SCREENING PARA NUEVOS PRODUCTOS DESDE MICROORGANISMOS:

SISTEMAS DE ENSAYO

Los sistemas de ensayo son procedimientos que se

utilizan para la selección de un microorganismo o de un
determinado metabolito microbiano de interés.

Se conocen diferentes sistemas de ensayo, algunos de

ellos se describe a continuación.

SCREEN ANTIBACTERIAL
Es realizado comúnmente en ensayos de difusión en agar.
Método que para antibióticos es una prueba sensible,
reproducible, y simple de operar.

PROCEDIMIENTO:

1. Disponer de un organismo de prueba: staphylococcus

aureus ATCC 6538P en agar nutritivo inclinado.
2. Sembrarlo en un caldo nutriente o caldo tripticasa
soya.
3. Incubar toda la noche a 37ºC con aireación.
4. Diluir el cultivo en el mismo medio hasta una
densidad óptica en 660 nm de 0.3 en
espectrofotómetro. Usar 1ml de esta dilución por
100 ml de agar ensayo.
5. Enfriar agar nutritivo a 45-50ºC e inocularle el
Staphylococcus diluído.
6. Mezclar y vertirlo en las placas Petri.
7. Colocar las muestras sobre papel de filtro en
discos (0.25-0.5 pulgadas) y éstas sobre el agar
contenida en la placa sembrada.
8. Incubar las placas toda la noche a 37ºC.
9. Anotar los diámetros de zonas claras que rodean a
las muestras y antibióticos control para determinar
qué muestras poseen actividad.

SCREEN ANTICOCCIDIAL

Se utiliza en la búsqueda de coccidiostatos que se

agregan en la alimentación de aves, ovejas, para
combatir la coccidiosis. El problema es obtener
grandes cantidades del compuesto puro.

PROCEDIMIENTO:
I. PREPARACIÓN DE CULTIVO PRIMARIO DE CÉLULAS DE
RIÑÓN DE POLLO:
 1. Obtener de los riñones de pollo de 8 días
muertos por dislocación cervical.
2. Colocar los riñones en PBS frío en placa Petri.
3. Decantar el PBS y desmenuzar con tijeras los
riñones.
4. Transferir lo desmenuzado a un matraz con 25 ml
PBS y con una barra de agitación magnética.
5. Agitar lentamente por varios minutos.
6. Decantar el PBS.
7. Añadir 20 ml al 0.25% de tripsina y mezclar
lentamente a temperatura ambiente.
8. Dejar sedimentar las células y decantar el
sobrenadante hacia un tubo de centrifuga de 50
ml hasta que pequeños racimos de células
empiezen a aparecer.
9. Guardar el tubo en hielo.
10. Repetir el procedimiento de tripsinación y
decantar el sobrenadante en un segundo tubo, y
guardar en hielo.
11. Repetir por una vez más la tripsinación y el
decantado de sobrenadante guardarlo en un
tercer tubo y en hielo.
12. Compactar las células por centrifugación a
1000 g por 10 minutos.
13. Decantar y añadir 20 ml de medio de
crecimiento 199 a cada tubo de centrífuga.
14. Voltear suavemente hasta que pellets de
células sean resuspendidas.
15. Colocar una muestra de suspensión celular en
un hemacitometro y determinar el número
celular.
16. Añadir suficiente medio 199 a la suspensión
celular hasta alcanzar 105 cel/ml.
17. Colocar 1 ml dentro de cada pozo de una placa
de 24 pozos ó 2 ml a cada uno para una placa
de 12 pozos.
18. Rotar suavemente cada placa para distribuir
uniformemente las células.
19. Incubar las placas con 5% CO2 y 95% aire a
41ºC.
20. Observar a las 48 horas de incubación 40-50%
en crecimiento. Estas células están listas para
ser inoculadas con esporozoitos y evaluar las
muestras.

II. PREPARACIÓN DE OOCYSTOS:

Los oocystos pueden ser solicitados o preparados a
partir de la ceca de pollos infectados.
1. Colocar los contenidos de las bolsas cecal que
han sido removidas de aves sacrificados en 500
ml de agua destilada y homogenizar cada 5
minutos.
 2. Añadir el homogenizado a 2.5 L de solución de
pepsina (0.5%w/v en agua destilada) pH2.0 y
colocar en baño maría a 39ºC por cada 4 a 5
horas.
3. Remover desde el baño de agua; diluir en un
volumen grande de agua destilada. Ajustar el pH
a 7.5 y dejarlos en posición vertical toda la
noche.
4. Decantar el sobrenadante y lavar los oocistos
tres veces por centrifugación repetida en agua
destilada.
5. Resuspender los oocistos en 1 % desolución de
dicromato de potasio y colocarlo en un agitador
a TºAb. Por 48 horas para esporular.
6. Centrifugar los oocistos esporulados y lavar
los pellets de oocistos por lo menos 4 veces
cada uno con 400 ml de agua destilada.
7. Resuspender el pellets en 20 ml de clorox 5%,
concentración de casa, y sostenerlo en baño
maría por 20 minutos.
8. Añadir 80ml de agua destilada esteril y lavar 4
veces por centrifugación.
9. Resuspender el pellet después del lavado final
en 100 ml de PBS estéril. Estos oocistos
lavados pueden ser mantenidos a 4ºC por lo
menos 2 meses.

III.PREPARACIÓN DE ESPOROZOÍTOS:

1. Colocar 5 a 10 ml del stock de oocistos

esporulados de Eimeria tenella estériles en un
tubo conteniendo 50 perlas de vidrio de 2 mm
cada uno.
2. Añadir PBS estéril para cubrir completamente
las perlas de vidrio.
3. Romper mecánicamente los oocistos en un
agitador rotatorio por 20 a 25 minutos.
4. Transferir la suspensión rupturada en un tubo
estéril y centrifugar por 10 minutos a 500x g.
5. Decantar y resuspender el pellet en 10 ml de
una solución 5 % de desoxicolato de sodio y
0.25% tripsina preparado con solución de Ringer
de sangre fría.
6. Voltear para resuspender el pellet y colocarlo
en un baño maría a 41ºC por 1.5 horas.
7. Centrifugar los esporozoitos desenquistados
frescamente por 10 minutos a 500x g.
8. Lavar una vez con PBS estéril y añadir 15 ml de
medio 199.
9. Voltear para resuspender los esporozoitos.
10. Contar la suspensión de esporozoitos con un
hematocímetro y diluir con medio 199 para
obtener 5x104 esporozoítos por ml.
IV. INFECCIÖN DEL CULTIVO DE CÉLULAS DE RIÑON DE POLLO.

1. Remover el medio desde donde las celulas de

riñon se han incubado a 41ºC por 48 horas.
2. Añadir 2 ml de la suspensión medio 199-
esporozoito fresca preparada (5x104 esporozoitos
por ml) acada pozo.
3. Dejar un pozo central sin esporozoitos.
4. Asépticamente añadir 0.1 ml de muestra de
caldo de fermentación diluido por lo menos 1:50
ó 1:100 en PBS estéril a cada pozo de prueba.
5. Dejar por 10 meses dos pozos en cada placa como
controles positivo y negativo.
6. Si la toxicidad para las células cultivada es
notada en 1:50 ó 1 : 100, prepare diluciones
adicionales dos veces en PBS y añada 0.1 ml de
éste.
7. Añada 0.1 ml de una solución MONENSIN (SIGMA
M2152) al pozo control (+) (concentración
final: 0.01 ug/ml) y 0.1 ml de PBS al pozo
(-).
8. Reincubar las placas a 41ºc por 4 días en una
atmósfera de 5% CO2 y 95% aire.

RESULTADO -INTERPRETACION: Después de 4 días examinar

las placas con un microscopio a 200X para ver el
desarrollo de lparasito o citotoxicidad de la droga.
La actividad es determinada por la presencia o ausencia
de merozoítos y esquizontes de segunda generación
asexual comparado a la infección en monocapas de
control negativo.

SCREEN ANTICÁNCER

Es aplicado para la búsqueda de varios productos

naturales semejantes al de los agentes
quimioterapeúticos contra el cáncer que produce daño al
ADN dentro de las células tumorales.

Los sistemas de detección que emplea puede ser:

a. Ensayo de inducción de profagos lambda: en donde el
daño del ADN libera profagos lambda desde su estado
latente reprimido en una bacteria E. coli lisógena,
detectándose luego estas partículas virales
completas en una placa de ensayo.
b. Ensayo de inducción bioquímica (BIA): empleado
mucho en el screening de caldos de cultivo
microbianos para agentes anticáncer. Es simple,
sensible y rápido. La versión de Placa de agar
 semicuantitativa es la que ofrece la versatilidad
requerida.

PROCEDIMIENTO:

1. Se elige como organismo de ensayo el E. coli

BR5132 (ATCC 33312). Este es una cepa indicadora
lambda lisogénica. En esta bacteria es donde está
el profago lambda que lleva el gen lac Z de
E.coli fusionado a un sitio adyacente a su mano
izquierda del promotor bajo el control del represor
lambda deficiente en genes requerido para el
desarrollo del fago. Mutaciones adicionales
afectan funciones de reparación del ADN (uvrB) y
de integridad de la membrana externa (envA) lo
cual hace mejorar la sensibilidad del ensayo para
agentes que dañan el ADN.
2. Preparar por lo menos un día antes del ensayo agar
sobrebase, colocando 170 ml de agar AMP-LBE
dentro de cada placa en un nivel superficial.
3. Raspar la superficie de una suspensión congelada
de la cepa de E.coli con un aza bacteriológica e
inocular 20 ml de medio LBE en un Erlenmeyer de
250 ml. Incubar la noche entera a 37ºC con
agitación (250rpm).
4. Diluir este cultivo dentro de un caldo LBE fresco
a una densidad óptica de 0.05 con 660 nm. El
volumen del caldo debe ser calculado asumiendo 35
ml por placa de ensayo.
5. Incubar este nuevo cultivo a 37ºC con agitación
suave y cuando una densidad óptica de 0,4 con 600
nm a sido alcanzado (usualmente después de
alrededor de 2 – 2,5 horas) inmediatamente
sedimentar las células por centrifugación en el
frío (4ºC) a 300X g por 10 a 15 min.
6. Descartar el sobrenadante, y suavemente
resuspender el pellet en 1/25 de volumen de agua
destilada estéril fría (4ºC). Ésta suspensión de
células debe ser refrigerada inmediatamente a 4ºC
y puede ser usada sobre un periodo de 4 días como
el inoculo BIA.
7. Para cada placa de ensayo añadir 1,4 ml de
inóculo BIA para 35 ml de agar suave derretido
que a sido enfriado a 45-47ºC.
8. Mezclar suavemente y verter inmediatamente el agar
blando inoculado uniformemente sobre una capa base
precalentada (37ºC).
9. Colocar la placa a TºAb. para que la sobrecapa
solidifique.
10. Aplicar 20 ul de muestras del caldo de
fermentación microbiano sobre la superficie del
agar.
11. Incubar las placas a 37ºC por 3 horas.
12. Aplicar una mezcla de substrato cromogénico a cada
placa para detectar inducción de la enzima
(profago) como sigue:

a. para cada placa disolver 84 mg de azul rápido

RR y 14 mg de 6-Bromo-2-NAPHTHYL-beta-D-
Galactopiranósido en 2 ml de Sulfóxido dimetil
(trituración suave con una pipeta puede ser
necesario).
b. Añadir 35 ml de agar suave derretido que a sido
enfriado a 45-47ºC, y verter la solución sobre
la superficie de la placa BIA.
c. Dejar en posición vertical 10-15 minutos a
TºAb. y entonces observar la placa para el
desarrollo del color.

INTERPRETACION DE RESULTADOS:

1. La aparición de una zona rojo-violeta por actividad

enzimática alrededor del sitio de aplicación de
muestra sugiere la presencia de un compuesto (S)
iniciador del daño en el ADN.
2. Una estimación de la cantidad relativa de actividad
en diferentes muestras puede ser hecho sobre la base
de la intensidad de color de la zona de inducción y
en alguna medida en función del tamaño de extensión
de la zona.
3. En concentraciones muy altas de material activo una
zona clara tóxica rodeado por un anillo coloreado de
inducción es usualmente observado.

SCREEN DE INHIBIDORES DE B-LACTAMASA

Las B-lactamasas son enzimas capaces de escindir

hidrolíticamente la amida cíclica enlazado al anillo B-
lactamico, un aspecto estructural común de estos
antibióticos.

La acción de la B-lactamasa se evita :

a. Haciendo modificación estructural: así el
antibiótico se hace más resistente a la escisión.
b. Usando inhibidores de B-lactamasa en combinación con
antibióticos B-lactámicos susceptibles.

Existen una variedad de inhibidores de origen natural,

sintético y semisintético.

La prueba permite un Screen de caldos de fermentación

para inhibidores de B lactamasa TEM-2, una enzima
clinicamente importante producida por una variedad de
bacterias gram (-) y codificad por el plásmido RP1 de
resistencia.

PROCEDIMIENTO:
I. PREPARACION DE B-LACTAMASA TEM-2:

1. Cultivar E. coli con plásmido RP1 a fase

exponencial con agitación a 37ºC en 1% Medium
CY.
2. Cosechar la bacteria por centrifugación a 5000X
g por 10 min.
3. Lavar por resuspensión una vez en 0,1M del
buffer NaH2PO4-K2HPO4 (pH7), y centrifugar
nuevamente (5000 X g por 10 min). Resuspender
los pellets de células lavado en 1/20 de
volumen de buffer pH 7 a 4ºC y romperlos por
sonicación.
4. Remover los restos celulares y las células
intactas sobrevivientes de la suspensión de
células sonicadas por centrifugación a 10000 X
g por 30 min a 4ºC. Esta preparación de células
crudas libre de B-lactamasa TEM-2 puede ser
mantenido por periodos limitados a 4ºC pero
puede ser almacenado por periodos largos como
un sólido congelado desecado a 4 ºC.

II. ENSAYO DE LA ACTIVIDAD DE B-LACTAMASA:

Este ensayo hace uso de la nitrocefina,

cefalosporina cromogénica disponible
comercialmente, que cambia desde amarillo a rojo
en la escisión del anillo B-lactámico. Este
cambio de color puede ser convenientemente
monitoreado en el espectrofotómetro a 486 nm. El
ensayo que se describe es una versión
miniaturizada y automatizada el cual puede ser
realizado con equipo estándar usado para
inmunoensayo de enzimas ligada.

1. Servir muestras por duplicado (superior a 10

ul por pozo) desde los caldos de fermentación
microbiano directamente hacia 96 pozos de la
placa de microtitulación.
2. Añadir 100 ul de enzima diluída adecuadamente
hacia uno de cada par de muestras y 100 ul de
buffer fosfato 0,05 M pH7 hacia el otro. La
solución stock de enzima debe ser diluída tal
que una incubación de 30 min con substrato a
37ºC dá una densidad óptica de 0,5-0,7 a 490
nm; típicamente esto requiere una dilución más
grande que 104 veces en Buffer.
3. Preincubar la placa de microtitulación a 37ºC
por 15 minutos antes de añadir substrato. Es
 conocido que ciertos inhibidores de B-
lactamasa, tales como acido clavulánico causa
una inhibición progresiva de la actividad de la
enzima y que la incorporación de un paso de
preincubación de enzima con inhibidor
considerablemente incrementa la sensibilidad a
tales compuestos.
4. Después de la preincubación añadir 100 ul de
una solución de 100 ug/ml de Nitrocefina en
0,05M buffer fosfato pH 7 a cada pozo.
5. Incubar las placas por unos 30 min adicionales
y a 37ºC.
6. Detener la reacción dela enzima añadiendo 50 ul
de 0,5M buffer citrato pH3, y leer las placas
en un lector de inmunoensayo de enzima ligada
automatizada, ejemplo : autolector de
microelisa. El aparato automatizado MicroElisa
puede medir una placa entera de 96 pozos en
menos de 1 min., analizar los datos e imprimir
los resultados.

INTERPRETACION DE RESULTADOS:
El propósito de correr una muestra de caldo sin enzima
(muestra control) es para corregir la presencia de
pigmentos interferentes o B lactamasas endógenas que
pueden estar presentes en la fermentación. En la
ausencia de asemejar una corrección, los valores DO más
grandes del control de la enzima relevante puede ser
obtenido. En suma las muestras de caldo corren con y
sin enzima; un control de enzima (100 ul de buffer mas
100 ul de enzima) debe ser rutinariamente incluído en
cada placa.
Después de la incubación con substrato, este control
proveerá el 100% de nivel de actividad.

SCREENING DE PRODUCCIÓN DE BACTERIOCINAS A PARTIR DE

BACTERIAS LÁCTICAS DEL VINO

Las bacterias lácticas llevan a cabo la fermentación

maloláctica (FML) en el vino, que supone la
transformación de ácido málico (dicarboxílico) en ácido
láctico (monocarboxílico). La fermentación maloláctica
es un proceso imprescindible para la obtención de vinos
tintos de calidad, y sobre todo en aquellos que van a
ser sometidos a un proceso de envejecimiento en
barrica. Con la FML se consigue una reducción de la
acidez del vino, así como una mayor estabilidad
microbiológica y complejidad en los aromas del vino.
Las especies directamente relacionadas con la FML de
los vinos son Oenococcus oeni, y en menor medida
Lactobacillus plantarum.

Las bacterias lácticas también pueden provocar

alteraciones de los vinos dando lugar a una pérdida en
la calidad del mismo. Bacterias como Lactobacillus
brevis, Lactobacillus fructivorans y distintas especies
de Pediococcus han sido aisladas en vinos alterados.
Las bacterias acéticas son otros importantes agentes
alterantes de los vinos.

El control de la FML de los vinos es un tema de gran

interés en Enología. En la actualidad éste se lleva a
cabo regulando parámetros fisico-químicos del vino,
tales como la temperatura o el pH, y mediante la
adición del agente antioxidante y antimicrobiano, el
anhídrido sulfuroso. Una práctica cada vez más habitual
en las bodegas es la adición de cultivos bacterianos
seleccionados iniciadores de la FML con el fin de
conseguir un mayor control microbiológico del proceso.
Los cultivos iniciadores de la FML comercializados en
la actualidad están constituidos por cepas de la
especie O. oeni aisladas de vinos y seleccionadas por
conferir las mejores características y por su alta
eficacia fermentativa. A la vista de todas estas
prácticas llevadas a cabo durante la elaboración y
conservación de los vinos, se puede deducir la
potencial importancia que pueden llegar a tener las
bacteriocinas tanto en el control de la FML, como en la
estabilización micobiológica y posterior conservación
de los vinos.

La microflora bacteriana presente en las muestras de

mosto y vino se estudia mediante la siembra en medio
agarMRS en presencia de nistatina para evitar el
crecimiento de levaduras, y cristales de difenilo para
inhibir el crecimiento de hongos. Las placas de agar
MRS inoculadas se incuban a 30ºC en condiciones de
anaerobiosis. Se realizan los recuentos de UFC/ml de la
muestra y se procede al reaislamiento de las colonias
que se estime oportuno.

Se identifica la especie bacteriana mediante pruebas

microbiológicas y mediante PCR con primers específicos
para las especies más frecuentes encontradas en los
vinos (Lb. plantarum y O. oeni). Se procede asimismo a
la identificación de la cepa mediante análisis de
restricción del ADN genómico con la enzima SfiI y
separación de las bandas obtenidas mediante
electroforesis de campos pulsados. Una vez identificada
la especie y el clon, se procede al screening entre los
cultivos puros de las cepas de interés, para encontrar
aquellas que sean productoras de bacteriocinas.

 Bacterias productoras para el screening:

Lactobacillus plantarum
Oenococcus oeni

 Bacterias indicadoras:
Lactobacillus plantarum
Lactobacillus brevis
Lactobacillus fructivorans
Lactobacillus paracasei
Lactobacillus delbruecki
Pediococcus pentosaceus
Pediococcus acidilactici
Leuconostoc mesenteroides
Oenococcus oeni
Bacterias acéticas
Acetobacter aceti
Gluconobacter

Metodología

Detección de la actividad antimicrobiana

Para realizar un screening inicial y evaluar la
producción de actividad inhibidora se utiliza el método
"botón en cesped" con algunas modificaciones (Lewus and
Montville 1991). En placas con Tripticasa-soja-caldo
(Difco) sin glucosa suplementado con extracto de
levadura 0,5% y 1,5% agar (TSAYE), se siembran en forma
de botón las posibles cepas productoras y se incuban en
condiciones anaeróbicas durante toda la noche a 30 ºC.
Se inoculan 40 ml de un cultivo de 24h (en BHI) de la
cepa indicadora en 5 ml de BHI (Difco) con 0,8% de agar
temperado a 45 ºC. Dicho cultivo se añade sobre las
placas de TSAYE agar sembradas con las cepas
productoras y se incuban en condiciones anaeróbicas
durante 48 h a 30º C. La inhibición del crecimiento se
detecta por una zona clara de no crecimiento alrededor
de la cepa productora (halos de inhibición).

Preparación del extracto de bacteriocina

La cepa productora de bacteriocina se deja crecer en
caldo MRS (Oxoid) a 30º C durante 48 h. Mediante
centrifugación a 5 000 rev/ min durante 15 min se
obtienen los extractos crudos. El sobrenadante libre de
células se concentra 10 veces mediante un evaporador
centrífugo a vacío y se guarda a -20º C.
Ensayo de la actividad bacteriocina
Se analiza la actividad antimicrobiana de los extractos
concentrados por el método de difusión en disco
(Ferreira and Gilliand 1988) con algunas
modificaciones. Sobre una placa de agar TSAYE se añaden
5 ml de BHI agar semisólido (0,8% de agar) inoculado
con 40 ml de un cultivo de 24 h del microorganismo
indicador. Se saturan discos de papel estériles (Difco)
con 25 ml del extracto concentrado y se colocan sobre
la superficie recién inoculada de la placa. Las placas
se incuban de 24 a 48 h a 30º C, y después se observa
la presencia de halos de inhibición alrededor de los
discos.

SCREEN ANTICÁNCER

Cepa Ecoli
(con profago lambda y gen lac Z)

Cepa + 20ml medio LBE (caldo)

Incubación a 37°C a 250 rpm (noche)

Dilución a 0,05 D.O. con 660nm

Incubación a 37°C con agitación suave hasta 0,4 D.O con
600nm (2-2,5h)

Sedimentar células a 300g x 10-15’

Descartar sobrenadante y resuspender el pellet en

A.D.E. a 4°C (inóculo BIA = inóculo de ensayo de
inducción bioquímica)

Añadir 1,4 ml de BIA a 35ml de agar suave en placa

Verterlo sobre capa base precalentada a 37°C

Esperar solidifique
 Añadir sobre la superficie 20ul de muestra de caldo
prueba (caldo de fermentación en donde se ha producido
la sustancia que puede tener propiedad
anticancerígena)

Incubar a 37°C x 3h

Aplicar mezcla de substrato cromogénico

(azul rápido RR y 6-Bromo-2-NAPHTHYL-beta-D-
Galactopiranósido disuelto en Sulfóxido dimetil)

Añadir agar suave derretido

Dejar en posición vertical 10 a 15’ a temperatura

ambiente

Observar zona rojo violeta (significa que la sustancia

evaluada a actuado dañando el ADN de la célula
bacteriana haciendo que el gen lac Z que estaba
inactivo en su profago se activara y sintetizara la B
galactosidasa que inmediatamente actúa sobre el beta-
D-Galactopiranósido conllevando al cambio de color de
azul a rojo violeta)

NOTA: Se mencionan a dos métodos para screen

anticáncer: el de ensayo de inducción de profagos
(En el cual la detección de la sustancia
anticáncer se basa en que ésta induce en el ADN de
la célula, por daño, la liberación de los profagos
como fagos líticos) y el de ensayo de inducción
bioquímica “BIA”(En el cual la detección de la
sustancia anticáncer se basa en que ésta induce,
por daño, en el ADN de la célula en el gen lac Z
de su profago para que se produzca beta
galactosidasa ).

SCREEN ANTIBACTERIAL

Organismo prueba

Siembra en caldo
 Organismo en fase logarítmica

Dilución hasta 0,3 de densidad óptica a 660nm

Añadidura de dilución 1ml a 10ml de agar ensayo

Vertido en placa Petri

Colocación de discos de papel filtro con muestra

prueba en bebido y controles estándar antimicrobianos

Incubación

Lectura observando halos

 SCREEN DE INHIBIDORES DE BETA LACTAMASA

FASE I
Cultivo de E. coli con plásmido RP1 en liquido

Incubación a 37°C, agitación

Cultivo en fase logarítmica

Centrifugación

Lavado de sedimento en buffer fosfato por resuspensión

Centrifugación

Lavado y resuspensión

Ruptura de células por sonicación

Centrifugar

Sobrenadante con beta lactamasa (enzima) Células y

restos sin betalactamasa

FASE II

Colocar caldos de fermentación (prueba) en pozo de

placas de microtitulación

Agregar a los pozos enzima diluída y buffer fosfato

Preincubación a 37°C por 15’

Añadir Nitrocefina (sustrato cefalosporina cromogénica

que cambia de amarillo a rojo cuando se escinde anillo
beta lactámico)

Incubación a 37°C por 30 minutos

Detención de reacción enzimática agregando buffer

citrato pH 3

Hacer lectura
 SCREEN DE CEPAS MICROBIANAS PRODUCTORAS DE
BACTERIOCINAS

I. SELECCIÓN DEL MICROBIO PRODUCTOR DE BACTERIOCINA:

Sembrar en placas con agar TSAYE en forma de botón

posibles cepas productoras de bacteriocinas
(método botón en césped modificado)

Incubar en anaerobiosis a 30ºC toda la noche

Añadir sobre la placa un inóculo de cepa indicadora

Incubar en anaerobiosis a 30ºC por 48 horas

Observar zonas claras (halos de inhibición) alrededor

de cepas productoras de bacteriocinas

NOTA: El medio agar TSAYE está compuesto por caldo

tripticasa soya sin glucosa suplementado con extracto
de levadura 0,5% y agar 1,5%.

El inóculo de cepa indicadora se obtiene inoculando 40

ml de un cultivo de cepa indicadora de 24 horas en BHI
en 5 ml de BHI con 0,8% de agar temperado a 45ºC.

II. ENSAYO DE LA ACTIVIDAD BACTERIOCINA:

PREPARACIÓN DEL EXTRACTO DE BACTERIOCINA:

Sembrar en caldo MRS una cepa productora de

bacteriocina

Incubar a 30ºC por 48 horas

 Centrifugar el caldo a 5 000 rpm por 15 min.

Descartar el extracto crudo o sedimento y separar el

sobrenadante (extracto de bacteriocina)

Concentrar el sobrenadante 10 veces mediante

evaporación centrífugo a vacío y guardarlo a -20ºC
hasta su uso posterior.

ENSAYO DE LA ACTIVIDAD BACTERIOCINA:

(Método difusión en disco)

Añadir sobre una placa con agar TSAYE 5 ml de un

preparado de inóculo de un cultivo indicador

Colocar sobre la placa con agar TSAYE inoculada discos

de papel estéril saturado con 25 ul de extracto de
bacteriocina

Incubar la placa a 30ºC por 24 a 48 horas

Observar halos de inhibición alrededor de los discos

NOTA: El preparado de inóculo del cultivo indicador se

prepara añadiendo 5 ml de agar BHI semisólido (agar
0,8%) inoculado con 40 ul de un cultivo indicador de
24 horas .