PRACTICA N°1

¨COLORANTES Y COLORACIONES¨

V. Resultados

COLORACIÓN GRAM

El frotis bacteriano se fija con calor y una vez fijada se tiñe con cristal violeta de hucker,
nuevamente se tiño con una solución de yodo, utilizado como mordiente, el cual facilita la
adhesión del cristal violeta a la pared celular. Las bacterias Gram positivas, debido a la estructura y
composición bioquímica de su pared celular retienen el complejo cristal violeta-lugol y aun
después del tratamiento con el decolorante conserva el colorante básico, por lo que se observan
de color púrpura o violeta al microscopio. Las bacterias Gram negativas pierden el colorante básico
cuando son tratadas con el decolorante debido a que el alcohol disuelve el contenido lipídico de la
pared celular (lo que aumenta la permeabilidad celular), dando como resultado la pérdida del
complejo cristal violeta-lugol. Las bacterias decoloradas captan entonces el colorante de contraste
SAFRANINA o FUCSINA DE GRAM colorante secundario, que imparte una coloración de contraste o
contracolor (color rojo o rosado) , razón por la cual estas bacteria se observan de color rojo al
microscopio.

COLORACION DE CAPSULAS (METODO MANEVAL)

Se observo bacilos de klebsiella. La cápsula se observa como un halo incoloro alrededor de los
microorganismos, gracias al contraste proporcionado por la coloración negra tanto del espacio
intercelular como de las células microbianas

COLORACION DE ESPORAS

Con la tinción de Gram las esporas se observan como cuerpos refringentes SIN TEÑIR, mientras
que con el método de Schaeffer y Fulton las esporas se observan de color VERDE y las formas
vegetativas se ven ROJAS.

VI.DISCUSIÓN.

 Las cápsulas bacterianas no pueden observarse en frotis teñidos con las técnicas usuales
porque son incapaces de retener el colorante y porque los procesos de fijación al calor y
lavado las disuelven. Por lo tanto El mejor método para observarlas es el de las tinciones
negativas.(LEONOR,2006)
 Las cápsulas bacterianas son importantes tanto para la bacteria como para otros
organismos. A las bacterias les proporcionan una cubierta protectora y además sirven de
reservorio de alimento almacenado. Las cápsulas de ciertas bacterias productoras de
enfermedades aumentan la capacidad infectiva de las bacterias. Si la bacteria pierde
 totalmente su cápsula, puede perder su virulencia y por lo tanto su capacidad de producir
enfermedad. (Jawetz,2002)
 Esta bacteria se observa de color violeta ya que en el proceso de tinción donde se le
agrego los diferentes colorantes como cristal violeta y fucsina básica, quedaron teñidas;
aun cuando se les retiró el exceso de colorante con agua destilada y alcohol de 95°,
tomando este color característico que se le denomina a las bacterias que lo presentan
“Gram positivas”. Estas bacterias presentan este color ya moléculas de cristal violeta, lugol
y ácidoteicoico que se forma en la pared celular de las
Gram positivas, es muy difícil de remover, lo que no sucede con las Gram negativas,
porque el cristal violeta y el lugol no reaccionan con el ácido teicocio, debido a que las
bacterias Gram negativas en su pared celular no lo tienen. Por
otra parte, la membrana externa que poseen las bacterias Gram negativas es soluble enco
mpuestos orgánicos como a la mezcla de alcohol y acetona, por lo tanto al momento de
agregar el decolorante alcohol 95°, el complejo de cristal violeta y lugol se perdió. De igual
forma ,las bacterias Gram negativas tomaron su color rosado, debido a que se le agrego el
colorante de contraste llamado Fuscina para colocarlas en manifiesto(KENIA,2011)

CONCLUSIONES.

 Tanto las bacterias Gram positivas como las Bacterias Gram negativas se presentan
morfológicamente como cocos o bacilos, sin embargo al ejecutar tinción de Gram en estas
para identificar su grupo taxonómico, las Gram positivas se tiñen de color violeta mientras
que las Gram negativas se tiñen de color rosado.
 Es importante decir que las colonias a las que se les realizó tinción de Gram, eran de una
muestra de suelo, lo cual explica la presencia de estas bacterias, debido a que en el
suelo predominan las bacterias Gram negativas. Sin embargo en el suelo también se
encuentran bacterias Gram positivas, pero en menor proporción que las Gram negativas, l
o cual también explica la presencia de estas bacterias en el suelo.
 La técnica de tinción tiene como finalidad crear un contraste entre la célula y el medio que
la rodea, y una de las más importantes, tanto por su aplicación clínica para hacer una
identificación preliminar de la bacteria causal de la infección y por su practicidad, es la
tinción de Gram. Es por eso que esta técnica se vuelve fundamental en el estudio de la
microbiología,
 Finalmente podemos mencionar que a pesar que la bacteria es una estructura muy
pequeña, por medio de la tinción con verde de malaquita, el cual requirió del calor para la
penetración; se pudo observar la estructura interna de la célula bacteriana,
particularmente las endoparas.
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

 Cedeño, Kenia (2011).fuentes de error en la tinción degram. [En línea].

Disponible:http://labmicrofarmaciaulat.blogspot.com/p/tincion-de-gram_20.html. Citado:
 López Tévez, Leonor (2006). Comportamiento de
las bacterias en la tinción de gram. [En línea]. Disponible:http://www.biologia.edu.ar/micr
ogeneral/tp6.pdf. Citado:19/10/2013.
 http://aprendeenlinea.udea.edu.co/lms/moodle/pluginfile.php/231237/mod_resource/co
ntent/0/2._PRACTICA_TINCIONES_ESPECIALES_EN_MICROBIOLOGIA.pdf

ANEXOS

COLORACION DE ESPORAS:

MUESTRA: Bacillus subtilis

COLORACION: Coloracion de wirts

AUMENTO: 40x

DESCRIPCION: Esporas con bacilos

esporulados.

COLORACIÓN DE CAPSULAS:

MUESTRA: klebsiella

COLORACIÓN: Rojo de Congo

DESCRIPCIÓN: capsula sin color, cuerpo

bacteriano color rojo

AUMENTO: 100X
COLORACION GRAM:

Fig.1: coloración Gram (+) Fig.2: coloración Gram (-)

 CUESTIONARIO

1.-¿Qué precaución es fundamental antes de colocar aceite de cedro sobre una lámina
coloreada?

el aceite de cedro es propio de la observación con el objeto de inmersión de 100x, se

debe utilizar para la observación de muestras fijadas no para otras muestras.

2.-¿Cuál es la posición del condensador en una observación de una muestra coloreada

en inmersión?

En una muestra coloreada de inmersion se debe subir totalmente el condensador para ver
claramente el circulo de luz que nos indica la zona que se va a visualizar y donde habra
que agregar el aceite.

3.-¿Cuál es la posición correcta del condensador en una observación en fresco y a

mediano aumento?

El condensador puede utilizarse a diferentes distancias respecto a la fuente luminosa,en

el caso de las preparaciones en fresco el condensador se debe bajar.

4.-¿Cuál es el comportamiento más usual de los cocos y cuál es el de los bacilos en la

coloración Gram?

Las bacterias pueden diferenciarse con la coloración gran en dos grupos. Los
microorganismos gran positivos se tiñen de azul, mientras que aproximadamente un tercio
de los cocus, la mitad de bacilos y todos los organismos espiraladas se tiñen de rojo y se
dice que son gran negativas.

5.- ¿ Podría reemplazarse la safranina o ziehl con el azul de metileno como colorante de
contraste en la coloración de Gram?

En coloración simple utilizar un solo colorante.se basan en el hecho que las células tienen
una composición química diferente frente a un colorante.

El colorante tiñe las células(azul de metileno,safrina).

La safranina( rojo básico), es un colorante biológico, de contraste que se utiliza en la

tinción de Gram para proporcionar un color violeta más intenso a las bacterias Gram (+) y
tiñe de rojo a las bacterias Gram (-), en histología y en citología.la safranina se usa como
liquido de contraste en protocolos de tinción,coloreando al nucleo celular de rojo,tambien
para detectar cartílago,mucinay granulos de mastocitos.
 PRACTICA N°2

PRACTICA DE MEDIOS DE CULTIVO, SIEMBRA Y AISLAMIENTO

RESULTADOS.

Los medios de cultivo pueden ser sólidos o líquidos. La composición de estos medios puede ser
definida (medio sintético) o no definida (medio complejo). No todos los medios de cultivo son
iguales, ni todos los microorganismos pueden crecer en todos los medios de cultivo.

En esta práctica realizamos la siembra de un microorganismo de agua estancada sobre un agar

nutritivo donde dimos uso de la técnica de siembra por estrias o sea pasando el inoculo en zigzag
sobre la superficie del medio inclinado cuya finalidad será conseguir que un germen quede aislado
de otro en la superficie del medio, donde se producirá hasta el punto de formar colonias .

DISCUSIÓN

 El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento

de los microorganismos. La composición precisa dependerá de la especie que se quiera
cultivar, porque las necesidades nutricionales varían considerablemente. Hay
microorganismos muy poco exigentes que crecen bien en medios de laboratorio
normales y microorganismos muy exigentes que necesitan determinadas sustancias para
crecer.(Nelson,2002)
 La siembra en cajas Petri nos permite cultivar microorganismos gracias a que contiene los
nutrientes necesarios para su desarrollo. El crecimiento de los microorganismos se
manifiesta de formas diferentes dependiendo de la técnica utilizada para su siembra y del
tipo de medio en el que se realizó dicha siembra, de esta forma es posible obtener
características morfológicas distintas cuando se realizan siembras de una misma muestra
en diferentes medios de cultivo o viceversa(Michael,2013)

Conclusión

 En este experimento se pudo realizar la siembra de dilución, en la cual dio como resultado
la formación de colonias sobre las placas de agar nutritivo. Las colonias se formaron
durante un tiempo de incubación de 24 a 48 horas.
Después de un largo periodo de tiempo se pudo observar las diferentes características de
las diferentes bacterias como su forma y tamaño.
 El desarrollo de colonias formadas a partir de los métodos realizados por estrías y por
extensión en placa difieren en forma, borde, elevación, superficie y estructura interna, lo
cual es notablemente influenciado por las concentraciones de carga microbiana del medio
en el cual dichas colonias se desarrollaron así como por el mismo medio de cultivo
Referencias bibliográficas.

 https://sites.google.com/a/goumh.umh.es/practicas-de-
microbiologia/indice/preparacion-de-medios-de-cultivo
 http://labmicrofarmaciaulat.blogspot.pe/p/aislamiento-de-2-microorganismos-y.html
 https://es.slideshare.net/rebecaoloarte/tecnicas-de-siembra-de-microorganismos

ANEXOS

Fig1: calentando el agar nutritivo Fig.2: calentando el caldo nutritivo

 Fig.3: siembra y aislamiento de
agua estancada

CUESTIONARIO

1.- ¿Considera usted necesario tomar alguna precaución en caso de tener que
adicionar sangre al medio?

Claro que si, ya que el medio es útil tanto para e aislamiento y cultivo de microorganismos
aeróbicos y anaeróbicos nutricionales exigentes a partir de una gran variabilidad de
muestras como para la observación de reacciones en hemólisis.

2.-¿Es posibles aislar gérmenes en estado de pureza en medios líquidos a partir de

muestras con flora variada?

Si podemos cultivar medios líquidos para aislar gérmenes en estado de pureza, sin
embargo, no es posible conseguir un cultivo puro. Se debe tener cuidado en la
composición de los caldos nutritivos por que el uso incorrecto de ellos puede hacer que se
cometa errores en la manipulación de microorganismos.

3.-¿Qué importancia tiene el aspecto de una colonia?

Es importante debido a que nos ayuda a conocer de manera cualitativa el cultivo

bacteriano, además su aspecto de coloración, tamaño. Permiten diferenciar de esta
bacteria y facilitar su identificación. Además que constituye una de las características para
el crecimiento de bacterias,

4.-¿Qué le indicaría la presencia de un bacilo y un coco en la coloración de una

suspensión hecha a partir de una colonia?

Las bacterias que son cocos y bacilos adoptan formas intermedias en los cocos y bacilos
que se denominan cocobacilos.

Este género es prototipo de la familia bacillaceae. Si hay presencia de cocos y bacilos se

observó sus crecimientos, pero siempre en ausencia del Mac Conkey.
 PRACTICA N°3

ACCIÓN DE LOS MICROORGANISMOS SOBRE DIVERSOS SUSTRATOS

V.RESULTADO

Para realizar las pruebas bioquímicas se dispone de múltiples medios, los cuales se deben aplicar
de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio. Entre las pruebas que utilizamos en
esta práctica fueron: Degradación de carbohidratos , Degradación de proteínas , Degradación de
las grasas.

A. Degradación de carbohidratos
 Tabla 1- Degradación del Agar- Almidón

Microorganismo Coloración Violeta con Lugol

Bacillus Subtilis No
Staphylococcus Sí

 Tabla 2- Degradación del Agar- Gelatina

Microorganismo Licuación o degradación de Gelatina

Pseudomonas sp Sí
Escherichia Coli No

 Tabla 3- Degradación del Caldo Glucosado

Microorganismo Acidez-Amarillo/Basidad -Rosa Degradación a CO2

Entero Bacter Amarillo Sí
Bacillus Subtilis Amarillo No
Pseudomonas sp Rosa No

B. Degradación de proteínas

 Tabla 1- Producción de H2S

Microorganismo Coloración Negruzca

Proteus Vulgaris Sí
Escherichia Coli No
  Tabla 2- Producción de Indol

Microorganismo Anillo Rosáceo

Escherichia Coli Sí
Proteus Vulgaris No

 Tabla 3. Hidrolisis de la Urea

Microorganismo Coloración Bugambilia

Proteus Vulgaris Sí
Escherichia Coli No

 Tabla 4- Caldo Nitrato

Microorganismo Reducción (coloración roja del medio)

Escherichia Coli Sí
Pseudomonas sp No

C. Degradación de las grasas

 Tabla 1-.Acción sobre las Grasas

Microorganismo Anillo Rosáceo

Pseudomonas Sí
Escherichia Coli No

DISCUSION.

 Los microorganismos utilizados en el laboratorio fueron Proteus Vulgaris, E. Coli; dio

positivo ya que es un microorganismo anaerobio y tiene la posibilidad de producción de
hidrógeno sulfurado descomponiendo sustancias proteicas o descomponiendo sulfato y
esto se pone de manifiesto con el ennegrecimiento del medio al producirse los sulfuros
metálicos correspondientes ya que el sulfato utilizado contenía cisteína que contiene
aminoácidos sulfurados por lo cual la enzima del microorganismo (E. Coli) dependía del
átomo de azufre de este aminoácido reduciéndolo ha hidrógeno para formar ácido
sulfhídrico correspondiendo a los resultados que emite Philip Carpenter en su libro de
microbiología.( Carpente,2010)
 Los microorganismos usados en el laboratorio fueron; E. Coli, y Proteus Vulgaris La
bacteria correspondiente al coli típico forma indol desaminación y descarboxilación de un
compuesto bencénico pirrolico detectando la presencia de indol al reaccionarlo con la
reacción de Kova que es un aldelhido unido a alcohol amilico que extrae el indol
formándose en la parte superior un anillo rojizo intenso causado por dicho alcohol que se
 deposita en la superficie del medio; correspondiendo a los resultados del libro de Philip
Carpenter.( Carpenter,2010)
 los nitratos sirven como fuente de nitrógeno para muchos microorganismos pero para ello
debe ser degradado, pero los microorganismos utilizan los nitratos para su reducción a
nitrito eliminando una molécula de oxígeno. Las enterobactericiae y muchos otros bacilos
gran negativos y hongos reducen los nitratos a nitritos ya que en la prueba realizada en el
laboratorio con los microorganismos sembrados en el medio nitrolado se le agregó alfa
naftalina, ácido sulfanílico y el resultado fue positivo indicado por un rojo intenso,
procediéndose a valorar el amoniaco con el reactivo de Nessler apareciendo un color
ladrillo y concluimos que ambos resultados concuerdan con la bibliografía. Los
microorganismos usados fueron pseudomonas, e. Coli. (Ohili,2010)

CONCLUSIONES.

 su finalidad es estudiar de forma detenida las acciones enzimaticas de los

germenes sobre algunos sutratos donde existen diferentes medios y el cual se
debera aplicar de acuerdo al microorganismo a estudiar.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.

 http://www.monografias.com/trabajos15/microorganismos/microorganismos.shtml#ixzz4
xZlOSwuS
 https://es.scribd.com/document/185344271/Accion-De-Los-Microorganismos-Sobre-
Diversos-Sustratos
 https://es.slideshare.net/Arturovm9510/accin-de-los-microorganismos-sobre-diversos-
sustratos
 ANEXOS

DEGRADACION DE CARBOHIDRATOS DEGRADACION DE

GRASAS

Degradación del Degradación Degradación del Caldo Acción sobre las Grasas
Agar- Almidón del Agar- Glucosado
Gelatina

DEGRADACION DE PROTEINAS

Producción de Indol Producción de H2S Hidrolisis de la Urea Caldo Nitrato

 CUESTIONARIO

1.-¿ Qué importancia tiene el estudio de las propiedades bioquímicas de

microorganismos?

Los microorganismos han sido de utilidad para el hombre aun desde antes del
conocimiento de su existencia, el estudio de los microorganismos y el conocimiento sobre
ellos ha sido aplicado en el ámbito médico, industrial, económico y ambiental.

El mundo nos rodea con objetos inertes que consiste en sustratos y soporte que permiten
el asentamiento de todo lo que nos rodea, además brinda algunos nutrientes que son
aprovechados por los seres vivos que lo habitan.

2.-¿ A qué productos se debe la variación de pH en un medio con hidratos de

carbono?

Un microorganismo puede alterar el pH del medio de cultivo como resultado de las

sustancias producidas por el propio microorganismo.

3.- ¿Que entiendes por hidrolisis de la urea?

Que su actividad es muy importante en los residuos de cosechas y en la parte superficial

de los suelos. También que la hidrolisis genera un incremento significativo del pH
alrededor del granulo de urea ya que consume protones. Este incremento del pH desplaza
el equilibrio del amoniaco y amonio favoreciendo la volatizacion del NH3 a la atmosfera.

4.-¿ Que produce finales de la degradación de la urea y otras sustancias

nitrogenadas fácilmente detectables en el laboratorio?

 Degradación de proteínas y aminoácidos y los productos finales son el

amonio y amoniaco.
 PRACTICA N°4

EL ANTIBIOGRAMA

V.RESULTADO.

se llevan las placas a incubar a una cierta temperatura podríamos decir (temperatura corporal)
durante un tiempo respectivo tras este periodo se recogen las placas y sin abrir se observa el
crecimiento bacteriano. Por la parte trasera de la placa incubada mediremos el diámetro de los
halos de inhibición que se han formado alrededor de los discos de antibiótico a los que la bacteria
“problema” es sensible.

VI.DISCUSION.

 El primer objetivo del antibiograma es el de medir la sensibilidad de una

cepa bacteriana que se sospecha es la responsable de una infección a uno
o varios antibióticos. En efecto, la sensibilidad in vitro es uno de los
requisitos previos para la eficacia in vivo de un tratamiento antibiótico. El
antibiograma sirve, en primer lugar, para orientar las decisiones
terapéuticas individuales.(ROSALES,2010)
 El segundo objetivo del antibiograma es el de seguir la evolución de las
resistencias bacterianas. Gracias a este seguimiento epidemiológico, a
escala de un servicio, un centro de atención médica, una región o un país,
es como puede adaptarse la antibioterapia empírica, revisarse
regularmente los espectros clínicos de los antibióticos y adoptarse ciertas
decisiones sanitarias, como el establecimiento de programas de prevención
en los hospitales.(ROSALES,2010)

VII.CONCLUSION

 se dio a conocer el mecanismo en la determinación de sensibilidad ïn vitro¨de las

bacterias frente a los antibióticos

VIII.REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.

 http://labmicrofarmaciaulat.blogspot.pe/p/elaboracion-de-un-antibiograma.html
 http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioAntibioticos.htm
 https://es.scribd.com/doc/31999516/practica1-antibiograma
 ANEXOS

Fig.1: Observación de halo de inhibición

CUESTIONARIO

1.-¿Qué opinaría usted si dentro de un nítido halo de inhibición desarrollan varias

colonias?

Si aparece alguna colonia dentro de los halos, esto se debe a mutaciones espontaneas
que hacen a algunas bacterias resistentes.

Cuando aparecen colonias dentro del halo, puede tratarse de mutantes resistentes,
contaminaciones, poblaciones heterogéneas o cultivos mixtos y conviene volver a
identificarlas y realizar otra vez el ensayo de sensibilidad antimicrobiana. Como la regla
general, no debe considerarse aquellas colonias diminutas que aparecen en el halo de
inhibición y que han sido visualizadas mediante luz transmitida o con ayuda de una lupa, a
excepción de estafilococos resistentes a oxacilina o enterococos resistentes a
vancomicina.

2.- ¿Qué factor tomaría en cuenta para elegir un antibiótico, además del resultado
del antibiograma?

Factores microbiológicos: Tipo de agente infeccioso y mecanismos de resistencia

descritos previamente en su especie.

Factores Farmacológicos:Tipo de antimicrobiano y parámetros de absorción, distribución y

eliminación.

Factores del paciente : Tipo de infección. Factores de riesgo y estado general de salud.
Situación inmunológica e hipersensibilidad.
Experiencia anterior: Referente a los patrones de resistencia antibiótica mas habituales
para cada especie.

3.-¿Qué opinaría si los discos antibióticos pertenecientes a un lote producen efecto

frente a un germen y discos del mismo antibiótico de otro lote no produce efecto
alguno?

Se diría que es resistente se refiere a aquellos microorganismos que no se inhiben por las
concentraciones habitualmente alcanzadas en sangre/tejidos del correspondiente
antimicrobiano, o a aquellos microorganismos en los que existen mecanismos de
resistencias específicos para el agente estudiado en los que no ha sabido una adecuada
respuesta clínica cuando se ha usado como tratamiento el correspondiente antimicrobiano
y con respecto al otro lote que es un término sensible indica que la infección ocasionada
por la cepa para la que se ha determinado la CMI o su correspondiente halo de inhibición
puede tratarse de forma adecuada empleando las dosis habituales de antimicrobiano, en
función del tipo de infección y de la especie considerada.