Você está na página 1de 41

INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E

TECNOLOGIA DE PERNAMBUCO – CAMPUS RECIFE


COORDENAÇÃO DO CURSO TÉCNICO EM QUÍMCIA
INDUSTRIAL

RELATÓRIO DE ESTÁGIO

PURIFICAÇÃO E PRESERVAÇÃO DE LINHAGENS


DE LEVEDURAS PRÉ-ISOLADAS EM INDÚSTRIAS
DE LATICÍNIOS DE GARANHUNS

Daywison Silva Rodrigues Gambôa

Recife-PE, julho de 2017


IFPE - INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE
PERNAMBUCO - CAMPUS RECIFE.

COORDENAÇÃO DO CURSO TÉCNICO DE QUÍMICA INDUSTRIAL

RELATÓRIO DE ESTÁGIO

PURIFICAÇÃO E PRESERVAÇÃO DE LINHAGENS DE


LEVEDURAS PRÉ-ISOLADAS EM INDÚSTRIAS DE
LATICÍNIOS DE GARANHUNS.

Relatório que o aluno Daywison Silva Rodrigues


Gambôa do curso Técnico em Química Industrial
apresenta à Supervisão de Estágio para atender ao
cumprimento de estágio obrigatório.

Recife-PE, julho de 2017

i
EQUIPE TÉCNICA

Estagiário

Daywison Silva Rodrigues Gambôa

Supervisor Técnico na Empresa

Pesquisadora Flávia Guilherme da Silva

Supervisor no IFPE – Campus Recife

Professor Ramon Fernandes da Silva

Orientador no IFPE – Campus Recife

Professor Ramon Fernandes da Silva

ii
SUMÁRIO

LISTA DE TABELA ............................................................................................................................... v


LISTA DE FIGURAS ............................................................................................................................. vi
RESUMO ............................................................................................................................................... vii
1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................................. 8
1.1. O CENTRO DE TECNOLOGIAS ESTRATÉGICAS DO NORDESTE .................................... 8
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA .................................................................................................... 13
2.1. MANIPULAÇÃO ASSÉPTICA ................................................................................................ 13
2.1.1. TERMINOLOGIA .............................................................................................................. 13
2.1.2. ÁLCOOL ETÍLICO ............................................................................................................ 14
2.1.3. ULTRAVIOLETA .............................................................................................................. 14
2.1.4. CABINES DE SEGURANÇA BIOLÓGICA ..................................................................... 14
2.2. ESTERILIZAÇÃO ..................................................................................................................... 15
2.2.1. ESTERILIZAÇÃO POR CALOR UMIDO ........................................................................ 15
2.2.2. ESTERILIZAÇÃO POR CALOR SECO ........................................................................... 16
2.2.3. FILTRAÇÃO ...................................................................................................................... 17
2.4. ISOLAMENTO DE MICROORGANISMOS: TÉCNICA DO ESGOTAMENTO POR
ESTRIAS........................................................................................................................................... 17
2.5. PRESERVAÇÃO DE MICROORGANISMOS POR BAIXA TEMPERATURA ................... 18
3. ATIVIDADES DESENVOLVIDAS NO ESTÁGIO........................................................................ 19
3.1. TRATAMENTO DE VIDRARIAS E ACESSÓRIOS PARA USO EM TRABALHOS
MICROBIOLÓGICOS ..................................................................................................................... 19
3.1.1. EQUIPAMENTOS E MATERIAIS UTILIZADOS ........................................................... 19
3.1.2. PREPARO PARA ESTERILIZAÇÃO ............................................................................... 20
3.1.2.1. PLACAS DE PETRI .................................................................................................... 20
3.1.2.2. TUBOS DE ENSAIO ................................................................................................... 20
3.1.2.3. TUBOS DE ENSAIO COM TAMPA .......................................................................... 21
3.1.2.4. ERLENMEYERS E KITASSATOS ............................................................................ 21
3.1.2.5. PONTEIRAS DE 200µL E DE 1000µL ...................................................................... 22
3.1.2.6. TUBOS DE EPPENDORF, TUBOS CRIOGÊNICOS E PONTEIRAS DE 5.000µL E
DE 10.000µL ............................................................................................................................. 22
3.1.2.7. TUBOS DE FALCON ................................................................................................. 23
3.1.2.8. FRASCOS GRADUADOS DE VIDRO BORISSILICATO COM TAMPA .............. 23
iii
3.1.3. ESTERILIZAÇÃO .............................................................................................................. 24
3.1.3.1. ESTERILIZAÇÃO POR CALOR SECO .................................................................... 24
3.1.3.2. ESTERILIZAÇÃO POR CALOR UMIDO ................................................................. 24
3.1.4. ARMAZENAMENTO ........................................................................................................ 24
3.1.5. DESCONTAMINAÇÃO .................................................................................................... 25
3.1.6. LIMPEZA............................................................................................................................ 25
3.2. PREPARO DE MEIOS DE CULTURAS E SOLUÇÕES ......................................................... 25
3.2.1. EQUIPAMENTOS E MATERIAIS UTILIZADOS ........................................................... 25
3.2.2. YPD-ÁGAR ....................................................................................................................... 26
3.2.3. YPD e YPL.......................................................................................................................... 28
3.2.4. YPM-ÁGAR........................................................................................................................ 28
3.2.5. YNB-Maltose ...................................................................................................................... 29
3.2.6. GLICEROL 60% (volume/volume) .................................................................................... 29
3.2.7. ALCOOL ETÍLICO 70% (volume/volume) ....................................................................... 30
3.3. PURIFICAÇÃO E PRESERVAÇÃO DE LINHAGENS DE LEVEDURAS ........................... 31
3.3.1. EQUIPAMENTOS E MATERIAIS UTILIZADOS ........................................................... 31
3.3.2. REPIQUE DAS CULTURAS ORIGINAIS PARA PLACA .............................................. 31
3.3.3. REPIQUE DA PLACA PARA TUBOS DE CULTURA ................................................... 32
3.3.4. PRESERVAÇÃO DAS LINHAGENS DE LEVEDURAS PURAS .................................. 33
3.5. PREPARO DAS SOLUÇÕES PADRÕES PARA CALIBRAÇÃO DO SISTEMA HPLC ..... 35
3.5.1. EQUIPAMENTOS E MATERIAIS UTILIZADOS ........................................................... 35
3.5.2. PROCEDIMENTO.............................................................................................................. 36
4. CONCLUSÃO .................................................................................................................................. 38
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................................. 39

iv
LISTA DE TABELA

Tabela 1: Terminologia do crescimento microbiano .............................................................................. 13


Tabela 2: Concentração dos padrões nas várias diluições ...................................................................... 37

v
LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Prédio principal do CETENE ................................................................................................... 8


Figura 2: Sala principal do LABIO .......................................................................................................... 9
Figura 3: Estoque de meios de cultura do LABIO ................................................................................. 10
Figura 4: Estoque de reagentes químicos do LABIO ............................................................................. 10
Figura 5: Sala de preparação .................................................................................................................. 10
Figura 6: Sala de apoio ........................................................................................................................... 11
Figura 7: Sala de crescimento e cultivo.................................................................................................. 11
Figura 8: Sala de fluxo ........................................................................................................................... 12
Figura 9: Mudança de coloração da fita adesiva indicadora para autoclave .......................................... 16
Figura 10: Técnica de semeadura por esgotamento ............................................................................... 18
Figura 11: Placas de Petri embaladas em jornal ..................................................................................... 20
Figura 12: Tubos de ensaios tamponados .............................................................................................. 21
Figura 13: Etapas do processo de preparação dos erlenmeyers ............................................................. 22
Figura 14: Ponteiras de 200µL em suporte ............................................................................................ 22
Figura 15: Ponteiras de 5.000 e de 10.000µL prontas para a esterilização ............................................ 23
Figura 16: Frascos Graduados prontos para a esterilização ................................................................... 23
Figura 17: Pesagem de peptona .............................................................................................................. 27
Figura 18: Medição do teor alcoólico com alcoômetro .......................................................................... 30
Figura 19: Distribuição de meio YPD em tubos de ensaio .................................................................... 33
Figura 20: Transparência das culturas puras para criotubos .................................................................. 34
Figura 21: Criotubos vedados com parafilm e etiquetados .................................................................... 35

vi
RESUMO

O trabalho teve como objetivo principal a purificação e preservação de leveduras pré-


isoladas em indústrias de laticínios localizadas em Garanhuns-PE. As atividades foram
desenvolvidas no Centro de Tecnologias Estratégicas do Nordeste, dentro do Laboratório de
Bioprocessos, do Laboratório de Fitoquímica e Processos e da Central Analítica. A
purificação de leveduras foi efetuada pela técnica do esgotamento por estrias e a preservação
foi feita por baixa temperatura (-20°C e -80°C) na presença de glicerol a 30% como agente
crioprotetor. Também foi feito a preparação de materiais de laboratório para a esterilização, a
esterilização deles por autoclavagem e por estufa de ar quente, preparação de meios de
culturas e preparação de soluções padrões para calibrar um sistema de cromatografia liquida
de alta eficiência.

vii
8

1. INTRODUÇÃO
Este relatório tem o objetivo de descrever as atividades que desenvolvi no Centro de
Tecnologias Estratégicas do Nordeste (CETENE), no período de 05/12/2016 à 05/05/2017,
para cumprir o estágio curricular obrigatório do curso técnico em química industrial do
Instituto Federal de Educação, Tecnologia e Ciência de Pernambuco (IFPE) - Campus Recife.

O estágio se desenvolveu quase que em sua totalidade no Laboratório de Bioprocessos


(LABIO), onde foram desenvolvidas atividades acompanhando uma pesquisadora que
trabalha no projeto do soro do queijo. O projeto tem o objetivo de descobrir novas leveduras
com potencial para produzir etanol utilizando soro de queijo (efluente liquido gerado no
processo de fabricação de queijos) como substrato.

Outra menor parte do estágio se desenvolveu na Central Analítica e no Laboratório de


Fitoquímica e Processos (LAFIP), com a preparação de padrões para calibrar um sistema de
cromatografia liquida de alta eficiência, ou sistema HPLC (do inglês: High Performance
Liquid Chromatography).

1.1. O CENTRO DE TECNOLOGIAS ESTRATÉGICAS DO NORDESTE


O CETENE (Figura 1), localizado na Avenida Professor Luís Freire, na Cidade
Universitária em Recife-PE, é uma unidade de pesquisa do Ministério da Ciência, Tecnologia
Inovação e Comunicação (MCTIC), que tem o objetivo de desenvolver e aperfeiçoar
tecnologias que possam ser aplicadas para o desenvolvimento econômico e social do nordeste
brasileiro, além de fornecer infraestrutura para a comunidade acadêmica poder desenvolver
pesquisas com laboratórios e equipamentos de altíssimo nível. O CETENE atua nas áreas de
biotecnologia, microeletrônica e nanotecnologia.

Figura 1: Prédio principal do CETENE.


9

No LAFIP desenvolvem-se atividades relacionadas à preparação de amostras, que


posteriormente são mandadas para a Central Analítica. Nele se realiza processos de extração e
transesterificação de óleos e gorduras, análise de viscosidade de óleos, moenda de tecidos,
dentre outras atividades.

Na Central Analítica são desenvolvidos os diferentes métodos de cromatografia, que


possibilitam a purificação, identificação e quantificação de substâncias. Ela conta com
diversos cromatógrafos, como gasosos, líquidos de alta eficiência e supercrítico.

Toda a manipulação de micro-organismos em pesquisas do CETENE é realizada no


LABIO, que possui infraestrutura para o desenvolvimento seguro das atividades em
microbiologia. O laboratório é dividido em uma área com nível de biossegurança 1 (NB-1),
onde foram realizada as atividades descritas nesse relatório, e uma área com nível de
biossegurança 2 (NB-2). O NB-1 é dividido em cinco partes: Sala principal, sala de
preparação, sala de apoio, sala de crescimento e cultivo e a sala de fluxo.

A sala principal (Figura 2) conta com agitadores magnéticos, Freezer, balanças


analíticas e outros equipamentos. Em sua bancada são realizadas atividades diversas, como o
preparo de meios de culturas e de soluções. Nela estão localizados os estoques de meios de
culturas (Figura 3) e de reagentes químicos (Figura 4) do LABIO.

Figura 2: Sala principal do LABIO


10

Figura 3: Estoque de meios de cultura do LABIO Figura 4: Estoque de reagentes químicos do LABIO

A sala de preparação (Figura 5) é o local onde os materiais que precisam ser


esterilizados são preparados para a esterilização. Nele se encontra as pias onde é feita a
lavagem de vidrarias, barrilete com água destilada e equipamentos como o ultrapurificador de
água e a macrocentrífuga refrigerada.

Figura 5: Sala de preparação

Na sala de apoio (Figura 6) são feito os processos de esterilização e descontaminação


de materiais. Ele conta com uma autoclave utilizada para esterilização, uma autoclave
utilizada para descontaminação, uma estufa utilizada para esterilização, uma estufa utilizada
para secagem de materiais, uma capela química, dentre outros equipamentos.
11

Figura 6: Sala de apoio

A sala de crescimento e cultivo (Figura 7) é o local que contem os equipamentos


necessários para garantir o melhor desenvolvimento dos micro-organismos. Ela conta com
uma câmara de germinação com alternância de temperatura, incubadoras com agitação orbital,
geladeiras, um ultrafreezer, um liofilizador, dentre outros equipamentos.

Figura 7: Sala de crescimento e cultivo

Na sala de fluxo (Figura 8) é feita a manipulação de micro-organismos. Ela possui


cabines de segurança biológica, agitador de tubos tipo vortex, espectrofotômetro, microscópio
óptico, dentre outros equipamentos.
12

Figura 8: Sala de fluxo


13

2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA

2.1. MANIPULAÇÃO ASSÉPTICA


Laboratórios de microbiologia são locais onde microbiologistas manipulam micro-
organismos. Como os micróbios estão presentes em quase todos os lugares, para que esse tipo
de atividade possa ser desempenhado deve-se adotar um conjunto de procedimentos que
criem um ambiente asséptico para a manipulação, evitando que o material a ser manipulado
seja contaminado com os micro-organismos do ambiente, como os que estão presentes na mão
do manipulador, em suspensão no ar, na superfície onde o material será manipulado, dentre
outros.

2.1.1. TERMINOLOGIA
Em microbiologia, existe um conjunto de termos específicos que são utilizados no
controle de crescimento microbiano. As definições dos principais termos relativos ao controle
do crescimento microbiano utilizados nesse relatório estão presentes na Tabela 1.

Tabela 1: Terminologia do controle do crescimento microbiano

TERMO DEFINIÇÃO
Processo de destruição, inativação definitiva e/ou remoção de todas as
Esterilização
formas de vida de um objeto ou material
Utilização de produtos (microbicidas ou microbiostáticos) sobre a pele
Antissepsia ou mucosa, com o objetivo de reduzir os micro-organismos em sua
superfície
Agente químico que mata ou inibe o crescimento de micro-organismos,
Antisséptico
sendo suficientemente atóxico para ser aplicado em tecidos vivos
Qualquer tratamento usado em um objeto inanimado para matar ou
Desinfecção
inibir o crescimento de micro-organismos
Desinfetante Agente antimicrobiano utilizado somente em objetos inanimados
Livre de, ou que emprega meios para ficar livre de micro-organismos
Asséptico
contaminantes.
Tratamento que torna um objeto ou superfície inanimada segura ao
Descontaminação
manuseio
Compostos orgânicos de ocorrência natural ou sintética que inibem ou
Antibiótico destroem bactérias de maneira seletiva, geralmente a baixas
concentrações
Agente químico genérico que mata germes, micróbios: bactericida -
Microbicida
mata bactérias; fungicida - mata fungos; etc
Agente químico que inibe o crescimento e multiplicação de micro-
Microbioestático
organismos, sem matá-los.
Fontes: ALTERTHUN; TRABULSI, 2004, p. 58; BROOKS et al., 2014, p. 62; CASE; FUNKE; TORTORA,
2012, p.861; MADIGAN et al., 2016, p. 944 e 947; SAERJ, 2006, p.838.
14

2.1.2. ÁLCOOL ETÍLICO


De acordo com Tortora, Funke e Case (2012, p.197), Os alcoóis tem efetiva ação
microbicida contra fungos e bactérias na forma vegetativa, tendo como principal mecanismo
de ação a desnaturação proteica, mas também podendo romper membranas e dissolver
diversos lipídeos. O álcool etílico é o mais utilizando, sendo usado tanto como para a
antissepsia quanto para a desinfecção.

Como age por desnaturação proteica, álcool etílico de alta pureza apresenta menos
atividade microbicida que misturas hidroalcoólicas, pois a presença de água facilita a
desnaturação das proteínas (TRABULSI; ALTERTHUN, 2004, p.62). De acordo com
Andrade et al. (2007, p. 251), a concentração ótima de etanol é de 70% (massa/volume),
sendo está superior sobre diferentes concentrações alcoólicas, e sua a atividade microbicida
decresce acentuadamente em concentrações inferiores a 50% e superiores a 70%.

2.1.3. ULTRAVIOLETA
A radiação ultravioleta (UV) danifica o DNA, provocando a formação de ligações
entre bases pirimídicas (principalmente timinas) adjacentes. Esses dímeros que são formados
pela exposição à luz UV causam alterações na replicação do DNA durante a reprodução
celular (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012, p. 193).

“A radiação UV é útil na desinfecção de superfícies e ar, e é amplamente utilizada


para descontaminar e desinfetar a superfície de trabalho de fluxos laminares equipados com
uma lâmpada UV ‘germicida’” (MADIGAN et al., 2016, p. 174). Uma desvantagem da
radiação UV é seu baixo poder de penetração, o que limita o seu efeito aos micro-organismos
que estão diretamente expostos a ela (TRABULSI; ALTERTHUN, 2004, p. 58).

2.1.4. CABINES DE SEGURANÇA BIOLÓGICA


A cabine de segurança biológica é o principal equipamento utilizado em laboratórios
de microbiologia para proteger tanto os funcionários quanto o meio ambiente de aerossóis
formados nos processos laboratoriais que possam oferecer risco biológico. Existem cabines de
segurança biológica do tipo I, II e III, onde a escolha de qual classe usar no laboratório
15

depende do risco dos micro-organismos que serão manipulados nele (YEKI et al., 2006, p.
223).

A cabine do tipo I apresenta um filtro de alta eficiência para ar particulado, ou filtro


HEPA (do inglês: High Efficiency Particulate Air), que filtra as partículas contaminadas
formadas nas operações dentro da cabine, devolvendo o ar que sai da cabine livre de
contaminação, protegendo o ambiente e o manipulador, mas não protegendo a amostra. A
cabine do tipo II é semelhante a do tipo I, mas além do filtro HEPA na saída ela apresenta
outro filtro HEPA na entrada de ar, protegendo assim o ambiente, o manipulador e a amostra.
A cabine do tipo III, diferentemente das anteriores, não troca ar com ambiente. Ela é
totalmente fechada e funciona com ar estéril e sob pressão negativa, oferecendo o máximo de
proteção ao ambiente, ao manipulador e à amostra (ZOCHIO, 2017).

A maioria das cabines de segurança biológica possui uma lâmpada UV germicida,


utilizada para fazer a desinfecção da mesma. Yeki et al (2008) demonstraram a eficiência da
descontaminação de cabines com álcool 70% e radiação UV.

2.2. ESTERILIZAÇÃO
É imprescindível que todos os materiais que vão entrar em contato direto com os
meios de culturas ou com as culturas de micro-organismos sejam previamente esterilizados. A
esterilização pode ser alcançada tanto por métodos físicos quanto por métodos químicos. Nas
atividades descritas nesse relatório foram utilizados como métodos físicos de esterilização o
calor seco, calor úmido e filtração.

2.2.1. ESTERILIZAÇÃO POR CALOR UMIDO


A esterilização com calor úmido necessita de temperaturas acima do ponto de ebulição
da água para ser rápida e confiável, pois os endósporos e alguns vírus conseguem sobreviver
por muitas horas à fervura da água em pressão ambiente. Essas temperaturas podem ser
obtidas por vapor sob pressão, em autoclaves. Com vapor sob pressão a temperatura de
121°C, cerca de 15 minutos é suficiente para matar todos os micro-organismos, incluindo os
vírus e endósporos, sendo este o método preferido para a esterilização de materiais que não
são danificáveis por calor ou umidade (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012, p. 188).
16

O calor úmido mata os micro-organismos principalmente pelo rompimento de ligações


de hidrogênio, que causa alteração na estrutura tridimensional das proteínas com consequente
inativação. “A esterilização pelo vapor saturado sob pressão, realizado em autoclaves, destrói
micro-organismo pela ação combinada da temperatura, pressão e umidade que promovem a
termocoagulação e a desnaturação das proteínas” (RIGHETTI; VIEIRA, 2012, p. 185).

No mercado existem métodos que indicam com praticidade se a esterilização foi


obtida. Um deles são as fitas adesivas indicadoras para autoclave, onde reações químicas
fazem o indicador, presente na fita, mudar de cor quando o tempo e a temperatura corretos são
atingidos (Figura 9).

Figura 9: Mudança de coloração da fita adesiva indicadora para autoclave: a) cor inicial da fita; b) cor
da fita ao atingir a esterilidade.

2.2.2. ESTERILIZAÇÃO POR CALOR SECO


Diferente do calor úmido, o calor seco mata os micro-organismos por efeitos de
oxidação. Um dos meios de esterilização por calor seco é a esterilização por ar quente, que
pode ser feita em estufas. Uma temperatura de 170°C por duas horas geralmente é suficiente
para garantir a esterilização (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012, p.191).
Outro procedimento, mas não necessariamente esterilizante, envolvendo calor seco é a
flambagem, onde o material é submetido a um contato direto a chama. Um caso particular da
flambagem é o aquecimento ao rubro, muito utilizado para esterilizar alças de platina, onde
elas são colocadas diretamente na chama até serem levadas a incandescência. (VIEIRA;
FERNANDES, 2016, p. 20)
17

2.2.3. FILTRAÇÃO
Trabulsi e Alterthun (2004, p.60) definem esterilização por filtração como “a
passagem de soluções ou gases através de filtros de poros suficientemente pequenos que
retêm micro-organismos, pode ser empregada na remoção de bactérias e fungos deixando,
entretanto, passar a maioria dos vírus”.

Muitos tipos de filtros são utilizados com frequência em laboratórios de microbiologia,


como os filtros de profundidade e as membranas filtrantes. Os filtros de profundidades são
laminas ou camadas, constituídas pela sobreposição de fibras de papel ou de vidro
borissilicato. São muito utilizados em cabines de segurança biológica, onde o fluxo de ar
passa por um filtro de profundidade, o filtro HEPA. Membranas filtrantes são feitas de
material polimérico, possuem microporos capazes de reterem micro-organismos e são usadas
rotineiramente em laboratório de microbiologia para filtrar pequenos volumes de líquidos,
com auxílio de uma seringa (MADIGAN et al., 2016, p. 175)

2.4. ISOLAMENTO DE MICROORGANISMOS: TÉCNICA DO ESGOTAMENTO


POR ESTRIAS
Muitas vezes se deseja observar o comportamento de um micro-organismo específico.
Para que isso possa ser feito é necessária a obtenção uma cultura pura do micro-organismo a
ser estudado. Uma das formas de se isolar micro-organismos é pela técnica de esgotamento
por estrias.

O isolamento através do esgotamento por estrias consiste na transferência de uma


alíquota de uma cultura que possui o micro-organismo que se deseja isolar para uma placa de
Petri com um meio de cultura sólido. Com uma alça de inoculação estéril essa cultura é
semeada em séries de estrias, de forma que nas ultimas estrias as células dos micro-
organismos estão suficientemente afastadas para formarem colônias isoladas, quando forem
incubadas (Figura 10). Com as colônias isoladas pode-se escolher a colônia do micro-
organismo que se deseja isolar e transferir para uma um tubo de cultura com meio de cultura
liquido, obtendo assim uma cultura pura (TORTORA; FUNKE; CASE, 2012, p.170).
18

Fonte: MADIGAN et al., 2016, p. 78

Figura 10: Técnica de semeadura por esgotamento

2.5. PRESERVAÇÃO DE MICROORGANISMOS POR BAIXA TEMPERATURA


De acordo com Girão et al. (2004, p. 230), a preservação de micro-organismos é
fundamental para pesquisas científicas que necessitem utiliza-los a longo prazo. Um dos
diversos métodos usados para preservar os micro-organismos é o do congelamento-
descongelamento. “Este método compreende a manutenção de materiais a baixas
temperaturas, -20ºC a -80ºC em freezers, e a ultra-baixas temperaturas, -150ºC a -196°C em
containeres de nitrogênio liquido” (DELLARETTI, 2014, p. 11).

O congelamento até -20°C apresenta as vantagens de ser um método simples, não


necessitando de equipamentos sofisticados e que pode armazenar diversos tipos de micro-
organismos, com segurança, por até dois anos. Uma desvantagem do método é que alguns
micro-organismos podem ser danificados pelos cristais de gelos, correndo o risco de terem
sua viabilidade reduzida (SOLA et al., 2012, p. 1405).

Polge et al. (apud SOLA et al., 2012, p. 1410) verificou, acidentalmente, que o glicerol
causa um efeito de proteção contra os danos do congelamento aos micro-organismos, evitando
que eles percam a sua viabilidade durante o processo.
19

3. ATIVIDADES DESENVOLVIDAS NO ESTÁGIO

3.1. TRATAMENTO DE VIDRARIAS E ACESSÓRIOS PARA USO EM


TRABALHOS MICROBIOLÓGICOS

3.1.1. EQUIPAMENTOS E MATERIAIS UTILIZADOS


 Autoclave vertical CS Prismatec
 Autoclave vertical AV Phoenix Luferco
 Estufa para secagem e esterilização Marconi MA033
 Estufa com recirculação de ar Marconi MA035
 Erlenmeyers
 Frascos graduados de vidro borissilicato com tampa
 Kitassatos
 Placas de Petri
 Ponteiras de 200μL, 1.000μL, 5.000μL e 10.000μl
 Tubos criogênicos
 Tubos de ensaio
 Tubos de ensaio com tampa
 Tubos de Falcon
 Tubos de Eppendorf
 Algodão hidrófobo
 Agulha
 Água Sanitária Comercial
 Bobina de saco plástico
 Detergente Comercial
 Fita adesiva indicadora para autoclave
 Fita adesiva de papel crepado
 Gaze em rolo
 Grampeador
 Papel Alumínio
 Papel Manteiga
20

3.1.2. PREPARO PARA ESTERILIZAÇÃO

3.1.2.1. PLACAS DE PETRI


Inicialmente, as placas de Petri eram dispostas em pares (casadas), ficando uma sobre
a outra, de modo que uma placa funcionava como base e a outra funcionava como tampa. Era
observado se as placas estavam totalmente secas. Se a placa estivesse úmida, ela era secada
com gaze.

As placas de Petri casadas eram empilhadas de cinco em cinco e eram feitos pares de
pilhas com tamanhos próximos. Esses pares de pilhas eram posteriormente embalados,
utilizando fita adesiva de papel crepado e duas folhas de jornal para empacotar cada par de
pilhas (Figura 11).

Figura 11: Placas de Petri embaladas em jornal

3.1.2.2. TUBOS DE ENSAIO


Os tubos de ensaio eram dispostos na bancada e tamponados com algodão hidrófobo
(Figura 12). Utilizando barbante, os tubos tamponados eram amarrados juntos, de modo a
formar um cilindro com os tampões apontando para uma base do cilindro e os fundos dos
tubos apontando para a outra. A base do cilindro que continha a parte tamponada dos tubos
era recoberta com papel alumínio. Os tubos tamponados também podiam, em vez de
amarrados, serem envelopados, utilizando folhas de jornal e grampeador.
21

Figura 12: Tubos de ensaio tamponados

3.1.2.3. TUBOS DE ENSAIO COM TAMPA


Os tubos eram tampados, com o cuidado de não deixa-los hermeticamente fechados
(as tampas deviam ficar levemente desrosqueadas), e amarrados entre si com barbante, de
modo a formar um cilindro com as tampas apontando para uma base do cilindro e os fundos
dos tubos apontando para a outra. A base do cilindro que continha as tampas dos tubos eram
revestidas com papel alumínio e colocava-se fita adesiva indicadora para autoclave.

3.1.2.4. ERLENMEYERS E KITASSATOS


Os erlenmeyers e kitassatos inicialmente eram tamponados com algodão hidrófobo.
Depois de tamponados, os tampões eram removidos e envolvidos em gaze. Amarrava-se a
gaze ao algodão utilizando barbante. Os tampões eram recolocados e o excesso de gaze e de
barbante era removido com a tesoura. Recobriam-se os tampões com papel alumínio. Esse
processo de preparação dos erlenmeyeres é mostrado na Figura 13. Os kitassatos, além disso,
tinham sua saída lateral vedada com papel alumínio amarrado com barbante.
22

Figura 13: Etapas do processo de preparação dos erlenmeyers: a) Erlenmeyer;


b) Erlenmeyr tamponado com algodão; c) Tampão revestido com gase; d) Tampãorecoberto com papel
alumínio.

3.1.2.5. PONTEIRAS DE 200µL E DE 1000µL


As ponteiras de 200µL e de 1000µL eram colocadas em suportes para ponteiras
(Figura 14). Esses suportes eram embalados em papel manteiga, utilizando fita adesiva de
papel crepado. Colocava-se fita adesiva indicadora para autoclave.

Figura 14: ponteiras de 200µL em suportes.

3.1.2.6. TUBOS DE EPPENDORF, TUBOS CRIOGÊNICOS E PONTEIRAS DE


5.000µL E DE 10.000µL
Os tubos Eppendorf, os tubos criogênicos e as ponteiras de 5000µL e 10000µL eram
colocados em recipientes de vidro. Esses recipientes eram tampados e tinham a tampa
23

recoberta com papel alumínio. Caso os recipientes não tivessem tampa, tinham a abertura
revestida com papel alumínio e amarrada com barbante (figura 15). Feito isso, colocava-se
fita adesiva indicadora para autoclave.

Figura 15: Ponteiras de 5.000 e de 10.000µL prontas para a esterilização

3.1.2.7. TUBOS DE FALCON


Os tubos de Falcon eram tampados, com o cuidado de não deixa-los hermeticamente
fechados, e colocados em sacos plásticos. A abertura dos sacos plásticos era fechada com um
nó e os sacos eram furados em vários locais com uma agulha, para não ficarem
hermeticamente fechado. Colocava-se fita adesiva indicadora para autoclave.

3.1.2.8. FRASCOS GRADUADOS DE VIDRO BORISSILICATO COM TAMPA


Os frascos eram tampados, com o cuidado de não deixa-los hermeticamente fechados.
As tampas eram revestidas com papel alumínio e coloca-se fita adesiva indicadora para
autoclave (Figura 16).

Figura 16: Frascos graduados prontos para a esterilização


24

3.1.3. ESTERILIZAÇÃO

3.1.3.1. ESTERILIZAÇÃO POR CALOR SECO


Os materiais que não possuem plástico (placas de Petri, erlenmeyers, kitassatos e tubos
de ensaio), depois de preparados para esterilizar, eram levados á estufa de esterilização. A
estufa de esterilização era ligada e esperava-se a temperatura de 180°C ser atingida. A estufa
era mantida ligada nessa temperatura por uma hora. Passado esse tempo a estufa era
desligada.

3.1.3.2. ESTERILIZAÇÃO POR CALOR UMIDO


Os materiais que possuem plástico (tubos de ensaio com tampa, ponteiras, tubos de
Eppendorf, tubos criogênicos, tubos de Falcon e frascos graduados com tampa), depois de
preparados para a esterilização, eram esterilizados por autoclavagem.

Inicialmente, era verificado se a quantidade de água destilada estava acima da


marcação indicada na autoclave ou se era necessário adicionar mais água destilada, para não
queimar a resistência. Feito isso, os materiais eram dispostos nos cestos e levados à autoclave,
e o equipamento era devidamente fechado. Ligava-se a autoclave no máximo e esperava até
que vapor começasse a sair pela mangueira do equipamento por aproximadamente três
minutos. Após isso, a válvula era fechada e a temperatura e pressão começavam a se elevar no
equipamento.

Quando a temperatura de 121°C era alcançada colocava-se a o aquecimento no médio,


que mantinha a temperatura constante, e marcava-se 15 minutos. Caso existisse muito
material para esterilizar e a autoclave ficasse muito cheia, o tempo era aumentado para 20
minutos. Passado o tempo da esterilização, desligava-se o equipamento e se esperava a
temperatura baixar.

3.1.4. ARMAZENAMENTO
Depois de esterilizados, cada material era guardado em armários e gavetas específicos
no laboratório. Esses materiais estéreis eram utilizados por pesquisadores na manipulação de
micro-organismos e descartados na sala de apoio.
25

3.1.5. DESCONTAMINAÇÃO
Os materiais que chegavam à sala de apoio com uma elevada carga microbiana
passavam pelo processo de descontaminação, que era feito em uma autoclave usada
unicamente para isso. Inicialmente, era verificado o aspecto da água. Se ela estivesse muito
suja, era necessário realizar a troca de água e limpeza da autoclave, com água e detergente.
Também era verificado se a quantidade de água destilada estava acima da marcação indicada,
para não queimar a resistência. Feito isso, os materiais eram levados à autoclave. As placas de
Pétri, antes de irem para a autoclave, eram colocadas em recipientes de plástico, para evitar
que o meio de cultura caísse diretamente na autoclave. Os materiais eram autoclavados a
121°C por 30 minutos. Entretanto, se existisse uma grande quantidade de material para
descontaminar, deixando a autoclave muito cheia, o tempo poderia ser aumentado para até
uma hora.

3.1.6. LIMPEZA
Ao saírem da autoclave, os materiais descontaminados passavam por uma rápida
lavagem com água, para remover o excesso de meio de cultura. Após essa lavagem os
materiais eram, usando baldes, submersos por um dia em água adicionada de detergente e
água sanitária.

Passado um dia, os materiais eram retirados dos baldes e lavados adequadamente,


utilizando esponja ou escova para que qualquer resíduo restante seja removido. Após isso,
colocavam-nos para secar naturalmente no escorredor da sala de preparação ou em bandejas,
na sala de apoio. Se houvesse a necessidade de acelerar a secagem, podia ser utilizada a
estufa. Quando secos, os materiais estão prontos para serem novamente preparados para
esterilização.

3.2. PREPARO DE MEIOS DE CULTURAS E SOLUÇÕES

3.2.1. EQUIPAMENTOS E MATERIAIS UTILIZADOS


 Autoclave vertical CS Prismatec
 Balança analítica Marte AY220
 Balança analítica METTLER TOLEDO AL204
26

 Cabine de Segurança Biológica Classe II ESCO


 Micro-ondas Brastemp
 Ultra purificador de água (Milli-Q) Direct 8
 Alcoômetro Gay Lussac
 Barquinhas para pesagem
 Bastões de Vidro
 Béqueres
 Bico de Bunsen
 Espátulas
 Filtro para seringa 0,22µL
 Fita adesiva indicadora para autoclave
 Fita adesiva de papel crepado
 Frascos spray
 Frascos graduados de vidro borissilicato com tampa
 Placas de Petri
 Plástico Filme
 Provetas
 Água destilada
 Álcool etílico 70% (volume/volume)
 Álcool etílico 92,8% (massa/massa)
 Dextrose
 Extrato de levedura
 Glicerina (pureza mínima de 99,5%)
 Peptona bacteriológica
 Lactose
 Maltose
 Cloranfenicol (6mg/mL)
 Amoxicilina (6mg/mL)

3.2.2. YPD-ÁGAR
Para cada 500mL de meio a produzir, utilizando uma balança analítica, espátulas e
quatro barquinhas para pesagem, pesavam-se 2,5g de extrato de levedura, 5g de peptona, 5g
de glicose e 10g de ágar (Figura 17).
27

Figura 17: Pesagem de peptona

O extrato de levedura, peptona e a glicose eram transferidos quantitativamente para


um béquer de 600mL. Usando um bastão de vidro, fazia-se a pré-dissolução dos mesmos em
água destilada. A solução era transferida quantitativamente para uma proveta de 1L e
adicionava-se água destilada até se obter 490mL de solução (desconta-se 1mL do volume
final para cada grama de ágar).

Parte desta solução era transferida da proveta para um frasco estéril de 500mL. A
outra parte era utilizada para transferir quantitativamente o ágar da barquinha para o frasco.
Em seguida, esse frasco era tampado, com o cuidado de não deixa-lo hermeticamente
fechado. Também era feita a identificação com a data, nome do meio de cultura e o nome do
pesquisador que iria utiliza-lo. Feito isto, colocava-se fita adesiva indicadora para autoclave
nos frascos e eles eram esterilizados por autoclavagem, a 121°C, durante um intervalo de
tempo de 15 a 20 minutos.

O meio estéril era levado à sala de fluxo. Se ele estivesse solidificado era levado ao
micro-ondas, com a tampa levemente desrosqueada, e era aquecido aos poucos, até sua
completa fusão, com o cuidado de não deixar o meio ebulir. No entanto, se o meio fosse ser
utilizado imediatamente após sair da autoclave, ele já estaria fundido, dispensando a
necessidade desse aquecimento. Esperava-se o meio fundido resfriar naturalmente até atingir,
apróximadamente, 40°C. Essa temperatura era identificada empiricamente, admitindo que ela
fosse atingida quando se conseguia segurar o recipiente que o calor machucasse as mãos. O
meio era então levado à cabine de segurança biológica e lá, na presença da chama do bico de
28

Bunsen, era adicionado 1,25mL do antibiótico amoxicilina a 6mg/mL e 1,25mL do antibiótico


cloranfenicol a 0,2mg/mL, para prevenir possíveis contaminações bacterianas.

Ainda na cabine de segurança biológica era feita a distribuição do meio em placas de


Petri estéreis. Transferia-se o meio com antibiótico do frasco para as placas, adicionando a
quantidade mínima de meio suficiente para recobrir toda a superfície da base de cada placa.
Se as placas não fossem ser usadas naquele momento elas eram, de quatro em quatro,
embaladas em plástico filme e guardadas em um armário a temperatura ambiente, para uso
posterior.

3.2.3. YPD e YPL


Para cada 500mL de meio a produzir, utilizando uma balança analítica, espátulas e três
barquinhas para pesagem, pesavam-se 5g de extrato de levedura, 10g de peptona e 10g de
glicose.

O extrato de levedura, peptona e a glicose eram transferidos quantitativamente para


um béquer de 600mL. Usando um bastão de vidro, fazia-se a pré-dissolução dos mesmos em
água destilada. A solução era transferida quantitativamente para uma proveta de 1L e
adicionava-se água destilada até se obter 500mL de solução. Esta solução era transferida da
provera para um frasco estéril de 500mL.

Em seguida, esse frasco era tampado, com o cuidado de não deixa-lo hermeticamente
fechado. Também era feita a identificação com a data, nome do meio de cultura e o nome do
pesquisador que iria utiliza-lo. Feito isto, colocava-se fita adesiva indicadora para autoclave
nos frascos e eles eram esterilizados por autoclavagem, a 121°C, durante um intervalo de
tempo de 15 a 20 minutos.

Para preparar o meio YPL era realizado o mesmo procedimento, modificando a penas
o carboidrato utilizado. No lugar das 10g de glicose utilizava-se 10g de Lactose.

3.2.4. YPM-ÁGAR
Para cada 700mL de meio a produzir, utilizando uma balança analítica, espátulas e
duas barquinhas para pesagem, pesavam-se 7g de extrato de levedura e 14g de peptona,
considerando uma casa decimal de precisão.
29

O extrato de levedura e a peptona eram transferidos quantitativamente para um béquer


de 600mL. Usando um bastão de vidro, fazia-se a pré-dissolução dos mesmos em água
destilada. A solução era transferida quantitativamente para uma proveta de 1L e adicionava-se
água destilada até se obter 550mL de solução. Esta solução era transferida da provera para um
frasco estéril de 1L.

Em seguida, esse frasco era tampado, com o cuidado de não deixa-lo hermeticamente
fechado. Também era feita a identificado com a data, nome do meio de cultura e o nome do
pesquisador que iria utiliza-lo. Feito isto, colocava-se fita adesiva indicadora para autoclave
nos frascos e eles eram esterilizados por autoclavagem, a 121°C, durante um intervalo de
tempo de 15 a 20 minutos.

Em um béquer fazia-se a pesagem de 14g de maltose e a sua pré-dissolução, usando o


mínimo de água destilada necessária para dissolvê-la. Na cabine de segurança biológica e na
presença da chama do bico de Bunsen, usando seringas e filtros para seringa com poro de
0,22µL, filtrava-se a solução com 14g de maltose dissolvida do béquer para o frasco com a
solução estéril de peptona e extrato de levedura. Após isso, transferia-se água destilada estéril
para o frasco até atingir a marcação de 700mL.

3.2.5. YNB-Maltose
Para cada 125mL de meio a produzir, pesava-se 0,98g de YNB e 2,8g de maltose em
um béquer. Com o auxílio do bastão de vidro, fazia-se a pré-dissolução do meio em água
milli-q. Na cabine de segurança biológica e na presença da chama do bico de Bunsen, a
solução era filtrada do béquer para um erlenmeyer, utilizando filtro para seringa com poro de
0,22µL e uma seringa. Após isso, filtrava-se água mili-q para o erlenmeyer, até completar
125mL do meio.

3.2.6. GLICEROL 60% (volume/volume)


Para cada 200mL de glicerol 60% em volume a produzir, transferia-se, para uma
proveta de 500mL, 120mL de glicerina de alta pureza (pureza mínima de 99,5%), com
cuidado para que a mesma não tocasse nas paredes da proveta. Após isso, adicionava-se água
30

destilada até completar 200mL de solução. A solução era então homogeneizada com um
bastão de vidro e transferida para um frasco graduado estéril de 250mL.

Em seguida, esse frasco era tampado, com o cuidado de não deixa-lo hermeticamente
fechado. Também era feita a identificação com a data, nome da solução, concentração e o
nome do pesquisador que iria utiliza-lo. Feito isso, colocava-se fita adesiva indicadora para
autoclave nos frascos e eles eram esterilizados por autoclavagem, a 121°C, durante um
intervalo de tempo de 15 a 20 minutos. Se não fosse ser utilizado imediatamente, o glicerol
60% estéril era guardado em um armário até o momento do uso.

3.2.7. ALCOOL ETÍLICO 70% (volume/volume)


Para cada 2000mL de álcool 70% em volume a produzir, era medido 1400mL de
álcool a 92,8% (massa/massa) em uma proveta de 2000mL. Adicionava-se água destilada até
completar 2000mL de solução. Após isso, utilizando um alcoômetro, fazia-se a leitura do teor
alcoólico em graus Gay-Lussac (°GL) (Figura 18).

Figura 18: Medição do teor alcoólico com alcoômetro

Se a leitura do teor alcoólico fosse diferente de 70°GL era adicionado álcool (caso
estivesse acima de 70°GL) ou água (caso estivesse abaixo de 70°GL), até se obter o resultado
desejado na leitura do alcoômetro, que era 70°GL. O álcool 70% em volume era então
transferido para os frascos spray, usados no laboratório.
31

3.3. PURIFICAÇÃO E PRESERVAÇÃO DE LINHAGENS DE LEVEDURAS

3.3.1. EQUIPAMENTOS E MATERIAIS UTILIZADOS


 Bico de Bunsen
 Cabine de segurança biológica classe II ESCO
 Câmara de germinação com alternância de temperatura Marconi, Ma 402
 Incubadora (shaker) com agitação orbital Marconi
 Geladeira Frost Free Eletrolux
 Ultrafreezer Thermo Scientific
 Alça de inoculação
 Cabo de Kolle
 Estante para tubos criogênicos
 Estante para tubos de ensaio
 Tubos criogênicos
 Tubos de ensaio
 Luvas de látex para procedimentos não cirúrgicos
 Micropipeta monocanal de volume variável (10 a 100µL) LABMATE
 Micropipeta monocanal de volume variável (100 a 1000µL) LABMATE
 Micropipeta monocanal de volume variável (500 a 5000µL) LABMATE
 Parafilm
 Plástico filme
 Ponteiras de 200, 1.000 e de 5.000μL
 Placas de Petri com meio de cultura YPD-Ágar
 Frascos graduados com meio de cultura YPD
 Tubos de ensaio com linhagens de leveduras pré-isoladas em indústrias laticínios de
Garanhuns
 Álcool etílico 70% (volume/volume)
 Glicerol 60% (volume/volume)

3.3.2. REPIQUE DAS CULTURAS ORIGINAIS PARA PLACA


Inicialmente era feita a desinfecção da cabine de segurança biológica com álcool
etílico a 70% e a luz UV era liga por 15 minutos. Antes de iniciar os procedimentos, fazia-se a
antissepsia das mãos e desinfecção micropipetas com álcool etílico a 70%. Colocavam-se
32

luvas de látex. Os tubos com as linhagens originais de leveduras que foram pré-isoladas em
Garanhuns e as placas de Petri com meio YPD-ágar eram levados à cabine de segurança
biológica, onde toda manipulação era feita na presença da chama do bico de Bunsen.

As culturas eram agitadas, batendo repetitivamente o tubo de ensaio contra a mão, até
que os micro-organismos depositados no fundo do tubo se dispersassem no meio. Cada
linhagem original possuía uma numeração e as placas eram identificadas com a numeração da
linhagem que iriam receber. Usando ponteiras de 200μL e uma micropipeta (10 a 100µL),
transferia-se uma alíquota de 40 μL de uma das culturas originais para a placa que foi
identificada com a sua numeração, e a ponteira era descartada logo em seguida. Uma alça de
inoculação era aquecida ao rubro na chama do bico de Bunsen, em seguida tocava-se de leve
com a alça no meio de cultura na placa de Petri para esfria-la e, logo após isso, usava-se ela
para semear por esgotamento a alíquota da cultura que foi colocada na placa. Todo esse
procedimento era repetido para as outras culturas originais.

Depois de semeadas, as placas eram agrupadas de 4 em 4 e cada grupo era empacotado


em plástico filme, identificado e levado para a câmara de germinação, à 30°C por 24 horas.
Passado esse tempo, as placas eram removidas da câmara e eram levadas à sala de fluxo para
verificar o desenvolvimento das culturas. Caso não se tenha obtido colônias isoladas, realiza-
se outro repique, pegando as leveduras crescidas na placa e semeando em outra placa, até se
obter colônias isoladas. Caso as culturas na placa não fossem ser utilizadas naquele momento,
elas eram empacotadas em plástico filme, identificadas e guardadas na geladeira.

3.3.3. REPIQUE DA PLACA PARA TUBOS DE CULTURA


Inicialmente era feita a desinfecção da cabine de segurança biológica com álcool
etílico a 70% e a luz UV era liga por 15 minutos. Antes de iniciar os procedimentos, fazia-se a
antissepsia das mãos e desinfecção micropipetas com álcool etílico a 70%.

Na cabine de segurança biológica, na presença da chama do bico do Bunsen, usando


uma micropipeta (500 a 5000µL) e ponteiras de 5000μL, o meio de cultura YPD era
distribuído em tubos de ensaio estéreis (Figura 19). Pipetava-se, para cada tubo de ensaio,
alíquotas de 5mL do meio, sempre flambando cada tubo ao remover e ao recolocar o tampão,
tomando o cuidado de não deixar a ponta da ponteira entrar em contato com nada além do
meio do cultura, para evitar contaminação.
33

Figura 19: Distribuição de meio YPD em tubos de ensaio

Após distribuir o meio, colocavam-se luvas de látex para realizar os próximos


procedimentos. As placas com as culturas originais semeadas por esgotamento já
desenvolvidas eram levadas a cabine. Os tubos de ensaio eram identificados com a numeração
da linhagem que iriam receber. Aquecia-se ao rubro uma alça de inocolação na chama do bico
de Bunsen, esperava-se a alça esfriar e transferia-se uma colônia que estivesse isolada na
placa para o tubo com meio liquido, tomando o cuidado de não deixar a alça tocar superfície
lateral do tubo e sempre flambando o tubo depois de tirar e antes de recolocar o tampão.
Repete-se esse processo para todas as placas. Um tubo de ensaio era identificado como o
branco e adicionava-se 5mL de meio YPD a ele. O branco não era inoculado.

Terminado isso, as placas eram, usando plástico filme, agrupadas de quatro em quatro,
identificadas e levadas à geladeira. Os tubos com as leveduras isoladas e o branco eram
levados para a incubadora com agitação orbital, onde ficavam a 30°C e a 150RPM por 48
horas. Passado esse tempo, os tubos eram tirados da incubadora e era verificado se houve o
desenvolvimento dos micro-organismos, observando se ouve o enturvecimento do meio ou a
deposição dos micro-organismos no fundo do tubo. Caso ocorresse o desenvolvimento de
micro-organismos no branco, significava que ocorreu contaminação e todos os tubos eram
descartados. Se essas culturas isoladas não fossem ser usadas naquele momento elas eram
guardadas na geladeira.

3.3.4. PRESERVAÇÃO DAS LINHAGENS DE LEVEDURAS PURAS


Inicialmente era feita a desinfecção da cabine de segurança biológica com álcool
etílico a 70% e a luz UV era liga por 15 minutos. Antes de iniciar os procedimentos, fazia-se a
antissepsia das mãos e desinfecção micropipetas com álcool a 70%. Na cabine de segurança
34

biológica, na presença da chama do bico de Bunsen e usando uma micropipeta (100 a


1000µL) e ponteiras de 1000μL, transferiam-se alíquotas de 750μL de glicerol a 60% em
volume para tubos criogênicos estéreis, tomando o cuidado de não deixar a ponta da ponteira
tocar em nada além do glicerol, para evitar contaminação.

Após distribuir o glicerol, colocavam-se luvas de látex para realizar os próximos


procedimentos. As culturas de leveduras puras, em tubos de ensaio, eram levadas a cabine de
segurança biológica. Utilizando uma micropipeta (100 a 1000µL) e ponteiras de 1000μL,
transferiam-se quatro alíquotas de 750μL de uma mesma cultura para quatro criotubos
contendo 750μL de glicerol que foram identificados com o código daquela linhagem (Figura
20). Esse procedimento era repetido para as demais culturas, sempre trocando a ponteira e
desinfetando a micropipeta com álcool 70% antes de começar a preservar uma nova linhagem.

Figura 20: Transferência das culturas puras para criotubos com glicerol.

Após terminar o procedimento com todas as linhagens, os criotubos eram levados à


bancada principal. Eles eram vedados usando parafilm e etiquetados com o código da
linhagem (Figura 21). As culturas eram separadas, onde duas amostras de cada linhagem eram
colocadas em um saco plástico e as outras duas amostras de cada linhagem eram colocadas
em outro. Os sacos plásticos eram identificados e um deles era preservado a -20°C e a outro a
-80°C.
35

Figura 21: Criotubos vedados com parafilm e etiquetados

3.5. PREPARO DAS SOLUÇÕES PADRÕES PARA CALIBRAÇÃO DO SISTEMA


HPLC

3.5.1. EQUIPAMENTOS E MATERIAIS UTILIZADOS


 Sistema HPLC Alliance,Waters e2695
 Ultra purificador de água (Milli-Q) Direct 8
 Balança analítica Marte AY220
 Balões volumétricos de 50mL
 Bastão de Vidro
 Béqueres
 Espátulas
 Filtro para seringa 0,22µL
 Micropipeta monocanal de volume variável (100 a 1000µL) LABMATE
 Micropipeta monocanal de volume variável (500 a 5000µL) LABMATE
 Pipeta de Pasteur
 Tubos de Falcon
 Vials
 Acido acético de elevada pureza
 Etanol de elevada pureza
 Frutose de elevada pureza
 Glicerol de elevada pureza
 Glicose de elevada pureza
 Sacarose de elevada pureza
36

3.5.2. PROCEDIMENTO
Inicialmente foram preparadas soluções dos padrões de sacarose, glicose, frutose,
glicerol, ácido acético e etanol, 50mL de solução para cada padrão e todas com a
concentração de 100g/L. Para isso foram identificados 6 béqueres com o nome de cada padrão
e, usando uma balança analítica, pesou-se 5g de cada padrão em seu respectivo béquer. Para
pesar as substâncias sólidas (sacarose, glicose e frutose) foi usada a espátula, para as liquidas
foi utilizada uma micropipeta e ponteiras de 5000μL. Após isso, fez-se a pré-dissolução dos
padrões com água milli-q e a transferência quantitativa deles para seis balões volumétricos de
50mL identificados com os seus nomes, até o volume da solução ficar próximo do menisco. O
volume era completado até o menisco adicionando água milli-q aos balões com pipetas de
Pasteur.

Foram identificados seis béqueres e seis tubos de Falcon com o nome dos padrões. As
soluções dos padrões a 100g/L foram transferidos para os béqueres. Usando filtro para seringa
com poro de 0,22µL e seringa, as soluções foram filtradas do béquer para os tubos de Falcon.
Depois de filtradas, as soluções dos padrões foram diluídas a uma concentração de 10g/L.
Para isso, um tubo de Falcon foi identificado com o código “SGFGAE” (primeira letra do
nome de cada substância do padrão) e a concentração das substâncias do padrão (10g/L) e,
usando uma micropipeta e ponteiras de 1000µL, pipetou-se 1mL da solução a 100g/L de cada
um dos 6 padrões para o mesmo tubo de falcon e o volume foi completado pipetando 4mL de
água milli-q.

A partir da solução dos padrões na concentração de 10g/L, usando micropipetas e


ponteiras, foram feitas oito diluições seriadas, obtendo-se nove soluções dos padrões com as
concentrações expressas na Tabela 2. Para isso, foram identificados nove vials com o código
do padrão e as suas concentrações, anotando todas as casas decimais. Foi pipetado para o
primeiro vial apenas 1mL da solução com os padrões a 10g/L. Para o segundo vial foi
transferido 900μL da solução a 10g/L (do falcon para o vial) e 900μL de água milli-q. Para o
terceiro vial, foi transferido 900μL da solução do segundo vial e 900μL de água milli-q. Para
o quarto vial foi transferido 900μL da solução do terceiro vial e 900μL de água milli-q, e
assim sucessivamente, até o nono vial.
37

Tabela 2: Concentração dos padrões nas várias diluições


Diluição Concentração (g/L)
Não diluído 10
1:2 5
1:4 2,5
1:8 1,25
1:16 0,625
1:32 0,3125
1:64 0,15625
1:128 0,078125
1:256 0,0390625

Como a amplitude entre os valores das duas primeiras concentrações (10 e 5g/L) foi
muito maior que a das outras concentrações, foi preparado um décimo vial com a
concentração 7,5g/L. Para isso transferiu-se 750μL da solução com os padrões a 10g/L e
250μL de água milli-q para o décimo vial.

Os 10 Vials foram levados a Central Analítica e um técnico responsável por um


sistema HPLC utilizou-os para construir uma curva de calibração no equipamento.
38

4. CONCLUSÃO
Durante todo o período de estágio os técnicos de laboratório e pesquisadores
mostraram total disposição para ensinar e tirar duvida das atividades desenvolvidas, tanto do
ponto de vista teórico quanto prático.

A experiência do estágio foi extremamente positiva, pois tive a oportunidade de por


em prática conhecimentos que tinha visto apenas em teoria, bem como aperfeiçoar a técnica
na execução de procedimentos já estudados em aulas práticas. Além disso, o estágio também
me possibilitou conhecer e ter contato com o funcionamento da pesquisa científica.
39

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ANDRADE, Denise et al. Atividade antimicrobiana in vitro do álcool gel a 70% frente às
bactérias hospitalares e da comunidade. Medicina (Ribeirao Preto. Online), v. 40, n. 2, p.
250-254, 2007.
BIOCOMBUSTÍVEIS. Disponível em:
<http://www.cetene.gov.br/index.php/infraestrutura/biocombustiveis/>. Acesso em:
20/07/2017.
BROOKS, Geo F. et al. Microbiologia Médica de Jawetz, Melnick & Adelberg. 26.ed.
Porto Alegre: Artmed, 2014.
CAVALCANTI, Ismar Lima; CANTINHO, Fernando Antônio de Freitas; ASSAD,
Alexandre. Medicina perioperatória. Rio de Janeiro: SAERJ, 2006.
DELLARETTI, Érica Maciel. Preservação de fungos em baixas temperaturas. Monografia
de conclusão de curso. Sete lagoas: UFSJ, 2014. Dísponivel em: <
http://www.ufsj.edu.br/portal2-repositorio/File/cobib/Dellaretti.pdf>. Acesso em: 22/07/2017.
POLGE, C.; SMITH, A.U.; PARKERS, A, S, Revival of spermatozoa after vitrification and
dehydratation at low temperatures. Nature, London, V. 164, p. 666, 1949.
GIRÃO, Marília Dutra et al. Viabilidade de cepas de Malassezia pachydermatis mantidas em
diferentes métodos de conservação. Revista da sociedade brasileira de medicina tropical,
v. 37, n. 3, p. 229-233, 2004.
MADIGAN, Michael T. et al. Microbiologia de Brock. 14.ed. Porto Alegre: Artmed Editora,
2016.
RIGHETTI, Carlos; VIEIRA, Paulo Cesar Gomes. Autoclave: aspectos de estrutura,
funcionamento e validação. Revista da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de
Laboratório, v. 1, n. 2, p. 185, 2012.
SOBRE O CETENE. Disponível em: <http://www.cetene.gov.br/index.php/institucional-
2/institucional/>. Acesso em: 20/07/2017.
SOLA, Marília Cristina et al. Manutenção de microrganismos: conservação e
viabilidade. Enciclopédia biosfera, Centro Científico Conhecer-Goiânia, v. 8, n. 14, p.
1405, 2012.
TORTORA, Gerard J.; CASE, Christine L.; FUNKE, Berdell R. Microbiologia. 10.ed. Porto
Alegre: Artmed, 2012.
TRABULSI, Luiz R.; ALTERTHUM, Favio. Microbiologia. 4.ed. São Paulo: Atheneu, 2004
UEKI, Suely Yoko Mizuka et al. Cabine de segurança biológica: efeito da luz ultravioleta nas
micobactérias. Revista do Instituto Adolfo Lutz (Impresso), v. 65, n. 3, p. 222-224, 2006.
UEKI, Suely Yoko Mizuka et al. Monitoramento em cabine de segurança biológica:
manipulação de cepas e descontaminação em um laboratório de micobactérias. J. bras. patol.
med. lab, v. 44, n. 4, p. 263-269, 2008.
40

VIEIRA, D. A. P.; FERNANDES, N. C. A. Q. Microbiologia Aplicada. Inhumas: Instituto


Federal de Ciência e Tecnologia, 2012. Disponível em:
<http://estudio01.proj.ufsm.br/cadernos/ifgo/tecnico_acucar_alcool/microbiologia_aplicada.p
df>. Acesso em: 20/07/2017
ZOCHIO, Larissa Barbosa. Biossegurança em laboratório de análise clínicas. Academia de
Ciência e Tecnologia. São José do Rio Preto, 2009.