- Temperatura:

Cada microorganismo tiene una temperatura de crecimiento adecuada.


Si estudiamos la variacin de la velocidad de crecimiento en funcin de la temperatura
de cultivo, podemos observar una temperatura mnima por debajo de la que
no hay crecimiento; a temperaturas mayores se produce un incremento lineal de la
velocidad
de crecimiento con la temperatura de cultivo hasta que se alcanza la temperatura
ptima a la que la velocidad es mxima. Por encima de esta temperatura ptima, la
velocidad
de crecimiento decae bruscamente y se produce la muerte celular.
El incremento de la velocidad de crecimiento con la temperatura se debe al incremento
generalizado de la velocidad de las reacciones enzimticas con la temperatura. Se
denomina coeficiente de temperatura a la relacin entre el incremento de la velocidad
de reaccin y el de temperatura. En trminos generales, la velocidad de las reacciones
bioqumicas suele aumentar entre 1.5 y 2.5 veces al aumentar 10C la temperatura a la
que tienen lugar.
La falta de crecimiento a temperaturas muy bajas se debe a la reduccin de la velocidad
de crecimiento por la reduccin de la velocidad de reaccin y al cambio de estado
de los lpidos de la membrana celular que pasan de ser fluidos a cristalinos impidiendo
el funcionamiento de la membrana celular.
La muerte a altas temperaturas se debe a la desnaturalizacin de las protenas y a las
alteraciones producidas en las membranas lipdicas a esas temperaturas.
Es importante tener en cuenta que a temperaturas bajas, el metabolismo celular se
enlentece y las clulas paran de crecer; aunque no tienen porqu morir. Sin embargo,
cuando la temperatura es superior a la ptima, se produce la muerte celular rpidamente
y las clulas no pueden recuperar su capacidad de divisin si baja posteriormente la
temperatura. Esto permite esterilizar por calor y no por fro.
Hay varios tipos de microorganismos en funcin de sus temperaturas de crecimiento
mnima, mxima y ptima.

Los microorganismos psicrtrofos son mesfilos que pueden crecer a temperaturas


bajas. Por tanto, se les puede considerar como psicrfilos facultativos. Esto es
importante
desde el punto de vista aplicado porque cuando se encuentran contaminando alimentos,
son capaces de crecer en condiciones de refrigeracin (4 - 8C) y de producir
infecciones en los consumidores del alimento (30 - 35 C).

Los microorganismos capaces de producir infecciones son los mesfilos y algunos


psicrtrofos ya que sus temperaturas ptimas de crecimiento coinciden con las
corporales.
sin embargo, tanto mesfilos como psicrfilos, psicrtrofos y termfilos pueden
producir toxinas causantes de intoxicaciones alimentarias.

2.- Actividad de agua:

Se denomina actividad de agua a la relacin entre la presin


de vapor de agua del substrato de cultivo (P) y la presin de vapor de agua del agua pura
(P0). El valor de la actividad de agua est relacionado con el de la humedad relativa
(HR).
El valor de la actividad de agua nos da una idea de la cantidad de agua disponible
metablicamente. Por ejemplo: comparemos el agua pura donde todas las molculas de
agua estn libremente disponibles para reacciones qumicas con el agua presente en una
disolucin saturada de sal comn (NaCl) donde una parte importante de las molculas
de agua participa en la solvatacin de los iones de la sal disuelta. En este ltimo caso, la
actividad de agua es mucho menor que en el primero. Conforme aumenta la cantidad de
solutos en el medio, disminuye su actividad de agua.
Cuando un microorganismo se encuentra en un substrato con una actividad de agua
demasiado baja, su crecimiento se detiene. Esta detencin del crecimiento no suele
llevar
asociada la muerte del microorganismo, sino que ste se mantiene en condiciones de
resistencia durante un tiempo ms o menos largo. En el caso de las esporas, la fase de
resistencia puede ser considerada prcticamente ilimitada.
La gran mayora de los microorganismos requiere unos valores de actividad de agua
muy altos para poder crecer. De hecho, los valores mnimos de actividad para diferentes
tipos de microorganismos son, a ttulo orientativo, los siguientes: bacterias aw >0.90,
levaduras aw>0.85, hongos filamentosos aw >0.80. Como puede verse, los hongos
filamentosos
son capaces de crecer en substratos con una actividad de agua mucho menor
(mucho ms secos) de la que permite el crecimiento de bacterias o de levaduras. Por
esta razn se puede producir deterioro de alimentos de baja actividad de agua (por
ejemplo, el queso o almbares) por mohos (hongos filamentosos) y no por bacterias.
En funcin de su tolerancia a ambientes con baja aw, los microorganismos que pueden
crecer en estas condiciones se clasifican en halotolerantes, halfilos y xerfilos
segn toleren o requieran condiciones salinas o hipersalinas, respectivamente.
La reduccin de la actividad de agua para limitar el crecimiento bacteriano tiene
importancia
aplicada en industria alimentaria. La utilizacin de almbares, salmueras y
salazones reduce la actividad de agua del alimento para evitar su deterioro bacteriano.

3.- pH:

Es un parmetro crtico en el crecimiento de microorganismos ya que cada


tipo de microorganismo slo puede crecer en un rango estrecho de pH fuera del cual
mueren rpidamente.
El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las clulas ya que,
en muchos casos, la obtencin de energa metablica depende de la existencia de una
diferencia en la concentracin de protones a ambos lados de la membrana citoplsmica.
El pH interno en la mayora de los microorganismo est en el rango de 6.0 a 7.0.

Los rangos de pH tolerables por diferentes tipos de microorganismos son, tambin,


distintos. Hay microorganismos acidfilos que pueden vivir a pH=1.0 y otros
alcalfilos
que toleran pH=10.0
Hay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el pH del medio de
crecimiento suele tender a bajar durante el cultivo. Por otra parte, la bajada del pH del
medio que producen ciertos microorganismos les confiere una ventaja selectiva frente a
otros microorganismos competidores. As, por ejemplo, las bacterias lcticas que
producen
grandes cantidades de cido lctico como consecuencia de su metabolismo primario
reducen el pH del medio de cultivo a valores inferiores a los soportables por otras
bacterias
competidoras (llegan a bajar el pH del medio hasta 4.5). De esta forma, las bacterias
competidoras mueren y las lcticas se convierten en la poblacin dominante.
La bajada del pH se puede deber a varios factores, uno de los cuales es la liberacin
de cidos orgnicos de cadena corta (frmico, actico, lctico) por ciertas bacterias. En
este sentido, hay que tener en cuenta que la accin bactericida de estos cidos orgnicos
de cadena corta es ms potente que la debida nicamente a la bajada del pH que
producen.
Esto es, los cidos orgnicos de cadena corta son txicos para algunas bacterias por
s mismos.
El efecto letal del pH cido sobre los microorganismos tiene aplicacin en la
conservacin
de alimentos acidificndolos. De esta forma, la adicin de cido actico en forma
de vinagre permite la conservacin de alimentos perecederos (escabeches, por ejemplo)
y la produccin de cidos en el curso de fermentaciones naturales permite alargar la
vida de los alimentos (coles fermentadas, por ejemplo).

4.- Potencial redox:

nos indica la capacidad del substrato para aceptar o donar electrones,


esto es: sus caractersticas oxidantes o reductoras. Uno de los factores que intervienen
en el potencial redox, aunque no el nico, es la concentracin de oxgeno
[O2].
Hay microorganismos que requieren ambientes oxidantes para crecer, mientras que
otros necesitan ambientes reductores. El metabolismo de ambos tipos de
microorganismos
presenta diferencias notables. El requerimiento de condiciones oxidantes o reductoras
no debe confundirse con la necesidad de presencia o ausencia de oxgeno para que
se produzca el crecimiento.
En general, cuando un microorganismo requiere un ambiente oxidante se dice que
desarrolla un metabolismo oxidativo (o respirativo) mientras que los microorganismos
que requieren ambientes reductores (o menos oxidantes) realizan un metabolismo
fermentativo.
Un microorganismo es aerobio cuando necesita oxgeno para vivir y es anaerobio
cuando o bien no lo necesita (anaerobios facultativos como las bacterias entricas, o
como Saccharomyces cerevisiae; o anaerobios aerotolerantes como las bacterias
lcticas)
o cuando muere en presencia de oxgeno (anaerobios estrictos como los clostridios).
Hay microorganismos que viven en ambientes carentes de oxgeno (anaerobios) que,
sin embargo, llevan a cabo un metabolismo oxidativo porque usan otro aceptor final de
electrones que acta como oxidante ambiental. Por ejemplo, las bacterias que "respiran"
nitratos (NO3
-), sulfatos (SO4
2-) u otros compuestos orgnicos oxidados (respiracin
anaerobia).
Hay microorganismos que, aunque viven en presencia de oxgeno, no son capaces de
utilizarlo como aceptor final de electrones y deben desarrollar un metabolismo
fermentativo
(las bacterias lcticas que son anaerobias aerotolerantes, por ejemplo).
Por otra parte, hay microorganismos que pueden desarrollar ambos tipos de
metabolismo.
Esto es: en presencia de oxgeno desarrollan un metabolismo oxidativo y en su
ausencia, fermentativo. El rendimiento de los procesos fermentativos es menor que el
de los respirativos: las bacterias y las levaduras producen menos biomasa cuando crecen
fermentando que cuando lo hacen respirando.
En el curso de ciertas reacciones metablicas redox se forman compuestos altamente
reactivos (radicales libres, formas superxido) que pueden daar las protenas,
membranas
y cidos nucleicos produciendo la muerte de las clulas. Las clulas se defienden
de estos compuestos reactivos mediante las enzimas siguientes: Superxido dismutasa
(SOD) y catalasa. Los anaerobios estrictos carecen de SOD y de catalasa o tienen
niveles
muy bajos de estas enzimas de forma que no pueden sobrevivir en presencia de
oxgeno. La deteccin de estas enzimas tiene valor taxonmico.

CINTICA DE CRECIMIENTO EN UN CULTIVO CONTINUO.

En un cultivo continuo se mantienen los microorganismos en crecimiento constante


porque se aade de forma constante medio de cultivo fresco (que aporta nuevos
nutrientes)
y se elimina cultivo (medio usado con sus microorganismos correspondientes)
a la misma velocidad con objeto de mantener el volumen total del cultivo constante.
Los cultivos continuos son importantes para trabajar con microorganismos que estn
creciendo constantemente de manera que sean capaces de producir constantemente
productos
de inters (biomasa, metabolitos secundarios, etc.). Este tipo de cultivo es tambin
importante en los estudios de fisiologa y de ecologa microbiana. En la naturaleza
un ejemplo de cultivo continuo lo constituye el rumen de ciertos animales y el conjunto
de procesos microbianos intestinales de todos los animales.
En un cultivo continuo se pretende mantener un ambiente constante durante todo el
tiempo de cultivo. Esto es imposible en un cultivo estanco en el que los nutrientes se
van consumiendo progresivamente y el medio se va cargando de productos de desecho.

QUIMIOSTATO
El tipo ms frecuente de cultivo continuo es el quimiostato en el que se introduce
medio fresco a un flujo constante denominado velocidad de dilucin (D) a la vez que
se elimina cultivo viejo al mismo flujo. El medio de cultivo de un quimiostato contiene
un nutriente esencial en una cantidad limitante (nutriente limitante). Estos parmetros
se relacionan de acuerdo a la siguiente ecuacin:
donde f es la velocidad de flujo (ml h-1) y V el volumen del recipiente en ml. Por
consiguiente, las dimensiones de D son [h-1]. El valor D indica el nmero de volmenes
de reactor (volmenes de fermentador) que pasan a travs el reactor por unidad de
tiempo.
Este valor es el recproco del tiempo de residencia o tiempo que una unidad de
substrato est dentro del reactor.

Tanto la tasa de crecimiento como el nivel de poblacin microbiana estn


relacionados con el valor de D.

A velocidades de D muy bajas, pequeos incrementos de la velocidad de dilucin


producen un cierto incremento de la densidad del cultivo debido a que se aportan ms
nutrientes al medio y el microorganismo no ve limitada su tasa de crecimiento () segn
lo indicado en la ecuacin de Monod (ecuacin 13).
La velocidad de crecimiento aumenta ( aumenta y disminuye) cuando la energa
aportada por los nutrientes entrantes supera la energa de mantenimiento de los
microorganismos
del cultivo.
A valores bajos de D la concentracin de nutriente limitante (S) en el efluente es baja
porque es consumido casi completamente por los microorganismos del cultivo que
alcanzan
unas poblaciones de gran tamao creciendo a una tasa () baja porque se encuentran
en condiciones de limitacin de nutrientes (S<Ks). A valores ms altos de D no
todo el nutriente es consumido por los microorganismos del cultivo por lo que S en el
efluente aumenta.
En una situacin de equilibrio (steady state), velocidad de dilucin D se iguala a la
tasa de crecimiento , de forma que el control de la tasa de dilucin (control del flujo f)
permite regular la tasa de crecimiento y, de esa forma, la situacin fisiolgica del orga
nismo. A valores de D> max, el microorganismo no es capaz de crecer lo suficiente
como para evitar ser eliminado del cultivo por el rebosadero y, por consiguiente S
alcanza
un valor mximo (el nutriente limitante no es consumido en el cultivo y la
concentracin
del substrato en el efluente es igual a la del substrato en el medio inicial) y la
tasa de crecimiento de microorganismos () dentro del cultivo se hace nula (el cultivo
desaparece).
La evolucin de la biomasa de un quimiostato se ajusta a la ecuacin siguiente:

Por consiguiente, si > D hay un incremento positivo de la poblacin en el quimiostato,


cuando = D el tamao de la poblacin se mantendr estable (equilibrio) y si
< D la poblacin disminuir como consecuencia de la dilucin de las bacterias. En el
steady-state, como (dN/dt) = 0, = D como se haba explicado anteriormente.

Habida cuenta de que en el estado estacionario D = , la ecuacin de Monod


puede reformularse en los siguientes trminos

donde Sr es la concentracin de nutriente limitante en el efluente del cultivo continuo.

Despejando de la ecuacin 16 el valor de Sr en funcin de los dems, se obtiene la


ecuacin siguiente:

que permite calcular cmo vara la concentracin del nutriente limitante en el efluente
en funcin de la tasa de dilucin D.
Si llamamos SR a la concentracin de nutriente limitante que entra en el fermentador
y Sr la concentracin de este nutriente en el efluente; considerando que el substrato
consumido en el fermentador (SR-Sr) es transformado en biomasa durante el estado
estacionario () con un rendimiento Ys, podemos calcular la produccin de biomasa en
el fermentador con las siguiente ecuaciones

Estas ecuaciones nos permiten modular la cantidad de biomasa producida o la cantidad


de substrato consumido regulando la tasa de dilucin del fermentador.
PRODUCCION DE ENZIMAS MICROBIANAS

CARACTERISTICAS GENERALES DE LOS PROCESOS DE


FERMENTACION PARA LA PRODUCCION DE ENZIMAS
MICROBIANAS

La ingeniera y diseo de los procesos de fermentacin ha sido ampliamente estudiada y


existen diversos textos donde estos aspectos pueden ser consultados.
CINTICA DE PRODUCCION DE ENZIMAS

OPERACIONES DE RECUPERACIN
ALGUNOS EJEMPLOS DE PRODUCCIN INDUSTRIAL DE
ENZIMAS MIBROBIANAS

AMILASAS

El almidn, polmero de glucosa, es despus de la celulosa el polisacrido ms abundante


en la naturaleza y materia prima para una gran diversidad de productos de la industria
alimentaria. Existen diversas enzimas involucradas en su transformacin y constituyen
probablemente el sector de mayor desarrollo en los ltimos 15 aos en lo que a tecnologa
enzimtica para el sector alimentario se refiere. A continuacin, se describen las
principales caractersticas de las amilasas de origen microbiano.

-amilasa

La -amilasa, endo-amilasa o 1 4 D-glucan 4 glucano hidrolasa. Hidroliza al azar


los enlaces 1 4 del almidn gelatinizado, provocando una drstica disminucin de
viscosidad (licuefaccin) y generando una distribucin de productos de bajo peso
molecular. Produce igualemente las -dextrinas, considerando que no puede hidrolizar
los enlaces 1 6 de la amilopectina.

Son producidas principalmente por bacterias y hongos y pueden ser clasificadas por su
actividad: licuefaccin o sacarificacin. En el segundo caso se llegan a producir
cantidades importantes de azcares (glucosa, maltosa y maltitriosa), mientras que en el
primero se desdobla el almidn, disminuyendo rpidamente la viscosidad, formando
maltohexosa como producto ms pequeo. En general, las -amilasas bacterianas son de
mayor resistencia a la temperatura que las fungales. El genero Bacillus es la fuente
bacteriana de mayor importancia destacando por su importancia comercial dos de ellos:
B. amyloliquefaciens y B. licheniformis. La enzima del primero fue la primera en aparecer
en el mercado, mientras que la -amilasa de B. licheniformis es actualmente la ms
empleada por su alta termoestabilidad.

La mayor parte de las -amilasas son metaloenzimas que requieren calcio, al menos un
tomo por molcula de enzima y hasta 10 en el caso de la enzima de A. aryzae.

En el caso de las enzimas bacterianas, la produccin durante durante la fermentacin es


lenta en la fase logartmica pero la secrecin de enzima se acelera antes de llegar a la fase
estacionaria, continuando cuando el microorganismo ha dejado de crecer y al inicio de la
esporulacin. Un medio adecuado de produccin podra ser 5% de almidn, 0.56%
NH4NO3, 0.28% nitrato de sodio, 0.13% KH2PO4, 0.05%MgSO4, 7H2O, 0.01% CaCl2,
2H2O, 0.05% peptona y 0.2% extracto de levadura. La fermentacin dura menos de dos
das.

La -amilasa A. aryzae es de importancia comercial, pues pertenece a las enzimas de


sacarificacin: es maltognica, pues produce altas cantidades de maltosa. Un medio
adecuado de produccin, podra ser: 8% almidn, 1.2% NaNO3, 0.1% K2HPO4, 0.1%
MgSO4, 0.05% KCl, 0.003% FeSO4, 0.08% Mg(NO3)2, 0.05%Mg(H2PO4)2, trazas de zinc
y 2% extracto de malta. La fermentacin dura de 2 a 3 das.

En ambos casos parecer ser que el pH de fermentacin juega un papel de suma


importancia. Un cambio hacia el lado alcalino durante el cultivo debe producirse. Por otro
lado, la temperatura de fermentacin depende de la cepa empleada. La produccin de
amilasas parece ser regulada por varios genes, habindose obtenido mutantes 250 veces
ms potentes que la cepa silvestre despus de 5 pasos de mutacin.

-amilasa

La -amilasa es una exoenzima que libera maltosa a partir del extremo no reductor de
amilosa y amilopectina. Dado que no tiene actividad hacia enlaces 1 6, tambien se
obtienen como producto dextrinas.

Aunque se encuentra, al igual que la -amilasa, ampliamente distribuida en vegetales


(granos malteados).

PECTINASAS

Por pectinasas se denomina a un complejo de enzimas que se clasifican de acuerdo con


el sustrato (pectina o cido pctico), del tipo de reaccin (hidlisis o transeliminacin) y
del mecanismo (endo o exo), incluyndose adems a la pectina esterasa. Los productos
comerciales provienen generalmente de Aspergillus niger, dado que de la gran variedad
de microorganismos que producen enzimas pcticas, es que el mayor nmero de stas
produce: una endo y una exo poligalacturonasa, adems de una endo
polimetilgalacturonasa y una endo pectin liasa. Esto permite una mayor efectividad en la
degradacin de pectina. Algunos productores japoneses emplean igualmente cepas de
Sclerotina libertiana y Coniothyrium diplodiella.

La enzima es inducible por pectina, y las condiciones de aireacin juegan un papel


importante en la proporcin de enzimas producidas al final del proceso.

DEXTRANASAS

Las dextranasas son producidas fundamentalmente para ingenios azucareros, en los que
la contaminacin con dextranas producidas por Leuconostoc mesenteroides requiere de
un tratamiento enzimtico. Se obtienen de cepas de Penicillum funicilosum, P. lilaceum
y Chaetomium gracilae, requiriendo de dextranas como inductor. Existe una gran
variedad de enzimas reportadas en la literatura con actividad hacia diversos tipos de
dextrana, ay que las enzimas comerciales slo presentan alta actividad hacia enlaces

1 6, pero existen dextranas con alto contenido de enlaces 1 3 y/o 1 2.

INVERTASA
Las invertasas pueden ser -fructofuranosidasas o -glucosidasas. Solo las invertasas de
S. cerevisiae y S. carlsbergensis (sinnimo: S. pastorianus y S. uvarum) (-
fructofuranosidas) son producidas industrialmente.

La levadura se crece en melazas (la sacarosa es inductor) y sulfato o fosfato de amonio.


La sacarosa es adicionada gradualmente durante la fermentacin con el fin de reducir la
represin catablica. Dado que la enzima se encuentra asociada a la pared celular, existen
dos tipos de productos: aquellos que consisten de preparaciones trituradas de levadura y
productos en los cuales la enzima es soluble, al ser liberada de la pared mediante un
proceso de autolisis en presencia de cloroformo o tolueno.

OTRAS ENZIMAS MICROBIANAS


Naringinasa
La naringinasa es una enzima comercial producida de Aspergillus niger, principalmente
en Japn, siendo empleada en el tratamiento de jugos de toronja para eliminar el sabor
amargo asociado con la presencia de naringina. La fermentacin se lleva en sustratos
(salvado, soya, etc.) a los que se adiciona cscara del ctrico. El proceso de recuperacin
debe eliminar las actividades pectinolticas que resultaran nocivas en el tratamiento del
jugo, lo que se logra con tratamientos con urea. Se han propuesto otros microorganismos
con muy baja actividad pectinoltica: A. saitoi, Cochliobolus miyabeanus y Rhizoctonia
solanii.

Ciclodextrina glucosil transferasa

Estas enzimas permiten obtener ciclodextrinas, tambien conocidas como dextrinas


Shardinger, a partir de hidrolizados de almidn (8-12 DE). Aunque existen tres tipos de
ciclodextrinas (G6, G7 Y G8) conocidas como alfa, beta y gama, respectivamente, parece
ser una sola enzima la responsable de la sntesis. Las cepas de Bacillus empleadas en la
produccin de la enzima permiten obtener: 74% de con B. megaterium, 73% de con
B. circulans, 57% de con B. stearothermophilus y 80% B. macerans. Por ingeniera
gentica se ha clonado el gene de B. macerans en B. subtiilis. Este es otro caso de enzimas
microbianas no comerciales, producidas por las empresas que manufacturan
ciclodextrinas.

Isomaltulosa sintetasa
Esta enzima se ha empleado en la produccin de isomaltulosa como intermediario en la
sntesis del edulcorante conocido como palatinita, empleando clulas completas de
Serratia plymuthica, Protaminobacter rubrum o Erwinia rhapontici. La isomaltulosa es
posteriormente hidrogenada con catalizadores de nquel. Actualmente la isomaltulosa ha
adquirido un mercado por s misma, dada su gran similitud tecnolgica con la sacarosa,
con un poder edulcorante netamente inferior.

Diacetil reductasa

Esta enzima permite transformar el diacetilo (2,3-butanodiona) en 2,3 butilen glicol. El


diacetilo, responsable del sabor de la mantequilla, es indeseable en la cerveza, donde se
produce como subproducto de la fermentacin alcohlica. Se puede emplear para
producir esta enzima Aerobacter aerogenes.

Acil tanino hidrolasa

Esta enzima se conoce como tanasa y se emplea para la produccin de t instantneo. Es


producida industrialmente por Aspergillus niger.
-galactosidasa

Esta enzima se puede emplear para hidrolizar la estaquiosa y obtener as rafinosa y


galactosa, y posteriormente para hidrolizar la rafinosa en galactosa y sacarosa. La
estaquiosa es un tetrasacrido responsable de problemas de flatulencia en algunas
semillas oleaginosas como la soja, mientras que la rafinosa es importante en la produccin
de azcar de remolacha, ya que afecta negativamente al proceso de cristalizacin de la
sacarosa. Esta enzima se produce de forma industrial a partir del
microorganismo Mortierella vinacea.