QBQ4020 - Bioquimica Metabélica Inicio: 03/08/2015 Fim: 08/12/2015 Dias e hordrio: sextas-feiras das 19hs as 22h40 Local: sala 04 B6 inferior Professor: Roberto K. Salinas Contato: roberto@iq.usp.br; sala 1001 do bloco 10 inferior Disciplina obrigatéria para “Licenciatura Notumo” (sexto semestre) e “Quimica Ambiental” (sexto semestre) Pré-requisitos: Introdugdo a bioquimica e Quimica orgénica II Bibliografia: Stryer e Lehninger ‘Mes __| Dia | Assunto Agosto _| 7 | Hemoglobina e mioglobina, cooperatividade 14 | Cinética enzimatica, equagao de Michaelis-Menten. 21 | Cinética enzimatica Mecanismos de catilise e tipos de inibigio 28 | Cinética Membrana biolégica Compostos ricos em energia (ex. ATP, GTP) Setembro | 4 | Transporte de membrana Revisdo de estruturas de carboidratos Introdugao ao metabolismo dos carboidratos 11_| Semana da Patria 18 | Revisio para Prova 1 25_| Semana da Quimica Outubro _| 02 | Prova 1 09 | Via glicolitica Ciclo de Krebs 16 | Cadcia de transporte de elétrons ¢ fosforilagao oxidativa 23. | Degradagiio e sintese de glicogénio Neoglicogénese Regulagdo, enzimas alostéricas Integragio do metabolismo de carboidratos, sinalizagio por insulina e glucagon 30 | Metabolismo de dcidos graxos Fotossintese Novembro | 06 | Revisio 13 20 27 carboidratos em plantas e bactérias Dezembro | 04 | Prova 3 Dezembro | _11_| Prova substitutiva (aberta) Dezembro | 15 | Data maxima para cadastro de notas Média Final = (P1 + P2 + P3y3 Observagiio: 1) Os alunos que entregarem os exercicios obterdo até 0.25 pontos na média final caso necessitem.2) A nota da prova substitutiva substitui a menor nota. Introdugao a Bioquimica Roberto Salinas — roberto@ig.usp.br Instituto de Quimica - USP 21 de outubro de 2015 __1.Estrutura de proteinas _ Proteinas so polimeros de aminodcidos conectados por ligagdes peptidicas. A ligagao peptidica ocorre devido a uma reagdo de condensacio entre o grupo amino do primeiro aminodcido ¢ a extremidade carboxila do segundo aminodcido (Figura 1): ' Ha, p Sr" i “ a a suc ‘OH Han Of mostadas, A ligacdo_peptidica é planar devido & existéncia de delocalizagio de elétrons do nitrogénio e do oxigénio da ligagdo amida. A planaridade da ligasio peptidica possui -enormes cansequéncias conformacianais. A primeira delas é que a conformagio do esqueleto polipeptidico pode ser descrita por apenas |trés angulos diedrais:|o Angulo ao redor da ligagdo peptidica, ¢ os angulos 6 e W do carbono alfa. Os dngulos $e V sio correlacionados ¢ nem todas as combinagdes so permitidas devido a0 impedimento esterico gerado entre a carbonila e 0 N-H da ligagao peptidica, e entre as, cadeias laterais de aminodcidos vizinhos. O grifico de correlagio entree W & chamado de Diagrama de Ramachandran em homenagem ao biofisico indiano que o desenvolveu, ¢ ainda é a principal ferramenta utilizada para avaliar a qualidade estereoquimica das estruturas de proteinas (Figura 2).180 120] 60 -60| -120 “460 =120 60 0 60 120 180 phi Figura 2. Diagrama de Ramachandran. As regides delimitadas pelas linhas verdes demarcam combinagdes permitidas de ¥ e ©. Pontos fora das regides delimitadas pelas linhas verdes indicam um aminodcido com algum problema ou corespondem a Estruturas tridimensionais de proteinas com resolugdo at6mica podem ser obtidas experimentalmente através de cristalizagio e Difragdo de Raios-X, Ressondncia Magnética Nuclear em solugao, e mais recentemente Crio-Microscopia Eletronica. > Conservacio e homologia de sequéncias Proteinas so polimeros de aminodcidos. A sequéncia de aminodcidos de uma _proteina ¢ chamada estrutura primaria. A cst tridimensional de uma proteina ¢ determinada pela sequéncia de aminodcidos. A@unca) biolégica de uma proteina esta intimamentewacionaga coma estutrattdimensional ‘A predicdo da estrutura tridimensional de uma proteina a partir da sequéncia de aminodcidos nao ¢ tarefa simples, especialmente para moléculas com mais de 100 aa. No entanto, a anélise da estrutura priméria pode oferecer pistas importantes sobre topologia (presenca de hélices transmembranares), estrutura secundaria ¢ grau de desordem. A relagio evolutiva entre proteinas de diferentes organismos pode ser inferida a partir de comparagies entre sequéncias de aminodcidos. Familias de proteinas que identificadas com base em similaridades entre sequéncias de aminodcidos. Membros de uma mesma familia sio chamados de proteinas homélogas, A fungio de umaproteina desconhecida pode eventualmente ser deduzida a partir da comparaco de sua sequéncia de aminodcidos com milhares de sequéncias de proteinas contidas nos ‘bancos de dados (por exemplo UNIPROT). Duas proteinas contendo ao menos 30% de identidade de sequéncia geralmente compartilham a mesma estrutura e fungdo. Aminodcidos conservados sio geralmente importantes para a fungdo. Geralmente, quando estes aminodcidos so alterados no decorrer da evolugao as propriedades fisico-quimicas s4o mantidas. Este fendmeno é chamado de mutagdo conservativa. Por exemplo, a mutagdo de uma Ile por uma Vel na mesma posigdo pode ser toleravel pois trata-se de dois aminoacidos hidrofébicos. Ou a mutagdo de um aspartato por um. um Scido glutamico também pode ser tolerével pois trata-se de dois aminodcidos com carga negativa na cadeia lateral. As alteragdes Ile — Val e Asp - Glu seriam duas mutagdes conservativas (Figura 3). Broteina A GUDEQRFRIEVIDDDVFEEDECFYIRLEN-—-----PSECVK-. LAVEMIAT Consenso G++ Rt +IDDDHFREDE P+ UN G+ LP oar Beoteina B GEIQKEIRVGIIDDDIFEEDENPLVILSNIRVSTEASDECILEASRVSTLACLESPSTAT Figura 3. Exemplo de alinhamento de sequéncias de duas proteinas “A” ¢ “B” de organismos diferentes mas com a mesma fungio, detectar a concentracdo de Ca’ intracelular, Note que “gaps” foram introduzidos na sequéncia da proteina “A” para optimizar o alinhamento com a proteina “B”. Funcio: proteinas que ligam Oxigénio (O:) Proteinas assumem diversas fungdes, mas uma das fungdes mais comuns é a ligagdo ‘specifica ¢ reversivel de outras moléculas. A molécula que sc liga 4 proteina é chamada ligante liga-se a um |sitio de ligacdé, o qual deve ser complementar em forma, tamanho, carga e hidrofilicidade ou hidrofobicidade ao ligante (modelo chave-fechadura). A interagio. entre o ligante e a proteina é fe forma que a proteina pode distinguir o ligante entre milhares de outras moléculas parecidas. Exemplo: enzimas reconhecem especificamente 0 substrato. No caso das enzimas, o sitio de ligagdo ao ligante ¢ conhecido como sitio catalitico Enzimas frequentemente reconhecem um substrato de acordo com um modelo de complementariedade espacial, chave-fechadura > Proteinas sio flexiveis, isto é, experimentam conformagdes distintas que se interconvertem em diferentes escalas de tempo. A interagio com um ligante frequentemente induz uma mudanga conformacional na protefna de forma a tornar 0 sitio de ligagdo 0 mais complementar possivel ao ligante, um processo conhecido como “induced fit”. Alterativamente, a proteina em solugo esta em equilibrio entre distintas eonformagdes sendo que apenas ume delas& espacalmente complementar 20 ligante, da confornaeZo completenae, um processocoaecido como “elogdo de confrmeros” uu “modelo sequencial”. A hemoglobina ¢ a mioglobina foram as duas primeiras proteinas cuja estrutura tridimensional foi determinada experimentalmente. Blas transportam oxigénio. Proteinas no so capazes de coordenar oxigénio, para isso elas utilizam ions metalicos como Fe(Il). O Fe(II) normalmente liga-se 4 proteina na forma complexada a um grupo prostético chamado Heme. O heme é uma protoporfirina que liga um fonFe™ (Figura 4). © grupo Heme esta ligado no covalentemente proteina (veja PDB IMBO). Figura 4. Grupo Heme encontrado na mioglobina ¢ na hemoglobina. O ion Fe" faz ligagdes de coordenargo com os quatro dtomos de nitrogénio do ancl. O Fe’ ainda pode formar duas outras ligagdes de coordenagfio que sio formadas com as histidinas proximal e distal (veja PDB IMBO). ‘A mioglobina consiste de um ‘nico polipeptideo de 153 aminoscidos. O equilibrio de associagao entre a mioglobina e uma molécula de O2 € descrito como: {Pi} ais Ka= toi; = eg onde P é a proteina, L é 0 ligante, e k, e ky sfio as constantes de velocidade de associagdo (segunda ordem) e de dissociacao (primeira ordem) do complexo. A fragdo de sitios ocupados pelo ligante é dada por 0: 9 = [rastode protemastigadas _ _(PL)__ _KalPlit} Katt] _ _(_ (9) Proteina total “‘peisiP] Ra[Plel+(?) — Raltj+i [el+Ka? em que [L] é a concentragio de ligante total. O comportamento de @ em fungao de [L] é uma hipérbole (Figura 5). E ficil observar que quando a proteina possui menor afinidade (maior Ka) é necessério adicionar maior quantidade de ligante para atingit saturago (Figura 5). Note que Ka (constante de dissociagdo) ¢ equivalente a concentragio de ligantes necesséria para saturar 50% dos sitios de liga. Portanto 0 valor de Ky é uma medida clara da afinidade de uma proteina pelo ligante.—otemmadetigscse 09 ee os theta (% sitios ocupados on (0.001 0.002 0.003 0.004 0.005 0.006 0.007 0.008 0.009 0.01 ‘concentracao de ligante total (mol) Figura 5. Simulagdo da curvas de ligagio para um complexo ligante:proteina com afinidade estimada por um Kq de 10 4M (azul) e 100 4M (vermetho). Em agua, 0 grupo heme liga-se a0 mondxido de carbono (CO) com 20 mil vezes maior afinidade do que ao oxigénio. Por outro lado, quando o heme esté ligado na mioglobina a diferenga de afinidade cai para 200 vezes. Detalhes estruturais, em particular a interagfo com a histidina distal explicam porque a afinidade do grupo heme pelo CO diminui. ‘A hemoglobina possui estrutura quaterndria, ela é um tetrémero formado por duas subunidades oc ¢ duas subunidades f. Ambas as subunidades a B so homélogas & mioglobina, mas mesmo assim apresentam baixa identidade de sequéncia (Figura 6). lpo:mioglobina __ VL SEGENOLVLEVWAKVEADVAGHGODIL IRLFXSHPETLEKF DRFKALKTEAENRASE cadeia alfa “VLSSPADKTNVKRAWGKVGAHAGEYGAEALERMELSFPTTATYPPHED~~~---LSHCSA beta beta ‘WaT EEKSAVEALHGRVIV~-DEVGGEALGRLLVVYPHTORF FESFCDLSTPDAVMCN? lwo:mioglobina _DLKHGVTVLTALGATLNAGH#AKLKPLAGSHATAAKIPIKYLEFSEAIIBVLHSRH cadoia alfa (QUKGHGKKVADAL TNAVABVDDNPNAL SAL SDLAAABRLRVOPUNPRLLSHCLLVILAART, beta beta VAIGEEVLGAESDGLAILDNLRGTFALSELICDELVDPENPRLLCNVLVCVLABEE iBo:mioglobina _—_~PGDFGADAQGASNKALELFRKOTAAKYEE, cadoia alfa PARP TPAVBASLOXPLASVSTVLTSRYR- beta beta GREFTPPYanAYaRVVAGyanatAR® Figura 6. Alinhamento de sequéncia da mioglobina (PDB 1MBO) com as cadeias alfa e beta da hemoglobina (PDB 1HGA).Apesar de diferengas na sequéncia de aminodcidos, as_estruturas tridimensionais da mioglobina (PDB IMBO) e da hemoglobina (PDB 1HGA) so muito parecidas. A hemoglobina possui quatro grupos heme, um em cada subunidade, podendo transportar até 4 moléculas de O>. A presenga de quatro sitios de ligago e 4 subunidades afeta profundamente as caracteristicas da hemoglobina como molécula carreadora de oxigénio. A curva de ligagdo do oxigénio na hemoglobina € sigmoide, indicando que oxigénio liga-se cooperativamente & proteina (Figura 7). Em um processo cooperativo, a interagao do ligante com 0 primeiro sitio altera a afinidade do segundo sitio e assim por diante. Como consequéncia da cooperatividade observada na curva de ligagio a oxigénio, a porcentagem de saturag4o da hemoglobina varia muito mais rapidamente com a concentragao de oxigénio do que no caso da mioglobina que nao é cooperativa. Por exemplo, no equilibrio de ligagdo mostrado na Figura 7, nota-se que para ir de 20% a 80% de saturagdo seria necessério aumentar a concentrago de ligante apenas duas vezes, de 12.6 para 25.2 nM (Figura 7). Enquanto que no caso de um equilibrio niio cooperative como exemplificado na Figura 5, a concentrago de ligante deveria ser aumentada aproximadamente 10 vezes para aumentar a fragdo de sitios ocupados de 20 a 80%, Portanto, uma proteina cooperativa € muito mais sensivel a pequenas alteragdes na concentragao de ligante. Esta caracteristica torna a hemoglobina capaz de captar oxigénio nos pulmées, onde a pressfio de O2 & maior, e liberar nos tecidos onde a presstio de O2 é menor. curva de Hill 35 25 v (numero de sitios ocupados 0005 0.01 0015 002 0025 003 0035 0.04 ‘concentracao de ligante (mol) Figura 7. Curva de Hill para uma proteina com 4 sitios de ligago ¢ Kd 0.1 wM. A concentragao total de proteina é 1 mM.A ligagdo cooperativa de um ligante com oxigénio em uma consequéncia da interago entre as subunidades. A estrutura quaternéria da hemoglobina envolve um grande niimero de interagdes fracas (eletrostitica, ligaglio de hidrogénio e van der Waals) entre as subunidades alfa e beta. Estas interagdes so cruciais para modular a afinidade dos diferentes sitios de ligagdo pelo oxigénio. Como ? Monod, Wyman e Changeaux propuseram um modelo para explicar a cooperatividade da hemoglobina. Este modelo, chamado de “concerted model”, propde que a hemoglobina esté em equilibrio entre um estado tenso (“T”) e outro relaxado (“R”): T——_ 0 > liga-se mais fortemente ao estado R deslocando o equilibrio na diregdo da forma “T”. Assim, quando O; liga-se & primeira subunidades todas as outas subunidades mudam de conformagao para a forma “R” concomitantemente. Exereicios para a aula 1 1. Aproteina A interage com o ligante X com Ky 10° M. A proteina B interage com 0 mesmo ligante mas com Ks 10° M. Qual proteina possui maior afinidade pelo ligante X? Explique. 2. A protefna caleineurina liga-se 4 calmodulina com uma velocidade de associagiio de 10° M's, e uma constante de dissociagdo, Kd, de 10 nM. Calcule a velocidade de dissociagdo do complexo (kau), inclua as unidades adequadas. 3. Desenhe a curva de desnaturagio de uma proteina A em fungio da temperatura. Assuma que a proteina A seja pequena, ¢ portanto o equilibrio de desnaturagdo envolve apenas dois estados. Em seguida, suponha que um mutante foi construido. Este mutante envolve a troca de dois residuos de Ser por Cys, de tal forma que as duas cisteinas esto préximas uma da outra na estrutura tridimensional da proteina, e formam uma ponte dissulfeto estabilizando a estrutura, Desenhe sobre o mesmo grafico, a curva de desnaturagio do mutante. 4, Estudos de transporte de oxigénio em fémeas gravidas mostraram que as curvas de saturagdo com oxigénio do sangue do feto ¢ do sangue materno séo diferentes. Os eritrécitos do feto contém uma variante estrutural da hemoglobina (HbF), que consiste de duas subunidades a e duas y (a2g2). Enquanto que a hemoglobina da mae (HbA) consiste de 0282. Qual ‘hemoglobina possui maior afinidade pelo oxigénio nas condigdes nativas? Explique.Op (kPa) 5. Depois de passar alguns dias em altitudes muito elevadas, a concentragao de BPG nos eritrécitos aumenta, Qual serd o efeito do aumento da concentragao de BPG na curva de saturagao da hemoglobina? Proponha uma explicagao para porque essa adaptagdo seria benéfica para o funcionamento do organismo em altas altitudes. Desenhe graficos para fundamentar a sua resposta. ) Cinética enzimitica Ee Enzimas sfo catalisadores em sistemas biolégicos. As caracteristicas mais notiveis das enzimas slo o seu poder-eatalitico e a sua especificidade. Quase a totalidade das enzimas sio proteinas, porém algumas moléculas de RNA também so capazes de promover catalise. O exemplo mais conhecido de riboenzima é o RNA ribosomal. Uma das fungdes mais importantes desempenhadas pelas proteinas é 0 ‘i i é formagio de interagdes néo covalentes. Enzimas utilizam esta capacidade para interagir com o substrato (ligante) osicionando-o de forma adequada para que reagdes quimices possam ocorrer. Enzimas catalisam reagdes quimicas porque estabilizam 0 estado de transicao. Elas catalisam apenas uma reagdo quimica, sendo que a ocorréncia de reagdes colaterais é rara em comparago com reagdes no catalisadas. A tabela 1 ilustra 0 ganho em velocidade de reago promovido por enzimas selecionadas: Tabela 1: Aumento de velocidade de reagdo proporcionado por certas enzimas Emima Velocidade da reacio | Velocidade da nio catalisada reacio catalisada Anidrase carbonica 13x10" st 110° s* Triose fosfato isomerase 43x10" s* 43x10" $ Carboxipeptidase A 3.0x10" s7 578s" Enzimas sio altamente especificas para o substrato, Um exemplo desta especificidade sio as proteases, enzimas que catalisam a reago de clivagem da ligagdo peptidica. A papaina € uma protease que n&o discrimina 0 aminodcido adjacente A ligagdo peptidica, assim ela reconhece diferentes sequéncias de aminodcidos. A tripsina, por outro lado, cliva somente ligagdes peptidicas adjacentes a lisinas ou argininas, que si0 aminodcidos de cadeia lateral longa e carregados positivamente. Outro exemplo & a DNA polimerase, uma enzima que catalisa a formagdo da ligago fosfodiéster paraformar uma nova dupla-fita de DNA. Ela ¢ praticamente insensivel a erros incorporando menos de um nucleotideo errado a cada mil, Dessa forma 2 DNA polimerase é uma enzima altamente especifica para a fita de DNA molde. Equilibrio O sentido de uma reagio quimica depende da variaglo da energia livre de Gibbs envolvida (AG = Gpruisios ~ Greapenes). Reagdes com AG negativo so espontineas, enquanto que reagdes com AG positivo ndo sio espontineas ¢ precisam de energia para ocorrer. Reagdes com AG = 0 esto no equilibrio. O valor do AG depende apenas dos estados inicial e final, independe do caminho. ‘A magnitude ¢ o sinal do AG nada informam sobre a velocidade com que as reagdes ocorrem. Por exemplo, a reagdo de oxidagio de glicose (CsllQs) a CO; ¢ H:0 € esponténea, mas nao ocorre a taxas perceptiveis na auséncia de enzimas. O AG de combustio da glicose ¢ 0 mesmo caso a reagdo seja catalisada ou nfo. grau de espontaneidade de uma reagio quimica depende do valor do AG, o qual depende, por sua vez, das concentragdes de reagentes e produtos conforme a equagdo 3 AG = AG? + RTIn 2zeestesl @) ireagences] ” sendo que AG? = RTInKeq. (4) A Tabela 2 mostra a correlago entre constantes de equilibrio e AG. Note como reagdes com AG positive ndo ocorrem na dirego esperada, ao contrario de reagdes com AG negativo (Tabela 2). ‘Tabela 2. Relagao entre Ke, ¢ AG. Ke AG (ki/mol) 10 34.2 10° 171 1.00 0.00 10! Mi 10° “17.1 6, Reagdes quimicas que nao sto espontineas (AG’ > 0) podem tomar-se espontineas ajustando-se as concentragdes de reagentes ¢ produtos. Este aspecto é determinante em condigdes celulares. Por exemplo, considere a reagio de isomerizagio de dihidroxicetona-fosfato (DHAP) em gliceraldeido-3-fosfato (GAP) que ocorre durante a via glicolitica. A razio entre as concentragdes de DHAP e GAP no equilibrio ¢ 0.0475 a 298 K e pH 7 (R = 8315 JK mol"). Pergunta-se: 10@ Ho. oo. —— 4 ope” Ai-hideox-cotonafosfato slicerldeido-3-fosfuto i) A reagao de isomerizagdo de DHAP em GAP nas condigdes de equilibrio ¢ espontinea? ii) A reagdo sera espontinea quando as concentragdes de DHAP e GAP forem 200 uM e 3 1M, respectivamente? Enzimas aceleram reagdes quimicas mas nfo alteram o equilfbrio da reagio, que € dado apenas em fungio da diferenga de energia livre entre produtos e reagentes (Figura 8). A velocidade das reagdes quimicas é expressa a partir de uma medida da variagiio da concentrago de produtos ou reagentes em fungo do tempo. Considere 0 equilibrio entre dihidroxicetons-fosfato (DHAP) e gliceraldeido-3-fosfato (GAP) ilustrado abaixo: spo" Ai-hideox-cetona-fosfto sliceraldedo-3fosfito Este equilibrio possui velocidades no sentido da formagao de gliceraldeido-3-fosfato ou dihidroxicetona-fosfato. A velocidade da reagio direta é expressa como: SOnAl— KIDHAP] (5) onde a constante de velocidade “k” & expressa em s. Reagdes que sio diretamente proporcionais 4 concentrago do reagente sio chamadas de “reagdes de primeira ordem”. Reagdes bimoleculares e cuja velocidade é proporcional a concentragio de dois reagentes so chamadas “reagdes de segunda ordem”, neste caso a constante cinética é expressa em M's". Catélise enzimética A velocidade de uma reagio quimica é diretamente proporcional a energia de ativagdo. Enzimas agem como catalisadores biolégicos, ¢ atuam para diminuir a barreira de energia de ativago conforme mostrado na Figura 8, acelerando a reagio. ‘A forma pela qual enzimas diminuem a barreira de energia é através da estabilizagiio do estado de transig&o. A primeira etapa de uma reagio catalitica é a formago de um complexo especifico entre enzima e substrato, Dessa forma, a enzima € capaz de orientar o(s) substrato(s) adequadamente para que a reagio quimica ocorra, i@ ev Prostar Toone . Coordenada de reagdo Figura 8, Diagrama de energia livre em fungi da coordenada de reago para uma reago na auséncia (preto) ¢ presenga da enzima (vermelho). A enzima estabiliza a 0 estado de transigao, diminuindo a barreira de energia de ativagao. ‘A velocidade das reagdes quimicas depende da constante de velocidade e das concentragdes dos reagentes. Portanto, no é de estranhar que a velocidade de uma reago enzimética, medida a partir da taxa de formago do produto “P”, aumente com aconcentragio de enzima: = KE lew ‘A velocidade da reagdo também aument com a concentrago de substrato como seria de esperar. O curioso é que a velocidade de reacdo aumenta linearmente para baixas concentragdes de substrato, mas deixa de aumentar em altas concentragdes de substrato e atingir um valor méximo (Vmax) (Figura 9). Com certeza, a velocidade de uma reago ndo catalisada no apresenta este efeito de saturagio. cog} y oa 38 + rT {Subsea (a Figura 9. Velocidade inicial (vo) em fungdo da concentragio de substrate (azul). Comparagio com enzimas diferentes apresentando menor Ky (verde) ou maior Vinex (vermelho). Para compreendermos a origem deste efeito de saturagio & preciso considerar as condigdes em que as medidas foram realizadas. Medidas de velocidades de reacdes enzimiticas so geralmente realizadas nos intervalos de tempo iniciais da reagio, € 12em condigées de baixissima concentragéo de enzima ¢ um excesso de substrato. Quando a enzima & misturada com um excesso de substrato, ha um perfodo inicial durante 0 qual as concentragdes de intermedidrios, de complexo enzima-substrato (ES) aumentam até atingir valores estaciondrios. Uma vez que os intermediarios atingiram concentragdes estacionarias, as velocidades de reagio alteram-se muito pouco com o tempo. Leonor Michaelis ¢ Maud Menten propuseram em 1913 um modelo simples para explicar as caracteristicas cinéticas observadas na Figura 9. 0 modelo de Michaeli Menten pressupée que o complexo ES é um intermediério da reagao catalitica. O complexo enzima-substrato também costuma ser chamado de “complexo de Michaelis”: k k, E+S ===> ES ==> E+P. ky k> A reagao catalitica é dividida em duas etapas. Inicialmente ocorre a interagao entre uma molécula da enzima e outra do substrato, formando 0 complexo “ES”. Este primeiro equilibrio é considerado répido € reversivel, € néo envolve alteragdes das ligagdes quimicas. O complexo ES ¢ mantido por interagdes nfo covalentes. As reages quimicas ocorrerio em uma segunda etapa, na qual 0 complexo ES se decompée em enzima livre e produto. Esta segunda etapa segue uma cinética de primeira ordem, dependente da constante kz ou kz. complexo ES também pode ser formado a partir da reagio reversa entre enzima e produto. Mas como as medidas so realizadas nos instantes iniciais em que a concentrago de produto é muito pequena, a reagdo reversa pode ser ignorada, Esta anilise também assume que a decomposigao de ES em enzima e produto livres ¢ répida, e portanto pode ser ignorada. O esquema final é: ky E+S <= BS > EP Com um pouquinho de Algebra e assumindo-se a condigdo de estado estacionério, ¢ possivel chegar a uma equacdo simples para a velocidade inicial de reagio em fungao da concentragdo de substrato e das constantes cinéticas. Esta é a chamada “equago de Michaelis-Menten”, e reproduz muito bem o comportamento ilustrado na Figura 9: o(BleS1 _ Ymasl$1 (7) Yo = FeFFasis} Kus] A constante cinética ky ou Ke € frequente chamada de “turnover”. Ela representa 0 nimero maximo de moléculas de substrato convertidas em produto por unidade de tempo. A constante k.x & uma constante de velocidade de primeira ordem. Na presenga de excesso de substrato, a velocidade inicial vo atinge o valor miximo (Vimas) que depende apenas da constante catalitica Kea 13Vmax = ke[E}tota (8) Ko é igual a concentrago de substrato na qual a metade da velocidade maxima (vo = Virue/2) 6 atingida. Dessa forma Ky representa a concentragdo de substrato necesséria para se atingir uma taxa razodvel de conversio de substratos em produtos. E na situago particular em que k; << kj, Ky representa a constante de dissociagio do complexo ES. As tabelas 3 e 4 apresentam os valores do tumover e de Ky para algumas enzimas. ‘controle — maior Vmax menor KM 0 02 oa 1 Oa O68 [Substrato] (Mj A Figura 9 ilustra o efeito de variagbes de Ky. ¢ Vinx Sobre 0 comportamento cinético de uma enzima. ‘Tabela 3, Tumover de algumas enzimas Enzima Kea 6") ‘Anidrase carbonica 6.0x10 Acetilcolinesterase 2.5x10" Lactato desidrogenase 10x10 Tabela 4. Ky de algumas enzimas Enzima Substrato (s") Km (uM) ‘Anidrase carbonica CO? 8.0x10° B-galactosidase Lactose 40x10" ‘Arginina-tRNA-sintetase ‘Arginina 3 Normalmente, em condigdes fisiolégicas, a velocidade de uma reagdo enzimética ¢ dada pela 12780 kea/Ky, que € uma constante de velocidade de segunda ordem aparente: % = (EIS. @) 14Em uma condigiio em que a concentragdo de substrato for muito menor do que o Ks, Ka EleorailS1. (10) A razio keu/Ky depende tanto da eficiéncia da reagdo catalitica kes, como da afinidade entre enzima e substrato, Ky. Esta razio é uma boa medida da especificidade da interagdo entre enzima e substrato como mostra a Tabela 5. Neste caso , fica evidente que a quimotripsina possui preferéncia por substratos volumosos como a fenilalanina. ‘Tabela 5. Preferéncias da quimotripsina pelo substrato Ester de amino acido kea/Ku (MS) Glicina 13x10" Valina 2.0 Fenilalanina TOx10 £ interessante imaginar 0 quao eficiente uma enzima pode ser. A resposta para essa pergunta depende do limite da azo ke/Ku. Suponha que a decomposicao do complexo ES em enzima e produtos seja muito mais répida do que a velocidade de dissociagdo do complexo (ky >> k.1), neste caso o limite & dado por ki, a constante de velocidade de formagio do complexo “ES”. O limite para k; é a velocidade de dif uso das moléculas em solugaio, um nimero da ordem de 10° a 10° M's". Enzimas que possuem valor keu/Ky¢ nesta faixa so ditas “perfeitas”, pois atingiram a perfeigao catalitica (Tabela 6). ‘Tabela 6 Enzimas que atingiram perfeicdo catalitica Enzima Kea/Ky (MTS) Acetilcolinesterase 1.6x10° ‘Anidrase carbSnica 83x10 Catalase 4.0x10 Representagio grafica dos dados £ muito util linearizar a equagao de Michaelis-Menten para determinar os valores de Kea € Ky, € também para examinar desvios da idealidade. Desa forma, um grifico de 1/v em fungdo de 1/[S] obedeceria a uma equacdo de reta igual a: 1 Kw 4 v Vmax [5] 1 me OD ‘A anilise dessa equagdo indica que 0 ponto em que o grifico cruza o eixo das ordenadas equivale a 1/Viax € que 0 coeficiente angular ¢ dado por Ky/Visux Inibigéio Enzimas podem ser inativadas pelo aumento da temperatura, ou pela interago no covalente com inibidores, pequenas moléculas que competem com o substrato pelo sitio ativo. Estes inibidores so chamados de “competitivos”. No caso de um inibidor competitivo, o mecanismo de Michaelis-Menten teria que ser alterado para: 15Kear ———> E+P K =IEJEN) EL E nao é dificil derivar a equagaio de Michaelis-Menten levando em conta o equilibrio entre a enzima eo inibidor competitivo: Observa-se que 0 Ky aparente aumentou por um fator de (1+{I]/Ki), ou seja, a afinidade aparente entre enzima e substrato diminuiu. Note que o inibidor competitive nao afeta 0 Vina, apenas Ky. Mecanismos De onde vem o poder catalitico ¢ a especificidade das enzimas? Nés j vimos que as enzimas formam um complexo com o substrato através da formagao de interagdes no covalente, e que elas interagem melhor com o estado de transi¢do. Como isto ocorre? Estruturas cristalograficas ¢ ensaios de mutacdo sitio-ditigida permitiram obter a resposta em alguns casos. Os mecanismos descritos abaixo trazem exemplos de um ou mais tipos de catdlise: a)catélise covalente: em que 0 sitio ativo contem um nicleofilo poderoso que liga-se covalentemente a parte do substrato durante a catélise b)catélise dcido-base: uma molécula que nio seja a agua assume o papel de doador/aceptor de prétons Ceatdlise por aproximacdo: enzimas facilitam proximidade entre os substratos ‘trazendo-os para uma mesma superficie de interagio d)catélise por ion metilico: ions metélicos agem cataliticamente, por exemplo a0 facilitar a formagdo de nucleofilos. Proteases Enzimas proteoliticas possuem a tarefa de acelerar a reagdo de hidrdlise da ligagdo eptidica, 16° A ? Ry —Pe + 0 a aL +k, Hy ‘0 r—2 Embora esta reagdo seja termodinamicamente favoravel, ela é extremamente lenta na auséncia de um catalisador. Para promover a clivagem da ligagdo peptidica a enzima deve facilitar um ataque nucleofilico no grupo carbonila da ligagdo peptidica. A quimotripsina emprega um nucleofico forte capaz. de fazer este ataque nucleofilico. Este nucleofilo é o grupo hidroxil da cadeia lateral de uma serina extraordinariamente reativa. A reatividade extraordindria da Ser’ vem do fato de que o grupo OH da cadeia lateral forma uma ligacdo de hidrogénio com a His’. O grupo NH da His” forma, por sua vez, uma ligagdo de hidrogénio com a cadeia lateral do Asp'. Este arranjo, conhecido como “triade catalitica”, estabiliza uma carga negativa na cadeia lateral da Ser195, que se torna extraordinariamente dcida (Figura 10). nN Figura 10. Triade catalitica da quimotripsina formada pela Ser'", His” © Asp". A rede de ligagdes de hidrogénio tora o grupo OH da Ser! extremamente reativo © estabiliza um oxidnion. © mecanismo proposto para a reago catalitica envolve um ataque nucleofilico do oxigénio da cadcia lateral da Ser'® sobre a carbonila do substrato, que assume configurag4o teatraédrica intermediério © uma carga negativa no oxigénio da carbonila, Esta carga negativa sera estabilizada por grupos NH da proteina, que formam 0 chamado “oxyanion hole”. O passo seguinte envolve a clivagem da ligagdo peptidica ao mesmo tempo em que o proton ligado a His57 ¢ transferido para o grupo amino da cadeia polipeptidica livre. Como resultado, a enzima permaneceu acilada por parte da cadeia polipeptidica. Portanto, este mecanismo envolve a formagao de um intermedifrio covalente, ¢ a proxima etapa deve se a hidrolise desse 17intermediario covalente. Na préxima etapa uma molécula de Agua ocupa o lugar do grupo amino do substrato. A HisS7 age como uma base e abstrai um proton da agua, enquanto o grupo hidroxila ataca a carbonila do intermediério que colapsa liberando a segunda metade do peptideo e regenerando a enzima. Este mecanismo nao explica a especificidade da enzima, A quimiotripsina cliva ligagdes peptidicas adjacentes a cadeias Iaterais grandes e volumosas, como fenilalanina. O reconhecimento do substrato envolve a interago da cadeia lateral na posigio amino-terminal a ligagdo que sera clivada, com um bolsio hidrofébico. Este bolso hidrofébico possui, no caso da quimiotripsina, maior afinidade por cadcias laterais aromaticas e volumosas. ‘A quimiotripsina 6 uma protease da classe das serino-proteases, pois utiliza a cadeia lateral de uma Serina para fazer o ataque nucleofilico na carbonila. Outras classes de proteases utilizam uma estratégia semelhante, as cisteino-proteases, aspartil- proteases ¢ as metalo-proteases. Nestas trés classes de proteases, o mecanismo de catdlise segue o mesmo padrdo. Primeiro ocorre a ativagdo de um agente nucleofilico capaz de realizar um ataque sobre a carbonila da ligagao peptidica que serd clivada. No caso das cisteino-proteases, esse agente serd uma cisteina que assume a fungdo da serina. No caso das metaloproteases ou aspartil-proteases, 0 ataque nucleofilico efetuado por uma molécula de Agua reativa. Frequentemente, 0 grupo carbonila que sofre o ataque também ¢ polarizado, de forma a assumir menor densidade eletrénica. O terceiro aspecto importante é a estabilizagao do intermediério teatraédrico através da formago do “oxyanion hole”. No caso das metalo-proteases, um fon metalico, por exemplo Zn’, interage com uma molécula de 4gua polarizando-a e tornando-a altamente reativa. Anidrase carbénica ‘A anidrase carbénica & uma enzima cuje fungdo ¢ acelerar a reago de hidratagdo de CO; formando 0 anion bicarbonato: Oo Oo f | | I +H,0 AL c. => cw +H l kon oon Oo As constantes ky (pseudo-primeira ordem) e k.; (primeira ordem) so 0.15 se 50s", respectivamente, na auséncia de catalisador. Portanto 0 equilibrio da reagdo é deslocado no sentido da formagio de CO>. Anidrase carb6nica acelera a reagao de hidratagao de CO2 para velocidades keat = 10° s|. A enzima possui um fon Zn” coordenado por trés histidinas, 0 quarto ponto de coordenagio do Zn*” é satisfeito por uma molécula de H20. © tumover da anidrase-carbonica é altamente dependente do pH, e apresenta uma transigo de um estado de baixa atividade em pH baixo para um estado de alta atividade em pHs maiores que 9, sendo que o ponto médio dessa transi¢o é o pH 7. O 18grupo responsdvel por essa transi¢@o ¢ uma molécula de 4gua que esté coordenada pelo Zn*. A interagio com o Zn” faz com que o pK, da molécula de Agua diminuisse de 15.7 para 7.0. Esta molécula de agua é capaz de perder um préton facilmente devido ao pKa mais baixo, formando um radical hidroxila que é capaz. de realizar um ataque nucleofilico no CO> gerando um ion bicarbonato. Exercicios 1. Uma enzima que catalisa a reagdo de conversio entre duas moléculas “X” ¢ “Y” é isolada de duas espécies de bactérias. As enzimas possuem 0 mesmo Vmax, mas possuem valores de Ky diferentes. A enzima A possui Ky = 2.0 4M, enquanto que a enzima B possui Ky = 0.5 uM. A grifico abaixo mostra a cinética de duas reagdes efetuadas com a mesma concentragéo de enzima e [X] = 1 4M. Qual curva corresponde a qual enzima? mw ‘Time 2. © exame da estrutura de uma enzima permite formular hipéteses sobre a contribuigo de cada aminoacidos para a estrutura e para a atividade da enzima, Uma forma de testar essas hipéteses € usar técnicas de DNA recombinante para gerar mutantes, e examinar 0s efeitos das mutagdes sobre a estrutura e atividade da enzima. A lactato desidrogenase (LDH) € uma enzima que catalisa a redugo de piruvato com NADH para formar lactato. Um esquema do sitio ativo da enzima, contendo piruvato © NADH ligados, esta mostrado abaixo: Lactate ehdrogenase wo see OG tote xanm og? Wy mega ae O mecanismo da reagdo é similar ao mecanismo de outras redugdes por NADH. O estado de transi¢ao envolve o grupo carbonil do piruvato fortemente polarizado: 19Pergunta-se: i) Um mutante da LDH no qual a Argl09 foi substituida por Gin mostra apenas 5 % de ligagdo a piruvato e 0.07 % da atividade da enzima selvagem. Proponha uma explicacdo para os efeitos desta mutagdo ii) Vocé espera que a substituigiio da Argl71 por uma lisina afete a afinidade da enzima pelo piruvato? Por qué? 3. Uma enzima recém descoberta catalisa a reagao descrita abaixo. =——- R O valor do turnover encontrado para esta enzima é 600 s. Quando [E]r = 20x10 M € (T] = 40 uM, a velocidade da reagdo é vo = 9.6 uMs". Calcule 0 Ky para o substrato. 4. A hidrélise de pirofosfato a ortofosfato € uma reagio acoplada importante para deslocar 0 equilfbrio de reagdes biossintéticas, por exemplo a sintese de DNA. Esta reagdo de hidrolise é catalisada por uma pirofosfatase que possui massa de 120 kDa consiste de seis subunidades idénticas. Para esta enzima, a unidade de atividade enzimitica & definida como @ quantidade de enzima necesséria para hidrolisar 10 jumol de pirofosfato em 15 minutos a 37 °C. A enzima purificada posstii Vinx = 2800 unidades por miligrama de enzima, 4) Quantos mols de substrato sGo hidrolisados por segundo por miligrama de enzima quando a concentrago do substrato for muito maior do que o Km? b) Quantos mols de sitios ativos existem em I mg de enzima? Assuma que cada subunidade possui um sitio ativo. ) Qual é 0 turnover da enzima? 5. Suponha que uma enzima mutante ligue-se com o substrato com uma afinidade 100x maior do que a enzima selvagem. Qual € o efeito desta mutagdo sobre o turnover (kes) considerando-se que a interago com o estado de transi¢fo nfo foi afetada? 6, Para uma enzima que segue a equagdo de Michaelis-Menten, qual ¢ 0 valor de Vinx considerando-se que vol uM/min a 1/10 Ky¢? 207. A penicilina é hidrolisada por uma enzima beta-lactamase que esta presente em algumas cepas de bactérias resistentes a antibidticos. A massa desta enzima é 29.6 kDa, A quantidade de enzima hidrolisada em 1 minuto em uma solugio de 10 ml contendo 10° gramas de beta-lactamase purificada foi medida em fungdo da concentragao de penicilina (tabela abaixo). Assuma que a concentragdo de penicilina niio se altera apreciavelmente durante 0 ensaio. [Penieiina] uM Quantidade hidrolisada (nanomols) 1 O11 3 025 3 034 10 0.45 30 0.58 50 0.61 a) Faga um grifico de Vo em fungao de [S] e de 1/Vo em fungao de 1/[S]. Responds: a beta-lactamase parece seguir a cinética de Michaelis-Menten? Neste caso, qual & 0 valor do Kyi? Observagaio: abaixo é dada a equagaio da reta do segundo grafico: y = 4.6x10* + 8.8x10" b) Qual & 0 valor do Vinx? ©) Qual é o turnover da enzima nestas condigdes experimentais? Assuma a presenga de um sitio ativo por molécula de enzima. isries. ee ve 8. A cinética de uma enzima foi medida em fungo da concentrago de substrato na presenga e auséncia de 2 mM do inibidor “I”. Is}@M) Velocidade (umoV/minuto) ‘Sem inibidor ‘Com inibidor 3 10.4 4d 5 145 64 10 22.5 13 30 33.8 22.6 90 405 33.8 8) Quais so os valores de Vinx ¢ Kye na auséncia e presenga de inibidor? Sao dadas as seguintes quagdes de reta: 21Aaul (sem inibidor): y = 13x + 1.3x108 Vermelho (com inibidor): y = 40x + 1.3%10° 1 ‘asin b) Qual é 0 tipo de inibigaio? ¢) Qual é a constante de afinidade do inibidor? 4) Se [S]=10 uM e [I] =2 mM, qual é a frago de moléculas de enzima ligadas a0 substrato? E com 0 inibidor? ©) Se [S]=30 wM, qual é a fragdo de moléculas de enzima que estilo ligadas com © substrato na presenga e na auséncia de 2 mM de inibidor? Compare esta razfio com a razdo entre as velocidades nas mesmas condigdes. C Metabolismo Fermentagao alcoslica Em aulas anteriores vimos como a hidrélise de ATP formando ADP e fosfato inorginico libera uma grande quantidade de energia (Figura 11) que sera utilizada para promover processos celulares que requerem o fornecimento de energia. Estes proceso podem ser: i) contra¢o muscular ¢ movimentos celulares, ii) transporte ativo de ions e moléculas através da membrana, iii) sintese de aminodcidos, nucleotideos, proteinas, DNA e outros compostos necessérios & célula, Como exemplo de transporte ativo, lembrem-se daquele promovido pela bomba de Nat/K+ para a manutengao do gradiente iénico através da membrana plasmética (aulas anteriores). 22AG? = —30.5 kj.mol* | Adenina HO OH ATP = Adenosina 5'-trifosfato Figura 11, Reagdo de hidrélise de ATP formando ADP e fosfato inorganico (Pi). A variagdo de energia livre nas condigdes padrio (AG?) esté indicada, Esta reago possui um AG ainda mais negativo nas condigdes celulares devido as concentragdes fora do equilibrio de ADP e ATP (veja a equago 3, pag. 10)!! Estrutura dos compostos fosforilados ATP, ADP ¢ AMP. metabolismo celular é voltado para dois aspectos fundamentais: de ATP para fornecer energia para os processos celulares ¢ ii) sintese de intermediarios de biossintese (4c. graxos, lipideos, horménios, aminodcidos, nucleotideos, etc). O metabolismo degradativo é chamado de eatabolismo, enquanto que o metabolismo biosintético ¢ conhecido como anabolismo. Organismos que obtém energia livre a partir da luz do sol séo chamados de fototropicos, enquanto que produgao 23orgenismos que obtém energia livre através da oxidago de moléculas (exemplo agiicares) so chamados de quimiotrépicos. Calulas clivam e oxidam moléculas glicose para produzir energia na forma de moléculas de ATP e intermediérios para as reagées de biossintese. A principal via para obtencdo de ATP é o metabolismo de glicose que se inicia através da quebra da glicose pela via glicolitica, na qual uma molécula de glicose é cli em duas moléculas de piruvato (4cido pirtvico) com a concomitante formagio de duas moléculas de ATP. A descoberta da via glicolitica (ou glicélise) esté intimamente relacionada ao estudo da fermentagio aledoliea promovida por leveduras. De fato, uma parte da Dioquimica tal qual conhecemos hoje originou-se a partir do estudo da fermentagao alcoélica durante o final do século XIX e a primeira metade do século XX. Nessa época, sabia-se que leveduras eram capazes de fermentar aglicar para produzir etanol (Figura 12), € percebeu-se que tanto o extrato de levedura como as células vivas possufam a mesma atividade. Uma fragdo do extrato de leveduras que era nio dializavel e sensfvel 4 temperatura foi chamada de zymase, enquanto que outra frago que era dializavel e insensivel & temperatura foi chamada de cozymase. Mais tarde descobriu-se que zymase e cozymase eram, respectivamente, uma mistura de enzimas € de co-fatores como NAD", ATP, ADP ¢ ions metalicos. Pesquisas realizadas para compreender este fendmeno acabaram conduzindo & descoberta da sequéncia de reagdes de envolvidas na quebra anaerdbica de glicose (hexose; agiicar de 6 carbonos) em etanol e gas carbonico, ¢ a identificagao isolamento das enzimas que catalisam estas reagdes, Estes estudos, realizados simultancamente tanto em leveduras como em extratos de misculo, mostraram que a glicdlise ¢ uma via comum a todos os organismos, de procariotos 4s nossas células, humanas. ‘A glicdlise quebra duas moléculas de glicose (uma hexose) em duas moléculas de piruvato (Acido pirivico). O catabolismo anaerébico do piruvato em células de levedura leva & formagao de etanol, enquanto que em células musculares leva & formagao de dcido litico (Figura 13). O Acido latico é formado no misculo quando a quantidade de oxigénio disponivel é insuficiente para promover o metabolismo aerdbico (por exemplo, uma situagdo de exercicio fisico intenso). O Acido lético formado no misculo pode ser convertido novamente em glicose nas células do figado pelo chamado “ciclo de Cori”. A sequéncia de reagdes enzimiticas da via glicolitica tal como a conhecemos hoje pode ser observada na Figura 14. 24hexose ce—c—c—c—c—cCc c—c—Cc c—c—c triose triose CH—CH,—OH Co, CO, CH.—CH—OH Figura 12. Destino dos étomos de carbono da glicose durante a fermentago em leveduras. Baseado em Bamett (2003) Yeast 20: 509-543. coor co \ MUSCLE CH, YEAST pyruvie acid elaine prwae deyrogenas deearbocise Mion ar W coon H dlechot H 1 NAD" coe doiyirogenase | CHOH co. > ion 1 | Napien = MNADS | chy Cy ch lactic acid acetakdehyde ethanol Figura 13. Catabolismo do piruvato a etanol (levedura) ou dcido Latico no miisculo em condigdes anaerébicas. Retirado de Barnett (2003) Yeast 20: 509-543. 25GLICOLISE ciicose ge Glicose 6-foefate 1 prutose G-foszato Ko bildvoxiacetons __s Gliceraidetde gostato, |< S-fostato I 4,3 Bisfestoglicerate ao Figura 14, Sequéncia de reagdes que compdem a glicélise ¢ a fermentagdo léctica, 26Todas as reagdes ocorrem no citosol das células eucariéticas. A glicose ni atravessa a membrana celular, entra na célula com auxilio de uma proteina carreadora especifica. Imediatamente, é possivel notar que: i) a glicélise envolve duas etapas de fosforilagdo por ATP, formando ADP e fosfato inorganico (Pi); ii) cada molécula de glicose contendo 6 atomos de carbono é convertida em duas moléculas de acido pirdvico, mais oxidado; iii) 0 processo global envolve a formagdo de 4 moléculas de ATP, ou seja, produgio liquida de duas moléculas de ATP; iv) ocorre uma reagio de oxido-redugdo quando gliceraldeido-3-fosfato é convertido em 1,3-bifosfoglicerato, 0s elétrons so transferidos para a coenzima NAD+ formando NADH. ‘Vamos analisar estas reagdes em mais detalhe. Reagdo 1: Fosforilagao de glicose por ATP formando glicose-6-fosfato ¢ ADP. Essa reagdio ¢ catalisada pela hexoquinase. bhexoguinase Figura 15. Reagio de fosforilagio da glicose por ATP formando glicose-6-fosfato e ADP. Essa reagiio é catalisada pela hexoquinase. A variago de energia livre -16.7 KJ.mol". £ interessante notar que jé no inicio do século XX era sabido que glicose-6- fosfato (hexose fosfato) nfo era fermentada ou hidrolisada por leveduras. A explicagdo para essa observacao é que as células nao possuem proteinas de membrana transportadores de glicose-6-fosfato (ou frutose 1,6 bifosfato). Portanto, o agticar fosforilado é incapaz de entrar ou sair da célula.! ‘Acenzima que catalisa esta reagdo é chamada hexoquinase. Quinases so enzimas que catalisam a adi¢o de um grupo fosforil do ATP para outra molécula. ‘A reagio de fosforilagdo da glicose formando glicose-6-fosfato ilustra um dos aspectos principais do metabolismo: reages endergénicas (que requerem fomecimento de energia livre para ocorrer) sfo tornadas espontineas através do acoplamento com outra reago altamente exerg6nica (que libera uma grande Note que a célula possui transportadores de glicose (exemplo GLUT1, GLUT2, ete). Estes transportadores so especificos para glicose. 27quantidade de energia livre). A reago entre glicose e fosfato inorginico (PO;*) formando glicose-6-fosfato consome uma grande quantidade de energia e no ocorreria caso no fosse acoplada a reagiio de hidrolise de ATP. Glicose + P; > glicose-6-fosfato + HxO AG? = + 13.8 kJ.mol! ATP + HO > ADP + P; AG? = - 30.5 kJ.mol™ Glicose + ATP > glicose-6-fosfato + ADP AG°= - 16.7 kJ.mol" Evidentemente estas duas reagées nfo ocorrem isoladamente em dgua, mas uma enzima, a hexoquinase aproxima os reagentes de propicia um ambiente adequado para a reagdo ocorrer. Da mesma forma, a formagao de ATP somente ¢ possivel porque esta acoplada a outra reagdo mais exerg6nica (ver abaixo): Fosfoenolpiruvato + HO > piruvato + P; AG°=- 61.9 kJ.mol! ADP +P, > ATP +H,0 AG? = + 30.5 kJ.mol" Fosfoenolpiruvato + ADP > ATP + piruvato AG°=-31.4kJ.mol! Logicamente que se as reagdes de hidrélise de fosfoenolpiruvato ¢ fosforilagao de ATP ocorressem isoladamente em 4gua uma no influenciaria a outra, A enzima piruvato kinase liga fosfoenolpiruvato e ADP no seu sitio ativo proporcionando condigdes para que a reago acoplada ocorra. Reagao 2. Isomerizagaio da glicose-6-fosfato em frutose-6-fosfato, catalisada pela enzima fosfoglico isomerase (Figura 16). a eo enon Figura 16. Reagio de isomerizagio de glicose-6-fofato, uma aldose, em frutose-6- fosfato, uma cetose. Essa reagiio é catalisada pela enzima phosphohexose isomerase. A variago de energia livre envolvida ¢ AG’ = +1.7 kJ.mol", o que indica que a reagdio € reversivel. Reacdo 3. Fosforilagao da frutose-6-fosfato por ATP formando frutose 1,6 bifosfato. Essa reagio é catalisada pela enzima fosfofrutoquinase 1 (PFK1, do inglés phosphofructo kinase). 28H °. *0,P0- on oon *0p0 On " Ho: + ATP ———= . + ADP roy S| oH Fos? H frotse-6-fsfato frutose--bifosfnto Figura 17, Reagdo de fosforilagao da frutose-6-fosfato catalisada pela enzima fosfoftutoquinase 1 (PFK1) com o consumo de uma molécula de ATP. A variagao de energia livre envolvida é AG® = -14.2 kJ.mol". A variagio de energia livre envolvida na reagao de fosforilaglo de frutose-6- fosfato catalisada pela fosfofrutoquinase-I é altamente negativa, indicando que esta é uma reagdo praticamente irreversivel. ReagSes irreversiveis costumam ser pontos de regulagio no metabolismo. A fosfofrutoquinse-1 é uma enzima alostérica e esta sujeita a regulagao a partir de uma série de fatores alostericos como ATP/ADP e fratose-2,6-bifosfato. A figura 18 mostra a estrutura da PFK1 em complexo com os produtos da reagio. A estrutura consiste de duas cadeias polipeptidicas cada qual contendo um sitio ativo e um sitio para ligago do efetor alostérico ADP. Figura 18. Estrutura tridimensional da PFK1 (PDB PFK1) em complexo com os produtos da reagdo, frutose 1,6 bifosfato ¢ ADP no sitio ativo, ¢ o ativador alosterico ADP. Esta estrutura mostra duas subunidades da enzima, que é tetramérica. Reagio 4. A quarta reagao corresponde & clivagem da frutose 1,6 bifosfato em dois compostos de 3 dtomos de carbono: gliceraldeido 3-fosfato e di-hidroxi-acetona fosfato (Figura 19): 29CH.OPO,? 4 ° H,0PO52 aldolase . neo 20,POH, oH HOHE sliceraldeido 3-fosfato dihidroxiacetona fosfato Figura 19, Reagdo de clivagem da frutose 1,6 bifosfato em dois compostos de 3 tomos de carbono, gliceraldeido 3-fosfato e dihidroxiacetona-fosfato. Essa reagio & catalisada pela enzima aldolase. A variagio de energia livre envolvida é AG” = +23.8 WJ.mol". “Apesar de que a variagdo de energia livre envolvida ¢ positiva, nas condigdes, celulares os produtos da reacio so rapidamente consumidos 0 que faz com que 0 AG da reagio seja menor e ela tome-se praticamente reversivel. Apenas 0 gliceraldeido-3- fosfato seré utilizado para as proximas etapas da glic6lise, Com a finalidade de nfio perder um composto de 3 carbonos, as células produzem uma isomerase (triose- fosfato isomerase — TPI ou TIM), que é capaz de catalisar a reagdio de isomerizagdo de uma cetose (dihidroxiacetona fosfato) em uma aldose (gliceraldeido-3-fosfato) (Figura 20): 4 oO CH_OPO;? triose-fosfato isomerase HOH,’ ‘0 20,POHs! ‘OH gliceraldeido 3-fosfato dihidroxiacetona fosfato Figura 20, Reagio de isomerizagio entre gliceraldeido-3-fosfato e dihidroxi-acetona- fosfato. A variagdo de energia livre envolvida é AG’ = +7.5 kJ.mol'. Apesar de que 0 AG° da reagdo é positivo, nas condigdes celulares esta reagao também ¢ praticamente reversivel. Esta etapa conclui a conversdo de uma molécula de glicose em duas moléculas de gliceraldeido-3-fosfato, um composto de 3 étomos de carbono ¢ mais oxidado do que a glicose. Para tanto foi necessério a hidrdlise de duas moléculas de ATP formando ADP. As préximas etapas envolvem a oxidagao de gliceraldeido-3-fosfato em piruvato, um dcido carboxilico e portanto um composto mais oxidado. A conversao de gliceraldeido-3-fosfato envolverd perda de elétrons (oxidagdo) e a formagdo de duas moléculas de ATP (quatro moléculas no computo geral). Reagdo 5. A reagio de oxidagdo do gliceraldeido-3-fosfato formando 1,3-bifosfo- glicerato (1,3-BPG) é catalisada pela gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase. Esta reagio depende da presenca de uma coenzima, NAD”. Historicamente, NAD* foi 30chamado de co-fermento ou co-enzima. O papel do NAD como carreador de hidrogénio foi sugerido em tomo de 1920, mas a natureza quimica da coenzima somente foi elucidada nos anos 30, NAD (Figura 21) é um dinucleotideo de nicotinamida e adenina. Ele funciona como um carreador de étomos de hidrogénio em uma ampla série de reagdes de oxido-redugdo ao aceitar um ion hidreto (H’; um proton e 2 elétrons). NAD e NADH sao solitveis, e podem mover-se de uma enzima para outra. Reages de oxido-redugo: Figura 21. Estrutura da coenzima nicotinamida adenina dinucleotide (NAD) nas formas oxidada (NAD) e reduzida (NADH). Um grande mimero de enzimas utiliza NAD como co-enzima carreadora de elétrons, catalisando reagdes nas quais NAD aceita um ion H’ do substrato (oxidagao) ou doa um on HT ao substrato (redugdo). Estas enzimas so chamadas de oxidoredutases ou desidrogenases. A gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase wiiliza a coenzima NAD" para receber um ion H do gliceraldeido-3-fosfato que é oxidado a 3- fosfoglicerato formando NADH. O dominio responsivel por ligar NAD+ ou NADH é chamado de Rossmann fold. A coenzima NAD (e NADP) é fracamente associada & enzima e pode difundir-se de uma enzima para a outra funcionando como um composto carreador de elétrons solavel. O NADH formado como resultado da ago da gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase difunde-se até encontrar a alcool desidrogenase que promoverd a redugdo de acetaldeido a etanol durante a fermentagao alcoslica: gliceraldefdo-3-fosfato + NAD* 3-fosfoglicerato + NADH + H* acetaldeido + NADH + H* etanol + NAD* A reagiio catalisada pela gliceraldefdo-3-fosfato desidrogenase pode ser compreendida como a soma de dois processos (Figura 22): 31‘Horost + HPO ~~ + mo ‘enor # " 0005 Figura 22. Reagio de oxidagdo e adicao de ortofosfato catalisada pela gliceraldeido- 3-fosfato desidrogenase. Reacdo 6. A proxima reagdo envolve a transferéncia de um grupo fosforil do 1,3- bifosfoglicerato (1,3 BPG) para ADP formando ATP e 3-fosfoglicerato, Essa reagdo & catalisada pela enzima fosfoglicerato quinase (Figura 23). ©. OPO? °. o fosfoglicerato quinase +ADPOO~— + ATP 4 H HO’ HO CH,OPO3* ‘CHOPO3? 13 bifosfoglicerato 3-fosfoglicerato Figura 23. Reagio catalisada pela fosfoglicerato quinase. A variagdo de energia livre dessa reagio nas condigdes padrio é AG’ = -18.8 kcal.mol", no entanto nas condigdes celulares a reacdo é reversivel com AG = + 1.3 keal.mol". Reagées 7 a 9: As proximas reagies envolverio a conversio de 3-fosfoglicerato a fosfoenolpiruvato, um composto com alto potencial de transferéncia de um grupo fosforil, ¢ finalmente a piruvato com a concomitante formago de uma molécula de ATP (Figura 24): 32fosfoglicerato mutase H HO" “20,PO' ‘CH,OPO,? ‘CH.OH 3-fosfoglicerato 2-fosfoglicerato H,0 °. oO H —— 20,0 \ enolase ‘CH.OH -20,PO" ‘CH, Alosfoglicerato fosfoenolpiruvato oe ATP °. o 20,70 piruvato quinase o ‘Hy piruvato Figura 24. Reagdes de isomerizagdo de 3-fosfoglicerato a 2-fosfoglicerato (AG’ = +4.6 kI.mol"); de desidratagdo de 2-fosfoglicerato formando uma dupla ligagdo e 0 composto fosfoenolpiruvato (AG® = +1.7 kJ.mol"); e de transferéncia de um grupo fosforil do fosfoenolpiruvato ao ADP formando ATP e piruvato (AG? =-31.4 kI.mol” ). fosfoenolpiruvato E interessante notar que a reag&o de transferéncia do grupo fosforil do fosfoenolpiruvato ao ADP é extremamente favoravel. Uma explicagao para essa observagiio é que a forma enélica do piruvato é altamente instavel e converte-se espontaneamente para a forma ceténica, piruvato. A reagio completa da quebra de glicose em duas moléculas de piruvato é: Glicose + 2Pi + 2ADP + 2NAD* 2piruvato + 2ATP + 2NADH + 2H + 2H,0 Esta reagdo envolve uma variagao de energia livre da ordem de AG? = -73.1 KJ.mot'", e resulta na formago de duas moléculas de ATP e na redugio de duas moléculas de NAD". Esse processo poderia seguir indefinidamente nio fosse 0 fato de que a disponibilidade de NAD* na célula ¢ finita. Conforme ja discutido acima, em condigdes anaerdbicas, o piruvato é reduzido a lactato (células musculares) ou a etanol (levedura) regenerando NAD’. Esse processo & conhecido como fermentagao (Figura 25): 33