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Universidade Federal de Santa Catarina

Centro de Cincias Biolgicas


XVIII Semana Acadmica da Biologia - UFSC

Curso terico-prtico

Princpios e Aplicaes da Tcnica de PCR

Prof. Dr. Rafael D Rosa


Departamento de Biologia Celular, Embriologia e Gentica
Laboratrio de Imunologia Aplicada Aquicultura
E-mail: rafael.d.rosa@ufsc.br
Princpios e Aplicaes da Tcnica de PCR
Carga horria: 10 h/a
Coordenador: Prof. Dr. Rafael Diego da Rosa
Ministrantes: Cair Barreto (PPGBTC-UFSC)
Gabriel M Matos (PPGBTC-UFSC)
Natanael D Farias (PPGBCD-UFSC)
Nicolas A Conceio (Biologia-UFSC)
Perodo: 18 a 21 de setembro de 2017 (segunda quinta)
Horrio: 19h30 s 22h00
Local: Laboratrio Morfofuncional do CCB
Princpios e Aplicaes da Tcnica de PCR

DIA AULA ASSUNTO

Apresentao do curso
18 Terica Estrutura de cidos nucleicos e Replicao do DNA
A Reao em Cadeia da Polimerase (PCR)

Eletroforese de cidos nucleicos


19 Terica
Escolha de iniciadores de PCR

Terica Preparo de amostras e otimizao de reaes de PCR


20
Prtica Reaes de PCR convencional
Terica Variaes da tcnica de PCR
21
Prtica Eletroforese de DNA
Princpios e Aplicaes da Tcnica de PCR
www.liaaq.ccb.ufsc.br
Princpios e Aplicaes da Tcnica de PCR
Bibliografia
PCR
Reao em Cadeia da Polimerase
A Reao em Cadeia da Polimerase (PCR)

PCR: POLYMERASE CHAIN REACTION

A REAO EM CADEIA DA POLIMERASE


A Reao em Cadeia da Polimerase (PCR)
Amplificao in vitro de sequncias
ESPECFICAS de DNA
ESTRUTURA E
REPLICAO DO DNA
Estrutura dos cidos nucleicos
DNA cido DesoxirriboNucleico
RNA cido RiboNucleico
Estrutura dos cidos nucleicos
Polmeros lineares de nucleotdeos

GRUPO FOSFATO

BASE NITROGENADA

PENTOSE
Estrutura dos cidos nucleicos
DNA ou ADN: cido DesoxirriboNucleico

Polmeros de desoxinucleotdeos

(dA, dT, dC e dG)

Normalmente em fita dupla (dsDNA)


Fitas complementares (em direes opostas)
Estrutura dos cidos nucleicos
Estrutura dos cidos nucleicos
Desnaturao e Renaturao do DNA
Estrutura dos cidos nucleicos
Desnaturao e Renaturao do DNA

FORTE FRACA
ligaes fosfodister pontes de H
(mesma fita) (entre as fitas)
Estrutura dos cidos nucleicos
Desnaturao e Renaturao do DNA

5 3

3 5
Estrutura dos cidos nucleicos
Desnaturao e Renaturao do DNA
5 3

3 5
Estrutura dos cidos nucleicos
Desnaturao e Renaturao do DNA

5 3

3 5
Replicao do DNA
A replicao do DNA ocorre de forma semiconservativa
Replicao do DNA
Polimerizao unidirecional: sentido 5  3
PCR
Fundamentos da Tcnica
Fundamentos da PCR
Estrutura dos cidos nucleicos
Replicao do DNA
Conceito da tcnica de PCR
Fundamentos da tcnica de PCR
Aplicaes da PCR
Como visualizar e interpretar os resultados
Quais as variaes da tcnica de PCR
Como preparar reaes de PCR
PCR na prtica!
Fundamentos da PCR
A Reao em Cadeia da Polimerase

Polimerizao in vitro do DNA


- Apenas molculas de DNA (RNA e protenas)
- Enzima DNA polimerase
- Amplificao de sequncias especficas

Reao em Cadeia: reao cclica


- Produtos de um ciclo so substrato para o ciclo seguinte
Fundamentos da PCR

PCR
Reao enzimtica baseada na Replicao
Fundamentos da PCR

TEMPERATURA
Fundamentos da PCR
Os iniciadores de PCR
A Enzima DNA polimerase no se liga em fita simples
Iniciadores ou oligonucleotdeos (=PRIMERS)
Utilizao de pares de inciadores (um complementar para cada fita)
Iniciador Senso (Forward): se liga na fita 3-5
Iniciador Antissenso (Reverse): se liga na fita 5-3
Fundamentos da PCR
tubulina actina miosina
25C

95C

60C

72C
Fundamentos da PCR

Reao Cclica

Desnaturao

Vrias vezes...
Extenso
Hibridizao
Fundamentos da PCR
Fundamentos da PCR

at bilhes de cpias!
Fundamentos da PCR

Visualizao dos produtos em gis (eletroforese)


A cada ciclo, o nmero de cpias aumenta

10 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38

Nmero de ciclos
Fundamentos da PCR
Componentes de uma reao de PCR:

Amostra de DNA
dNTPs (dATP, dTTP, dCTP, dGTP)
Iniciadores (S e AS)
Enzima DNA Polimerase
Tampo da enzima
Mg2+ (MgCl2 ou MgSO4)
Fundamentos da PCR

Mg2+

TAMPO
Fundamentos da PCR
As principais etapas:

Desnaturao Hibridizao Extenso


(90-96C) (45-60C) (68-72C)

DNA Polimerase
(termoestvel)
Fundamentos da PCR

Enzima DNA polimerase

95C 60C 72C


Fundamentos da PCR
Fundamentos da PCR

Thermus aquaticus (1976)


+
(Yellowstone National Park)
Pares de iniciadores

(Taq DNA polymerase)


Fundamentos da PCR

1983 Automao da tcnica de PCR

1989 Patente (Hoffman La Roche & Perkin-Elmer Corporation)

1993 Prmio Nobel de Qumica

Kary Banks Mullis


PCR
Amplificao da sequncia alvo
Fases da PCR: princpio bsico
Reao enzimtica: DNA polimerase.
Temperatura + pH
Temperaturas diferentes: enzima e substrato/produto
Produto da reao: Gel (agarose; poliacrilamida).

Reagentes Termociclador Gel


Fases da PCR: ciclos

T C

95

72
60

Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo n

Tempo
Fases da PCR: ciclos
Termocicladores
Fases da PCR: amplificao da sequncia alvo

http://www.youtube.com/watch?v=ZmqqRPISg0g
Fases da PCR: amplificao da sequncia alvo
Fases da PCR: amplificao da sequncia alvo

Rate of PCR 2n
1.8E+09

1.6E+09

1.4E+09

1.2E+09
DNA copy number

1.0E+09

8.0E+08

6.0E+08

4.0E+08
1 2 4 8
2.0E+08

0.0E+00
0 5 10 15 20
PCR cycle
25 30 35
Nmero de molculas de DNA
Fases da PCR: amplificao da sequncia alvo

109
108
107
Plat
Cpias

106
105
104 Cpias do DNA: 1.073.741.824
Cpias do alvo: 1.073.741.764
103
102
10

1 3 5 10 15 20 25 30
Ciclos
Fases da PCR: amplificao da sequncia alvo

Plat
Linear Sem amplificao
Baixa eficincia

Log [DNA]

Exponencial
Alta eficincia

N de Ciclos
Fases da PCR: amplificao da sequncia alvo

Plat Deteco em gel


Sem amplificao

Perda da atividade da enzima;

Todas as enzimas disponveis esto ocupadas com a sntese de DNA;

Acmulo de produtos amplificados que tendem a parear entre si, em


detrimento do pareamento com os iniciadores;

Gasto dos reagentes, especialmente dos inciadores e dos dNTPs;

Acmulo de pirofosfato (resultante das ligaes fosfodister);

Competio com outros produtos que vinham sendo amplificados;

INIBIO PELOS PRODUTOS.


PCR
Aplicaes da tcnica
Aplicaes da tcnica de PCR

Identificao de espcies
Iniciadores para cada espcie
Amplificao de genes especficos
(Ausncia nas outras espcies)

Diagnstico molecular
Iniciadores especficos
Presena/ausncia do gene
(positivo ou negativo para o teste)
Aplicaes da tcnica de PCR

Medicina forense
Identificao humana
Marcadores humanos especficos
(necessidade de controles)

Teste de paternidade
Identificao humana
Marcadores humanos especficos
(teste em todos os envolvidos)
Aplicaes da tcnica de PCR
As diferentes aplicaes da tcnica de PCR:

Amplificao de fragmentos especficos de DNA;


Clonagem;
Medicina forense;
Diagnstico molecular;
Deteco de mutaes;
Identificao de espcies;
Anlises de expresso gnica;
Filogenia molecular...
PCR
Variaes da tcnica
Variaes da Tcnica de PCR
Touchdown PCR e Hot start DNA pol
RAPD, AFLP e RFLP
Nested PCR
Multiplex PCR e Rep-PCR
SSCP
PCR assimtrica e LATE-PCR
PCR inversa
QC-PCR
Long PCR e PCR in situ (PRINS)
RACE
PCR digital
Transcrio Reversa seguida de PCR (RT-PCR)
PCR quantitativa em tempo real (qPCR)
Variaes da PCR: RT-PCR

Transcrio Reversa

mRNA

cDNA
Variaes da PCR: RT-PCR

Permite a anlise de transcritos (mRNA)


Anlises fenotpicas de expresso gnica
Variaes da PCR: RT-PCR
Padronizao;
Baixa sensibilidade;
Baixa resoluo;
Pobre discriminao entre os produtos amplificados;
Tcnica qualitativa (pouco quantitativa);
No automatizado.
1 2 3 4
500
400
305, 315 ou 325 pb ?
300
50, 55 ou 70 ng ? 200
100
Variaes da PCR: qPCR

PCR quantitativa em tempo real (qPCR)


Mtodo baseado na PCR convencional (presena de fluorforos)
Monitoramento contnuo de um sinal fluorescente ao logo dos ciclos
Permite anlise de dados durante todo o processo (Real-Time).
Converso do sinal fluorescente em valor numrico para cada amostra.

Desnaturao Hibridizao Extenso


Variaes da PCR: qPCR
Variaes da PCR: qPCR
Aumento da quantidade de um produto de amplificao

Aumento da fluorescncia
Variaes da PCR: qPCR

Ciclos
MIQE Guidelines