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MET CQM DAV 001

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IDENTIFICAÇÃO E PESQUISAS DE Emissão: 18/11/1996

MICROORGANISMOS Revisão: 03
Data: 29/03/2011
Revisar até: 29/03/2014

Elaborado por: Conferido por: Aprovado por: Aprovado por:

Ni Mei Edilene Costa Fernanda Sena Carolina Goffi


N. Mei - CQ E. Costa - CQ F. Sena - GQ C. Goffi - GQ
Data: 29/03/2011 Data: 29/03/2011 Data: 29/03/2011 Data: 29/03/2011

1.0 OBJETIVO

Método aplicado a pesquisa e identificação de microorganismos:


- Mesófilas totais
- Fungos e leveduras
- Pesquisa de patógenos: Escherichia coli
Pseudomonas aeruginosa
Staphylococcus aureus

2.0 APLICAÇÃO

Controle de Qualidade Microbiológico X


Controle de Qualidade Produto acabado
Controle de Qualidade Matéria-prima
Controle de Qualidade Embalagem

3.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Guia do ABC.

4.0 PRECAUÇÕES DE SEGURANÇA

No momento da pesagem da amostra com bico de bunsen aceso cuidado com material
inflamável.
Na realização da análise o analista deve estar usando avental descartável, luva de
procedimento e touca para evitar qualquer contaminação cruzada.

5.0 MATERIAIS/EQUIPAMENTOS

5.1 Balança semi-analítica (POP CQ DAV 024)


5.2 Autoclave; (POP CQ DAV 045)
5.3 Fluxo laminar; (POP CQ DAV 046)
5.4 Estufa (35 a 37°C para bactérias); (POP CQ DAV 047)
5.5 Incubadora (25 a 27°C para fungos); (POP CQ DAV 044)
5.6 Geladeira; (POP CQ DAV 049)
5.7 Bico de bunsen;
5.8 Placas de petri esterilizada ou placa de petri descartável;
5.9 Pipeta graduada esterilizada de 1 mL ou micropipeta eppendorf;
5.10 Pipeta graduada de 20 mL;
5.11 Garrafas de leite;
5.12 Placas descartáveis com três divisões;
5.13 Alça de Drigalski;
5.14 Gaze;
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5.15 Tela amianto;


5.16 Tripé de ferro;
5.17 Proveta graduada de 1000 mL;
5.18 Béquer graduado de 1000 mL;
5.19 Balão volumétrico de 2000 mL;
5.20 Espátula de aço inox;
5.21 Tubo de ensaio com tampa;
5.22 Béquer graduado de 4000 mL;
5.23 Pera para sucção

6.0 REAGENTES

6.1 Caldo diluente LETHEEN


6.2 Tripticase Soy Agar
6.3 Trypticase Soy Broth
6.4 Vogel Johnson
6.5 Cetrimide
6.6 Mac ConKey
6.7 Ácido Tartárico 10%
6.8 Água destilada esterilizada
6.9 Saboraud Dextrose Agar
6.10 HC Agar
6.11 Lactose Broth
6.12 Endo Agar

7.0 PROCEDIMENTO

7.1 Identificação

7.1.1 Pesar assepticamente 10 g/100 (10 g em 90 g de caldo LETHEEN) ou 1g/100 (1 grama


em 99 g de caldo LETHEEN).
7.1.2 Identificar 1 placa para Sabouraud ou HC Agar (fungos e bolores) e 1 placa para Tryptic
soy Agar (mesófilas totais).
7.1.3 Pipetar 1 mL da diluição 10/100 ou 1/100 em cada placa de petri esterilizada (ou 10 ml
para produtos mais críticos) sendo que a placa de bolores e leveduras (quando usar o
Agar sabouraud caso seja necessário acidificar o meio com ácido tartárico).
7.1.4 Acrescentar aproximadamente 20 ou 25 ml (quando for 10 ml de amostra na placa de
petri) do meio específico em cada placa (Trypticase Soy Agar para contagem de
mesófilas totais) e 15 - 20 ml na placa de petri descartável (sabouraud ou HC Agar
Base).
7.1.5 Pipetar 1,0 mL de diluição 10/100 ou 1/100 para um tubo contendo Trypticase Soy
Broth para pesquisa de identificação de P.aeruginosa e S. aureus e 1,0 mL para outro
tubo contendo Lactose para pesquisa e identificação de E. coli.
7.1.6 Incubar as placas de mesófilas totais em posição invertida em estufa a 35 - 37°C por
48 horas. Caso haja dúvidas em relação ao crescimento de microorganismos a mesma
poderá retornar para a estufa por mais 24 horas.
7.1.7 Incubar as placas de fungos e leveduras em posição invertida a estufa a 25 - 27°C por
3-4 dias (HC Agar Base) e de 5 dias (Sabouraud) .
7.1.8 Após o período de incubação, proceder à leitura das placas.
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7.1.9 O resultado é expresso em <10 ufc/g ou ml (contagem zero) para fungos e leveduras e
contagem multiplicado por 10 quando é usado 1 ml da diluição é expresso por ex: 1,0 x
101 para mesófilas totais e ausentes em 1 grama para patógenos
7.1.10 Se o resultado estiver dentro destas especificações, o produto será aprovado e
liberado. Ao contrario serão submetidos a pesquisas e testes bioquímicos para
identificação dos microorganismos.

7.2 Pesquisas

7.2.1 Pesquisa de E. coli

7.2.1.1 Pipetar 1 ml da diluição (10 g da amostra em 90 g de caldo letheen contendo


inativantes de conservantes) para tubo contendo 10 ml de caldo lactose.
7.2.1.2 Incubar 24/48 horas a 35-37oC
7.2.1.3 Tubo de lactose turvo, com auxilio da alça retirar alíquota e estriar na placa de
MaConkey ou Endo incubar 18/24 horas a 37 oC
7.2.1.4 Se houver crescimento, característicos, prosseguir com BBL cristal (conforme MET
CQM DAV 008) e efetuar coloração de Gram (conforme MET CQM DAV 002).

7.2.2 Pesquisa de Pseudomonas aeruginosa

7.2.2.1 Pipetar 1 ml da diluição (10 g da amostra em 90 g de caldo letheen com adição de


inativante de conservante) para tubo contendo 10 ml de caldo trytic soy
7.2.2.2 Incubar 24/48 horas a 35-37oC.
7.2.2.3 Tubo de trytic soy turvo, com auxilio da alça retirar aliquota e estriar na placa de agar
cetrimide.
7.2.2.4 Incubar 18/24 horas a 42 oC.
7.2.2.5 Se houver crescimento característico, confirmar com citocromo oxidase: impregnar
discos de papel com p-amino dimetilanilina colocada sobre placa de petri e discos
umedecidos com água destilada, colônias suspeitas são aplicadas nos discos
umedecidos e aguardar a mudança de coloração (cor vermelha a púrpura =
Pseudomonas).

7.2.3 Pesquisa de Staphylococcus aureus

7.2.3.1 Pipetar 1 ml da diluição (10 g da amostra em 90 g de caldo letheen com adição de


inativante de conservante) para tubo contendo 10 ml de caldo trytic soy
7.2.3.2 Incubar 48 horas a 37oC
7.2.3.3 Tubo de trytic soy turvo, com auxilio da alça retirar alíquota e estriar na placa de Vogel
Johnson
7.2.3.4 Incubar 48horas a 37oC
7.2.3.5 Se houver crescimento característico, confirmar com prova coagulase e BBL cristal
(conforme MET CQM DAV 008).
7.2.3.6 Prova da coagulase: em tubo de ensaio contendo plasma de coelho adicionar
suspensão de microorganismo (colônia em suspensão em solução salina 0,9%) e
incubar a 37º C.
7.2.3.7 Formação de coágulos: prova positiva para coagulase

8.0 RESULTADO
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Bactéria Formato Coloração Tamanho Especificaçãp


Escherichia Bacilo / bastonetes Vermelha presença 1 – 5 micrometro Ausencia em 1 g
coli precipitado
Pseudômonas Bacilo / bastonetes Amarelo Ausencia em 1 g
aeruginosa esverdeado
Staphylococcus Cocos / células Negra c/ halo 1 micrometro Ausencia em 1 g
aureus esfericas
Mesófilas totais na na na < 100 ufc/g
Fungos e na na na < 10 ufc/g
leveduras

9.0 HISTÓRICO DE REVISÕES

Revisão Data Motivo Responsável


00 18/11/1996 1.º Emissão C. Manca
01 23/08/2000 Mudança de layout N. Mei
02 15/04/2004 Mudança de layout N. Mei
03 29/03/2011 Mudança de layout. Adicionada as informações: N. Mei
Se deve pipetar 10 ml da diluição para produtos
mais críticos; 15-20 ml na placa de petri
descartável (sabouraud ou HC Agar Base); Caso
haja dúvidas em relação ao crescimento de
microorganismos a mesma poderá retornar para a
estufa por mais 24 horas. Tubo de lactose turvo,
com auxilio da alça retirar alíquota e estriar na
placa de MaConkey ou Endo. Alteração nas
informações: Na quantidade de Trypticase Soy
Agar adicionada de 15 ml para 20 a 25 ml
(quando for 10 ml de amostra na placa de petri); A
incubação das placas de fungos e leveduras de 7
dias para 3-4 dias (HC Agar Base) e de 5 dias
(Sabouraud); O resultado é <10 ufc/g ou ml
(contagem zero) para fungos e leveduras de <
100 UFC/mL para contagem por 10 quando é
usado 1 ml da diluição e expresso por ex: 1,0 x
101. Atualização do tópico de reagentes. Inclusão
das informações - prova da coagulase: em tubo
de ensaio contendo plasma de coelho adicionar
suspensão de microorganismo (colônia em
suspensão em solução salina 0,9%) e incubar a
37º C. Formação de coágulos: prova positiva para
coagulase. Inclusão das referencias dos MET
CQM DAV 008; MET CQM DAV 002.

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