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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA


DE BIOTECNOLOGA

DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS
ACADEMIA DE BIOTECNOLOGA

LABORATORIO DE BIOTECNOLOGA MOLECULAR


PRCTICA 5: Extraccin de ADN genmico

GRUPO: 4BM2

PROFESORES:

MORENO ZAVALA FABIOLA // PREZ SLIS ERICK EMMANUEL


//VILLANUEVA RODRGUEZ MARA RITA

EQUIPO 2

INTEGRANTES:

Cervantes Martnez Alejandra

Hernndez Tllez Tonatiuh

Hernndez Gaona Esteban

Sandoval Guilln Daniel Alejandro

FECHA DE ENTREGA:
MARTES 06 DE NOVIEMBRE DEL 2017
OBJETIVOS

General:
Extraer DNA a partir de fresas.

Especficos:
Observar la estructura fibrilar del DNA.
Mejorar la comprensin de conceptos relacionados con el DNA y su aplicacin
logrando el desarrollo de habilidades (simples=caseras).

INTRODUCCIN

DNA genmico
El DNA genmico es el DNA contenido en los cromosomas se utiliza este nombre
para diferenciarlo del DNA extra-cromosmico como son los plsmidos. Tambin es
abreviado como gDNA. La mayora de los organismos tienen el mismo DNA genmico
en cada clula, pero solo ciertos genes sern expresados para permitir que estas
funcionen y puedan diferenciarse en todos los tejidos del cuerpo. [1]

El genoma de un organismo est codificado en el DNA cromosomal y contiene la


informacin gentica que se heredar de un organismo hacia su descendencia. El
genoma es traducido para producir varios tipos de RNA, que son necesarios para el
funcionamiento del organismo. El pre-mRNA o el precursor de mRNA es transcrito
por la RNA polimerasa II en el ncleo de la clula, despus es procesado por splycing
para remover los intrones y dejar los exones en el RNA mensajero maduro. Otra
parte del procesamiento incluye la adicin de un cap 5' al final, y una cola de poli-A
en 3' al pre-mRNA. El mRNA maduro se transporta al citosol para ser procesado por
los ribosomas y producir protenas. Otros tipos de RNA son el RNA ribosomal, rRNA,
y el RNA de trasferencia, tRNA. Estos se transcriben por medio de la RNA polimerasa
III y tambin son esenciales para la sntesis de protenas. [2]

Mutacin gentica
Se denomina mutacin gentica a los cambios que alteran la secuencia de
nucletidos del ADN. Estas mutaciones en la secuencia del ADN pueden llevar a la
sustitucin de aminocidos en las protenas resultantes. Un cambio en un solo
aminocido puede no ser importante si es conservativo y ocurre fuera del sitio activo
de la protena. De lo contrario puede tener consecuencias severas.

Tipos de mutacin gentica:

Mutacin silenciosa o sinnima. No cambia la secuencia de aminocidos de la


cadena polipptidica. Los cambios en el nucletido no resultan en cambios
estructurales o funcionales de la protena.
Mutacin por sustitucin de bases. Se producen al cambiar en una posicin
un par de bases por otro. Distinguimos dos tipos que se producen por
diferentes mecanismos bioqumicos:

o Mutaciones transicionales. Un par de bases es sustituido por su


alternativo del mismo tipo (pricas o pirimdicas). La sustitucin de un
par AT, por ejemplo, por un par GC, sera una transicin.

o Mutaciones transversionales. Un par de bases es sustituida por otra


del otro tipo. Por ejemplo, la sustitucin del par AT por TA o por CG.

Mutacin no sinnima. Los cambios en las bases dan lugar a un nuevo


aminocido, generando cambios estructurales o funcionales en la secuencia
de la protena.
Mutacin nula. Afecta al centro activo, o a un sitio cercano a este, provocando
la posible falta de funcin.

Mutaciones de corrimiento. Se aaden o se quitan pares de nucletidos


alterndose la longitud de la cadena. Si se aaden o quitan pares en un
nmero que no sea mltiplo de tres (es decir, codones), las consecuencias
son especialmente graves, porque a partir de ese punto, y no slo en l, toda
la informacin queda alterada. Hay dos casos:

o Mutacin por prdida o delecin de nucletidos. En la secuencia de


nucletidos se pierde un codn y la cadena se acorta.

o Mutacin por insercin de nuevos nucletidos. Dentro de la secuencia


del ADN se introducen nucletidos adicionales, interpuestos entre los
que ya haba, alargndose correspondientemente la cadena.

Mutaciones en los sitios de corte y empalme (Splicing). Las mutaciones de


corrimiento del marco de lectura tambin pueden surgir por mutaciones que
interfieren con el splicing del ARN mensajero. El comienzo y final de cada
intrn en un gen estn definidos por secuencias conservadas de ADN. Si un
nucletido muta en una de las posiciones altamente conservada, el sitio no
funcionar ms, con consecuencias para el mARN maduro y la protena
codificada. [3]

Economa de la fresa en Mxico


Las principales entidades productoras de esta frutilla son Baja California,
Guanajuato, Estado de Mxico y Michoacn; en esta ltima entidad se concentra la
mayor produccin nacional.
El periodo de cosecha de la fresa en Mxico, vara de una entidad a otra; el estado
de Baja California y Guanajuato, levantan su cosecha a partir del mes de enero;
Guanajuato concluye en julio y Baja California en agosto. Michoacn y el estado de
Mxico tienen el mismo periodo de cosecha, entre los meses de noviembre a junio.

En Mxico se cultivan diferentes variedades, cada una con caractersticas


especficas; y con diferentes rendimientos debido a las pocas de produccin,
resistencias a plagas y enfermedades, sabor, color, tamao, por mencionar algunas.
Cabe mencionar que las variedades utilizadas en Mxico han sido desarrolladas por
la Universidad de California USA y Universidad de Florida USA. Entre las variedades
ms utilizadas en Mxico se encuentran la Festival, Sweet Charlie, Galexia,
Camino Real, Albin, Camarosa, Aromas, Ventana y Diamante.

En el ao 2008 el mercado de la fresa fresca en Estados Unidos registr ventas de


$1,607,762,344 de dlares. El volumen total del mercado en 2008 fue de
644,347,318 libras que equivalen a 292,271 toneladas mtricas. La Repblica
Mexicana produjo en 2008 un total de 208,932.15 toneladas, lo que significa que el
consumo de Estados Unidos rebasa en un 40% el total de la produccin mexicana.
De las fresas frescas importadas en los EE.UU., casi todas provienen de Mxico. En
2008, el 98,9% de las importaciones vinieron de Mxico. El segundo pas de las
importaciones es Canad con 0,4%. [4]

No hay ninguna restriccin relevante para las importaciones de fresas de Mxico.


METODOLOGA EXPERIMENTAL: EXTRACCIN DE DNA GENMICO

Materiales:
2 fresas
1 bolsa de plstico con cierre de seguridad
1 cuchara de plstico
1 vaso de precipitados
1 embudo
1 probeta
1 ablandador de carne
1 detergente lquido para trastes
1 bolsa de sal de mesa fina

Enfriar 50 mL de etanol Lavar las fresas y quitar Colocar en una bolsa


las hojitas

Aadir 2 cucharadas de detergente, 1 cucharada Machacar y hacer pur


de sal y una pizca de ablandador de carne
Colocar un embudo en Filtrar la solucin de Recuperar el DNA
una probeta y colocar fresa y agregar 50 mL en un tubo Falcn
cuadritos de gasa dentro de etanol fro

Refrigerar a 4C hasta la prx sesin


Colocar el DNA en
un tubo Eppendorf

r 1 min mx rev

Resultados

La fresa por su
gar el mismo volumenconsistencia
de suave,Leer
facilita el manejo
absorbancia ende la misma, tiene un
el espectrofotmetro olor agradable,
280/260 y lo cual
hace cmodo el trabajo con
ili-Q, preparar disoluciones ella,enadems
correr es un organismo
gel de agarosa octaploide, es decir, que
1%, rojo texas
1:10, 1:100,1:1000
contiene ocho juegos idnticos de cromosomas, lo cual facilita la extraccin del
material gentico para fines prcticos.

Durante el proceso de lisis las interacciones entre las molculas que conforman la
pared, la membrana celular y nuclear se modifican o destruyen permitiendo que los
cidos nucleicos se liberen. Se utilizan soluciones bsicas, detergentes o agentes
caotrpicos que permiten disolver la membrana celular, as como inhibidores para
inactivar las enzimas que degradan el ADN.

Despus de que son eliminados los lpidos y las protenas, se recupera el ADN.
Para ello, se adiciona etanol y soluciones con altas concentraciones de iones de
sodio o amonio que se unen a los grupos fosfato, esta mezcla reduce las fuerzas
repulsivas entre las cadenas y permite que el ADN se pliegue sobre s mismo
hacindolo insoluble

Una vez realizado el procedimiento de extraccin se observa la formacin de una


capa superior de consistencia viscosa, la cual es el ADN extrado.

Ilustracin 1.-Separacin de fases en la probeta


Una vez que se ha eliminado el etanol, el paso siguiente es hidratar el ADN para
mantenerlo en solucin. En el caso de emplear agua, el pH debe ser de 7 para
permitir la redisolucin completa del ADN y evitar una hidrlisis cida.

Cuando se utiliza una solucin amortiguadora, es preferible utilizar una solucin de


Tris-HCl a 10mM y EDTA a 0.1M a un pH de 8.0 (low TE) para almacenar el material.
Cuando se est disolviendo el ADN es importante evitar el pipeteo y la agitacin
agresiva pues se pueden fragmentar molculas de alto peso molecular. Una opcin
que evita la fragmentacin consiste en incubar a 55 C el ADN, 1 a 2 horas con
agitacin suave.

Cuantificacin del ADN

Una vez obtenido el material gentico, es importante determinar el rendimiento


mediante espectrofotometra. La ley de Beer-Lambert indica que la concentracin
de una molcula en solucin depende de la cantidad de luz absorbida de las
molculas disueltas. Una caracterstica del ADN es que absorbe la luz ultravioleta
(UV) a 260 nm y permite estimar su concentracin mediante espectrofotometra.
Cuando la longitud de la celda en que se disuelve el ADN, es de 1 cm, la
absorbancia es igual a la densidad ptica (DO). En el caso de ADN genmico o de
doble cadena, una densidad ptica equivale a 50 ug/ml. Se debe considerar el factor
de dilucin para obtener la concentracin en nanogramos/microlitro (ng/ul). En el
caso de algunos equipos como el espectrofotmetro Nanodrop, no es necesario
diluir la muestra y el equipo nos proporciona directamente la concentracin en ng/ul.
Considerando que para una reaccin de PCR se requieren de 10 a 200 ng debemos
obtener al menos, 5 ng/ul de ADN en cada muestra, si se recuperaron 50 ul, el
rendimiento neto de la extraccin sera de 0.25 ug. Concentraciones menores
dificultan la estandarizacin de la PCR u otras tcnicas. Para estimar la pureza del
ADN se considera la proporcin de la absorbancia a 260 nm y 280 nm. Una
proporcin de 1.8 es aceptada como ADN puro, proporciones menores a este valor
indican la presencia de protenas. Una segunda valoracin de la pureza de cidos
nucleicos es la proporcin 260/230, los valores aceptados se encuentran en el rango
de 2.0 a 2.2, si la relacin es menor indican la presencia de contaminantes como
carbohidratos o fenol.
1 2 3 4 5 6 7

ADN Genmico

1 2 3 4 5 6 7

ADN Plasmdico

Marcador
Ilustracin 2.- Gel de agarosa para visualizar la integridad del ADN. Carril 1 marcador de peso molecular, carril 2,3,5 y 6 con mucha fragmentacin, carril 4 y 7
vacos.

Ilustracin 3.- Marcador de peso molecular

Ilustracin 4.- Equipo de electroforesis


Comprobacin de la integridad del ADN por electroforesis

Adems de conocer la cantidad y calidad del ADN por espectrofotometra, es


importante conocer si el ADN obtenido est integro. La integridad del ADN se puede
observar mediante electroforesis en gel de agarosa. Si el ADN est integro, se debe
observar una banda estrecha cercana al pozo en que se coloc la mezcla de ADN.
Si est fragmentado, se observar una banda de ms de un cm de ancho o un
sendero luminoso en el carril de la muestra (Ilustracin 2). El ADN fragmentado
dificulta la amplificacin de productos de PCR de alto peso molecular y afecta la
reproducibilidad de las tcnicas.

Conclusiones

La obtencin de ADN integro y puro es una parte fundamental para el buen


desempeo de las tcnicas utilizadas en biologa molecular. Una de las ventajas
de utilizar mtodos tradicionales es su bajo costo, as como un alto rendimiento.
Sin embargo, en ocasiones el material obtenido est fragmentado. Estos
mtodos son susceptibles de contaminacin, variacin y errores por los mltiples
pasos de manipulacin.
El rendimiento y el uso de los kits depende del tipo de tejido y la cantidad de
muestra inicial, as como de la capacidad de unin de la membrana.
En los ltimos aos ha aumentado el uso de los de mtodos de extraccin
comerciales debido a que la matriz permite capturar selectivamente al ADN
haciendo posible obtener un extracto de alta pureza con molculas ntegras; al
tiempo que se reduce el nmero de pasos en la extraccin y se disminuye la
posibilidad de contaminacin con ADN o ARN exgeno .
Extractos con estas caractersticas aumentan la sensibilidad y reproducibilidad
de las tcnicas moleculares, con lo que se garantiza la obtencin de resultados
confiables.
Aunque se sacrifique el rendimiento en algunas ocasiones, las tcnicas actuales
de biologa molecular no requieren de grandes cantidades de material gentico.
Independientemente del mtodo de extraccin que se utilice, lo importante es
realizar cada paso con cuidado para obtener ADN integro y puro que permita
llevar a cabo las tcnicas posteriores.

Referencias
1. Wise Geek. (2003). What is Genomic DNA? Disponible en:
http://www.wisegeek.org/what-is-genomic-dna.htm

2. Perry, R. (1976). "Processing of RNA". Annu. Rev. Biochem. 45: 605630.

3. Griffiths, A; Gelbart, W; Miller, J, et al. (1999). The Molecular Basis of


Mutation. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21322/

4. Unin Agrcola Regional de Productores de Fresa y Hortalizas del Valle de


Zamora. (2009). Sistema productor fresa. Estudio de oportunidades de
mercado e inteligencia comercial internacional para fresa. Disponible en:
http://www.sagarpa.gob.mx/agronegocios/Documents/Estudios_promercad
o/FRESA.pdf