LOCALIZACIÓN)TISULAR)DE)MARCADORES)RELACIONADOS)CON)MALFORMACIONES)EN)LARVAS)DE)

LENGUADO)(Solea&senegalensis))PROVOCADAS)POR)LA)SALINIDAD)
P.)Armesto)1,)C.)Infante2,)X.)Cousin3)y)M.)Manchado1!!!
!
1!IFAPA!centro!El!Toruño,!camino!6ro!de!pichón!s/n,!11500,!El!Puerto!de!Santa!María!paula.armesto@juntadeandalucia.es!
2!Fitoplancton!Marino,!Dársena!Comercial!s/n!(Muelle!Pesquero),!11500,!El!Puerto!de!Santa!María!
3!IFREMER,!Laboratoire!Ressources!halieu6ques,!place!Gaby!Coll,!BP!7,!17137!L’Houmeau,!France!

Summary!
Previous! studies! revealed! that! incuba6on! of! Senegalese! sole! eggs! in! low! salinity! water! (10! ppt)! produced! nonZfunc6onal! larvae! showing! a! 100%! of! occurrence! in! mouth! deformi6es.! The! aim! of! this! work! was! to! decipher!
mechanisms!underlying!the!effect!of!salinity!using!staining!techniques!and!whole!mount!larvae!in#situ!expression!of!key!genes!for!osmoregula6on!and!head!development!in!early!postZhatching!larvae.!!
Resumen!
Estudios!previos!mostraron!que!la!incubación!de!embriones!de!lenguado!senegalés!en!agua!de!baja!salinidad!(10!ppt)!produce!larvas!disfuncionales!el!100%!de!las!cuales!muestra!malformaciones!en!la!boca.!El!obje6vo!de!este!
trabajo! es! elucidar! los! mecanismos! subyacentes! en! el! efecto! de! la! salinidad! mediante! tecnicas! de! 6ncion! y! expresión! in# situ! en! larvas,! de! genes! clave! para! la! osmoregulación! y! el! desarrollo! de! la! cabeza! en! larvas! recién!
eclosionadas.!

JusMficación!
El!lenguado!senegalés!(Solea#senegalensis#Kaup,!1858)!es!una!especie!eurihalina!que!se!encuentra!expuesta!a!cambios!significa6vos!de!salinidad.!Se!requiere!un!mayor!conocimiento!de!la!
influencia!de!la!salinidad!sobre!su!desarrollo,!especialmente!en!Andalucía,!donde!algunas!empresas!han!apostado!fuertemente!por!el!cul6vo!de!esta!especie!en!aguas!salobres.!Estudios!previos!
de!nuestro!grupo!demostraron!que!es!necesario!mantener!valores!de!salinidad!superiores!a!10!ppt!durante!los!primeros!días!de!cul6vo!para!el!desarrollo!adecuado!de!la!boca!(SalasZLeiton!et#
al.,!2012).!Actualmente,!no!se!conocen!las!bases!moleculares!de!estas!observaciones.!!
En! el! marco! del! proyecto! AQUAGENET! se! han! desarrollado! estudios! de! transcriptoma! masivos! para! la! iden6ficación! de! genes! expresados! diferencialmente! ante! diferentes! condiciones! de!
salinidad,!pero!aún!no!se!conoce!la!ubicación!específica!de!muchos!de!los!genes!diferencialmente!expresados.!
El! obje6vo! de! este! trabajo! ha! sido! describir! la! malformación! observada,! localizar! la! expresión! de! genes! clave! en! osmoregulación! (atp1a1a),! control! endocrino! del! balance! hídrico! (agt)! y!
formación!del!carilago!de!la!cabeza!(sox9a)!mediante!hibridación!in#situ#(ISH)!y!determinar!si!dicha!expresión!se!ve!afectada!por!la!salinidad!en!larvas!de!lenguado!senegalés!de!1!a!3!días!tras!
la!eclosión.!

Material)y)Métodos!!!
Los! embriones! de! lenguado! se! obtuvieron! de! una! puesta! única! y! se! sembraron! en! fase! de!
blastodisco,! equivalente! a! fase! 1! según! Fonds! (1979)! o! 3Z4! según! Devauchelle! et! al.! (1987)! a!
salinidades! de! 10,! 20! y! 36! ppt! por! duplicado.! Las! larvas! se! muestrearon! a! día! 1,! 2! y! 3! tras! la!
eclosión,! se! fijaron! y! se! conservaron! de! acuerdo! con! lo! descrito! por! Thisse! y! Thisse! (2008).! La!
generación!de!las!ribosondas!marcadas!con!digoxigenina!se!realizó!mediante!amplificación!por!PCR!
seguida! de! transcripción! como! se! ha! descrito! anteriormente! (Limle! et# al.,! 2007,! Rumballe! et# al.,!
2008).!Las!hibridaciones!in#situ!se!realizaron!según!se!describe!en!Thisse!y!Thisse!(2008),!la!6nción!
con! azul! Alcian! se! hizo! según! el! protocolo! publicado! por! Walker! y! Kimmel! (2007)! y! la! 6nción!
inmunohistoquímica! según! lo! descrito! por! ! Macdonald! et# al.! (1999).! Tras! la! 6nción,! las! larvas! se!
conservaron! en! glicerol! 100%! y! previamente! a! ser! fotografiadas! se! sus6tuyó! el! glicerol! por!
me6lcelulosa!al!2%.!

1.  Descripción)de)la)naturaleza)de)las)malformaciones)mediante)Mnciones)histológicas)(Azul)AlciánjRojo)Alizarina)e)inmunohistoquímica)de)la)miosina))

Cbr Cbr

Ih

Etm Etm Hsi

Hsi

AH P P?
AH?
36ppt! CM CM
10ppt!
IH!

HSY!
HB!
! !

36ppt!
! 10ppt!
!
La) incubación) a) salinidad) 10) ppt) produjo)
malformaciones) a) nivel) de) hueso) y) carWlago)
incluyendo!una!deformación!de!la!parte!frontal!del!cráneo,!
menor! longitud! en! la! placa! etmoide! (Etm),! alteración! de! la!
A)salinidad)de)10)ppt,)el)músculo)se)desarrolló)tanto)en)la)mandíbula)como)en)las)aletas)pectorales)aunque)de)forma)alterada)debido)a)su)
posición! y! deformación! de! la! ceratobranquia! (Cbr),! el! arco! formación)sobre)un)carWlago)malformado!(en!rojo,!el!músculo!malformado!a!salinidad!baja!y!en!verde!el!músculo!normal!a!salinidad!20!y!36!ppt).!
hioideo! (AH),! el! carilago! hiosimplec6co! (Hsi),! el! carilago! A!salinidad!intermedia!(20!ppt),!el!desarrollo!muscular!fue!normal!pero!retrasado!en!el!6empo!respecto!a!la!salinidad!control!!(en! ,!inicio!de!la!
interhial! (Ih),! el! carilago! de! Meckel! (CM)y! el! arco! formación!del!músculo!de!las!aletas!pectorales).!
palatocuadrado!(P)!así!como!menor!densidad!y!longitud!del!
carilago!de!las!aletas!pectorales!y!ausencia!de!radios.!

2.)Localización)especifica)de)la)expresión)del)angiotensinógeno)(agt),&subunidad&alfa&1a&de&ATPasa&Na+K+&(atp1a1a)&y&SRY<box&containing&gene&9a&(sox9a)&mediante)ISH)y)
determinación)de)diferencias)en)la)expression)inducidas)por)la)salinidad.)
)
La! expresión! de# agt! se!
localizó! específicamente!
en! hígado! (H)! y! difirió!
entre!las!larvas!incubadas!
a! 10! ppt! y! aquellas!
! incubadas! a! 20! y! 36! ppt! !
e n ! c u a n t o! a ! s u! !
! localización.! Estos! se!
podría! explicar! por! un!!
retraso! en! la! absorción!
!
La!expresión!de#atp1a1a#se!localizó!en!el!tubo!neural!(Tn)!
y!en!tejidos!osmoreguladores!tales!como!la!branquia!(Br),!
!
La! expresión! de! sox9a# se! localizó! en! las! poblaciones! de! células!
precursoras!del!carilago!de!la!cabeza!originarias!de!la!cresta!neural!del!
del! vitelo,! tal! como!
observaron! SalasZLeiton! intes6no! (I)! y! riñón! (R).! Se! observó! menor! expresión! en! embrión.! En! este! caso,! la! expresión! mostró! diferencias! significa6vas! en!
et! al.! (2012),! que! podrá! branquias!a!salinidad!10!ppt!lo!que!coincide!con!la!función! las!larvas!de!1!día!tras!la!eclosión!siendo!a!salinidad!10!ppt!menor!en!la!
afectar! a! la! situación! del! osmoreguladora!de!este!gen!para!una!mayor!excreción!de! mandíbula! inferior! y! ausente! en! parte! de! las! células! precursoras! de! los!
hígado!en!formación.! sales!a!salinidades!más!altas.! arcos!faríngeos!y!la!mandíbula!superior.!!
! !

La)incubación)de)embriones)de)lenguado)a)salinidad)baja)(10)ppt))causa)malformaciones)en)la)boca)y)las)aletas)pectorales)(ver)video)en)www.aquagenet.eu).)
Dichas)malformaciones)ocurren)a)nivel)de)hueso,)carWlago)y)músculo)y)Menen)orígen)en)la)disrupción)parcial)o)retraso)en)el)Mempo)de)migración)de)las)células)
de)la)cresta)neural.))

Bibliogra]a)
Devauchelle) N.) et) al.,) 1987.! Aquaculture! 66:! 125–147;! Fonds) M.) 1979.! Marine# Ecology# Progress# Series! 1:! 91–99;! Liale) M.H.) et al., ) 2007.! Gene# Expression# Pa<erns! 7:! 680–699;! Macdonald) R.) et al., 1999.! En:#
Molecular#Methods#in#Developmental#Biology##Humana!Press:!77Z88;!Rumballe)B.)et al., 2008.!CSH#Protocols.!310.1101/pdb.prot5030;!Thisse)C.)y)B.)Thisse.)2008.)Nature#Protocols!3:!59–69;!Walker)MB)y)C.B)Kimmel.)
2007)Biotech#Histochem.!82(1):!23Z8.!
Agradecimientos!
La!asistencia!técnica!de!Raúl!López,!Fermín!Vélez!y!Manuel!Aparicio!fue!indispensable!para!llevar!a!cabo!el!cul6vo!larvario.!
Este!trabajo!ha!sido!financiado!por!el!proyecto!AQUAGENET!incluido!dentro!del!programa!INTERREG!IVB!SUDOE!(FEDER)!(SOE2⁄1381P1⁄E287).!!