7.1. Macromoléculas ¢fnformagio sgendiica 176 72 Aduplabelice 177 7.3 Superenovelamento 180 7A Cromossomos e outros elementos senéticos 181 Principios de Biologia Molecular 7A2 Avnidade de tramsrigio 198 7.43 Océdigo genético 194 7.46 Aincorporagio de aminaécidos 7.47 Dobramento serosto de proteinas. 202 genoma, incluindo a produgdo de RNA) e a traducéo (sintese proteica)176 Nie camisle , saracterizamos as fll como usinas .quimicas e dispositivos codificadores. Como usinas quimicas, as células acumulam e transformam seu vasto conjunto de macromoléculas em novas células, Na forma de dispositivos codificadores, elas armazenam, processam € utiliza os genes, a informagao genética da célula. Os genes ea expresso génica sio 0 tema da biologia molecular. Em. particular, a revisao da biologia molecular abordada neste ccapftulo inclui a natureza quimica dos genes, a estrutura e fungdo do DNA e RNA, assim como a replicago do DNA. Em seguida, consideraremos a biossintese de proteinas, as ‘macromoléculas que desempenham importantes papéis tan- to na estrutura como nas atividades da célula, Neste capitu- lo, enfocaremos como os processes ocorrem em Bacteria, Escherichia coli, um membro do dominio Bacteria, € 0 oF- ganismo modelo para a biologia molecular, sendo utilizado como principal exemplo. GENES E EXPRESSAO GENICA Macromoléculas e informagao genética ‘A unidade funcional da informagio genética corresponde a0 ‘gene. Todos os micro-organismos, na realidade todas as for: mas de vida, contém genes e, portanto, o conhecimento bési- cco da natureza do gene e de suas fungdes ¢ importante para, entender a estrutura ¢ 0 comportamento de células e virus. Fisicamente, os genes esto localizados nos cromossomos ou em outras moléculas grandes, referidas coletivamente como elementos genéticos. Atualmente, na “era da gendmica’, a Diologia tende a definir as células em termos de seu conjunto de genes. Assim, devemos conhecer o processo do fluxo da informagao biolégica, se desejarmos entender como os mi crorganismos atuam, Genes e etapas do fluxo informacional [Em todas as células, os genes so compostos por écido deso- ximibonucleico (DNA), A informagao do gene encontra-se na forma de uma sequéncia de bases ~ purinas (adenina e gua- nina) ¢ pirimidinas (timina e citosina) ~ no DNA. A informa- 80 armazenada no DNA é transferida ao deido ribonucleico (RNA). 0 RNA pode atuar como um intermediario informa- cional (mensageiro), como um componente estrutural ou até ‘mesmo como uma enzima, Finalmente, a informag&o carre- ada pelo RNA 6 utlizada na produgao de proteinas. Uma vez, que estas trés moléculas, DNA, RNA e proteina, contém as inlormagées genéticas em suas sequéncias, clas sfo denomi- nadas macromoléculas informacionais (“= Seco 3.2). Os processos moleculares subjacentes ao fluxo da infor ‘ago genética podem ser divididos em ts estos (Figu- ra7.1) 1. Replicagio. A molécula de DNA corresponde a uma du- pla hélice de duas longas eadeias (=> Sega 3.5). Du- rante a replicago, o DNA ¢ duplicado, produzindo duas duplas hélices (Figura 7.1). 2. Transcrigdo. O DNA participa da sintese protefca atra- vés de um intermedidrio de RNA. A transferéncia da informagao para o RNA é denominada transcricao, en- quanto a molécula de RNA que codifica um ou mais po- Michael T. Madigan, John M. Martinko, Paul V. Dunlap & David P. Clark TRANSCRIGAO DAFITAINFERIOR RNA 5. | rmovcao Proteina +.\- i A SE coo Figura 7.1. Sintese dos trés tipos de macromoléculs informa- cionais. Observe que, para qualquer gene em particular, somente Luma das duos ftas da cupla hélice de ONA 6 transcrt lipeptideos 6 denominada RNA mensageiro (mRNA). Alguns genes contém informagZo para outros tipos de RNA, particularmente 0 RNA de transferéncia (tRNA) © ‘RNA ribossomal (rRNA). Esses desempenham papéis na sintese proteica, porém nio codificam a informago genética referente & produgao de proteinas. 43, Tradugdo. A sequencia de aminoscidos em um polipep- ‘deo € determinada pela sequéncia especifica de bases no mRNA. Ha uma correspondéncia linear entre a se- dquencia de bases de um gene e a sequéncia de amino- 4cidos de um polipeptideo (Figura 7-1). Cada grupo de ‘és bases em uma molécula de mRNA codifica um tinico aminodcido, sendo cada conjunto de tres bases denomt- nado eédan. Esse cédigo genética é traduzido em protet nas, por meio do sistema de sintese proteica. Esse siste- ma consiste nos ribossomos (compostes por proteinas e FRNA), 1RNA e virias protefnas conhecidas como fatores de tradusio. As trés etapas apresentadas na Figura 7.1 sfo utilizadas por todas as células e constituem o dogma central da biologia molecular (DNA -> RNA ~> protefna). Observe que muitas moléculas distintas de RNA sio transcritas a partir de uma regito relativamente curta da longa molécula de DNA. Em. ‘eucariotos, cada gene € transcrito, originando um Gnico mRNA (== Capitulo 8), enquanto, em procariotos, um tinico RNA mensageiro pode carrear a informagdio genética de vi codificadora (Figura 7.2). No Capitulo 10, verificaremos que alguns virus violam © dogma central. Isso inclu situagdes em que 0 RNA con- siste no material genético viral, atuando diretamente como MRNA, ou codificando mRNA. Isso também ocorre em retro- virus, como o HIV ~ o agente etiol6gico da AIDS - onde um ‘genoma de RNA codifica a produgdo de DNA, um processo ‘denominado transcrico reversa. Observe que, em ambos os ‘casos, a transferéneia da informagio mantém-se de écido nu- ‘leico para dcido nucleico, porém nao da maneira original- ‘mente afirmada pelo dogma centralMicrobiologia de Brock 7 Figura 7.2 Transcrigo em procariatos. Um Unico mRNA fe ‘quentemente contém mais de uma ragiio codiicadora (Os tés processos essonciais da sintose de macromotéculas so: (1) replicacio do DNA, (2) transcrigio (a sintese de RNA a partrdo um DNA mold) e (3) tradugdo(sntose de protes nas, utlizando o RNA mensageiro come molde). 1 Quaie as trés macromeoléculasinformacionais envolvidas no fuxo da informagéo genética? 1 Em todas as células, ha ts processos envolvidos no fuxo dda informagso genética. Qusis so esses processos? (ID) ESTRUTURA DO DNA No Capitulo 3, abordamos a estrutura dos dcidos nucleicos de uma maneira geral. Nas préximas segdes deste capftulo, discutiremos a estrutura do DNA em detalhes, incluindo 1s de elementos genéticos contendo DNA que podem ser encontrados nas eélulas. Com essas informagées como base, poderemos entao discutir como ocorre a replicasao do DNA, sua transcriggo em RNA e sua traduedo em pro- teinas. A dupla hélice Quatro bases de Acido nucleico so encontradas no DNA: adenina (A), guanina (G),citosina (C) e timina (1). Conforme apresentado na Figura 3.11, o esqueleto da cadeia de DNA consiste em repetigées alternadas de fosfato ¢ da pentose de- soxirribose; conectada a cada agticar, ha uma das bases de fcido nucleico, Lembre-se especialmente do sistema de ni meragio das posigbes do agicar e da base. O grupo fosfato que conecta as duas moléculas de asicar liga-se ao carbono 3! de um agiicar e ao carbono 5’ do agdicar adjacente (ver Fi gura 7.4). Em uma das extremidades de cada fita do DNA, 0 acdcar apresenta um fosfato ligado a hidroxila 5’, enquanto, 1a outra extremidade, o agticar apresenta um grupamento hhidroxila livre, na posigio 3" © DNA como uma dupla hélice Em todas as células, como em alguns virus, 0 DNA ¢ encon- trado sob a forma de moléeula de fita dupla com duas cadeias polinucleotidicas, cujas sequencias de bases sio comple- Ports go exqueite “WD trogtna Figura 7.3. Pareamento especifico entre adenina (A) e timina (16 entre guanina (G) @ citosina (C), por meio de pontes de hidrogénio, Estes s80 05 tipicos pares de bases encontrados no DNA de fita dupla, Os stomos encontrados na sulco maior da dupla haélice, que interagem com as proteinas, encontram-se assinalados 19m rosa. Os esqueletos de desoxiribosefosfato das duas ftas de DNA si0 também ingicados, Observe as diferentes tonalidades de ‘verde assinalando as duas ftas de DNA, uma convengéo utlizada 20 longo deste vr, Esquoeto ‘mentares. (Conforme discutido no Capitulo 10, os genomas de alguns virus consistem em fitas simples.) A complemen- taridade do DNA decorre do parcamento especifico entre as bases paricas e pirimidicas: a adenina sempre pareia-se com a timina, e a guanina, com a citosina (Figura 7.3). As duas fitas na molécula de fita dupla resultante esto organizadas ‘em um padrio antiparalelo (Figura 7.3 ¢ Figura 7. ciadas por dois tons de verde). Por exemplo, na Figura 7.4, fita da esquerda encontra-se na direcio 5" para 3" (de cima para baixo), enquanto a outrafita esta na diregao 5’ para 3/ (de baixo para cima). As duas fitas de DNA sao torcidas uma sobre a outra, formando uma dupla hélice (Figura 7.5). Nessa dupla hélice, © DNA forma dois sulcos distintos, @ sulco maior e o suleo ‘menor. Dentre as muitas protefnas que interagem especifica~ ‘mente com 0 DNA (=> Capitulo 9), a maforia liga-se a0 sul ‘co maior, onde o espago é consideravelmente maior: Devido a regularidade da dupla hélice, alguns étomos de cada base ‘encontram-se sempre expostos no sulco maior (¢ alguns no suleo menor). As regides essenciais dos nucleotideos, impor. tantes para nas interagdes com protefnas, s30 apresentadas. na Figura 7:3. Diversas estruturas de duplas hélices podem ser encon- tradas no DNA. A dupla hélice de Watson e Crick é conhecida como a forma B ou B-DNA, para diferencis-la das formas A eZ. A forma A é mais curta e grossa que a forma B da dupla hélice; possui 11 pares de bases por volta e o suleo maior & mais estreito e profundo. O RNA de fita dupla ou hibridos de um RNA e uma fita de DNA frequentemente formam a héli- ‘ce A. A dupla hélice do Z-DNA possui 12 pares de bases por volta, sendo levégira. Seu esqueleto de agiiear fosfato exibe configuragéo em ziguezague, em vez de curva suave. 0 Z- DNA ¢ encontrado em regives ricas em GC ou GT, especial ‘mente quando se apresenta em superenovelamento negativo, Enzimas e proteinas regulatorias ocasionais ligam-se prefe- rencialmente a0 Z-DNA,178 ql} Hee oH Figura 7.4 Estrutura de DNA. Natureza complementar o ant paralela do DNA. Observe que uma das cadeias termina em grupa ‘mento 5'-fofato, enquanto a outa termina em uma 3'-hidoxa, As bases em vermelho representam as primidinas ctosia (C) e timing (1), enquanto as bases em amarelo, epresentam as purinas adenina (je quanina (G) Tamanho de uma molécula de DNA © tamanho de uma molécula de DNA pode ser expresso ‘como o niimero de milhares de bases nucleotidicas ou pares de bases por molécula. Assim, uma molécula de DNA com 1,000 bases contém 1 quilobase (kb) de DNA. Se o DNA esti- verna forma de dupla hélice, utliza-se a nomenclatura pares de quilobases (kpb) Dessa forma, uma dupla hélice contendo 5.000 pares de bases teria um tamanho de 5 kpb. A bacté- ria Escherichia coli contém cerca de 4.640 kpb de DNA em. seu cromossomo. Uma vez que muitos genomas sic bastante grandes, é mais simples falar em termos de milhdes de pares, de bases, ou pares de megabases (Mpb). Assim, o genoma de E. coli apresenta 4,64 Mpb. Em termos de comprimento real, cada par de bases apre- senta cerea de 0,34 nandmetros (nm) de comprimento ao lon- ‘20a hice, e cada volta da hélice contém aproximadamente 10 pares de bases. Assim, um DNA de 1 kb apresenta uma hélice com 100 voltas, medindo 0,34 yum de comprimento, Calculos desse tipo podem ser muito interessantes, conforme veremos em breve, Estrutura secundéria, repeticdes invertidas ¢ hastes-alcas ‘Moléculas longas de DNA sio bastante flexiveis, enquanto segmentos de DNA com menos de 100 pares de bases so Michael T. Madigan, John M. Martinko, Paul V. Dunlap & David P. Clark Uma vota ‘a aloe (Go pares Geese) Esqueeto gear ato Figura 7.5 Modelo computacional de um pequeno segmento de DNA apresentando o arranjo global da dupla hélice. Um dos lesqueletos de agicar-fosfato 6 apresentado om azul e 0 outro, em verde. As piriidinas so apresentadas em vermelno © as purinas, em amarelo. Observe 2 localizagZo dos suleos maior e menor (comparar com Figura 7.3). Uma volta da lice contém 10 pares de bases. mais rigidos. Alguns segmentos curtos de DNA podem ser do- brados por proteinas que interagem com eles. Entretanto, de- terminadas sequéncias de bases podem, por si s6, promover © dobramento do DNA, As sequéncias desse DNA dobrado. frequentemente apresentam diversas repetigées de cinco out seis adeninas (na mesma fita), cada uma separada por quatro fu cinco outras bases. Além disso, algumas sequencias con- tribuem para a capacidade de dobramento do DNA, quando certas protefnas interagem com a molécula. O dobramento do DNA é um mecanismo envolvido na regulacio da expres- sio genica (a ativagdo e inativagao de genes), como veremos. no Capitulo 9 ‘Sequéncias repetitivas curtas slo frequentemente en contradas em moléculas de DNA. Muitas protefnas intera- ‘gem com regiées de DNA contendo sequéncias repetitivas arranjadas em orientagao inversa (> Capitulo 9). Esse tipo de repetigao é denominado repeticao invertida e confere & sequéncia de DNA uma simetria duplicada, Como ilustrado na Figura 7.6, repetigées invertidas préximas podem levar a formagao de estruturas do tipo haste-alca. As hastes sao regides curtas da dupla hélice com pareamento normal de bases e fitas antiparalclas. alga consiste em bases nao pare- ‘adas entre duas unidades repetitivas. ‘A produgdo de estruturas em haste-alga no DNA é re- lativamente rara nas células, No entanto, a produgio de es- ‘truturas em haste-alga no RNA originado apés a transeri¢ao do DNA 6 comum, Tal estrutura secundéria (o> Sega0 3.5), formada pelo pareamento de bases em uma tinica fita de dei do nucleico, 6 eritica para a atividade do RNA de transferén-Repetigces | — Aga status em hastoaiga Haste s aTo® Saco ” Figura 7.6 RepetigSes invertidas e formagio de uma estrutura fom haste-alka. (2) Ropoticbosinvrtidas préximas no DNA. As sotas ingicam a simetia 20 redor de ur exo imaginéio nha pontilhe di). 6) Formacio de ectutures em haste-algs pelo parsamento de bases compiementares de uma mesma fita, Observe que, #¢ © RNA, for orginado a partir de qualquer uma das tas de DNA, 0 RNA po: dor formar uma tria haste-alea(comparar com Figura 7.23), cia (Segao 7.14) e do RNA ribossomal (Segao 7.15). Mesmo sem a formagao de uma haste-alga, as repetigdes invertidas do DNA frequentemente correspondem a sitios de ligasao de proteinas espectficas de ligago ao DNA que regulam a trans- erigdo (=> Capitulo 9). O efeito da temperatura na estrutura do DNA Embora as pontes de hidrogénio entre os pares de bases se- jam individualmente muito fracas (= Seeao 3.1), um gran- de niimero dessas pontes, presentes em uma molécula longa de DNA, efetivamente mantém as duas fitas unidas. Podem existir milhoes ou mesmo centenas de milhoes de pontes de hidrogénio em uma molécula de DNA, dependendo do nime- ro de pares de bases existentes. Lembre-se, a partir da Figura, 7.3, que cada par adenina-timina apresenta duas pontes de hhidrogénio, enquanto o par guanina-citosina apresenta tres Isso torna os pares GC mais fortes que os pares AT. ‘Quando isolado de eélulas e mantido & temperatura am- biente, em concentragaes fisiolégicas de sal, o DNA mantém-se sob a forma de fita dupla. Entretanto, se a temperatura for clevada, as pontes de hidrogénio irao romper-se, sem haver, no entanto, a quebra das ligagdes covalentes que mantém uma, cadcia unida, resultando na separagao das duas fitas de DNA. Esse processo denomina-se desnaturagao (fusdo), podendo ser ddeterminado experimentalmente, ja que dicidos nucleicos de fita simples e de fita dupla diferem quanto & capacidade de absorver radiacao ultravioleta 2 260 nm (Figura 7.7), Microbiologia de Brock 179 ‘Absorvinia a 260 nm Figura 7.7 Desnaturagie térmica de DNA. © DNA absone mais radiacSo ultravoleta a 260 am a medida que dupla hélice sole desnaturaglo. A vansiglo é bastante abruptae a temperatura do ponte médio, T, € proporcional ao conteido de GC do DNA. Embora © DNA desraturado possa ser renaturado pelo restriamen- 1 lento, 0 processo nao apresenta uma curva similar. A renaturagio ‘corre progressivamente,tomando-se mais completa em tempera- turas abaino da T,, @ somente apée um considerével periodo do incuba. DNA contendo alta porcentagem de pares GC sofre des- naturagdo em temperaturas mais elevadas que uma molécu- Ja de tamanho similar, contendo mais pares AT. Se um DNA. previamente aquecido for resfriado lentamente, o DNA de fita dupla pode ser novamente formado, processo denominado anelamento. Esse processo pode ser empregado tanto para a reorganizagao de uma molécula nativa de DNA, como também para obtengio de moléculas hibridas, cujas fitas originam-se de fontes distintas. A hibridizacéo, a construgao artificial de tum acido nucleico de fita dupla, pelo pareamento de bases ‘complementares de duas fitas simples, consiste em uma tée- nea poderosa de biologia molecular (= Segio 12.2). ODNA consste em uma molécula de ta dupla que forma uma hélice. Seu comprimento é medido em termos do rnimero de pares de bases. As duas fits da dupa hélice ‘orientam:se deforma antiparalela, porém repetigdesinver- tidas permitem a formagio da estrtura secundaria. As fits de uma molécula de DNA em dupla hélce podem ser des naturadas pelo calor, sendo possivel sua reassociago apés 0 resfriamento, 11 Explique qual o significado do termo amtiparalelo, em re- lagSo & estuture do ONA de fta dupla. 11 Defina 0 terme complementaridade, quando empregado fem relagéo as duas fitas de ONA. 1 Defina os termos desnaturacéo, reanelamento e hibridiza- ‘80, em relaco 205 Scidos nucieicos. (reer)180 Michael T. Madigan, John M. Martinko, Paul V. Dunlap & David P. Clark Vo (@) DNA crcularcovalentemente fechado,relsxado Dominio ‘superenovelado (0 DNA cromassomal com dominios superenovelados Superenovelamento Quando linearizado, o cromossomo de Escherichia coli exibi- ria comprimento superior a 1 mm, cerca de 400 vezes maior ‘do que a propria célula de E, coll! Como é possivel empacotar tanto DNA em um espago to diminuto? A solugao consiste na necessidade de um tipo de estrutura de “ordem superior” para o DNA, na qual o DNA de fita dupla é adicionalmente torcido, em um processo denominado superenovelamento. A Figura 7.8 ilustra como ocorre o superenovelamento em um, DNA duplex circular, Quando uma molécula de DNA circus lar é linearizada, qualquer superenovelamento € perdido e 0 DNA torna-se “relaxado”, Assim, uma molécula de DNA re- laxada apresenta exatamente o ndmero predito de voltas da hice, a partir do nimero de pares de bases. ( superenovelamento submete a molécula de DNA a um. ‘estado de toreao, muito similar 8 tensio imposta a um elés- tico quando ¢ torcido. © DNA pode ser superenovelado tanto de forma positiva, como negativa. No superenovelamento po- sitivo, a dupla hélice torna-se mais enovelada, enquanto no superenovelamento nogativo a dupla helice torna-se subeno- vvelada. O superenovelamento negativo ocorre quando 0 DNA 6 torcido ao longo de seu eixo, na dirego oposta a da dupla hélice dextr6gira. O DNA superenovelado negativamente cor- responde a forma mais encontrada na natureza, com algumas ‘excegdes interessantes observadas em certas espécies de Ar- chaea (= Capitulo 8). Em Escherichia coli, acredita-se que ‘existam mais de 100 dominios superenovelados, cada qual cestabilizado pela ligagio de protesnas espectficas, Topoisomerases: DNA girase 0s superenovelamentos podem ser introduzidos ou removi- dos por enzimas conhecidas como topoisomerases, Exisiem ‘duas clases prineipais de topoisomerases ¢ cada uma atua por um mecanismo distinto, As topoisomerases de clasee T Tealizam uma clivagem em uma das ftas do DNA, que per- mite a rotagdo de uma das fitas da duplahelice sobre a ou- tra, Cada uma dessasrotagdes adiiona ou remove um tnico ‘superenovelamento. Apds esse processo, 0 core éselado. AS topoisomerases de classe I ealizam quebras nas duasFitas, passam a dupla hélice intacta através da quebra e finalmente Selam o corte. Cada uma dessas operagdes adicfona ou re- move dois superenovelamentos. A insergao de superenovela- rmentos no DNA requer ATP para o fornecimento de energia, ‘enquanto a liberagao de superenovelamentos nao o requer. Em Bacteria ena maioria de Archaea hi uma enaima de- nominada DNA girase, a qual introduz superenovelamentos negativas no DNA, A DNA girase pertence ao grupo de topol- Somerases do tipo I. Sua atividade ocorre em varias etapas. Inicialente, a molécula de DNA circular €vorcida; em seg da, no local onde as duas cadeias se encontram, ocorre uma quebra de fita dupla em uma das cadeias. Entao, a ca¢ intacta € deslocada através da quebra ea dupla hélice que- brada é novamente selada (Figura 7.9). E interessante notar ‘que alguns antibiéticos que atuam em Bacteria, como a qu holon dcido nalidisco, afluoroquinolona ciprofloxacina, € Figura 7.8 DNA superenovelado. As partes(s, (bec) apresen- tam DNA circular superenoveladoe relaxado e DNA circular eivado, relaxado. Um corte correspond & quebra de ura ligacio fesfoci- stor em uma das fas. (Na realidade, © DNA de fita dupla do cromossome bacterano no se organiza como um DNA supereno- velado, mas sim como vérios dominios superenaveladas, conforme aprecentad na figuraQO) Microbiologia de Brock 181 ADNA grave ‘romove uma quebra ata pla Relgagso de \/ POY _ aa fea DONA superenovelado Figura 7.9 DNA girase.Inroducio de superenovelamente negative em um DNA circular, pela agdo da DNA girase (topoisomerase I), que realza quebrasnafta dupla. a novobiocina, inibem a atividade da DNA girase. A novobio- cina € também eficaz contra varias espécies de Archaea, onde parece também inibir a DNA girase. ‘A remogio do excesso de superenovelamentos no DNA & geralmente realizada pela topoisomerase I. Essa enzima in- troduz uma quebra na fita simples no DNA, promovendo a rotagdo de uma das fitas da dupla hélice sobre a outra. Con- forme apresentado na Figura 7.8, uma quebra (clivagem) no tesqueleto de uma das fitas permite que 0 DNA retorne ao es- tado relaxado, Contudo, para evitar que 0 cromossomo bac teriano inteiro torne-se relaxado sempre que uma clivagem é realizada, 0 cromossomo contém dominios superenovelados, conforme ilustrado na Figura 7.8d. Um corte realizado no DNA em um destes dominios nao promove o relaxamento do DNA nos outros dominios. Nao se sabe ao certo como esses dominios sao formados, embora proteinas especificas de li gagdo ao DNA estejam envolvidas. ‘A molécula de DNA pode alternar entre os estados rela- xado e superenovelado por meio da atividade das topoiso- ‘merases. Uma vez, que 0 superenovelamento € necessério a0 empacotamento do DNA na célula e o relaxamento € neces sario a replicagao ¢ transcrigao do DNA, os processos com- plementares de superenovelamento e relaxamento desempe- nnham um importante papel na biologia celular. Na maioria, dos procariotos, o grau de superenovelamento negativo é resultante do equilfbrio entre as atividades da DNA girase & da topoisomerase I. Além da replicagao, no entanto, o supe- renovelamento também afeta a expresso génica. Determina- dos genes so mais eicientemente transeritos quando o DNA esld superenovelado, enquanto a transcrigo de outros genes 6 inibida pelo superenovelamento excessivo. Moliculas muito longas de DNA podem ser empacotads nas células devido a0 seu superencvelamento. Em procarctos, {ste superenovelamento & mediado por enimas denominadas topoisomerases, A DNA girase ¢ uma enzima chave de proca Fotos @introduz syporenovelamentos negativs no DNA 1 Por que o superenovelamento 6 importante? 1 Qual a funcéo desempenhada pelas topoisomerases no interior das células? ‘Cromossomos e outros. elementos genéticos Estruturas contendo material genético (DNA na maioria dos ‘organismos e RNA em alguns virus) sio denominadas ele- ‘mentos gensticos. 0 genoma é o conjunto total de genes de ‘uma célula ou de um virus. Embora o principal elemento ge- nético de procariotos seja 0 cromossomo, outros elementos ‘genéticos so conhecidos e desempenham papéis importan- tes na funcao génica, tanto de procariotos como de eucario- tos (Tabela 7.1). Na Segdo 2.6, mencionamos que um proca- Floto ipico possui um dnico cromossomo circular, contend todos (ou a maioria) dos genes encontrados na célula. Em- bora um nico cromossomo corresponda & regra entre os procariotos, ha excegées. Alguns procariotos possuem dois ‘cromossomos. Os eucariotos apresentam miltiplos cromos- somos que constituem seu genoma (> Seco 8.5). Além disso, o DNA de todos os cromossomos eucariéticos conhe- ccidos € linear, ao contrario da maioria dos cromossomos is correspondem a moléculas circulares Virus e plasmideos Além do eromossomo, outros elementos genéticos s80 co- nhecidos, incluindo genomas viras, plasmideos, genomas de ‘organelas e elementos transponives. 0s virus contém genomes, quer de DNA quer de RNA, ‘que controlam sua prépria replicagao e transferéncia de cé- Tula a célula. Sio conhecidos genomas virais tanto lineares ‘como circulares. Além disso, o dcido nucleico dos genomas virais pod ser de fta simples ou dupla. Os virus exibem es- pecial interesse, uma vez que frequentemente causam doen- ‘sas. Discutiremos os virus nos Capitulos 10. 19, bem como luma variedade de doengas viras em capitulos posteriores. Plasmideos sao elementos genéticos que se replicam inde- pendentemente do cromossomo. A grande maioria dos plas- :ideos é constitufda por DNA de fita dupla e, embora grande parte deles exiba configuragdo circular, alguns sao lineares. Os plasmideos diferem dos virus de duas maneiras: (1) no provocam dano celular (geralmente sio benéficos) e (2) no ‘exibem formas extracclulares, a0 contririo dos virus. Embo- ra somente poucos eucariotos contenham plasmideos, um ou ieee)182 Pisces Corin ONAetin Eisenman ee torgergor- ene Se pene Todosce Plasmids’ ONAdefta Noll cela one Sine utea lt = eae pee a EE a eee Bae paths cova Moca Gerona DNAdefRa Tamer in coco bee ema, plasto geralmente a Vins Goons DAMOWIOA cororar aileron ane “Psmidecs orator em evcarotr. ‘mais plasmideos foram detectados na maioria das espécies procaridticas, os quais podem ser de grande importancia. Dis- cetiremos os plasmideos no Capitulo 11. Alguns plasmideos contém genes cujos produtos protei- os contferem importantes propriedades a célula hospedeira, como a resisténcia a antibidticos. Qual a diferenga existente centre um plasmideo grande e um cromossomo? Um cromos- somo ¢ um elemento genético que contém genes cujos pro- dutos sio necessérios as fungdes celulares essenciais. T genes so denominados genes housekeeping (do inglés, que ‘mantém a “easa"). Alguns deles codificam protefnas essen- ciais, como DNA e RNA polimerases, enquanto outros co- dificam RNAs essenciais, como RNA ribosomal e RNA de transferencia, Contrariamente aos cromossomos, os plasm deos so frequentemente descartéveis ¢ raramente contém genes necessirios a0 crescimento sob todas as condigoes. Existem muitos genes em um cromossomo que também nao so essenciais, mas a presenga de genes essenciais é neces- séria para um elemento genético ser considerado um ero- Elementos transponiveis Elementos transpon{veis so segmentos de DNA capazes de ‘moverem-se de um sitio em uma molécula de DNA a outro sitio na mesma molécula, ou em uma molécula distinta de DNA. Cromossomos, plasmideos, genomas virais ¢ qualquer ‘outro tipo de molécula de DNA podem atuar como molécu- las hospedeiras para os elementos transpontveis. Os clemen- tos transponfveis nao so encontrados como moléculas de DNA independentes, sendo inseridos em outras moléculas de DNA, incluindo cromossomos, plasmideos ou genomas virais. Elementos transponiveis sa0 encontrados em eucario- tos e procariotos, desempenhando importantes papéis nos Michael T. Madigan, John M. Martinko, Paul V. Dunlap & David P. Clark processos de variagto genética. Em procariotos, existem trés tipos principais de elementos de transposigio: sequéncias de {nsergdo, transposons ¢ alguns virus especiais. As sequéncias de insersio s20 0 tipo mais simples de elemento transpontvel, ‘e nao carreiam qualquer informago genética, alémm daque- la necessiria a sua mobilizagdo no cromossomo, Os trans- posons so maiores e contém outros genes. Estes dois tipos de elementos serio discutidos em maior detalhe no Capitulo 11. No Capitulo 19, abordaremos um virus bacteriano, de- nominado Mu, que também é um elemento transpontvel. A caracteristica Singular de todos os elementos transponiveis corresponde ao fato de replicarem-se como parte de alguma futra moléeula de DNA. Além do cromostomo, vérios outros elementos genéticas podem ser encontrados nas células. Plasmideos so molé culas de DNA quo existom de maneira independiente do cromossomo cellar. Os vius contém um genoma, de DNA, ‘URNA, que controla sua propria replicacéo. Elements ‘ransponiveissf0 encontrados como parte de outros ele- rmentos genéticos. 1 O quese entende por genoma? 1 Qual o material genético encontrado em todos os cro- mozsomos calulares? 1 O que define um cromossome om procariotos? (ll) REPLICAGAO DO DNA 0 fluxo da informagao biol6gica ¢ iniciado pela replicagao do DNA. A replicagio do DNA é necesséria para que as células dividam-se, seja na reproduedo, originando novos organis- ‘mos, como no caso de micro-organismos unicelulares, seja, na producio de novas células em um organismo multicelu lar, O processo de replicagao do DNA deve ocorrer de modo suficientemente preciso, a fim de que as células filhas sejam. geneticamente idénticas (ou praticamente) célula mie. Isso envolve um conjunto de enzimas e processos especiais. Moldes e enzimas © DNA encontra-se nas eélulas como uma dupla hélice, exi- ‘indo pareamento de bases complementares (Figuras 7. 7.4). Quando a dupla hélice do DNA é aberta, uma nova fita, pode ser sintetizada como complemento de cada uma das {as parentais. Conforme apresentado na Figura 7.10, a repli ‘cago é semiconservativa, significando que as duas duplas hélices resultantes consistem em uma fita recém sintetizada ‘e uma fita parental. A fita de DNA que foi copiada é deno- minada molde, e, na replicagao do DNA, cada fita parental corresponde ao molde para uma fita filha (e complementar) recém-sintetizada (Figura 7.10). ‘A quimica do DNA, a natureza de seus precursores ¢ as atividades das enzimas envolvidas na replicago impaem res- trigdes importantes & maneira pela qual as novas fitas si0 sintetizadas, O precursor de cada novo nucleotideo da cadeia, ‘correspond a um desoxinucleosideo 5'-trfosfato, do qual so removidos os dois fosfatos terminais, sendo 0 fosfato interno ligado covalentemente a desoxirribose da cadefa emFigure 7.10 Vise geral da replicagio do DNA. A replicago do DNA é um processo semiconseniative, tanto em procaviotos como feucarotos. Observe que cada uma das novas duplashélics contémn uma fita nove (lusirada em vorralho, no alto} e ums fta parental. crescimento (Figura 7.11). A adigdo do nucleotfdeo a fita em crescimento requer a presenga de um grupo hidroxil livre, ‘© qual encontra-se disponivel somente na extremidade 3° da molécula. Essa restricio leva a um importante principio que corresponde & base da replicagio do DNA: a replicacio do DNA sempre ocorre a partir da extremidade 5’, em direga0 a extremidade 3’, com o grupo 5'-fosfato do nucleotideo a ser adicionado & Cadeia sendo ligado ao grupo 3'-hidroxil do nucleotideo previamente adicionado. DNA polimerase e primase [As enzimas que catalisam a adigo dos desoxinucleotideos stio denominadas DNA polimerases. Existem diversos tipos de tais enzimas, cada uma apresentando uma ungdo espe- cifica. Existem cinco DNA polimerases distintas em Esche- richia coli, denominadas DNA polimerases I, I IT, IV e V. A DNA polimerase III (Pol I) &a principal enzima envolvida na replicagao do DNA cromossomal. A DNA polimerase I (Pol 1) também esta envolvida na replicagao cromossomal, embo- raem menor grau (vera seguir). As demais DNA polimerases auxiliam no reparo de DNA danificado (=> Segdo 11.7). ‘Todas as DNA polimerases conhecidas sintetizam DNA. na diregao 5’ > 3’. No entanto, nenhuma DNA polimerase conhecida é capaz de iniciar a sintese de uma nova cadeia; todas essas enzimas somente sto capazes de adicionar um rnucleotideo a um grupo 3!-OH preexistente, Dessa forma, para iniciar uma nova cadeia, é necessério um iniciador, luma molécula de Acido nucleico a qual a DNA polimerase pode ligar o primeiro nucleotideo. Na maforia dos casos, este jor consiste em um pequeno segmento de RNA. ‘Quando a dupla hélice 6 aberta no inicio da replicagao, uma enzima de polimerizagio de RNA sintetiza 0 RNA ink ciador: Essa enzima, denominada primase, sintetiza um pe- queno segmento de RNA, com cerca de 11-12 nucleotfdeos © complementar ao DNA molde, quanto ao pareamento de bases, Ao final dessa molécula de RNA iniciador, no ponto de crescimento, hé um grupo 3'-OH ao qual a DNA polimera se pode adicionar o primeiro desoxirribonucleotideo. Desse modo, a extensiio continuada da molécula ocorre sob a forma de DNA, em ver de RNA. A molécula recém-sintetizada apre- senta uma estrutura semelhante aquela ilustrada na Figura 7.12, Eventualmente,o iniciador sera removido e substituido por DNA, conforme descrito adiante. Analisaremos os deta- Ihes da replicagio do DNA em seguida. Microbiologia de Brock 183 a NA, polimerase DDesoximibonucleositeo ‘toro Figura 7.11 Estrutura da cadeia de DNA e o mecanismo de crescimento pela adigo de um desoxiribonucleosideo trifos- ato 8 extromidade 3° da eadela, O croscimento ocone ® partir do 5'-fosfato, em direcio & extremidade 3-hidroxi. A enzima DNA polimerate catalisaareagio de adigso. Os quatro precursoressio a esoxitimidina tifosfato (STP), desoxiadenosina tfosfato (ATP), desoxiguancsina tifosfeto (GTP) e desoniciiina wifosfto (dCTP). Na insergo do nucleotideo, os dois fosfatos termina do trifosta te s8o dlvados na forma de profosfato PP). Assim, duas gages {osfatoricas em energia séo consumidas na adigao de um dnieo nu- cleotideo. ‘As duas tas dahélice de DNA atuam como molde na sinte: ‘se de duas novas fitas replicagao semiconservatva). As duas ‘duplas hélces cesultantes contém uma ita parental e uma fita nova. As novasfitas 880 elongadas pela adicso de deso- xiribonucleotideos & extremidade 3’. As DNA polimerases requerem um iniiacor de RNA. 1 Aqualextremidade (5'0u 3") de uma fita de DNA recém-sintetizada a polimerase adiciona uma base? 11 Porque hé a necestidade de um inicador na replicagio do DNA? RNA|ncindor DNA PPP LE A 30%: s NA Figura 7.12 ORNAniciador.Estrutura da combinago RNA-DNA, formada na iniiagSo dasintese de DNA (reer)184 ANA iiciagor| _— Pease Protona de igacéo a spies DNA palimerase I ae ta conta ANA inciacor Figura 7.13 Eventos que ocorrom na forquilha de roplicagio do DNA. Observe a polaridade e a natureza antiparaela das ftas de DNA, A forquilha de replicagéo Grande parte de nosso conhecimento sobre o mecanismo de replicagdo do DNA foi obtido por estudos realizados com a bactéria Escherichia coli, sendo a discussio a seguir enfocada principalmente nesse micro-organismo. No entanto, & provi vel que o pracesso de replicagao seja bastante similar em to- das Bacteria, Ao contrivio, embora a maioria das espécies de Archaea possua cromossomos circulares, muitos dos eventos dda replicagio do DNA sio mais semelhantes aqueles observa- dos em células eucarioticas que em Bacteria (= Capitulo 8). Isso novamente reflet a filiagao filogenética entre Archaea © Eukarya (=> Segio 2.7). Iniciagao da sintese de DNA Antes da DNA polimerase ser capa de sintetizar novo DNA, 1 dupla hélice preexistente deve ser desenovelada para expor as fitas molde. A regio de DNA desenovelado, onde ocor re a replicaglo, é referida como forquilha de replicagio ‘Uma enzima, conhecida como DNA helicase, desenovela a dupla hélice do DNA, expondo uma pequena regido de fita simples (Figuras 7.13 e 7:14), A energia requerida pelas he- licases para desenrolar © DNA ¢ proveniente da hidrélise de ATP. As helicases deslocam-se ao longo da hélice e separam as fitas, imediatamente a frente da forquilha de replieagao. A regio de fta simples 6 complexada a uma protefna especial, a proteina de ligagao &fita simples, que estabiliza o DNA na forma de fita simples, impedindo a formagao de pontes de hhidrogénio intrafitase reversdo A dupla hélice Em procariotos, a sintese de DNA ¢ iniciada a partir de um tinieo local no eromossomo, a origem de replicagao. Ela consiste em uma sequéncia especifica de DNA, com cerca de 250 bases, reconhecida por proteinas de iniciagao espe- cificas, particularmente uma proteina denominada DnaA (Fabels 7.2) que se liga a essa regifo ¢ promove a abertura Michael T. Madigan, John M. Martinko, Paul V. Dunlap & David P. Clark ( rw ~ rw rw me Forquiha de replicagso —-Hescase Figura 7.14 Uma DNA helicase desenrolando uma dupla hél- 2. Nesta figura, a protein @ as moléculas de DNA esto desenha- das em ercala.Frequentemente, diagramas simples séo utilzados para dor uma ideia dos eventos moleculares que ocortem na of lula, mas eles podem dar afalsa impressao de que a maioria das, proteinas é relatvamente pequena, quando comparadas ao DNA. Embora as moléculas de DNA sejam, em gera,bastantolonges, 580 relativamente delgadas em compars¢so avirias proteinas dda dupla heélice, expondo as fitas individuals & maquinaria de replicagao. A helicase (também conhecida por DnaB) é a préxima a compor o conjunto, cuja ligagéo a0 DNA é auxi- liada pela proteina carregadora de helicase (ou DnaC). Duas helicases so carregadas, uma em cada fita, voltadas em di- rogdes opostas. Em seguida, dias primases, ¢entio duas en- zimas DNA polimerases, sao carregadas no DNA, atrés das hrlicases. A iniciagio da replicagio do DNA ¢ entio iniciada nas dua fitas simples. A medida que a replicagao prossegue, a forquilha de replicagao parece mover-se ao longo do DNA. (Figura 7.13). Fitas continua e descontinua ‘A Figura 7.13 apresenta uma importante diferenga na repli- ‘cago das duas fitas de DNA, devido ao fato de a replicagao sempre ocorrer no sentido 5’ — 3" (havendo sempre a adi ‘sao de um novo nucleotideo a extremidade 3'-OH da cadeia ‘em crescimento). Na fita que cresce a partir do 5'-PO,? em direcio ao ¥-OH, denominada fita continua, a sintese de DNA ocorre ininterruptamente, uma vez que sempre ha uma extremidade ¥-OH livre na forquilha de replicagio, & qual ‘um novo nucleotideo pode ser adicionado. Ao contrario, na fita oposta, denominada fita descontinua, a sintese de DNA ‘corre de forma descontinua, porque nao ha uma extremi- dade 3'-OH livre na forquilha de replicagao, & qual um novo nucleotideo possa ser adicionado. Onde se encontra a extre- midade 3'-OH livre dessa fita? Ela esta localizada na extre- ‘midade oposta, distante da forquilha de replicag3o. Portan- to, na fita descontinua, é necessério que a primase sintetize iniciadores de RNA repetidas veres, para fornecer os grupos 3-0H livres, Por outro lado, a fita continua recebe um inicia- dor somente uma ver, na origem. Como resultado, a fita des-ONAgiase yA Desenvolasuperenove- lamentos 8 frente do replissomo Proteina de igagio na iga-se& origem da ‘origem replicacio; auxlia na desneturagéo do DNA, para abrira dupls hélice CCarregador de he- hac Carrega a helicase na Tease ‘coriger Hebcase nad Dasenrola a dupla hilice na forqulha de repi- cagdo Protwina de lgagio ssb Impede o anelamento afta simples das ftas simples Pomace nas Fomece oinciador para roves fits de DNA DNA polimeras ill Principal enima de pol- arizagso Bragadoira desi- dha Mantém 3 Pol ino DNA ante Caregadords —holAE Carrega a Pollina braga- bracadera dlira deszante (Figura 719) Subunidade de hax Mantém as das encimas cimerzagzo carne unidas nas fits continue @ deseontinus Suburidade do hat Elongago da fta ppolimerase| Suburidade de cna Mecanismo de revisio reviebo DNApolimersse pol Realiza a excisdo do inicador de RNA 2.0 preenchimento das Tecunas DNA ligase ligA,ligB Sela as quebras no DNA Protea tus ts Lige-se &terminagso, blo- ‘queando.o avango da forquiha de replicagso. Topoisomerase IV parC Separagso dos crculos intorigades continua € sintetizada como curtos segmentos, denominados fragmentos de Okazaki, em homenagem a seu descobridor, Relji Okazaki. Esses fragmentos sao posterformente unidos, originando uma fita continua de DNA. Replicacdo do DNA: sintese de novas fitas de DNA AAp6s sintetizar RNA iniciador, a primase é substituida pela Pol Il, Essa enzima consiste em um complexo de vé- ras proteinas (Tabela 7.2), ineluindo a prépria enzima cerne da polimerase. Cada polimerase é mantida no DNA por uma bragadeira deslizante, que circunda e desliza ao longo das fitas simples de DNA que atuam como molde. Consequente- Microbiologia de Brock 185 NA ponerse @ “ae € ¥ —: I |S ricardo ron sp ———— 07%q a) ‘DNA polimerase ———— 0 rouge 7 Ne@omtone @ Owes vo o Figura 7.15 Unit de dots fragmentos na fita descontinua. {a} A DNA polimarase Il promove a sintese de DNA no sentido 5°93, em diego a0 inilador de RNA presente em um fragmento previamente sintetizado na fita descortinua. (6) Ao alcangar esse ragmento, a DNA polimerase il é substuida pela DNA polimerase (GA DNA polimerase continua a sitese de DNA, enguanto retra ®iniciadar de RNA co fragmento prévo.(d) ANA ligase substitu DNA polimerase | apés a remoglo do inciador.(e) A DNA ligase line 08 dois fragments. mente, a forquilha de replicago contém duas polimerases ‘cerne ¢ duas bragadeiras deslizantes, um conjunto para cada fita, Entretanto, hé apenas um tinico complexo carregador de bragadeira, Ele é necessario & montagem das bracadeiras deslizantes no DNA. Apés a montagem na fita descontinua, ‘ocomponente clongador de Pol Ill, Dna, promove, enti, a adigdo dos desoxirribonucleotideos até que atinja 0 segmen: tode DNA previamente sintetizado (Figura 7.15). Nesse mo- mento, cessa a atividade da Pol II. A proxima enzima a participar, a Pol I, possui mais de uma atividade enzimética, Além de promover a sintese de DNA, a Pol I exibe atividade de exonuclease 5’ 3’, que remove o iniciador de RNA localizado a sua frente (Figura 7.15). Apés a remocio do iniciador e sua substituigo por DNA, a Pol ¢ liberada. A tltima ligagio fosfodiéster & pro- ‘duzida por uma enzima denominada DNA ligase. Essa envi- ‘ma sela 0s corte feitos no DNA que apresentam um 5'-PO,” ‘© um 3'-OHT adjacentes (processo que a Pol IMI ndo & capaz de realizar) e, juntamente com a Pol I, também participa de processos de reparo de DNA. A DNA ligase também desem- penha importante papel na selagem de DNAs manipulados reers)186 —orgem de rapteagao Figura 7.16 Replicagso de DNA circular a estrutura teta. Em um DNA circular, a replicago bidirecional a partir de uma origers leva 8 formagSo de ume estruturaintermediéria, emelhante & letra rege teta sgeneticamente, durante 0 processo de clonagem molecular (60 Segdo 12.3). Cerra A sintese de DNA inicia-se em um local especifico, denomi- nado origem de replicagio. A duplahalice ¢ desarvolacs pela helicase e estabilzada pelas proteinas deligagSo afta imples.A extensio do DNA acorre de maneira nirterrupta na ita continua e em vérias etapasna fta descontinua. Os fragmentos da ita descontinua sio unides posteriormente 1 Por que exstom as fitas continua e descontinua? 1 Como 2 origem de replicacio 6 reconhecida? 1 Que enzimas partcipam ne unigo dos fragmentos da fits sdescontinua? (7.7 ) Replicagao bi e 0 replissomo jirecional Annatureza circular do cromossomo de Escherichia coli e da ‘majoria dos demais procariotos cria uma oportunidad de aceleragao da replicagao. Aqui abordaremos de que modo Michael T. Madigan, John M. Martinko, Paul V. Dunlap & David P. Clark ‘esse fato adapta-se ao esquema geral da replicagao e divisio cclular: Replicagao bidirecional do cromossomo Em E. coli, e provavelmente em todos os procariotos con- tendo cromossomos circulares, a replicagao ¢ bidirecional, ‘partir da origem de replicagao, conforme apresentado nas Figuras 7.16 e 7.17. Existem, desse modo, duas forquilhas de replicagao em cada cromossomo, movendo-se em dire- {goes opostas. No DNA circular, a replicago bidirecional leva a formagao de estruturas caracteristicas, denomina- das estruturas tetas (Figura 7.16). A maioria das moléculas ‘srandes de DNA, quer de procariotos quer de eucariotos, apresentam replicagao bidirecional a partir de origens fi- xas. De fato, um Gnico eromossomo eucaristico possui di- vversas origens. A andlise cuidadosa de um DNA em replica- so revela que, durante a replicagao bidirecional, a sintese ‘ocorre de modo continuo ¢ deseontinuo em cada fita molde (Figura 7.17). ‘A sintese bidirecional de DNA ao longo de um cromos- somo circular permite que o DNA seja replicado 0 mais répi- ‘damente possivel. Mesmo diante desse fato,e considerando que a Pol III écapaz.de adicionar nucleotfdeos a uma fita de DNA cm crescimento a uma velocidade de 1.000 por segun- do, a replicagio do cromossomo de E. coli ainda demanda cerca de 40 min, Curiosamente, nas melhores eondigoes de crescimento, E. coli & eapaz de crescer com um tempo de ‘geragio de cerca de 20 min, No entanto, nessas condigées, a replicagio do eromossomo ainda leva 40 min. A solu para esse enigma esté no fato de as eélulas de E. coli eres- ‘cendo com tempos de geragio inferiores a 40 min conterem riitiplas forquilhas de replicagdo. Isto é, um novo ciclo de replicagao do DNA é iniciado antes do ciclo anterior ter sido completado (Figura 7-18). Apenas dessa forma pode-se ™manter um tempo de geragao menor do que o tempo de re plicagio do eromossomo. O replissomo Enguanto 0 DNA esti sendo sintetizado na forquilha de re- plicagdo, 0 grau de enovelamento do DNA sofre alteragoes ‘evido as atividades das topoisomerases (Sega0 7:3). O dese- novelamento é uma caracteristica essencial da replicagao do DNA, como 0 DNA superenovelado encontra-se sob tensio, ‘seu desenrolamento ocorre mais faciimente que em um DNA no superenovelado. Assim, ao regular o grau de supereno- yelamento do DNA, as topoisomerases podem controlar © processo de replicagao (e também de transcricio, conforme Aiscutido posteriormente, ‘A Figura 7.13 iustra as diferengas na replicago das fi tas continua ¢ descontinua, além das enzimas envolvidas no processo. A partirdesse diagrama simplificado, pode parecer ‘que a forguilha de replicagio contém um grande niimero de protefnas distntas, atuando de forma independente. Na rea- Tidade, esse nao ¢ 0 caso. As proteinas altamente dinamicas agregam-se, formando um grande complexo de replicago < i Pepa co | Figura 7.18 Divisio celular versus duplicagio do cromossomo. (3) As céulas de Escherichia collevam aproximadamente 40 min para replicar 0 eromossomo e 20 min adicionais pare a divisdo celular (b} Quando as oluls se duplicam em menos de 60 min, um novo ciclo de replicase cromozeomal deve sar iniciaco antes do anterior ter sido completad, ieee)188 [DNA potemerase it VN, G A Fa reotm-antetzeds Michael T. Madigan, John M. Martinko, Paul V. Dunlap & David P. Clark ONA parental Inia a RNA Figura 7.19 0 replissomo. © replissomo consiste em duss cépiss da DNA polimerase Il além da helicase primase (que, em conjun- to, foram o primossoma) e muitas cSpias da proteina de ligacdo a DNA de fita simples. As subunidades tau mantém os dois conjuntos <6 DNA polimeras hlicase unidos. Imediatamento a montante ao rplissomo, a DNA girase remove os superenovelamentos do DNA 2 ser replicado. Observe que as duas polimerases estdo promovendo a replicagzo de duasfitas individuals de DNA em diecdes opostas Consequentemente, a fita descontinus molde forma ums alga, de modo que todo © replissomo se move na mesma dtegio ao longo do Revisdo e terminagao (© DNA replica-se com uma taxa de erros significativamente baixa. Entretanto, quando os erros ocorrem, ha um mecanis- ‘mo de seguranca que os detecta e os corrige. Apés conside- rrarmos esse mecanismo, discutiremos como ocorre a termi naga da sintese de DNA. Fidelidade da replicacéo do DNA: revisio Erros durante a replicagao de DNA introduzem mutagdes,al- teragdes na sequéncia do DNA. As taxas de mutaconas célu- las sio extremamente balxas, entre 10" 10~""erros por par de bases inserido. Essa preciso é possivel, em parte, porque as DNA polimerases tém duas oportunidades para incorporar fa base correta em um determinado sitio. A primeira oportu- nidade ocorre ap6s a insergao de bases complementares as bases opostas da fita molde pela Pol II, de acordo com as re gras de pareamento de bases, A com Te G com C. A segunda ‘oportunidad depende de uma segunda atividade enzimatica de Pol Te Pol Ill, denominada mecanismo de revisdo (Figura 7.20). No caso da Pol II, uma subunidade proteica distina, Dna0, ¢ responsével pela revisio. Como é realizada a revisio? Pol Le Pol IIT possuem uma atividade de exonuclease 3! — 5" (exo significa ‘extremida- de") capaz de remover um nucleotideo inserido erroneamen- te. Aatividade de revisio ocorre quando uma base incorreta foi inscrida, uma vez.que isso origina um parcamento incor: reto de bases. A polimerase peroebe esse fato porque um nu- cleotideo inserido incorretamente nao forma o padrio cor- roto de pontes de hidrogénio com sua base correspondente na fita complementar, promovendo uma discreta distoreao na dupla hélice. Apés a remogo do nucleotideo pareado in- ‘corretamente, a Pol III tem uma segunda oportunidade de Inserir 6 nucleotideo correto (Figura 7.20). ‘A atividade exonucledsica de revisio ¢ distinta da ativi- ‘dade de exonuclease 5’ ~> 3° da Pol I, utilizada para remover 6 iniciador de RNA das fitas continua e descontinua (Figura 7.15). Apenas a Pol I possui essa tiltima atividade. A revisio por exonuclease ocorre em sistemas de replicagao de DNA. ‘em procariotos, cucariotos e virus. Todavia, muitos orga- nismos apresentam mecanismos adicionais para reduzir os. ‘erros realizados durante a replicagao de DNA, tendo alguns esses sido discutidos no Capitulo 11. Terminagao da replicagao Finalmente 0 processo de replicagao de DNA é concluido. Como o replissomo percebe o momento de parar? No lado posto de um cromossomo circular, em relagao a origem, ha um sitio denominado terminagao da replicasdo, Nesse ponto, as dias forquilhas de replicago colidem, enquan- 0 05 novos circulos de DNA sio completados. Os detalhes da terminagio nao sio totalmente conhecidos. No entanto, na regido de terminaclo encontram-se varias sequéncias de DNA, denominadas sitios Ter, que so reconhecidas por uma proteina denominada Tus, cuja fungao € bloquear 0 avango das forquilhas de replicagao. Quando a replicagao, de um cromossomo circular chega ao fim (Figura 7.16), as ‘duas moléculas circulares encontram-se ligadas, como elosPonte do hiroinio norma Nucieotso0 areado DNA polimerase I Y o ® Figura 7.20 Mecanismo de revisio madiado pela atividade de exonuclease 3’ +5’ da DNA polimerase Microbiologia de Brock 189 oem "gage o Um pareamento incor reto no par de bases terminal (a) indus a polimerase a realizar uma breve pausa, Ese 6 6 snal para que o mecarismo de reieso promova 8 lexcisd0 do nucleotideo incoreto(b), aps © qual, a base correta 6 inserida pela atvidede poimersica (2 de uma corrente. Sua separagio é catalisada por outra en- zima, a topoisomerase IV. No Capitulo 6, estudamos como a sintese da parede celular e a replicagao do DNA estao acopladas a divisao celular (> Segao 6.2). Obviamente, €-critico que, apés a replicagdo do DNA, ele seja segregado de tal maneira que cada célula filha receba uma cépia do cromossomo. Esse processo pode ser auxiliado por FtsZ, uma importante proteina de divisio celular que auxilia na coordenaao de varios eventos essenciais da divisio celular (= Segao 6.2) Minirrevisio de 7.8 Muitos erras de pareemento de bases que acorrem durante 2 replicacdo sSo corrigidos pelas atividades de revsso das DNA polimerases. Os nuclestideos incorretos sio removidos substtuidos. Finalmente, a replicago do DNA é concluida quando as forqulhas de eplicagSo encontram-se em uma regio especial de terminagao no cromossomo. 1 Como a atividade de revisso 6 realizada durante a replica ‘glo do DNA? 1 que promove a parada das forquihas de replicacio na regiao de terminacao do cromossomo? (IV) SiNTESE DE RNA: TRANSCRICAO, 0 acid ribonucleico (RNA) desempenha uma série de papeis| importantes na eélula. Existem res diferencas essenciais na quimica do RNA e do DNA: (1) 0 RNA contém 0 agticar ribo- se em vez de desoxirribose, (2) o RNA contém a base uracila em lugar de timina, e (3) exceto no caso de alguns virus, 0 RNA nao é encontrado na forma de fita dupla. A substituigao da desoxirribose pela ribose afeta as propriedades quimicas de um acido nucleico; as enzimas que atuam sobre o DNA geralmente no exibem qualquer efelto no RNA, e vice-versa Entretanto, a subst no afeta ‘0 pareamento das bases, uma vez que elas bases parelam-se ‘com a adenina com a mesma eficién« cde RNA esto envolvidos na sinte- se proteica: RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferéncia (RNA) e RNA ribossomal (PRNA). Varios outros tipos de RNA so também encontrados, estando a maioria envolvida na regulagao (> Capftulo 9), Todas essas moléculas de RNA io produtos da transcrigio do DNA, Deve-se enfatizar que ‘0 RNA atua em dois niveis, genético e funcional. No nivel ‘genético, 0 MRNA carreia a informagio genética do genoma para 0 ribossomo. Ao contriio, o FRNA desempenha papel funcional e estrutural nos ribossomos, enquanto o tRNA de- sempenha tum papel ativo no transporte de aminoscidos di rante a sintese proteica. Alguns tipos de RNA podem ainda apresentar atividade catalftica (enzimétiea) (ribozimas, > Secio 8.8). Nesta segio, enfocaremos como o RNA ¢ sinte- tizado em espécies de Bacteria, utilizando Escherichia coli ‘como nosso organismo modelo. Visdo geral da transcrigao ‘A transcrigio da informagio genética, de DNA para RNA, é realizada pela enzima RNA polimerase. Assim como a DNA polimerase, a RNA polimerase catalisa a formacao de lisa- ‘gbes fosfodiéster, porém, nesse caso, entre ribonucleotideos ‘em vez de desoxirribonucleotideos. A RNA polimerase requer ‘© DNA como molde. Os precursores do RNA sto os ribonu- ‘leosideostrfosfato ATR, GTP, UTP e CTP. (© mecanismo de sintese de RNA é muito semelhan- te aquele da sintese de DNA (Figura 7.11). Isto é, durante a clongasao de uma cadeia de RNA, os ribonucleosideos trifosfato sio adicionados ao grupo 3-OH da ribose do nu- leotideo precedente. A polimerizagao é conduzida pela li ‘beragao de energia de duas ligagdes fosfatoricas em energia presentes nos ribonucleosfdeos trifesfato que esto sendo adicionados. Na replicagao do DNA, assim como na trans- criggo do RNA, a diregio global do creseimento da cadeia cocorre a partir da extremidade 5' em diregao a extremidade 3" e, portanto, a fita reeém-sintetizada é antiparalela 3 fita ees)190 marten), jen on Figura 7.21 Transerigho. (a) Etapas de sntese de RNA Os sitios {ie iniciagdo (promotor e de terminacao correspandem a saquén- as nuleoticicas especificas no DNA. A RNA polimerase move-se ‘a longo da cedeia de DNA, promovendo a abertura temporéria da ddupla hélice, tanscrevendo uma das ftas do DNA. (b) Micrografia. letrbnica de transcrigio de um gone do cromossomo de Escheri- ia coli. Aregiso de transcigdo ative possi cerca de 2kb de ONA. A transcrig5o estd ocorrendo da esquerda para a dieita, com os. transcritos mais cutos,& esquerda, tamandose mais longos & me dida que a vanscrgao prosseque. Michael T. Madigan, John M. Martinko, Paul V. Dunlap & David P. Clark molde, Contudo, contrariamente & DNA polimerase, a RNA polimerase € capaz de iniciar novas fitas de nucleotideos de forma independente; consequentemente, nao hé a necessi- dade de um iniciador. RNA Polimerases (© molde para a RNA polimerase consiste em uma molécula dde DNA de fita dupla, embora apenas uma das fitas seja transcrita em cada gene. No entanto, genes esto presentes em ambas as fitas do DNA e, portanto, as sequencias de DNA das dias fitas sdo transertas, embora em localizagées distintas, Embora esses principios sejam verdadeiros para a transerigao de todos 08 organismos, as RNA polimerases apresentam grandes variagdes quando comparadas entre Bacteria, Archaea e Eukarya. A discussio a seguir abordard somente a RNA polimerase de Bacteria, que possui a es- trutura mais simples, sendo também a mais conhecida (as RNA polimerases de Archaea e Eukarya serio discutidas no Capitulo 8). ‘ANA polimerase de Bacteria possul cinco subunida- des diferentes, denominadas B, 6’, a, o (Omega) o (sig- ma), estando a subunidade a presente em duas cépias. ‘As subunidades 6 e (beta linha) sBo similares, mas idénticas. As subunidades interagem, formando a enzima auiva, denominada holoenzima da RNA polimerase, porém © fator sigma nao se encontra to fortemente ligado como as demais subunidades, podendo dissociarse facilmente, levando & formagao da enzima cerne da RNA polimerase, ‘4,8B'e. A enzima cere sozinha sinttiza 0 RNA, ‘o fator sigma reconhece o sitio apropriado para a intese de RNA, no DNA. A subuinidade Omega & necessaria ‘a montagem da enzima ceme, porém nao é requerida para a sintese de RNA. A sintese de RNA é realizada pela RNA polimerase e peo fator sigma, conforme ilustrado na Figura 7.21. www.mierobiologyplace.com Tutorial Online 7.2: Transcription (Transcriga0). Promotores A RNA polimerase ¢ uma protefna grande, que estabelece ‘contato simultaneamente com varias bases do DNA. Protet- ras como a RNA polimerase podem interagir especificamen- te.com 0 DNA, pois porgées das bases encontram-se expostas no sulco maior (Figura 7.5). Entretanto, para iniciar a sintese de RNA corretamente, € necessério que a RNA polimerase primeiramente reconhega os sitios de iniciagao no DNA. Es- ‘ses importantes sitios, denominados promotores, s30 reco- necidos pelo fator sigma (Figura 7.22). Uma ver.que @ RNA polimerase encontra-se ligada ao promotor, a transcrigio pode ocorrer. Nesse processo, a dupla hélice de DNA na regio do promotor é aberta pela RNA polimerase, originando uma bolha de transcrigao, A medida que a RNA polimerase se desloca, desenrola 0 DNA em curtos segmentos. Esse desenovelamento transi- X6rio expve a fita molde e permite que ela seja copiada no ‘complemento de RNA. Dessa forma, os promotores podem ser considerados como direcionadores da RNA polimerase para uma direcao ou outra ao longo do DNA. Quando uma regio do DNA apresenta dois promotores préximos, com diregdes opostas, a transcrigao a partir de um dos promo- {ores ocorre em uma diregao (em uma das fitas), enquanto ‘a transcrigao a partir do outro promotor ocorre na diregao ‘oposta (na outra fita).(enwima cane) Iria de.m RNA, pe f : ; SRCTGTTGACAATIAATCATCGAACTAGTTAAC TAGTACGCAAG. 2 TTT a “ 5 a LTT TTT TTT TTT 6 CaaS Sequincia-35 “Prionow box Consens NA potierase Transerigto ———s Microbiologia de Brock 191 Figure 7.22 A interagio da RNA polimerase ‘com © promotor. Apresentadst sbsixo da RNA ppolimerace © de DNA encontrarse ses sequén- {as de diferentes promotores identicados om E> chericha coi, uma especie de Bacteria, S30 apce- tentados os contatos da RNA polimerare com 2 sequéncia ~35 ¢ com 0 “Prbnow box” (sequénela 10), A transrigfoinci-se em uma base expac- fica, imediatamente a usante ao "Pribnow box’. Abbsixo das sequéncias reais das regises ~35 © do “Pribnow box", estdo as sequéncias consen- 50, derivadas de comparagées realizadas entre ‘muitos promotores, Observe que, embora sigma reconhega as sequénciae do promotor na ita 5'-> 3° do DNA (er verde escuto) a enzima cere da RNA polimerase transcreve, de fto, afta om ver- Sequérciapronciora Ap6s a sintese de um pequeno segment de RNA, 0 fator sigma dissocia-se. A elongacao da molécula de RNA 6 entao realizada pela enzima cerne isoladamente (Figura 7.21). 0 fator sigma esté envolvido somente na formagio do complexo inicial RNA polimerase-DNA, no promotor. A medida que o RNA recém sintetizado dissocia-se do DNA que se encontrava aberto, volta a fecharse, assumindo a forma de dupla hélice original, A transcrigao cessa em sf tios espectficos, denominados terminadores transcricionais (Segao7.11). ‘Contrariamente & replicagao de DNA, que envolve a c6- pia de genomas completos, a transcrigo envolve unidades muito menores de DNA, frequentemente correspondendo um Gnico gene, Esse sistema permite que a célula seja, capaz de transcrever diferentes genes com frequéncias distintas, dependendo das necessidades da célula por di- ferentes protefnas. Em outras palavras, a expresso genica € regulada. Como veremos no Capitulo 9, a regulagio da transcrigao um processo importante e elaborado, que em- prega varios mecanismos diferentes, sendo muito eficiente no controle da expressdo génica e na conservagdo de recur- 0s celulares. (Os rs tiposprincipais de RNA slo 0 RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferéncia (RNA) @ 0 RNA ribossomal (PRNA\. & transcrgio do RNA a partie do DNA & decorrente da atvidade da enzima RNA polimerase, que adiciona nu: cleotideos as extremidades 3 das cadeias em cresciment, Contrariamente 3 DNA polimerase, a RNA polimerase no necessita de um iniciador ereconhece um sto de iniciagso tespectice ne DNA, denominade promotor 1 Ao longo da fta molde, em que direcdo (5'-» 3'0u3'-> 5) ‘ocorte a transergio? 1 O que é um promotor? Qual protein reconhece os pro: motores de Escherichia col? de clara, com sentido 3” 5, uma vaz que 2 enzi- raceme atua apenasna drecéo 5-3. Fatores sigma e sequéncias consenso Conforme discutido anteriormente, 0 promotor desempenha ‘um papel central na transcrigio. Os promotores sfo sequén- cias especificas de DNA, as quais a RNA polimerase se liga. {A sequéncia de um grande niimero de promotores de varios ‘organismos foi determinada e a Figura 7.22 apresenta a se~ ‘quéncia de alguns promotores de Escherichia coli. ‘Todas as sequencias de DNA apresentadas na Figura 7.22 slo reconhecidas pelo mesmo fator sigma, o principal fator sigma de E.coli, denominado «” (o nimero 70 sobrescrito indica o tamanho dessa protefna, 70 quilodaltons). Se voce ‘comparar as sequencias de DNA dos promotores, percebers ‘que ni sto idénticas. Contudo, duas sequéncias menores, no interior da regio promotora, sAo altamente conservadas nos promotores, sendo elas reconhecidas pelo fator sigma. As duas sequéncias precedem (sto a montante) o sitio onde a transcri- ‘¢40 ¢ iniciada. Uma corresponde a uma regiao contendo 10 ‘bases, localizada antes do sitio de iniciagao da transerigho, a regio ~10, denominada "Pribnow box". Observe que, embo- ra cada promotor seja ligeiramente diferente, a maioria das ‘bases da regido ~10 sio idénticas. Ao comparatse as regides =10 de todos os promotores reconhecidos por esse fator sig~ ma, visando determinar qual base ocorre com maior frequén- ‘cia em cada posigio, chega-se & sequéncia consenso: TATAAT. Em nosso exemplo, cada promotor apresenta de trés a cinco ‘coincidéncias para essas bases. A segunda regio de sequén: ‘cia conservada no promotor encontra-se a aproximadamente 35 bases do infcio da transcrigao. A sequéncia consenso na re- _gido ~35, corresponde a TTGACA (Figura 7.22). Novamente, ‘a maioria das sequéncias nio é exatamente igual & sequéncia ‘consenso, porém elas so muito similares. ‘Observe que, na Figura 7.22, a sequéncia promotora de somente uma das fitas de DNA é apresentada. Por conven: ‘edo, a fita apresentada corresponde aquela orientada com a ‘extremidade 5’ a montante (portanto, nao corresponde a fita utilizada como molde pela RNA polimerase). A apresentaco reers)192 ©? RpoDTTGACA Para maioria dos genes, ‘principal fator sigma duran tec crescimento norma ‘Assimilagio de nitrogério Principal fator sigma durante ‘fase estaconsra, tam. ‘bem para genes envolvidos ‘om respostasoxidatvas © cosméticas Resposia ao choque térmico Para genes envolvidos nasin- ‘220 de lageloe Respostaaproteinas dobra- ‘das incorretamente no periplasma Para certos genes envolidos no transporte de fero oRpoN oP RpoS TTGGCACA cosaca o* RpoH FIA RoE eo" Fecl AAGGAAAAT “Onsmore sober indica otamanho do proteins em quilogsitone Mui {oe ators apresentam oes danornasdes por exemple tomb ‘Sevominacoa™ ‘arama decusio sobre sequéncas consonso, vor Sgées7.108¢7:1 @ Fowa730 ‘We uate nudeotiden, dda sequéncia de apenas uma das fitas corresponde simples- ‘mente a uma forma “abreviada” de redigir as soquéncias de DNA. Na realidade, o DNA possui duas fitas e a RNA polime- rase liga-se a0 DNA de fita dupla, promovendo seu desenrola- ‘mento. Uma tinica ita do DNA desenrolado, 2 fita transcrita, entao utilizada como molde pela RNA polimerase cerne. Embora ela ligue-se as duas fitas do DNA, 0 fator sigma re- cconhece as sequencias espectficas das regides ~10 e ~35 da fita ndo transcrita, com a qual estabelece a maioria dos con- tatos. Alguns fatores sigma de outras bactérias so muito mais especiticos em relagao a ligagao as sequéncias que o exem= plo apresentado na Figura 7.22, Em tais casos, hi pequena, liberdade de troca em relagao as bases criticas que so reco- nhecidas. Em E. coli, os promotores que apresentam maior simllaridade com a sequéncia consenso sto geralmente mais, cficientes na ligagio & RNA polimerase, Esses promotores ‘ais eficientes sio denominados promotores fortes, sendo de grande utilidade na engenharia genética, conforme discu- tido no Capftulo 12. Fatores sigma alternativos em Escherichia coli ‘A maioria dos genes de E. coli requer 0 fator sigma padrio, conhecido como 6”, para a transcrieio e t&m promotores semelhantes aqueles ilustrados na Figura 7,22. Entretanto, varios fatores sigma alternativos sio conhecidos, os quals, reconhecem sequéncias consenso diferentes (Tabela 7.3) Cada um destes fatores sigma alternativos ¢ espectfico para, um grupo de genes necessrios em circunstincias especiais. esse modo, *, também conhecido como Rpos, reconhece ‘uma sequéncia consenso presente em promotores de genes expressos durante a fase estacionaria. Consequentemente, Michael T. Madigan, John M. Martinko, Paul V. Dunlap & David P. Clark {é possivel controlar a expresso de cada familia génica, re- gulando-se a concentragao do fator sigma correspondente, Isso pode ser realizado alterando-se a taxa de sintese ou a taxa de degradagio do fator sigma. Além disso, a atividade dos fatores sigma alternativos pode ser modulada por outras proteinas, denominadas fatores antissigma. Essas protefnas podem inativar temporariamente um fator sigma em respos- twa sinais ambientais. No total, existem sete fatores sigma distintos em E. coli, cada um reconhece uma sequéncia consenso diferente (Ta bela 7.3). Os fatores sigma foram originalmente denomina- dos de acordo com sua massa molecular: Mais recentemente, receberam denominagoes de acordo com suas atividades. Por ‘exemplo, RpoN refere-se a "RNA polimerase-Nitrogénio". A maioria desses fatores sigma apresenta equivalentes em ou tras Bacteria. A bactéria formadora de endésporos Bacillus subtilis possui 14 fatores sigma, com quatro fatores sigma diferentes dedicados a transcrigo de genes espectticos do ‘endésporo (o> Segao 4.12). Cierra Em Bacteria, 0s promotores so reconhecidos pela subuni- dade sigma da RNA polimerase. As regides de DNA reco ‘nhocidas por uma determinada proteina de ligac3o a0 DNA ‘exibem sequéncias muito similares, Os fatores sigma alterna ‘vos permitem a regulagéo conjunta de grandes familias de genes em resposta 8s condigses de cresciment. 1 O que é uma sequéncis consenso? 11 Em que partes da regido promatora ocorre a ligagao de sigma? 1 Quantas familias de genes, requeridas em condigbes es ‘pecias, podem ser controladss como um grupo utlizando fatores sigma? (7.11) Terminagao da transcrigéo ‘Apenas aqueles genes que necessitam ser expressos devem ser transcritos. Portanto, ¢ importante que a transcrigao seja, ‘conclufda no local correto. A terminagdo da sintese de RNA ‘égovernada por sequéncias de bases especificas, presentes no DNA. Em Bacteria, um sinal comum de terminagao no DNA ‘corresponde a uma sequéncia rica em GC, contendo uma re- peticao invertida com um segmento central nao repetido (ver Secio 7.2 e Figura 7.6, para uma explicagao sobre repetigoes invertidas). Quando tal ipo de sequéncia de DNA ¢ transcrita, ‘RNA forma uma estrutura em haste-alca, devide ao parea- ‘mento intrafita de bases (Figura 7.23). Tals estruturas em has- tealea, seguidas por uma série de adeninas no DNA molde e, consequentemente, por vérias uridinas no mRNA, consistem ‘em eficientes terminadores transericionais, Esse fato deve-se 8 formagio de um segmento de pares de bases U:A que man- tém o RNA c o DNA molde unidos. Essa estrutura é bastante fraca, pois os pares de bases U:A possuem apenas duas pontes de hidrogenio cada. A RNA polimerase realiza uma pausa na ‘estrutura em haste-alga, havendo a separagio do DNA e do RNA na regio contendo a série de uridinas. Isso promove a terminasio da transcrigao, Os padres de sequencia que ter- ‘minam a transcrigéo sem a adigao de qualquer fator adicional sto referidos como terminadores intrinsecos.Peet era <=, 2 HAA RAAR Seite apaipsovaverisa | [aRGERESS BH tamecor Figura 7.23 Repetigées invertidas e a terminaglo da transcri- so. As epetigBes invertidas no DNA tranecito promovem aforma- {8 de ura estrutura em haste-alga no RNA, que promove a termi ‘hago da trenscrigSo, quanclo seguida por uma série de uracil, Terminagao Rho-dependente © outro mecanismo de terminagao da transerigao iliza um fator proteico espectfico, conhecido como Rho, em Escher: chia coli. proteina Rho nose liga tRNA polimerase ot a0 DNA, mas lga-sefortemente ao RNA e desloca-se 30 longo da cadeia, em dirego a0 complexo RNA polimerase-DNA. Quando a RNA polimerase realiza uma pausa no sitio de terminagao Rho-dependente (ama sequencia especifica no DNA molde), Rho promove a liberagao do RNA e da RNA polimerase do DNA, finalizando, asim, a transcriglo. Em bora as sequencias de terminagio atuem em nivel de RNA, lembre-se que o RNA é transerito a partir do DNA. Conse: quentemente, a terminagio da transcrig8o 6, em slkima and lise, determinada por sequéncias nucleotdicas especticas, presentes no DNA, 'ARNA polimerase conclui a trancrigdo em sitios especticos, cdenominades terminadorestransricionais. Embora sejam codificados pelo DNA, esses terminadores atuam em nivel do RNA. Alguns slo terminadoresitrinecos e no requerem proteinas acostéras,além da propria RNA polimerase. Em Bacteria, essas sequéncias geralmente consistem em estruti= ras em haste-alga, seguidas por uma série de urdinas. Outros terminadores requerem proteins, como Rho, por exernplo. 1 © que é um terminador intrinseco? 1 O que é uma estrutura em haste-alga? 2 ) A unidade de transcrigao 0s cromossomos organizam-se em unidades delimitadas pe- los sftios de iniciagao e terminagao da transcrigao do DNA em RNA: as unidades de transcrigo. Poder-se-ia acreditar que cada unidade de transcrigao inclui apenas um dnico Microbiologia de Brock 193 ‘gene, Embora isso seja verdadeiro em algumas situagdes, rem sempre esse & 0 caso. Algumas unidades de transeri¢a0 ‘contém dois ou mais genes, os quais so referidos como co- transcritos, originando uma tinica molécula de RNA. RNAs ribossomal e de transferéncia e a longevidade do RNA Conforme discutimos na Seeao 7.1, a maioria dos genes codifica proteinas, porém outros codiieam RNAs que no Sao traduizidos, como 0 RNA ribossomal (tRNA) ¢ 0 RNA de transferencia (RNA). Existem varios tipos diferentes de FRNA em um organismo (havendo uma edpia de cada tipo nos ribossomos; Seco 7.13). Os procariotos possuem trés tipos: rRNA 168, rRNA 23S e RNA 5S (discutiremos a im- portancia do rRNA 16S nos extudos evolutivos, na Capitulo 2), Conforme lustrado na Figura 7.24, existem agrupamen- tos que contém um gene de-cada um desses RNAs, sendo os genes de tal agrupamento cotranscritos, Uma situagao similar ocorre em eicarfotos, Dessa forma, em todos os organismos, a unidade de transcrigao da maioria dos rR NAS é mais extensa que um dnico gene. Em procariotos, of genes de tRNA sfo frequentemente cotranscritos entre si, Cou mesmo com outros genes de rRNA, conforme apresen- tado na Figura 7.24. Contudo, esses cotranseritos deve ser processados (elivados em unidades individuais), para gerar os FRNAs ou {RNAs maduros (funciona) (Figura 7.24), 0 processamento de RNA éraro em procariotos, mas comum em eucariotor, conforme veremos posteriormente (© Capitulo 8). Em procariotos, a maioria dos RNAs mensageiros possui mela-vida cura (da ordem de poucos minutos), apés a qual Figura 7.24 Uma unidade de transcrigSo do rRNA ribostomal dde Bacteria e seu processamento subsequente. Em Bacteria, 0- das as unidades de ranscricdo de ?RNA possuem os genes de ¢RNA. ro ordem rRNA 165, rRNA 235 @ RNA SS (apresentados aprexima- ddamente em escala). Observe que, nessa unidade de transcrigdo em particular, 0 “espacador”entra.os genes de fRNA 16S @ 23S canter lum gene de tRNA Em outrae unidades de venscrigdo, esta reaiBo ppade conter mais de um gene de tRNA. Frequentemente, um ou Iaie genes de tRNA também encontrar 2e apés o gane do rRNA 55, sendo cotranscitos, Escherichia col possvi sete unidades de ‘vanserigdo de RNA,194 Michael T. Madigan, John M. Martinko, Paul V. Dunlap & David P. Clark uuu Fenilalanina UCU Serna ua uc Fenilalanina UCC Serina uac ua Levcing = UCA.—Serina uaa uus Leucna = UC Serina uAG cw Levcna —« CCU——Prolina cau cuc ccc Protina cac cua CCA Proina CAA cus. CCG Pralina caG uu Ieoleucina §=— ACU.—=Treonina. «AAU. auc Isoleucing © ACC Treoning AAC AUA Isoleucina © ACA Treoning AAA AUG Metionina ACG Treanina AAG (niciacéo)* uu Valina GcU Alaning = GAU cuc Valina GCC Alanina = GAC cua Valina GCA Alaning «GAA cus Valina GCG Alaning GAG Tiosina UGU—Cisteina Trosina UGC Gisteina Nenhur inl de UGA Nenhum sina de teeming) terminae39) Nenhur inal de UGG Tiptofeno terminagéo) Histiina cou Asginina Histna CGC Asginina Glutamine CGA Asginina Gltamina C6G_ Arginine Asparagina AGU Serina Asparagine AGC Serna Lisina AGA Arginna sina AGG Aginina ‘eid Aspartico 6cU Glide Koide Aspartco 66C Glicna Keido Glutdmico GGA Glicna Keido Glutdmico GGG Glicna "AUG codica una Mfrmiimetonina no ino das cadeaepoipaticias de Bacteria sto degradados por ribonucleases celulares. Isso no & obser. vado com o rRNA e tRNA, que so RNAs estaveis. A estabi lidade ocorre porque os (RNAs e rRNAs formam estruturas altamente dobradas, impedindo-as de serem degradadas por ribonuclease, Por outro lado, o mRNA normal nao forma tais estruturas, sendo suscetivel ao ataque por ribonuclea. ses, A rapida reciclagem dos mRNAs procariéticos possivel- ‘mente corresponde a um mecanismos que permite a célula adaptarse rapidamente a novas condigGes ambiental terromper a traducéo de mensagens cujos produtos no sio ‘ais necessérios, mRNA policistrénico e 0 operon Em procariotos, os genes que codifieam enzimas relacio- nadas sto geralmente agrupados (Figura 7.2). A RNA poli- ‘merase move-se ao longo de tais agrupamentos e transereve toda a série de genes, originando uma tinica longa molécula de mRNA. Um mRNA que codifica tal grupo de genes co- transcritos é denominado mRNA policistrénico. Quando ele 6 traduzido, vrios polipeptideos sto sintetizados, um apos 0 ‘outro, pelo mesmo ribosome. ‘Um grupo de genes relacionados, transcritos em con- junto, gerando um nico mRNA policistronico, é referido ‘como tum operon. A organizagio de genes de uma mesma via biogufmica, ou de genes necessarios sob as mesmas condigdes, em um operon, permite que sua expressio seja regulada de maneira coordenada. Apesar disso, os euca- riotos nao possuem operons e mRNAs policistrénicos (> Capitulo 8). Frequentemente, a transcrigao de um operon & controlada por uma regito espeeifica do DNA, situada ime- diatamente a montante a regiao codificadora de proteinas do operon. Esse assunto sera abordado em maiores detalhes no Capitulo 9. Em procariatas, a unidade de transcrigSo frequentemente contém mais de um tinico gene. Vios genes s80 ent ‘ranacitas em uma Unica molécula de mRNA, que contém @ informago para mais de um polipeptideo. Um agrupamento de genes transcritos em conjunto, a partir de um Unico pro ‘motor, constitu um operon. Em todos os organismos, of g0- res que codificam os FRNA sio cotranscritose, em seguida, procestados para orginar as egpéciesfinae de RNA, 1 O que é um RNA mensageiro (mRNA)? FO que é um mRNA policistrnico? 1 O queso operons e por que eles séo ites aos procariotos? (V) siNTESE DE PROTEINAS Nas duas primeiras ctapas de transferéncia da informasao biolégica, a replicagao e a transcrigao, os dcidos nucleicos so sintetizados, empregando écidos nucleicos como moldes, Na tltima etapa, a tradugao, a sintese ocorre a partir de um Acido nucleico molde, mas, neste caso, o produto final é uma protefna e nfo um deido nucleico, (7.13 ) 0 cédigo genético [Antes de descrevermos o mecanismo de tradugio, devemos Aiscutir 0 coragao da transferéncia da informacao biol6gi- ‘ca: a correspondéncia entre 0 molde de dcido nucleico ¢ a sequéncia de aminodcidos do produto polipeptidico. Ela é ‘conhecida como 0 eédigo genético. Conforme mencionadoFigura 7.25 © conceite de oxcilagio. O pareamento de bases «mais fexivel na tercera base do cédon do que em celaggo 8s duas primeiras. Somente uma porcéo do tRNA ¢ ilustrada (e estutura completa do tRNA 6 apresentade ne Figura 7.27). na Segio 7.1, um conjunto de trés bases, denominado cédon, codilica win aminadeido espectfico. O eédigo genético ¢ des- crito na forma de mRNA, em lugar de DNA, uma vez que a tradugdo envolve o mRNA. Os 64 cédons possiveis (quatro bases utilizadas em grupos de trés, 4°) de mRNA slo apre- sentados na Tabola 7.4, Observe que, além dos cédons que especificam os varios aminodcidos, ha também eédons espe- cificos para a iniciagao e terminagao da traduso, Propriedades do cédigo genético ‘Uma das earacteristicas mais interessantes do c6digo gené- tico é o fato de muitos aminodcidos serem codificados por mais de um cédon, Nesses casos, nfo hé qualquer corres- pondéncia univoca entre © aminodcido e 0 cédon. Conse- quentemente, o fato de conhecerse um aminoscido de um determinado local no significa que o eédon daquele local seja automaticamente conhecido, Tal tipo de cédigo, em que no existe a correlagao univoca entre a palavra e 0 c6digo, € denominado e6digo degenerado. No entanto, o inverso verdadero, Conhecendo-se a sequéncia de DNA e a fase de leitura correta, ¢ possivel especificarse o aminoscido presen- te na proteina. Isso permite a determinagao de sequéncias de aminodcidos a partir de sequéncias de bases do DNA, o que corresponde 20 coragio da genémica (=> Capitulo 13) Curiosamente, na maioria dos casos em que miiltiplos e6- dons codificam 0 mesmo aminodcido, os miltiplos cédons exibem estrcita relaglo na soquéncia ce RNA (Tabela 7.4) Um cédon ¢ reconhecido pelo pareamento especttico de bases com uma sequéncia complementar de trés bases, denominada antieddon, uma sequéncia encontrada em tR- NAs. Se esse pareamento ocorresse sempre de acordo com 0 pareamento padrao de A.com U e G com C, pelo menos um IRNA especfico deveria existir para cada cédon. Em alguns casos, esse fato é verdadeiro. Por exemplo, Escherichia coli apresenta sels (RNAs diferentes que carreiam 0 aminoscido Jeucina, um para cada eédon (Tabela 7.4). Anda, ao contré- rio, alguns tRNAs podem reconhecer mais de um e6don. Por exemplo, embora existam dois eddons para a lisina em E. coli, hd somente um tRNA lsil, cujo anticédon pode parear- se com AAA ou AAG (ver Tabela 7.4), Nesses casos especiais, as moléculas de tRNA realizam pareamentos padrao somente nas duas primeiras posigdes do cédon, tolerando um parea~ ‘mento irregular na terceira posigao. Esse fendmeno é de- Microbiologia de Brock 195 Figura 7.26 Possivels fases de leltura om um mRNA. Uma se quéncia interna de um mRNA é apresentads, (a) Os aminoscidos ‘ue seriam codicados se 0 rbossomo estvesse na fase de litura correte(denominade fase "0"). (b) Os aminoscidos que seriam co: dificados por essa regiéo do mRNA, se 0 ribossomo estivesse na fase do leitura ~1. (2 Os aminodcidos que seriam codificados se 0 bossomo estvesse ne fase de letura +1, nominado oscilagao, sendo ilustrado na Figura 7.25, onde pode-se observar que pareamento entre Ge U (em lugar de G com C)é permitido na posigio oscilante. Cédons de iniciagao e de terminacao Alguns eédons nfo codificam um aminodcido (Tabela 7.4). Es- ses cédons (UAA, UAG e UGA) sto 0s e6dons de terminasao, uma vez que atuam como sinalizadores da terminagéo da tra- ‘dugdo de uma sequéncia codificadora de proteinas no mRNA (Sega0 7.15). Os eédons de terminasio sto também denomi- nados eédons sem sentido, pois interrompem o "sentido" do polipentideo em crescimento, quando terminam a traduedo. ‘© RNA mensageiro ¢ traduzido a partir do e6don de iniciagao (AUG), que codifica uma metionina quimicamente rmodificada, a N-formilmetionina. Embora um AUG situado no inicio de uma regio codificadora codifique N-formilme- tionina, os AUG situados no interior da regio codificadora codificam metionina. Dois tRNAs distitos esto envolvidos neste processo (ver a seguir). Diante de um cédigo triplo, € fundamental que a tradugao sea iniciada no nucleotideo cor- reto. Caso contrario, toda a fase de leitura no mRNA sera alterada, podendo haver a sintese de uma proteina comple- tamente diferente. Quando a alteragio introduz. um eédon de terminagio na fase de leitura, a proteina seré terminada prematuramente, Por convencto, a fase de leitura que é tra- duzida, originando a proteina codificada pelo gene, € deno- ‘minada fase 0. Como pode ser obscrvado na Figura 7.26, as coutras das fases de letura possiveis (1 e +1) nao codificam ‘a mesma sequéncia de aminoécidos. Portanto, ¢ essencial ue 0 ribossomo encontre o eédon de iniciago correto para Iniciar tradugao e, uma ver localizado, ele move-se ao longo do mRNA exatamente sobre trés bases a cada vez. Como a ‘correta letura da fase é garantida? ‘A fidelidade da fase de leitura é controlada pelas intera- ¢8es entre omRNA ¢ 0rRNA no interior do ribossomo. O RNA ibossomal reconhece um AUG especifico no mRNA como oé- don de iniciagao, com o auxilio de uma sequéncia localizada a ‘montante no mRNA, denominada sequéncia de Shine-Dalgar no (Segio 7.15). Essa exigéncia de alinhamento explica por-196 ‘que mensageiros ocasionais de Bacteria podem utilizar outros ‘e6dons de iniciasao, como GUG. No entanto, mesmo esses c6- dons de iniciagao pouco usuais conduzem a incorporagao de Fases de leitura aberta (Os genomas de muitos organismos foram sequenciados (=> Capitulo 13). Contudo, essa grande quantidade de dados de sequéncias seria de pouca utilidade caso os cientistas fos- sem incapazes de determinar a localizagéo dos genes que codificam as protefnas. Um método comum para identifi- car genes codificadores de proteinas consiste em examinar cada fita da sequéncia de DNA em busca de fases de leitura aberta (ORF, do inglés, Open Reading Frames). Lembre- se de que o mRNA ¢ transcrito a partir do DNA; portanto, conhecendo-se a sequéncia do DNA, é possivel conhecer & sequéncia de RNA transcrita a partir dela. Se um RNA pode ser traduzido, ele contém uma fase de leitura aberta: um cédon de iniciagio (tipicamente AUG), seguido por varios ccédons ¢ ent um cédon de terminagao na mesma fase de leitura que o e6don de iniciagio. Na prética, apenas ORFS longas o suficiente para codificar uma protefna de compri ‘mento compativel com a realidade sao aceitas como ver- dadelras sequéncias codificadoras. Embora a maloria das proteinas funcionais exiba extensiio de pelo menos 100 ami- nodcidos, alguns horménios proteicos e peptideos regulat6- ios sio muito mais curtos. Consequentemente, nem sempre € possivel deduzir somente a partir de dados de sequéncia se uma ORF relativamente curta é meramente casual ou se codifica uma proteina genufna, embora curta, Um computador pode ser programado utilizando as diretrizes acima para realizar uma varredura de longas se- 4quéncias de bases de DNA, em busca de fases de leitura aber- ta. Algm da busca por eddons de iniciagao e terminagio, a pesquisa pode incluir também promotores e sequéncias Shine-Dalgarno de ligacdo ao ribossomo. A pesquisa por ORFs é muito importante na gendmica (=> Capitulo 13) ‘Quando um fragmento de DNA desconhecido é isolado e se- quenciado, a presenga de uma fase de leftura aberta Indica {que cle pode codificar protefnas, Viirios aminodcidos sio codificados por miltiplos eédons. Poderfamos presumir que tais cédons maltiplos fossem uti> lizados com frequéncia equivalente. No entanto, esse nao 60 caso, ¢ os dados de sequéncia revelam um importante uso preferencial de cédons. Em outras palavras, alguns ¢6- dons sao preferencialmente utilizados em relagao a outros, embora codifiquem o mesmo aminodeido. Além disso, essa preferéncia € especifica de cada organismo. Em E. coli, por exemplo, somente cerca de 1 dentre 20 resfduos de isoleucina presentes nas proteinas é codificado pelo cédon da isoleuci- na AUA, sendo 0s outros 19 codificados pelos outros cédons de isoleucina, AUU e AUC (Tabela 7.4). 0 uso preferencial de ccédons esté correlacionado a uma preferéncia corresponden- tena concentragao de diferentes moléculas de tRNA. Assim, ‘um tRNA correspondente a um cédon raramente utilizado estard presente em quantidade relativamente pequena. A origem do uso preferencial de cédons nao esta clara, porém pode ser facilmente reconhecida e utilizada em ati- vidades praticas envolvendo a informagao da sequéncia gé- Michael T. Madigan, John M. Martinko, Paul V. Dunlap & David P. Clark nica, Por exemplo, um gene de um organismo, cujo uso de ‘eddons seja surpreendentemente diferente daquele de outro, pode nao ser traduzido com eficiéncia se o gene for clonado esse tiltimo por meio de engenharia genética (> Capitulo 12). Isso se deve a um deficit do tRNA para cédons que so raros no hospedeiro, porém frequentes no gene clonado, En- tretanto, esse problema pode ser corrigido, ou pelo menos ‘compensado, por meio da manipulagao genética, Modificagées do cédigo genético ‘Todas as células parecem utilizar 0 mesmo eédigo genético. Portanto, ve-se que o eédigo genético ¢ universal. Contudo, ‘esse conceito foi ligeiramente modificado diante da desco- berta de que algumas organclas e umas poucas células u zam c6digos genéticos que consistem em variagées discretas do cddigo genético “universal (Os eédigos genéticos alternativos foram originalmente descobertos em genomas mitocondriais de animais. Esses ‘eédigos modificados normalmente utilizam tanto eédons sem sentido quanto eédons com sentido. Por exemplo, mito- ‘Ondrias de animais (mas nao de plantas) utilizam o e6don UGA para codificar triptofano, em lugar de utilizé-lo como tum o6don de terminacao (Tabela 74). So conheci ‘organismos que também utilizam eédigos genéticos ligeira- ‘mente distintos. Por exemplo, no género Mycoplasma (Bac- teria) € no género Paramecium (Eukarya), determinados c6- dons sem sentido codificam aminodcidos. Esses organismos simplesmente apresentam um niimero menor de cédons sem sentido, uma vez que um ou dois deles so utilizados como ‘dons com sentido. Em alguns casos raros, cédons sem sen tido codificam aminoécidos pouco usuais em lugar de um dos 20 aminodcidos comuns (vera seguit). 0 cédigo genético & expresso na forma de RNA, podendo Lum inieo aminoéeido ser codifcado por virios eédons ie rentes, embora relacionados. Além dos cécons sem sentido, existe também um cédon de iniciagio especiico, que sina za onde 0 processo de traducéo deve ser iniciado. 1 Por que é importante que o rbossomo faga a leitura “em face"? 1 Descreva uma fase de leitura aberta, Se vocé recebecte uma sequéncia de nucleotideos, como vocé encontrar, ‘as ORFs? RNA de transferéncia Lembre-se da Segdo 7.13, que a porgdo anticédon do tRNA pareia-se com o cédon. No entanto, um tRNA é muito mais do que um simples anticédon (Figura 7.27), Um tRNA € es- pecffico tanto para um c6don, como para seu aminodcidos ‘cognato (isto é, 0 aminoécido correspondente ao anticédon do tRNA). 0 tRNA ¢ seu aminoscido especifico sto ligados por enzimas especfficas que garantem que um tRNA em par- ticular receba seu aminodcido correto. Essas enzimas, deno- ‘minadas aminoacil-tRNA sintetases, tm a importante fun- ‘glo de reconhecer tanto 0 aminodcide cognato como o {RNA especifico para aquele aminodcido,NeaT¥C. Microbiologia de Brock 197 Haste aceptoa stg’ xremidade acopsora Akad ‘anton Figura 7.27 Estrutura de um RNA de transferéncia. (a) estuturaconvencional em folha de trevo do tRNA fenlalanina de levedura. (© aminodcido ligase & rbose do A terminal, ne extremidade aceptora. A, adenina C, ctosina;U, wracila; G, guanine, imine; , pseudou racila;D, déhidrouracila; met ¥, uma purina modificada. (6) Na rea de, a molécula de tRNA dobra-s de tal forma que a alga De as, algas THC aproximam-se, associando-s0 por meio de interacSeshidrofdbicas, Estrutura geral do tRNA Existem cerca de 60 diferentes (RNAs em eélulas bacteria- nas, ¢ de 100-110 em células de mamiferos. As moléeulas de RNA de transferéncia sio curtas, de fita simples, apresen- tando extensa estrutura secundiria e comprimento de 73-93 nucleotideos. Determinadas bases ¢ estruturas secundrias so constantes em todos os tRNAs, enguanto outras partes so varidveis. As moléculas de RNA de transferéncia tam- bbém possuem algumas purinas e pirimidinas que exibem ligeiras diferengas, quando comparadas as bases normais encontradas no RNA, uma vez.que sio quimicamente mo- dificadas. Essas modificagbes sto introduzidas nas bases aapés a transcrigao, Algumas dessas bases pouco usuais S80 a pscudouridina, inosina, di-hidrouridina, ribotimina, me- tilguanosina, dimetileuanosina e metilinosina. O RNA final rmaduro e ativo nfo contém somente bases incomuns, mas também extensas regiées de fita dupla no interior da molé- cula, Essa estrutura secundéria é formada pelo pareamento interno de bases, quando a molécula de fita simples dobra-se sobre si (Figura 7.27) ‘Acestrutura de tum RNA pode ser representada como uma folha de trevo, conforme ilustrado na Figura 7.27a. Al- sgumas regides da estrutura secundria do tRNA recebem de- signagécs relacionadas as bases mais frequentemente encon- tradas naquela regio as algas THC e D) ou a suas fungoes espectticas (alga do anticsdon e haste aceptora). A estrutura tridimensional de um tRNA é apresentada na Figura 7.27b, Observe que as bases que aparecem muito distanciadas no ‘modelo em folha de trevo esto, na realidade, muito préxi- ‘mas, quando observadas no modelo tridimensional. Isso per- rite que algumas das bases presentes nas algas pareiem-se com bases de outras alga. O anticédon e 0 sitio de ligagdo do aminodcido ‘Uma das porgdes varidveis essenciais da molécula de {RNA corresponde ao anticédon, 0 grupo de trés bases que reco- rece 0 cédon no mRNA. O anticédon é encontrado na alga do anticédon (Figura 7.27). Os trés nucleottdeos do anticé- don reconhece o eédon, pareando-se especificamente com suas trés bases (Seco 7.13 ¢ Figura 7.25). Por outro lado, ‘outras porgées do tRNA interagem com o tRNA e 08 compo- nentes proteicos do ribossomo, as proteinas nao ribossomais de tradugio ¢ com a enzima aminoacil sintetase Naextremidade 3', ou haste aceptora, de todos 0s (RNAS ‘existem tres nucleotideos nao pareados. A sequencia desses trés nucleotideos ¢ sempre citosina-citosina-adenina (CCA), sendo eles absolutamente essenciais para a atividade. Curlo- samente, na maioria dos organismos, esses trés nucleotideos no sio codificados pelos genes de {RNA no cromossomo. Em ver disso, so sucessivamente adicionados por uma enzi- rma denominada enzima de adigao de CCA, utilizando CTP ATP como substratos. O aminoécido cognato liga-se covalen- temente & adenosina terminal da extremidade CCA por m ‘de uma ligagio do tipo éster& ribose. Conforme veremos, 0 “aminofcido ¢ incorporado a cadeia polipeptidica presente no ribossomo a partir deste local no (RNA, por um mecanismo ‘que seré descrito na préxima segéo. Reconhecimento, ativagio e carregamento dos tRNAs Oreconhecimento do tRNA correto por uma aminoacilRNA sintetase envolve contatos especificos entre regides chave do {RNA e da sintetase (Figura 7.28). Conforme esperado, devi- do a sua sequéncia tnica, o anticédon do (RNA ¢ importante no reconhecimento pela sintetase. Entretanto, outros sitios ‘de contato entre 0 1RNA ea sintetase sio também importan- (rect)198 {RNA espectico paraa vaina tNA™) Seccaregedo Fegido do aticddon ‘Aino ‘Sittase para vlna Sirtetase para vlna VallsANA caragado. pronto paraa Sntse protica @ ‘Nea do antiesdon Michael T. Madigan, John M. Martinko, Paul V. Dunlap & David P. Clark Haste acoptora do NA » Figura 7.28 AminoaciL4RNA sintetase. (0) Mecanismo de a¢o de ume aminoscl+RNA sintetase. O reconhecimento do tRNA coreeto ppor uma sintotase em particular envolve contatos entre sequéncias especticas de Scido nucleco presentes na alga D e haste aceptora do {RNA @ aminodeidos eepecticos da sintotace. Neste diagram, 6 apresentada a valitRNA sintotaso catalisando a etapa final da reacio, ‘onde ocorre a transferdncia da valina, na forma de vali-AMP, para o RNA, (6) Modelo computacional apresentanda a interac da gutari- rLERNA sintotase (azu), com seu respectivo tRNA (vermelho). Reproduzide com a permissio de M. Ruf etal. 1991. Science 252: 1682-1689, ©1991, AAAS. tes, Estudos da ligagao do tRNA a aminoacil-tRNA sintetase, conde bases especificas do tRNA foram alteradas por meio de ‘mutagdes, demonstraram que apenas um pequeno nimero de nucleotideos essenciais em um tRNA, além da regio do anticédon, estio envolvides no reconhecimento. Esses ou tros nucleotideos essenciais ao reconhecimento geralmente enconiram-se na haste aceptora ou alga D da molécula de ARNA (Figura 7.27), Devesse enfatizar que a fidelidade desse processo de reconhecimento é crucial, pois, se um aminod- ido incorreto for ligado ao tRNA, ele serd inserido no poli peptideo em crescimento, levando a sintese de uma proteina defeituosa. A reacio especifica entre o aminoécido e o RNA, cata sada pela aminoacil-tRNA sintetase, ¢iniciada pela ativagao do aminodcido por uma reagao envolvendo ATP: Aminofcido + ATP <—> aminoaci-AMP + P—P 0 intermediério aminoacil-AMP formado normalmente per- ‘manece ligado & enzima, até colidir com a molécula de tRNA apropriada. Em seguida, conforme apresentado na Figura 7.282, 0 aminodcido ativado € ligado ao RNA, originando sum tRNA carregado: ‘AminoaciLAMP + tRNA «<—> aminoaciL4RNA +AMP 0 pirofosfato (PP) formado na primeira reagdo é clivado por uma pirofosiatase, originando duas moléculas de fosfa- to inorgnico. Como ATP ¢ utllizado, gerando AMP nessas reagbes, é necessério um total de duas ligagdes fosfato ricas ‘em energia para carregar um tRNA com seu aminodcido cog- nato. Ap6s a ativagao e o carregamento, 0 aminoacil-RNA deixa a sintetase e desloca-se alé 0 ribossomo, onde o poli- peptideo é sintetizado, Cerrar Hi um ou mais RNAs para cada aminoscide incorporado a tua proteina pelo rbossomo. Enzimas denominadas ami oaciltRNA sintetasesligam os aminodcidos a seus RNAS cognatos. Uma vez que © aminoscido correto fo ligado 20 seu tRNA, uma especficidade acicional reside principalmen- ‘e:nainteragdo codon-anticédon, 1 Qual afungo do anticddon de um RNA? 1 Qual afungio da haste aceptora de um :RNA?Traducdo: o processo de sintese proteica Estudamos, no Capitulo 3, que a sequéncia de aminoécidos determina a estrutura, e portanto a fungao, de uma prote‘na, Assim, é vital para o funcionamento das proteinas que o ami- nodcido correto seja adicionado nas posigGes adequadas da cadeia polipeptidica, Essa ¢ a funsio da maquinaria de sinte- se proteica, 0 ribossomo. Ribossomos 0s ribossomos correspondem aos sitios da sfntese proteica ‘Uma eélula pode conter vérios milhares de ribossomos, sen- do o niimero relacionado diretamente a taxa de erescimento. Cada ribossomo é composto por duas subunidades (Figura 7.29). Os procariotos apresentam as subunidades ribosso- ‘mais 30S ¢ 50S, originando ribossomos intactos 70S. Os va- lores S correspondem a unidades Svedberg, que se referer ao coeficiente de sedimentagao das subunidades ribossomais (dS e 505) ou de ribossomos intactos (708), quando sub- metidos a forga centrifuga em uma ultracentrifuga. (Embora particulas maiores exibam valores $ maiores, a relagao nao é linear e 0s valores S ndo podem ser somados.) ‘Cada subunidade ribossomal consiste em um complexo ribonucleoproteico composto por RNAS ribossomais e protei- nas ribossomais espectficas. A subunidade 30S contém o rRNA. 16S e 21 proteinas, enquanto a subunidade 50S contém os rR- NAs5Se 23S, além de 31 protefnas. Assim, em Escherichia coli ‘io encontradas 52 proteinas ribossomais diferentes, a maio- ria presente como c6pia tinica por ribossomo. O ribossomo € uma estrutura dinmica, cujas subunidades associam-se e dissociam-se alternadamente ¢ também interagem com varias, ‘utras protefnas. Existem diversas proteinas essenciais & ati- vidade ribossomal, que interagem com o ribossomo em varios estigios da traducio (discutides a seguir), porém elas nio so consideradas “protefnas ribossomais’, por si, Etapas da sintese proteica A sintese de uma proteina consiste em um cielo, em que va rios componentes ribossomais desempenham papéis especi- ficos. Embora a sintese proteica seja um processo continuo, ela pode ser dividida em algumas etapas:iniciagao, elonga- G40 e terminacio, Além de mRNA, tRNA e ribossomos, proceso requer a participacio de varias protesnas, denomi- nadas fatores de iniciagao, de elongacao ede terminagao. 0 composto rico em energia guanosina trifosfato (GTP) fornece a energia necesséria ao processo. As principais etapas da sin- {ese protcicaestdo ilustradas na Figura 7.298, Figura 7.29 0 rbossomo e a sintese protec. (a) Estrutura do ribossomo, apresentando a localizagdo do sitio A (eceptor, sitio P (Peptides) e sito E (aida; do inglés, ex). (6) Tradugso. Iniciacio e clongagio. (i) A interagao entre 0 cddon o anticédon posicions (08 tRNAs carregados covretos na posiggo apropriada — nesse caso © tRNA iniiador # 0 segundo tRNA carregade. (i) A formagso de lume ligagio peptiica entre aminoseidos de molécula adjacentes de 1RNA completa 2 elongagzo. (i) A translocacéo do rbossomo de um cédon para 0 seguinte ccorre com a iberacéo do tRNA a portr do sitio E 0) © préximo tRNA carregado ligase a0 sitio A © w Microbiologia de Brock 199 $< — Wao do tRNA camegado 2080 A ELONGAGAO (requeras peotenas EF-Tu e EFT) oxo on ee"; careneso ~ BTL [a prcsoee coninim hg Se ‘ 1 UL” | Sesneads grote as RF Datu 6 tana na terminagdo)Polpeptideo om croscimento ANA Michael T. Madigan, John M. Martinko, Paul V. Dunlap & David P. Clark Poiipepteo quase ralizad Figura 7.30 Polissomos. A traducéo de um dnico RNA mensageio por vitios ribossomos forms 0 palssomo. Observe que os ribosso- mos mais préximos 8 extremidade 5! do mensageio encontram-se em um estigio mais ical do processo de traduclo do que os ribasso- ‘mos mais préximos 8 extremidade 3" e, portanto, apenas uma porgao relatvamente curta do polipeptide final oi sinttizada, Iniciagao da tradugio Em Bacteria, como E, coli, a iniciagso da sintese proteica sempre comega com uma subunidade ibossomal 308 ire, A partir dela, um compleno de iniciaglo éformado, consistin- dona subuinidade 308, no mRNA, no RNA formil-metionina © em varias proteinas de iniciagio denominadas IF1, 1F2 © IF3. GTP é também necessrio nesta etapa, Em seguida, tuma subunidade ribossomal 50S ¢ adicionada a0 complexo de iniiagto, formando o ribossomo 708 ativo. Ao final do, processo de tradugio, oribossomo novamente se separa nas Subunidades 305 © 508. Imediatamente precedente 20 eédon de iniciaglo no mRNA, hd uma sequéncia de tsa nove nucleotideos, de- ‘nominada sequéncia de Shine Dalgarno ou sitio de ligagto 20 ribossomo, que auxilia a ligagdo do mRNA ao ribossomo. O’sitio de ligagao ao ribossomo, ocalizado na extremida de 5’ do mRNA, possui bases complementares & sequencia presente na extremidade 3° do FRNA 16S. O pareamento de bases entre estas duas moléculas mantém o complexo ribos- somo-mRNA unido firmemente,na fase de leltura correla, A presenga da sequéncia Shine-Dalgarno no mRNA e sua in teragto especica com 0 FRNA 168 permite aos ribossomos bbacterianos traduzirem mRNAs poicistrdnicos, uma vee que os ribossomos so capazes de encontrar cada sitio de ini- ciagdo presente em um mensageiro pea ligagdo a seu sitio ‘Shine-Dalgarno (Seco 7.13). ‘Niniiago da tradugdo sempre comega com a ligagSo de um aminoaciL1RNA iniciador especial ao cédon de ini- cago, AUG. Em Bacteria, esse corresponde ao {RNA for- mi-metionina. Ap6s 0 polipeptideo ter sido completado, 0 grupo formil €removido. Consequentemente, o aminoécido N-terminal da proteina completa sera a metionina. No en tanto, em multas proteinas essa metionina é removida por tuma protease espectfiea. Como as sequéncias Shine-Dalgar= no (alm de outras possiveis interagdes entre INA e mRNA) dlirecionam o ribossomo a0 sitio de iniciagao adequado, os RNAs procariticos podem utilizar um eédon de niciagSo diferente do AUG. O cédon de iniciagto alterativo mats ut lizado € GUG. Quando empregado neste contexto, no entan- to, GUG requer 0 tRNA iniciador formil-metionina (nao de valina, ver Tabela 73). Elongagdo, translocagio e terminagéo (0 mRNA passa através do ribossomo principalmente ligado a subunidade 30S. 0 ribossomo contém outros sitios onde 0s (RNAS interagem. Dois desses sitios localizam-se princ- palmente na subunidade 50S, sendo denominados sitio Ae sitio P (Figura 7.29), O sitio A, sitio aceptor, € 0 local do ribossomo onde o novo tRNA carregado liga-se inicialmente. 0 deslocamento e a ligagao de um RNA ao sftio A é auxilia- do por um dentre varios fatores de elongagao (EF, do inglés, elongation factor), denominado EF-Ta. O sitio P, sitio peptidil, éo local onde peptideo eres- cente encontra-se ligado por um tRNA. Durante a formaga0. da ligagdo peptidica, a cadeia polipeptidica em erescimento _move-se em diregao ao tRNA localizado no sitio A, enquanto uma nova ligagio peptidica € originada. Varias protefnas no ribossomais so necessérias & elongagdo, especialmente os fatores de elongacio EF-Tu e EF-Ts, assim como moléculas adicionais de GTP (visando simplificar a Figura 729b, 0s f tores de elongacio foram omitidos, sendo apresentada ape- nas uma poredo do ribossomo). Apés a elongagdo, o tRNA ligado ao peptideo € translocado (movido) do sitio A para 0 sitio P, deixando o sitio A vazio para receber um outro tRNA carregado (Figura 7.296). A translocagdo requer uma proteina EF especifica, de- nominada EF-G, e uma molécula de GTP para cada evento de translocagtio. Em cada etapa de translocacio, 0 ribosso- ‘mo avanga por trés nucleatideos, exponda um novo cédon {a0 sitio A. A translocagio empurra o (RNA, agora livre, para um terceiro sitio, denominado sitio E, A partir desse sitio de safda, 0 RNA ¢ liberado do ribossomo (Figura 7.29). A pre cisao da etapa de translocagao ¢ critica a fidelidade da sin- tese proteica, O ribossomo deve mover-se exatamente sobre tum eédon em cada etapa. Embora, durante esse proceso, 0 mRNA pareca estar deslocando-se através do complexo ri- bbossomal, na realidade o ribossomo esté movendo-se ao lon- ‘go domRNA. Assim, 0s trés sitios ribossomais que identifica- ‘mos na Figura 7.29 no so locais estaticos, mas sim partes méveis de uma complexa maquinaria biomolecular. Varios ribossomos podem traduzir simultaneamente uma tinica molécula de mRNA, formando um complexo de- nominado polissomo (Figura 7.20). Os polissomos aumentam. a velocidade e ficiéncia da tradugao e, como cada ribossomo ‘atua independentemente dos demais, cada ribossomo de um ‘complexo polissomal sintetiza um polipeptideo completo, Observe, na Figura 7:30, como os ribossomos mais préximos a extremidade 5" (infcio) da molécula de mRNA apresentam polipeptideos menores ligados a cles, uma vez que somente poucos cédons foram lidos, enquanto os ribossomos mais,proximos a extremidade 3° do mRNA apresentam polipept eos praticamente prontos. ‘Aterminagio da sintese proteica ocorre quando 0 ribos- somo alcanga tim oédon sem sentido (cédon de terminagio). Nenhum tRNA seliga a um cédon sem sentido, Em vez disso, proteinas especificas denominadas fatores de liberagdo (RFS, do inglés, release factors) reconhecem 0 eédon de terminacio e clivam 6 polipeptideo ligado a0 tRNA terminal, liberando 0 produto completo, Em seguida, as subunidades ribossomais dissociam-se, disponibilizando as subunidades 30S e 50S para formarem novos complexos de iniciagao e repetirem 0 processo, Papel do RNA ribossomal na sintese proteica O RNA ribossomal desempenha papel vital em todos os est- gios da sintese proteica, da iniciagio & terminagio. O papel das varias proteinas presentes no ribossomo, embora menos conhecido, pode ser o de funcionar como arcabouco para o posicionamento de sequéncias essenciais nos RNAS ribos- Conforme jé discutido, em procariotos, esta claro que FRNA 16S esté envolvido na iniciagdo através de seu pa- reamento de bases com a sequéncia de Shine-Dalgarno do MRNA. Também ocorrem outras interagdes MRNA-1RNA durante a elongagdo. Em quaisquer extremidades dos e6- dons dos sitios A'e P, o mRNA é mantido em posigio por meio da ligagao a0 FRNA 16S e as proteinas ribossomais. O RNA ribossomal também desempenha papel na associago ‘bem como no posicionamen- to do tRNA nos sitios A e P do ribossomo (Figura 7.296). Embora os tRNAs carregados que chegam ao ribossomo reconhegam 0 cédon correto pelo pareamento eédon-an- ticédon, eles também ligam-se ao ribossomo por meio de Interagdes da haste-alca do anticssdon do tRNA com sequén- cias especificas do rRNA 16S, Além disso, a extremidade aceptora do IRNA (Figura 7.27) pareia-se com sequéncias do rRNA 23S. ‘Além de todos esses fatos, a real formagao de ligagoes peptidicas é catalisada pelo rRNA. Esse processo ocorre na subunidade 50S do ribossomo durante a reagao da peptidl transferase. Essa reaglo € catalisada pelo proprio rRNA 238, em vex de qualquer uma das proteinas ribossomais. O RNA 238 também desempenha um papel na translocagao e, nesse aspecto, sabe-se que as protefnas EF interagem especifica- ‘mente com o rRNA 23S, Assim, além de seu papel como es- queleto estrutural do ribossomo, o RNA ribossomal também dlesempenha um importante papel catalitco no processo de tradusio. Liberacio de ribossomos capturados ‘Um mRNA defectivo, desprovido de um cédon de termina 0, provoca um problema na tradugo. Tal tipo de defeto pode surgi, por exemplo, a partir de uma mutagio que re- ‘oveu o codon de terminagao,sintese defectiva do mRNA ow dlegradagto parcial do mRNA. Quando um ribossomo atinge atextremidade de uma molécala de mRNA e ndo ha qualquer cédon de terminagio, ofator de UberagSo no pode se ligar, impedindo a liberagao do ribossomo do MRNA. O ribossomo_ encontra-se capturado, ‘As células bacterianas contém uma pequena molécula de RNA, denominada tmRNA, que liberaribossomos para- dos (Figura 7.31). As letras “tm” na denominagao referem- Microbiologia de Brock 201 Figura 7.31 Liberagéo pelo tmRNA de um ribossomo parado. Um mRNA defectvo, desprovido de um cédon de torminagio, pro move a parada de um ribossome que contém um polipeptidas par- Cialmentesintetizado igado a um tRNA (azu),nostio PAligagdo do tmRNA (amarelo) 20 sitio A ibera 0 polipeptide. A tradugdo ent, prosseque até o cédon de terminagso fornecido pelo tmRNA, se a0 fato de o tmRNA imitar tanto o tRNA, uma vez que carteia o aminoacido alanina, como mRNA, pelo fato de conter um curto segmento de RNA que pode ser traduzido. Quando 0 tmRNA colide com um ribossomo parado, lisa-se a0 lado do mRNA defectivo. A sintese proteica pode entao prosseguir, primeiro pela adicéo da alanina no tmRNA e, em seguida, pela tradugao da curta mensagem do tmRNA. Finalmente, o tmRNA contém um cédon de terminagao que permite a ligagio do fator de liberago e desmontagem do. Fibossomo. A proteina sintetizada como resultado dessa operagao de resgate € defectiva, sendo subsequentemente degradada. A pequena sequencia de aminoscidos codificada pelo tmRNA e adicionada a extremidade da proteina defec- tiva é um sinal para que uma protease especifica degrade a proteina, Desse modo, pela atividade do tmRNA, os ribosso- 'mos parados sao liberados para participarem novamente da sintese proteica, Efeito dos antibisticos na sintese proteica ‘Um grande nimero de antibiéticos inibe a tradugio por inte- ragir como ribossomo, Essas interagées so bastante especi- ficas e demonstrou-se que muitas envolvem 7RNA. Virios ‘desses antibidticos exibem utilidade clinica e muitos também ‘orrespondem a eficientes ferramentas de pesquisa por espe- cificos a etapas diferentes da sintese proteica. Por exemplo, aestreptomicina inibe a iniciagéo, Por outro lado, a puromi- cina, 0 eloranfenicol, a cicloeximida e a tetraciclina inibem a clongagio. Sua utlidade clinica é aumentada pelo fato de muitos antibistios inibirem especificamente os ribossomos, ‘de organismos de somente um ou dois dominios filogenéti- ‘os. Dos antibistico listados, por exemplo, o cloranfenicol e acstreptomicina si especificos para ribossomos de Bacteria, enquanto a cicloeximida 0 ¢ para os ribossomos de Eukarya. mecanismo de ago desses ¢ de outros antibi6ticos sero discutides no Capitulo 27,202 © ribossomo desempenha um papel essencial no processo cde tradugio, associando o mRNA aos aminoacl- tRNAs, Ex tem tris sitios no ribossomo: ostia acaptar, onde o RNA carregado inicialmente combine-se;o sitio peptic, que sustenta a cadeia polipeptidics em crescimento; e um sitio de saida, Durante cada etapa da adicéo de arinoécides, 0 ribossomo avanca por trés nucleotideos (um eédon) a0 lon 190 domRNA, enquanto.o RNA, que eats no sitio acaptor, move-se para sitio peptiil. A terminaglo da sintese protei- 2 acorre quando um cédon sem sentido, que nBo codifice qualquer aminoscido, ¢ alcangado 1 Quais sio 0s componentes de um rbossomo? 1 Que papsis funcionsis 0 rRNA desempenha na sintose proteica? A incorporacao de aminodcidos incomuns A variedade de aminodcidos © codigo genético universal apresenta cédons para 20 ami- nodcidos (Tabela 7.4). Entretanto, multas proteinas contém ‘outros aminoscidos. Na realidade, mais de 100 aminoscidos diferentes foram encontrados em diversas protefnas. A maio- ra deles ¢ originada pela modificagio de um dos aminodcidos padrio, apés sua incorpora¢io em uma molécula proteica, processo denominado modificagdo pds-traducional. Entretan- to, pelo menos dois aminodcidos incomuns sio inseridos nas proteinas durante a propria sintese proteica. Essas excesdes, correspondem & selenocisteina e pirrolisina, 0 21° 22° ami nofcidos codificados geneticamente (o> Figura 3.12), Selenocisteina ¢ pirrolisina A selenocistefna apresenta a mesma estrutura da cistefna, diferindo apenas pela presenga de um atomo de selénio, em lugar de um atomo de enxofre. Ela é formada pela modifica- cio de uma serina apés sua ligacdo ao tRNA selenocisteina pela aminoacil-RNA sintetase. A pirrolisina é um derivado de lisina, que contém um anel aromético adicional. Nesse aso, a pirrolisina ¢ totalmente sintetizada e somente entao tunida a0 RNA pirrolisil pela aminoacil-tRNA sintetase cor- respondente. A selenocisteina e a pirrolisina so codificadas por c6- dons de terminagio (UGA e UAG, respectivamente). Ambas possuem seus préprios ERNAs, os guais contém anticédons ccapazes de ler esses c6dons de terminagao. Tanto a selenocis- te{na como a pirrolisina também possuem aminoacil-RNA sintetases especificas para carregar o RNA com os amino- 4cidos. Observe que esses aminoscidos sio utilizados por organismos que empregam o e6digo genético universal; em ‘outras palavras, a maioria dos cédons de terminacao desses ‘organismos indica, de fato, a terminago. No entanto, c6dons. de terminagao ocasionais s40 reconhecidos como codificado- res de selenocistefna ou pirrolisina. De que modo um cédon pode algumas vezes corresponder a um eédon sem sentido «© outras vezes a um cédon com sentido? No caso da sele- nocistena, a resposta é bem conhecida e depende de uma sequéncia de reconhecimento situada imediatamente a ju- sante ao cédon UGA codificador de selenocisteina. Ela forma Michael T. Madigan, John M. Martinko, Paul V. Dunlap & David P. Clark uma estrutura em haste-alga que se liga a um fator proteico especial, a protefna SelB. A protein SelB também se liga a0 IRNA selenocisteina carregado, conduzindo-o ao ribossomo, quando necessério, durante a tradusio. De maneira similar, «a incorporagio da pirrolisina depende de uma sequéncia de reconhecimento imediatamente a jusante ao eédon UAG co- \ificador da pirrolisina. A selenocisteina e a pirrolisina sio relativamente raras. Escherichia coli sintetiza somente poucas proteinas contendo selenocistefna, incluindo duas enzimas formato desidrogena- ses diferentes. O sequenciamento dos genes dessas enzimas levou a descoberta da selenocistefna e de seu mecanismo de incorporagao. A maioria dos organismos, incluindo plan- tas e animais, apresenta um pequeno nimero de protefnas ccontendo selenocistefna. A pirrolisina € ainda mais rara. Ela foi encontrada em determinadas Archaea e Bacteria, porém foi originalmente descoberta em espécies metanogenicas de Archaea, organismos cujo metabolismo gera gas natural (metano) (co Segdo 21.10). Em certos metanogenicos, a ‘enzima metilamina metiltransferase contém um resfduo de pirrolisina. A existencia de outros aminoscidos codificados geneticamente que utilizam eédons sem sentido com outras atribuigées, ou talvez até mesmo cédons com sentido com ‘outras atribuigdes, permanece como uma possibilidade. Cimerrear Muitos ominodcides incomuns s8o encontrados em protel- nas como resultado de modificag0 pés-traducional. Por ou ‘10 lado, dois aminodcidos raros,selenocisteina e piolisina, slo inseridos em cadeias polipeptidicas crescentes durante a sintese proteica, Ambos s80 codificados por addons de ‘terminagao expecias que apresentam uma sequéncia de reconhecimento prévima, especfica para a insercio de sole- rocsteina ou piroisna Explique 0 tormo modifcagio pés-traducional. 1 Que componentes especificas (além do um rbossomo tum cédon de terminagéo)s80 necesséros 8 insergBo de selonocisteina em uma cadoia polipepticica croscento? Dobramento e secregao de proteinas Até 0 momento, descrevemos como a informagao genética presente na sequéncia de bases do DNA 6 replicada em uma ‘e6pia idéntica, transcrita em uma sequéncia de bases de RNA e traduzida em uma sequéncia de aminoscidos de uma ca- dia polipeptidica. No entanto, para que uma protefna tenha atividade, cla deve ser dobrada corretamente (> Sogbes 3.6- 3.8), assim como deve destinarse ao local correto na célula, Aqui discutiremos brevemente esses dois processos. Dobramento de proteinas ‘A maioria dos polipeptideos dobra-se espontancamente em sua conformagao atv, & medida que ocorre sua sintese. En- tretanto, algumas nio fazer e requerem o auxslio de outras proteinas, denominadas chaperonas moleculares ou cha- Peroninas, para realizar seu dobramento correto, ou para Sua organizagao em complexos maiores. As proprias cha- peroninas nao se tornam parte das proteinas organizadas,apenas auxiliando no processo de dobramento, De fato, uma importante atividade das chaperonas consiste em impedir a agregagao imprépria de proteinas. Existem muitos tipos diferentes de chaperonas molecu- lares. Algumas auxiliam no dobramento correto de protefnas recém sintetizadas. Outras chaperoninas sio muito abun- dantes nas células, especialmente diante de condigaes de crescimento que trazem risco a estabilidade da proteina (p. ex, temperaturas altas). As chaperoninas sio amplamente distribuidas em todos os dominios da vida, e suas sequéncias so altamente conservadas em todos os organismos. Escherichia coli possui quatro chaperonas essenciais, DnaK, DnaJ, GroEL e GroES. DnaK ¢ Dnal sio enzimas ATP.dependentes que se ligam a polipeptideos recém-forma- dos, impedindo seu dobramento abrupto, um processo que aumenta o risco de dobramento impréprio (Figura 7.32). 0 dobramento mais lento, portanto, aumenta as oportunidades de dobramento correto. Se o complexo DnaK for incapaz de dobrar a proteina adequadamente, ele pode transferir a pro- tefna parcialmente dobrada as duas proteinas de multissubu- nidades, GroEL e GroES, Primeiro a proteina ¢ introduzida, em GroEL, uma protefna grande em forma de barril que, utilizando a energia da hidrélise de ATP, dobra a proteina corretamente, GroES auxilia nesse processo (Figura 7:32). Estima-se que apenas cerca de 100 das varias milhares de proteinas de E. coli requerem auxilio do complexo GroEL/ Gro para seu dobramento e, dente elas, aproximadamen= te uma diizia ¢ essencial sobrevivéncia da bactéria. {Além do dobramento de protefnas reoém-sintetizadas, as chaperonas também promovem o redobramento de protef= nas celulares parcialmente desnaturadas. Uma proteina pode ser desnaturada por virias razdes, porém, muitas vezes, isso ‘corre quando um organismo € submetido temporariamente aaltas temperaturas, Desse modo, as chaperonas sio um tipo de protetna de choque térmico, senda sua sintese intensamen- te acelerada quando a célula encontra-se sob estresse devido ao calor excessive (> Segio 9.11). A resposta ao choque térmico consiste em uma tentativa da célula redobrar suas proteinas parcialmente desnaturadas, a fim de que possam ser reutilizadas antes que as proteases as reconhegam como dobradas incorretamente ¢ as destruam. O redobramento rem sempre é bem sucedido, e as células contém proteases cuja fungio € localizar e destruir especificamente protefnas com dobramento incorreto, liberando seus aminodcidos para a sintese de novas protefnas. Secrecao de proteinas e particula de reconhecimento de sinal ‘Muitas protefnas atuam em nivel de membrana citoplasmé- tica, no periplasma de eélulas Gram-negativas (o> Secao 4.9) ou mesmo externamente A célula. Tais proteinas devem ‘migrar a partir do sitio de sua sintese nos ribossomos para a membrana citoplasmética, ou mesmo atravessar essa es- trutura. Como é possivel uma célula transferir seletivamente algumas proteinas através de uma membrana, deixando a ‘majoria das protefnas no citoplasma? ‘A maioria das proteinas que deve ser transportada para ou através de membranas ¢ sintetizada apresentando uma se- quéncia de aminodcidos de 15-20 residuos, denominada se ‘quéncia sinal, no inicio da molécula proteica. As sequéncias sinal s40 muito varidveis, mas normalmente apresentam pou- cos res{duos carregados positivamente no inicio, uma regio central com residuos hidrofbicos e, em seguida, uma regio Microbiologia de Brock 203 Protaina —— Protena constamente ‘mont @ obrada fat). GroeL. Groes Prteina corstaments ‘sobreda fave) Figura 7.32 A atividade de chaperonas moleculares. Uma proteins com dobramento incoreto pode ser redobrada pelo com plexo Dnakl ou pelo complexo GroEL/ES. Em ambos os casos, 3 fenergia para © redobramenta & proveriante do ATP. ‘mais polar. A sequéncia sinal“sinaliza” ao sistema seeretério da célula que essa proteina em particular deve ser exportada, além de impedir o dobramento completo da proteina, um pro- cesso que poderia interferirna sua secrogao, Uma vez que ase- ‘quencia sinal corresponde & primeira porgo da proteina a ser sintetizada, as etapas iniciais de exportagdo podem ter inicio antes que a proteina seja totalmente sintetizada (Figura 7.33). As proteinas a serem exportadas sio identificadas por sua sequéncia sinal pela proteina SecA ou pela particula de reconhecimento de sinal (SRP, do ingles, signal recognition particle) (Figura 7.33). Geralmente SecA liga-se a proteinas ue sdo totalmente exportadas através da membrana para 0 periplasma, enguanto SRP liga-se a proteinas que so inseri- das na membrana, mas nio liberadas na outra face. As SRPS ‘lo encontradas em todas as eélulas. Em Bacteria, estas con- tém uma dinica proteina e uma pequena molécula de RNA ‘io codificadora (RNA 4,58). Tanto SecA como SRP encami- nnham as protefnas que devem ser secretadas para 0 comple- xo seeretério da membrana. Em bactérias, ele habitualmente ‘corresponde ao sistema Sec, cujo canal consiste nas trés proteinas SecYEG (> Seco 4.5). A proteina é exportada através da membrana eitoplasmatica por meio desse canal. Ela pode entao permanecer na membrana ou ser liberada no periplasma ou ambiente (Figura 7.33). Apés atravessar a ‘membrana, a sequéncia sinal é removida por uma protease. Secrecao de proteinas dobradas: o sistema Tat No sistema See de transporte proteico, as proteinas trans- portadas atravessam a membrana citoplasmatica na forma desdobrada, sendo dobradas posteriormente (Figura 7.33) Entretanto, hé um pequeno niimero de proteinas que devem ser transportadas para fora da célula apés terem assumido sua estrutura dobrada final. Isso se deve ao fato de conterem204 Momeana ‘Aparato wasn Figura 7.23 Exportagio de proteinas por meio do principal sistema secretério. A soquencia sinal 6 reconhecida por SecA ou pela paricula de reconhecimento de sina, que concuzem a pro- twina ao sistema de secregéo da membrana. Aparticulade reconhe- ccimento de sal liga-se 8s proteins que s8o inseridas na membra a, enquanto SecA liga-se as proteinas que séo secetadas através, dda mombrana. Em bactérias Gram-negativas, estas dtimas prote- nas sao secretadas no espago perplasmético (> Secé0.4.9) ppequenos cofatores que devem ser inseridos na protefna an- tes que ela dobre-se em sua configuragao final. Tais proteinas sto dobradas no citoplasma, sendo enti exportadas por um. sistema de transporte distinto de Sec, denominado sistema Tat de exportagdo de proteinas. Oacrénimo Tat 6 derivado de “ivin arginine translocase’ ‘uma vez que as proteinas transportadas apresentam uma se Peete eee ard ‘Aminoacil4RNA sintetase enziima que catalisa a ligagdo de um aminodcido a seu {RNA cognato Antieddon sequncia de rés bases, pre: ‘sente em uma molécula de tRNA, que se pareia com um cédon durante a sintese proteea Antiparalelo em relacio ao DNA de fta dupl, refere-s x duns tas gue se orien tam em diregoes opostas (uma na diego 5°53’ eaffitacomplementar, na direglo 355) CChaperonina ou chaperona molecular proteina que ausilia outras proteinas turado ‘uma proteina ‘em seu dobramento ou redobramento & partir de um estado parcialente desna- Cdigo genético correspondéncia entre sequencia de cidos nuclecos ea sequéa- cia de aminoscidos de proteinas CCédon sequéncia de tts bases de um ‘mRNA, que codifca um aminoscido (Cécion de iniciagao céion especial, ha- bitualmente AUG, que indica 0 inicio de CCécon de terminagio cécion que indica 0 final de uma proteina Michael T. Madigan, John M. Martinko, Paul V. Dunlap & David P. Clark ‘queéncia sinal curta contendo um par de res{duos de arginina, [A presenga dessa sequéncia sinal em uma proteina dobrada & reconhecida pelas proteinas TatBC, que conduzem a proteina a TatA, o transportador da membrana. O evento de transpor- te requer energi, que é fornecida pela forca proton motiva (ce Segoes 4.4 e 5.12). Uma ampla variedade de proteinas & transportada pelo sistema Tat, especialmente proteinas ne- ‘cessérias ao metabolismo energético que atua no periplasma. Entre elas incluem-se as proteinas contendo ferro-enxolie & ‘varias outras protesnas do tipo “redox”. Além disso, a via Tat transporta as proteinas necessérias a biossintese da membra- na externa (> Seglo 4.9), assim como algumas protefnas ‘que nio contém cofatores, mas que se dobram corretamente ‘apenas no citoplasma, ‘As proteinas devem ser dobradas apropriadamente para ‘que possam atuar de forma correta. O dobramento pode s@ dar de forma espontines, mas pode também envolver @ participaco de outras proteinas, denominadas chaperonas, ‘molecular. Muitas proteinas também devem ser transpor ‘adas para 0 interior de membranas ou mesmo atravess-las Tas proteinas sao sintetizadas apresentando uma sequéncia ‘inal, que ¢ reconhecida pelo sparsto de exportagso celular, sendo removida durante ou apos a exportagio. 41 © que é uma chaperona molecular? 1 Por que algumas proteinas apresentam uma sequéncia sinal?| 1 que é uma partcula de reconhecimento de sinal? Neste capitulo, abordamos os fundamentos dos proces- ‘sos moleculares essenciais que ocorrem em bactérias. Em ‘seguida, consideraremos como as células de Archaea e eu- ‘cariéticas realizam os mesmos processos. Existem muitas similaridades, mas também algumas importantes diferensas, nos processos de replicacio, transcrigdo e tradugao entre 0s ‘organismos dos trés dominios da vida. ‘Cédon sem sentido oxtra denominacio ‘parao eédon de terminagao ‘Complementar sequéncias de sco nuclel- ‘co que podem parearse ‘Cromossomo clemento genético, nor malmente cireularem procaritos, que carrela os genes essnclals s fungoes cclulares| DNA girase enzima encontrada na matoria dos procariotos que introduz superenove lamentos negativos no DNA DNA polimerase enzima que sintetiza ‘uma nova fita de DNA, na diregto 5+ 3",uulzando uma fia antiparalla de DNA como molde Elemento genético estrutura que eareiaa Informagao genética, como um cromos- somo, plasmideo ou genoma viral Fase de leitura aberta (ORF) sequéncis dde DNA ou RNA que pode ser traduzida, originando um polipeptideo Fita continua a nova fita de DNA, snteti- ‘ada ininterruptamente durante a repli cacao do DNA, Fita deseontinua a nova fita de DNA, sin- tetizada em fragmentos curtos durante a replicasao do DNA, os quas so poste: ‘ormenteunidos Forquilha de replieagio sitio no cromos somo onde ocorre a eplicasio do DNA & ‘onde as enzimas envolvidas na replicagto ligam-se a uma fita simples edesenrolada de DNA Gene segmento de DNA que especifica ‘uma proteina (via mRNA), um 1RNA, um [RNA ou qualquer outro RNA no codi- fieador Genoma conjunto total de genes contidos fem uma eéhila ou virus Tnlelador um oligonucleotieo ao qual a DNA polimerase¢ capaz de adicionar 0 RNAe proteina mensageiro ‘édonrantieédon midade Questées de re ao 1, Descreva o dogma central da biologia molecular (Seg80 7.1). 2. Os genes foram descobertos antes que sua natureza quimica fosse conhecids. Defina um gene sem meneionar sua natu- reza quimica, De que um gene é composto (Segao 7.1)? 3. Repetigdes invertidas podem originar estruturas em haste-al- ‘ca. Mostre esse fato apresentando a sequéncia de um DNA. de fita dupla contendo uma repetig8o invertida e indique ‘como. transcrito dessa reglao pode originar uma estrutura ‘em haste-alga (Segao 72). 4. A sequéncia 5-GCACGGCACG-3' pode ser considerada uma repetigao invertida? Jutifique sua resposta (Seg0 7.2). ‘5. Moléculas de DNA ricas em AT separam-se em dus fltas ‘com maior faciidade que moléculas de DNA ricas em GC, ‘quando ha o aumento da temperatura. Explique essa obser- ‘vag, baseando-se nas propriedades do pareamento das ba- ses AT e GC (Ses0 7.2) 6. Descreva como 6 DNA, quando linearizado ¢exibindo com- primento muitas vezes maior que uma eélula, pode caber na ‘eélula (Seg 7.3). 1. Liste os principas elementos genéticos encontrados em mi- ‘crorganismos (Segio 7.4). 8. Umaestrutura frequentemente observada durante a replica ‘elo de DNA circular corresponde a estrutura teta. Desenhe tum esquema do processo de replicago e mostre como uma ‘esirutura teta pode ser originada (Sepves 7.5-7., 9. Por que os erros durante a replicagao do DNA slo tio raros? Que atividade enzimatica, além da polimerizagio, esta as- primelro desoxisibonucletideo durante areplicagao do DNA Macromolécula informacional qualquer ‘moléculapolimerica grande que earela ‘a informago genética incluindo DNA, ‘Operon agrupamento de genes que io ‘cotranscrtos, riginando um tnico RNA ‘Oscilagéo forma menos rgida de parca ‘mento, permitida apenas no pareamento Promotor sitio no DNA ao qual a RNA poli- merase liga-se¢ que inicia a transcrigao Replicagio siatesede DNA utlzando uma fit de DNA como molde Replicagio semiconservativa sintese de 'DNA que gera duas novas duplas hice, ‘ada uma consistindo em uma fita paren tale uma fta fia Ribossomo purticulactoplasmsica com: ‘osta por RNA ribosomal eproteinas, cua fungio consist em sinttizarprotenas RNA de transferéncia (URNA) pequens molécula de RNA utilizada no processo de tradusdo, que apresenta um antiédion fem uma das extremidades eo aminodcl do correspondente ligado outraextre- Microbiologia de Brock — 205 [RNA mensageiro (mRNA) molécula de RNA que contém a informasao genética necessria&codificagio de um ou mais, polipeptideos [RNA polimerase enzima que sinttiza moléculas de RNA, na dites0 5/3", utlizando uma fitacomplementare ant paralelade DNA como molde RNA ribossomal (FRNA) tipos de RNA en: ‘cntrados nos rbossomos, alguns parti- ‘ipam ativamente no processo de sintese proteica ‘Sequéncia snal sequéncia N-terminal ‘special, contend aproximadamente 20aminoseidos, que sinaliza que uma ‘roteina dev ser exportada através da ‘membrana ctoplasmatica ‘Terminagio término da elongagao de ‘uma molécula de RNA em um sitio es. pectfico ‘Tradugio processo de sintese de proteinas ‘que utiliza a informagdo genética contida no RNA como molde ‘Transeriggo sintee de RNA, ‘molde de DNA. Uso preferencial de eédlon uso nao aleats- "io de maliplos cédons que codileam o ‘mesmo sminodcido izando um sociada & DNA polimerase Ile como ela minimiza os erros (Segto 7.8)? 10, Os genes de tRNA apresentam promotores? Eles apresentam ‘eéddons de inieiagio? Explique (Seges 7.12 € 7.13), Os sitios de iniciagao e terminagdo da sintese de mRNA (no DNA) sio diferentes dos sitios de iniciagdo e terminago da sintese proteica (no mRNA), Explique (Sep6es 7.10 e 7.13) © que se entende por “oscilagio” eo que a torna necessétia a sintese proteica (Seg 7.13 € 7.14? 13, 0 que sto aminoacil-tRNA sintetases e que tipos de reagses clas realizam? Aproximadamente, quantos tipos diferentes destas enzimas sio encontrads na célula? Como uma sinte- tase reconhece seus substratos corretos (Sega 7.14)? 14, Aatividade que resulta na formagio da ligagao peptidica no ribossomo é denominada peptidil transferase. Que molécula catalisa essa reagiio (Seg 7.15)? Algumas vezes, proteinas apresentando dobramento incor relo podem ser corretamente redobradas, embora algumas vvezesiss0 no ocorra, sendo elas destrufdas. Que tipos de proteinas esto envolvidas no redabramento de proteinas incorretamente dobradas? Que tipo de enzimas estio envol- vidas na degradagao de proteinas incorretamente dobradas (Seco 71777 16, De que modo a célula identifica quais de suas protefnas de- ‘vem atuar externamente a eélula (Seo 7.17)? (rect)206 Michael T, Madigan, John M. Martinko, Paul V. Dunlap & David P Clark CEE ee ud 1, O genoma da bactéria Neisseria gonorrhoeae € uma molécula de DNA de fita dupla que contém 2.220 pares de quilobases. Caleule o comprimento dessa molécula de DNA em centime- tras, Se 85% dessa molécula de DNA correspondem a fases de Ieitura aberta de genes que codificam protefnas, ¢ se 0 tamanho médio das proteinas corresponder a 300 aminodci- dos, quantos genes codificadores de protefna sto encontra- ddos em Neisseria? Que tipo de informagao voe® imagina que estaria presente nos outros 154% de DNA? 2. Compare ¢ diferencie as aividades de DNA e RNA polime- rases. Qual a funcio de cada uma delas? Quais so os subs- tratos de cada uma? Qual a principal diferenga no compor- tamento das duas polimerases? ‘Qual seria o resultado (em termos de sintese proteica) se a RNA polimerase iniciasse a transcrigo uma base a mon= tante 20 seu sitio normal de iniciacao? Por qué? Qual seria ‘o resultado (em termos de sintese proteica) se a tradugao fosse iniciada a uma base a jusante ao seu sit iniciagao? Por qué? No Capitulo 10, estudaremos as mutagdes, alteragdes he- reditérias na sequéncia de nucleotideos em um genoma, -Examinando a Tabela 7.4, discuta como o eddigo genético ‘evoluiu de modo a minimizaro impacto das mutagbes