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TÉCNICAS DE ilAcrÚÓsnco MotEcUtAR

Material didáctico: Módulo 2{lase 6

I.-PLANIFICACIÓN DEL E§TUDIO GENÉTICO

El diagnóstico 8enético es un proceso en el que hay que pasar por diferentes fases: la
historia genética fdeterminación de si se trata de un caso fami]iar, por medio de la
observación de los antecedentesJ, un estudio genético en el que se obtiene información
de
tipa molecular del paciente y su farnili4 y para el que hay que determinar Ia metodologÍa
más adecuada a cada caso, y por último, el consejo genético en el que se interpretan los
datos obtenidos y se informa al paciente.

Para el estudio genéüco, es importante identificar qué técnica es Ia más adecuada para
el
análisis que §e quiere llevar a cabo, porque depende del gen que se analiza o de Ia
informacién que se quiere obtener,

CONSUITAR DIAPOSIfiV A 2 aT z
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2.- REACCIéN EN CADETTADELA pOtrMERá§A (pcR)

Prácticamente todas las muestras que entran en un laboratorio de estudios genéticos

tienen que pasar en algún momento por la técnica de PCR
{reaccién en cadena de Ia
polimerasa).

§e descubrió en 1986 por Kary Mullis, quien recibió el premio Nobel en 1993 por
esta
aportación. Desde entonces la técnica se utiliza en todos los campos de la biología y
ha
sido considerada como la más revolucionaria en los últimos años.

EI análisis de ADN es una herramienta esencial en la investigacién y

diagnósüco, pero con
Ia mayorla de rnétodos la cantidad de ADN obtenida para un determinado parámetro
es
muy baia. El propósito de la PCR es producir un gran número de copias de
un determinado
fragmento del genoma, es decir, obtener una gran cantidad de ADN a partir
de unas pocas
copias. La PCR posibilita la amplificacién de cadenas de ADN de un
amplio rango de
tamaño [hasta 20 kilobases) hasta 1 millón de veces y es extremadamente sensible.

2.1.- Fundamentos y componentes de Ia pCR

La PCR es una técnica de amplificación enzimática in yifro. permite amplificar un

fragmento específico de ADN situado entre dos regiones de secuencia conocida, y consta
de tres pasos:

I De§naturalización del ADN [a 95eCJ: las dos hebras se abren a esta temperatura.
¡ Hibridación de dos cebadores (a 50sC-65sC): en este rango de temperaturas los
cebadores se unen a la hebra de ADN complementaria.

Certificado de Genética Médica ZOl4-2015

Página 1
 rÉcru¡cs or ousxósr¡co MotEcuL,AR
Matedal di!fuho: Mó&1,, 2{lase á

¡ Extensión o elongación de ra pcR

{Tzec}: ra Taq porimerasa se une ar cebador y
empieza a replicar la cadena que se desea
amplificar.
Estos tres pa§o§ o fases conforman un
ciclo que §e repite unas 30 o 40 veces. puesto
que cada cadena que se sinteüza en
el ciclo anterior sirve de molde para el
en cada ciclo se duplican las copias de ADN. siguiente,
Así la cantidad de ADN obtenido crece de
forma que e§ exponencial y pueden conseguirse
al final rlel proceso millones de copias
de un único fragmento de ADN.

CON§UITAR DHPO§ITIYAS 9, 10, tt y t2

irr'":*,l6*tr-i'.§ffiil.$ a.:'¡egE3ñ 'a@I ir'§"?ri.ii{i¿:}.1 #hB.5¡i::.iJ,.:i.

Componentes de Ia pG?'

r ADN molde:

EI primer paso antes de iniciar una pcR

es extraer er ADN que se quiere amprifica¿
normalmente a partir de muestras de sangre
o de parafina. EI protocolo de extracción
y de PCR cambia en funcién del origen de ra
muestra ya que er ADN puede haberse
visto afectado de forma diferente por los
diferentes *"."nir*os de preparación de
muestras.

Mediante técnicas de pcn llegar a detectar una única molécula

¡e¡yede
compleia de ADN' La sensibilidad
en una mezcla
de la PCR varfa dependiendo de la cantidad
molde [tamaño medio de los fragmentos y purezaJ. de ADN
Además, determinadas sustancias
que pueden estar presentes en el
ADN extraldo pueden disminuir Ia eficacia
de la pcR.
La cantidad óptima de ADN morde
de partida para Ia reacción de pcR
es de 10-z00ng.
¡ Cebadores:

Los cebadores son crfticos para ra pcR ya

que proporcionan ra especificidad de
reacción' Asi en función del diseño de Ia
estos cebadores se amplificará una región
dentro der ADN uürizado como morde (normarmente, u otra
en ra materia que nos ocupa, §e
amplificará una región exónica de un gen
reracionado con Ia enfermedad),
La longitud y secuencia de los cebadores
son características esenciales para la reacción
de PcR ya que determinan la eficiencia
de Ia misma. cuando se diseñan los cebadores
{existen programas informáticos especfficos para eilo),
hay que considerar bien Ia
temperatura a la que debe realizarse Ia
hibridación y .rri,r. íos motivo, repetidos que
puedan hibridar de forma incorrecta
con el ADN. También debe evitarse la presencia
de secuencias invertidas que puedan dar Iugar
a ra formación de estructuras

Certificado de Genética Médica ZA]/.-ZALS

Página 2
 rÉcucm oe o¡narósrrco MoLEcULAR
Material ditt#in lYúótlulo 2-Clase 6

secundarias en el cebador, o las secuencias complementarias entre los cebadores que

darlan lugar a dímeros entre ellos.

r Enzirqa laq polimerasa:

Es una enzima termoestable capfrr. de incorporar progresivamente nucleótidos desde

el extremo 3'de un cebador. l,aTaq polimerasa fue ínicialmente aislada de la bacteria
Thermus aqaoticus y es capaz amplificar el DNA a altas ternperaturas (y por tanto no se
desnaturaliza cuando en el ciclo se superan Ios 75sC y 95sC). Actualmente, se usan
polimerasas comerciales y con actividad "hot-starC', cuya acüvación se inicia a
elevadas temperaturas, lo que impide la sfntesis a partir de dlmeros de cebadores, que
se pueden formar a bajas temperahras.

r Otrolcomponentes:

Tampones: cada ADN polimerasa requiere de su tampón especlfico para realizar su

actividad enzimática en condiciones óptimas.

MgClz: la concentración de MgCl influye en Ia productivÍdad y especificidad de la PCR.

Una concentración baia de estos iones produce un bajo rendimiento. Sin embargo, una
concentración elevada produce la formación de productos inespecíficos. La
concentración final en Ia mezcla de reacción debe estar entre 1.5 y s nM

Nucleótidos: componentes básicos del ADN, constituyen las unidades que la Taq
polimerasa va a uülizar para formar la nueva cadena de ADN. La concentración
estándar de los nucleótidos en la reacción es de 200 microM. Los cuatro deben estar a
la misma concentración para evitar errores en la polimerización.

Termocidador: es un equipo que marca las temperaturas en los üempos indicados,

de forma que permite reelizar de forma automática las distinas fases que conforman
Ia reacción de PCR

En una PCR se pasan de unas pocas copias de ADN a millones de copias, que se pueden
visualizar mediante diferentes métodos. Normalmente Ia visualización del ADN
amplificado durante la PCR se realiza mediante electroforesis en gel de agarosa o
electroforesis capilares en acrilamida. En ambos casos, se utiliza la aplicación de una carga
eléctrica para hacer migrar al ADN, cargado negativamente, hacia el polo positivo. En el gel
de agarosa, el ADN, transparente se hace visible mediante un componente que se une al
ADN, el Bromuro de Etidio y en electroforesis capilar se utilizan fluoróforos.

CON§UITAR DIAPOSITM§ 13. 14, 15 y 16:

¡r'r'¡s¡!1:liar¡ $ffiW;r"'1-r*ii{li}rer"} ":ffi irr-lul63tlr-¡ '.§ffif !rr34g**"u ffiffi

Certificado de Genética Médica ZOL4-2015 Página 3

 TECNICAS DE DIAGNÓsflcCI MoI."ECUI.,AR

Mater¡al dktáctico: Módulo 2{lase 6

2.2.-Aplicaciones de la PCR conyencional

{ Amplificagión de microsatélites ISTRs]:

Los microsatélites son regiones del genoma con repeticiones en tándem de secuencias
corta§ fmotivos] de nucleótidos fcag St). Su presencia no es indicativo de enfermedad,
sino que su carácter polimórfico se puede utilizar para considerarlos marcadores
moleculares asociados a un gen. Es decil no es que las repeüciones en sl mismas
impliquen una patologfa, pero sf que pueden ir ligadas o asociadas a un aleto que produce
una enfermedad y por tanto su herencia es similar. Mediante marcadores polimórficos se
pueden etiquetar genes y ver cómo se están heredando dentro de una familia. Se pueden
hacer haplotipos, árboles familiares, etc

Eiemplo f : Distrofia muscular de cinhrras fenfermedad autosómica dominanteJ se sabe )

que el gen responsable está ligado a una región concreta del cromosoma 7q32. Se hizo un
estudio de haplotipos con 7 microsatélites, hnto en el probando, el padre, como en los
hermanos de éste para ver qué cromosoma habla heredado el feto del padre, si el sano o el
asociado a la enfermedad.

Eiemplo 2: síndrome de Prader-willi t15q11-13J* está asociado a una deleción en el

cromosoma de origen paterno, a una disomia uniparental materna o a defectos en el
imprinting del cromosoma 15 paterno. En el caso especificado se determinó mediante
microsatélites que el paciente habfa heredado los dos cromosomas maternos y por tanto
estaba afectado de Ia enfermedad por un efecto de disomÍa uniparental del cromosoma
materno.

CONSUTTAR DIAPOSITIVAS 17, 18 Y 19:

ir-¡¡c",)§:¡,*+r.l tffi rff :1--¡:;r.rr-: tffiffi t:r-li¡¡p13¡,1=ffi
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Jr:

J Mutacionesdinámicas:

Son secuencias cortas repetidas, similares a las anteriores pero para las que, en este caso,
su repetición y/o expansién sí afecta a la expresión o función de algún gen. Son por tánto
repeticiones de nucleótidos en tándem que pueden adquirir un tamaño patológico. Se
denominan dinámicas porque este carácter patológico depende del número de
repeticiones. Hay muchas mutaciones dinámicas descritas tanto en zonas exónicas como
intrónicas. Algunos eiemplos pueden verse en la enfermedad de Hunüngton, ataxias
cerebroespinales, distrofia miotónica, etc, todas ellas debidas a expansiones de tripletes.

caracterfsticas de la inestabilidad de repeticiones de tripletes en tándem:

¡ Número de repeticiones polimórfico en la población,

r Adquieren un tamaño patológico.

Certificado de Genérica Médica Z0L4-ZO1S Página 4

 TECNICAS DE üAGT¡ó§TEO MOLECULAR
Material dkt¡áctiu Mótlulo 2{lase 5

a Inestabilida d intergeneracional
I Fenómeno de anüciPación
a Enfermedades neurológicas

Ejemplo 1: Enfermedad de Huntingon) alelos normales de 6'26

repeüciones/ alelos
más de
intermedios de27-Slrepeticiones/ alelos asociado a la enfermedad de Huntington
suelen realizar
36 repeticiones/ forma iuvenil 60 repeticiones. En este tipo de casos se
de tripletes, al ser
electroforesis capilar, que permite detectar variaciones de repeticiones
patológicas se localizan en
más sensible que la eleetroforesis en agaros¿ Las repeticiones
PCR con unos
el exón 1 del gen que codiñca para la hunüngtina y lo que se hace es una
por elecÚoforesis'
cebadores que flanqueen esa región repeüda y después analizarlo

Ejemptoz: Distrofia miotónica )

alelos normales de5'24 repeticiones/ alelos premutados
alelos
de 35-49 repeticiones/ alelos asociados a DM1 mínima de 5&150 repeticiones/
a DM1 Congénita de
asociados a DM1 Clásica de 100-1000 repeticiones/ alelos asociados
pacientes no se puede
más de 2000 repeticiones. En el caso planteado, en algunos de los
con Ia PCR no se
establecer de forma absoluta uno de los alelos por lo que únicamente
una PCR
puede caracterizar genéücamente al probando. En estos casos se puede hacer
capilar los alelos
flanqueante a la repetición que se está analizando y ver por electroforesis
que están presentes: una segunda PCR, que está especlficamente diseñad,a para amplificar
zonas repetidas. Es la TP-PCR, corno se indica a continuación.

2.3.- Modiñcaciones de la PCR! TP-PCR (triplet repeatprirned PCR)

La Tp.pCR es una modificación de la PCR, específica para el esnrdio de

zonas repetidas' En
sobre la
ella se utiliza un cebador adyacente a la zona repetida y otr0 cebador diseñado
que
repetición [es decir, que su secuencia es homóloga a los tripletes de la expansión],
a un
tiene añadida una cola que no hibrida con el ADN molde. Esta cola es complementaria
tercer cebador'

Dado que el cebador homólogo a la repetición tiene muchos posibles sitios

donde hibridar,
y para cada una
se va a ir uniendo en todas las posibles posiciones dentro de la expansión,
de e§tas posiciones, con el tercer cebador vamos a obtener amplificados de longitud
variable.

Así pues, en la TP-PCR no se obtiene un solo pico, sino que se obtiene un

pico por cada una
se
de las repeticiones de Ia expansión y en los pacientes que tengan alelos expandidos
observará un efecto sierra, de muchos picos, en la electroforesis capilar'

CON§UITAR DIAPOSITIVAS ZO, 2I'22Y 232

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Página 5
Certificado de Genética Médica 20L+'2015
 ¡Ec¡lrces or urc¡*ós¡co MoTECUTAR
Materialdkáctir: Módulo 2-Clase 6

3.. PCRA TIEMPO NEAI

La PCR a tiempo real es también una modificación de la PCR convencional,

que permite
tanto Ia deteccién como Ia cuantifiecién de mRNA RNAy DNÁo la identiñcación
de
mutaciones puntuales ISNPsJ, el estudio de Ia expresión génica y Ia diferenciación
alélica.
3.1.- Fundamentos de Ia pCR a tiempo real

La PCR a tiempo real simplifica la técnica de PCR puesto que no es necesario

realizar una
electroforesis posterior ya que es en el propio termociclador donde se detecta tiempo
a
real la canüdad de amplificado existente. Por tanto se minimizan los riesgos de la técnica,
como por ejemplo las ccntaminaciones.

Fases de la PCR a tiempo real:

r Exponencial: en cada ciclo se duplica Ia cantidad inicial del ADN diana (asumiendo
un 100% de eñciencÍal
r Lineal: los componentes de la reacción empiezan a consumirse,la reacción es más
Ienta y algunos de los reastivos o enzimas empiezan a degradarse. La eficiencia ya
no es del fiAVb por lo que en cada ciclo ya no se duplica Ia cantidad de ADN.
r Plateau: la ampliñcación está parada, no se producen nuevos productos. Algunos
productos de Ia PCR se pueden degradar. Esta fase es la que se detecta
en la pCR
tradicional.

A diferencia de Ia PCR que se visualiza en un gel de agarosa y en Ia que sélo se

analizaría el resultado de "sí" o "no" respecto a Ia amplificaciór¡ en ta pCR en tiempo
real se pueden analizar todas las fases. No obstantg la fase que normalmente
se
analiza es la exponencial y el valor con el que se suele trabajar es e] Cs o
ciclo en el
cual se detecta Ia fluorescencia.

Los productos de ampliñcación en tiempo real se detectan a medida que

transcurren
Ios ciclos de Ia PCR. En este caso, el termociclador no sólo aumenta y disminuye
la
temperatura sino que está diseñado para detectarla en cada ciclo. Este mecanismo
está
basado en la detección y cuantificación de un reporter fluorescente, cuya
señal
aumenta en proporción directa a la cantidad de producto de PCR generado
en la
reacción. El termociclador üeue acoplado un sistema de detección capazde
, cuantificar
la señal emitida por el reporter, al final de cada ciclo.

En una misma reacción de PCR se pueden detectar diferentes mutaciones o

amplificados, en función del fluoroforo que se utiliza.

CON§ULTAR DAPOSITIVA§ 24 a 32:

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Certificado de Genética Médica ZOI4¡-ZOLS

Pfuina 6
 TECN DIAffisN@ MOIICUT.AR
IcAs DE
Materialdktfi*n f¡foddo 2'Clase 6

3.2.- §istemas de deteccién de f,uoreseacia

Los sistemas principales de detección de la fluorescencia son:

1J ,SYBRGreen I similar al bromuro de eüdio. BrEtJ;

Se une preferentemente a DNA de doble cadena incrementando fuertemente su

fluorescencia. La fluorescencia emitida es proporcional a la concentración de DNA, de
esta forma, el producto que se está formando en cada ronda de amplificación puede
ser visualizado de forma conünua. ta señal aparece a partir de un número
determinado de ciclos, dependiendo de la concentración de partida. La concentración
de DNA se determina usando estándares de concentración conocida y comparando las
curvas de fluorescencia de dichos estándares con la fluorescencia de la muestra.

2) Sondas FRET LFluaresence Resonance TransferJt

Las sondas FRET están compuestas por dos sondas; un fluoróforo donador, que
excitado por una fuente de luz externa, emite luz, absorbida por un segundo fluoróforo
próximo a é1, denominado aceptor. Este aceptor emite luz a una longitud de onda
distinta del donador. Esta luz puede medirse. Para que este fenémeno ocurra, ambas
sondas deben estar muy próximas entre sí. Por 1o que deben diseñarse de manera
específica para que hibriden con el DNA objetivo en regiones muy cercanas, que
permiEn, que tras la excitación del fluoróforo donador, éste sea capaz de excitar al
fluoróforo aceptor, en la zona interna del amplificado por PCR con cebadores
normales. A medida que se incrementa la cantidad de DNA debida al número de ciclos,
se incrementa igualmente la cantidad de sondas que hibridarán y darán una señal. Asl,
la señal FRET será directamente proporclonal a la cantidad de producto de PCR
específico. §i el DNA no es específico, no se producirá hibridación de las sondas y por
tanto no habrá reacción-

3) SondasTaqman:

Es una única sonda formada por un reporter, fluoróforo que emite a una determinada
y
longitud de onda; un quencher, que absorbe la luz emitida por el reporter haciendo
que dicha emisión no sea detectada. El quencher puede ser un fluoróforo o una
molécula que no emite fluorescencia. Tras la fase de elongación de la PCR, se libera el
reporterpor un fenómeno de hidrolización y se produce Ia detección. Es decir, durante
la elongación la sonda se une al DNA y cuando la polimerasa se encuentra con la sonda,
gracias a su acüvidad exonucleasa factividad que degrada el DNA que encuentra por
delanteJ degrada la sonda liberando el reporter (CONSULTAR DIAPOSITMS 38 A 52J.
A medida que se incrementa la cantidad de DNA debida al número de ciclos, se
incrementa igualmente la cantidad de las sondas hidrolizadas. Así la señal será
directamente proporcional a la cantidad de producto de PtR especffico. Si eI DNA no es
específico no se producirá la hibridación de la sonda y por tanto no habrá reacción.

Certificado de Genéüca Médica 2014-2015 Página 7

 rÉcuces or uleirósnco MoLEcurAf,
Material dk ártiD: Mótlulo 2{lase 6

CON§ULTAR DLAPOSITIVA 35 a 52:

¡r-r-:i."r_f§É§r.1 'l&s@, imegten =!B$§
§tw{Fr%rygtrmrt j*f--rff-t

Ir
r
3,3.-Ventaias de Ia PCR a tiempo real

Las ventajas de la PCR en Tiempo Real son:

r En Ia PCR convencional se obse¡wa el resurtado final de Ia amplificación

fFase
plateau). En la pcR a üempo real se analizan ros datos
de Ia fase de crecimiento
exponencial.
. El incremento de Ia fluorescencia es directamente proporcional al nrimero
de
amplicones generados.
t la precisión, Ia resolución y la sensibilidad son mayores con Ia pCR a tiempo real.
r La PCR convencional solo discrimina por el tamaño
delamplificado.
r No se requiere ningún proceso post-PCR por lo que se ahorra
tiempo. Además se
minimizan los problemas de contaminación por amplicones y
se reduce la
variabilidad en el resultado.
r El rango dinámico, es decir la sensibilidad de Ia téenica para
diferenciar entre
diferentes cantidades, es mucho mayor empleando pcR a tiempo
real.
' si se emplean sondas en la detección de Ia fluorescencia, se evita
la detección de
los artefactos de la reacción como ros dímeros de cebadores.

3.4.- Aplicaciones de Ia pCR a tiempo real

1J Genotipado

r Curvas Melting o Curvas de Fusión:

' Cada ADN se caracteriza por su Tm o temperaüra
de Fusión, que se define
como Ia temperatura en Ia que el 50% del ADN está
en cadena simple (mitad del
DNA estí desnaturalizado).
- La Temperatura de fusión de un producto de PCR puede monitorizarse
midiendo la disminución de fluorescencia por incremento
de Ia Temperatura se
obüenen así las curvas de fusión.
- Variaciones de la Tm del producto de PCR: la Tm depende
de Ia secuencia del
fragmento que estemos amplificando, Un fragmento
baio en GC tendrá una Tm
más baj4 mientras que un fragmento rico en GC, tendrá una
Tm más alta. El
tamaño o longitud del fragmento también modifican la Tm, así como las
concentraciones de sal y otros componentes de Ia reacción.

Certificado de Genéüca Médica ZA]4-2015

Pfuina I
 rÉcxrces ot t rAffiósn@ MoLEcurAR
Material diiácrioa f,lotlulo 2{lase 5

t HRM (High Resolution Melting):

- Es una técnica reciente, de tan sólo unos pocos años, que permite analizar la Tm
del producto amplificado con alta resolución. Está basada en un agente
intercalante similar al SYBRGrem, pero con mayor capacidad de intercalarse en
el ADN de doble cadena. El análisis es mucho más sensible y proporciona
información incluso de un único cambio en la cadena nucleotídica.
- Tras obtener un amplificado, si empezamos a subir la temperatura, el nivel de
fluorescencia caerá según vayamos aumentándo Ia temperatura de la reacción.
Podemos normalizarlo y diferenciar distinbs secuencias que tengamos en la
muestra. El HRM necesita muchas muestras a la vez, porque lo que hace es
comparar muchas cun as de Melting de unas muestras con respecto a las otras.
- Se está uülizando para genoüpado de mutaciones conocidas, mutaciones
recurrentes, y para el scrceniryg de BRCA L y Z.El problema es que el saber si va a
detectar un cambio punhral o no, por Io que se debe validar, Esto lleva a que las
mutaciones ya descritas sí pueden validarse, pero las mutaciones de novo no se
puede estar seguro de deteshr todos los cambios.

t AnúIisis de mutnciones mediontesondos FRET:

- Las curvas de Melüng se hacen después de la PCR Si tenemos una pareja de
sondas FRET y tenemos una mutación conocida, podemos diseñar una sonda que
se una en la región donde está esa mutación conocida. Segun aumentemos la
temperatura, si el alelo posee esa región que hemos detectado con la sonda, la
unión va a ser más fuerce que si el DNA tiene una secuencia diferente (su unión
será más débil, por lo que se despegará a una temperátura interior).

Ejemplo 1: Genotipado de fActorqs de coagulasión: el factor 5 Leiden üene una

mutación recurrente que se analiza con sondas FRET. Se parte de una
fluorescencia ini'cial provocada por Ia unión de las sondas y según se
incrementa la temperatura se van desnaturalizando fdeshibridandoJ las
sondas FRET del DNA de la muestra. Entonces, un resultado de 2 picos nos
indica que es DNA heterocigoto, mientras que si sólo aparece un pico se
pueden dar dos opciones; si es el pico que üene la temperafura más alta, es el
alelo frente al cual se ha diseñado Ia sonda (puede ser el alelo mutante o el
normal); y si es el pico de la temperatura más baia, es el alelo frente al cual no
se ha diseñado sonda. ICONSULTAR DIAPOSITM 58)

Eiemplo 2: Síndromes mieloproiferativos crónicos: detección semicuantitativa

de la mutación p,Val617Phe del gen IAK? mediante el empleo de sondas FRET.
(C0NSULTAR DTAPOSTTTVA 5e.)

r El genoüpado también puede realizarse usando .§ondas TaqMan: en este caso, en

Iugar de utilizar curvas melting, se diseñan dos sondas, cada una de las cuales se
une de forma especffica al alelo mutado o al alelo normal.

Certificado de Genéüca Médica 2014-20Ls Página 9

 TÉcNIcAs DE TilETÓ§nco MoLECUL.AR
Material dkfttir¡. lrlódulo 2{lase 6

Eiemplo: SÍndrome de Gilberts genoüpado del alelo AITA]7TAA en el promotor

del gen UGTIAI mediante sondas TaqMan. ICONSULTAR DIAPOSITIVA 60].

2l Cuantificación

La cuantificación puede ser absoluta o relaüva. La absoluta presenta errores más grandes
por lo que se suele usar la cuantiñcació¡ relaüva

La cuantificación mediante la PCR a tiempo real permite determinar el porcentaie del

analito [del amplicón de interesJ presente en una muestra. La PCR cuanütaüva se diseña
de manera que el incremento de la canüdad de producto produce un incremento en la
fluorescencia emitida por sondas especlficas. Para cuantificar la muestra se obtiene el
número de ciclo a partir del cual se empieza a detectar la fluorescencia, denominado "Cf y
se compara con Ios diferentes Ct obtenidos con un estándar en cantidades conocidas, Con
una serie de patrones se puede realizar una recta de regresién, entre el número de copias
y el número de ciclos necesarios para llegar al umbral de fluorescencia establecido
frealización de curvas patrón]. Dependiendo de la concenkación inicial del analito se
detectará antes o después la fluorescencia.

Ejemplo: Cuantificación de reordenamientos (translocacionesJ en oncohematologfa,

COI{SULTAR DIAPOSITIVA 65.

Eiemplo: Cuantificación de polimorfisrnos en quimeras hematopoyéticas mediante sondas

TaqMan, Mediante este anáIisis se puede corocer si la sangre de un paciente someüdo a un
trasplante de médula óse4 se está volviendo a producir o si por el contrario ha sido
totalmente sustiflrida por la sangre del donante. Así se evalrla la evolución del trasplante.
En este caso no se utilizan esHndares sino que se utiliza el ADN del receptor, antes del
trasplante, como calibrador. Lo que se analizan son polimorfismos ínformativos de
inserciones o deleciones, así como alelos nulos. CONSUTTAR DIAPOSITIVAS 66 Y 67.

CONSUTTAR DIAPO§ITIVA§ 53 A 67:

!.r-*!lr::t: ffi.ffilt ii:'rr.,¡6361¡1 : il i¡.,".rrir¡i¡1r': im-imtrl tÍ'r'r*rt:li¡l ¡ :ffi
*i&§§ffi rrl1$4li¡mt'gj*§r!§ffi

III i

III
3.5.- Modifrcación de la PCR a tiempo real: PCR digital

La PCR digital lleva ya desarrollada desde hace unos años, pero ha sido durante el rlltimo
año cuando se ha iniciado su incorporación en diferentes laboratorios para su uülizaclón
de forma rutinaria. La base de Ia PCR digital es dividir una única reacción de PCR en miles
de reacciones. Esta modificacíón de la PCR a tiempo real permite hacer cuantificaciones
absolutas. Funciona con sond.as TaqMan por lo gue se puede diseñar una sonda para un
alelo mutante y una sonda para el alelo normal y ver la proporción de cada uno.
Normalmente,la reacción es fragmentada en alrededor de 12000-15000 PCRs. La técnica

Certificado de Genética Médica 2014-2015 Página 10

 rÉcn¡ces oe urerósrrc MoLEcu LAR
Material diH*s Módub 2{lase 6

permite la cuanüficación de cantidades iniciales muy pequeñas ya que al subdividir la

muestra la proporción de un alelo de baia frecuencia en la muestra general se ve
incrementada en algunas de las micromuestras. Dependiendo del número de reacciones
vacías, se sabe cuánhs reacciones se tiene con 1, 2..5 copias, ya que se sigue un modelo de
distribución de Poisson, Se puede obtener raüos entre alelos raros y alelos común, Se
puede cuantificar hasta un ratio del 0.01q&

La PCR digital presenta como ventaias principales,la posibilidad de hacer cuantificaciones

absolutas y el hecho de que muchos factores que influyen en la PCR de tiempo real normal,
no influyen en la PCR digital. Por eiemplo, si hay presencia de inhibidores en una muestra,
todas las submuestras experimentarán el mismo problema, sin influir en el ratio entre los
productos que se detectan Sus principales utilidades es el genotipado en sangre materna
deDNA fetal y el genoüpado de mutaciones en tumores ICONSULTAR DIAPCISITIVAS 68-
72).

4..§ECUENCIACIÓN DE AI'N

La secuenciación del ADN es una técnica que surgió en el año7j77 y una de las prÍncipales
herramientas en el diagnóstico genético. La mayoría de diagnésücos se llevan a cabo
mediante PCR y posterior secuenciación del producto, bien por sen¡enciación Sanger, bien
utilizando las rlltimas tecnologfas de secuenciación.

La secuenciación enzimática diseñada por Sanger es un proceso enzimático similar a la

PCR, en el que únicamente se utiliza un primer y en el que, además de los nucleótidos
normales, se incluyen oros nucleótidos modificados, denominados terminadores, que no
permiten el avance de la reacción de la polimerasa. La reacción de síntesis de ADN va
progresando hasta que la poljmerasa utiliza uno de los nucleóüdos modificados, Al final de
la reacción lo que se obüene es una colección de fragmentos de todos los tamaños posibles
en los que el último nucleóüdo es un nucleótido terminador. Estos nucleótidos terminales
están marcados de manera que pueda detectarse toda la variedad de fragmentos
obtenidos. Originalmente se marcaban por radioactividad y se separaban en electroforesis
por geles de acrilamida. En el método actual, cada nucleótido estiá marcado con un
fluoróforo diferente y la separación de fragmentos por tamaño se lleva a cabo mediante
electroforesis capilar con un lector que reconoce qué fluoróforo es cada uno de los
nucleóüdos y que va indÍcando la secuencia.

coNsutTAR DIAPOSITM§ 70, 7l.,72,73 y 74

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Certificado de Genética Médica 20L4-2015 Página 11

 rÉc¡¡rc¡s o¡ oHanósnco MoLECUIAR
Material dirffi Módub 2{lase 6

4,1.- Aplicaciones de la §ecuenciación: ¡n¡ilisis de enfermedades.

La secuenciacién, iunto con la PCR son las dos técnicas más usadas para el diagnóstico
genéüco de
enfermedades, además, normalmente ambas técnicas son usadas
coniuntamente: con Ia PCR aumentamos la canüdad del ADN muestra para posteriormente
ser analizado rnediante su secuenciación y comparación con secuencias de referencias
públicas.

En el diagnóstico genético molecrrlar de enfermedades, la secuenciación Sanger de

electroforesis capilar se considera como Ia técnica de referencia, dada su alta sensibilidad
y especificidad.

Para el análisis, en primer lugar, el ADN es extraído y se amplifica por FCR la zona
genómica objeto de estudio. Normalmente son amplificadas zonas exónicas de genes
"sospechosos" y/o zonas adyacentes a los mismos. Tras Ia secuenciación automática de
estas zonas, el anáIisis de las secuencias obtenidas se realiza comparando con secuencias
de referencia para dichos Eenes publicadas en bases de datos.

§e pueden obtener diferentes resultados: secuencias con posiciones sin cambios con
respecto a Ia secuencia de referencia o secuencias donde son detectados cambios que
pueden ser en homocigosis [por ejemplo cambio de una G poruna A en ambos alelosJ o en
heterocigosis (por eiemplo cambio de C por una T en sólo uno de los alelosl. Estos cambios
pueden dar lugar a un polimorfismo del gen que no afecta a Ia enfermedad o a una
mutación que provoque la alteración en Ia expresién del gen ó en las zonas de procesado
del ARN mensaiero del gen, provocando transcritos diferentes del gen.

Ejemplos:

- Poliquistosis Renal Autosómica Dominante: enfermedad hereditaria prevalente (su

incidencia es de 1/1000-1/5001 asociada a mutaciones en el Een PKDL en un 85%-90% de
Ios casos y en el gen PKDZ en un 100/o-15Y0 de los casos. El gen PKDL es un gen grande, con
46 exones y además presenta hasta 6 pseudogenes que no son procesados pero con una
similitud a PKDL de hasta el 90Y0. Por tanto, el análisis directo resulta costoso.
Normalmente se hace una Iong-PCR usando cebadores únicamente presentes en el gen y
no en los pseudogenes, y se utiliza esa misma PCR como molde para posteriores PCRs de
los exones.

CONSUTTAR DAPO§ITIYA§ 79 a 86:

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Certiffcado de Genética Médica 2014-2075 Página L2

 rÉcmas or urcrósnco MorEcu LAR

Material dirláctio: fá&fulo 2{lase 5

4.2.- timitaciones de la secuenciación Sanger

- En el caso de análisis de genes grandes supone unos altos costes económicos, debido a la
gran cantidad de exones {con una reacción de PCR para cada unoJ.

- Enfermedades con heterogeneidad genéüca; las enfermedades con muchos genes

asociados presentan una dificultad añadida porque requieren de un diagnóstico
diferencial, resultando diffcil diferenciar a qué gen está asociada la enfermedad de una
familia concreta.

-Enfermedades compleias y multifactoriales: Muy frecuentes, diagnóstico genéüco todavía

no resuelto.

-ldentificación de nuevos genes finvestigaciónJ: Enfermedades monogénicas, multigénicas

y complejás.

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CONSUTTAR DIAPOSITIVA 87 :
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5.- TECNOTOGÍAS DE NUEYA GENERACIóN, UTTRASECUEilCIACIÓN

Desde hace unos pocos años se han ido desarrollando nuevas tecnologlas que permiten
hacer una secuenciación masiva. Son las denominadas NG§ del inglés New Generation
§equencing. r

Existen multitud de equipos, la mayoría son usados con fines de investigación, otros arln
en desarrollo y otros ya adaptables al laboratorio de diagnóstico molecular.

Para Ia secuenciación masiva hay tres procesos principales:

r La captura del ADN

o La preparación de las librerfas
r Lasecuenciación

En los resultados de la secuenciacién masiva ya no se ven picos como en la secuenciación

Sanger, que simbolizan Ia media de las secueilcias totales, sino que se obtiene información
de cada una de las secuencias.

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CON§UITAR

DTAPOSITIVA§ 89 A 90:

Certificado de Genéüca Médica 2014-?.075 Página 13

 TEcNIcás Df DUEI6§}C1] MoLECULAR
Materialdidáctin ilodulo 2{lase 6

ANEXO 1. Secuenciación masiya Amplimión

Para la secuenciación masiva hay Ees procesos principales:

a La captura del ADN

a La preparación de las librerías
T La secuenciación

La captura del ADN de interés ó selección de regiones de interés, puede ser mediante:

Método de captura mediante §ondas; sondas marcadas con biotina o cualquier otro
compuesto y diseñadas de forma específica hacia distintas regiones de interés del genoma
o que capturen todo el exoma Se diseñan las sondas, se fragmenta el DN& se hace una
reacción en la cual las sondas reaccionan con el DNA y se capturan estas sondas que han
reaccionado con el DNA. Muchas casas comerciales comercializan este tipo de sondas con
un sistema propio.

Capmra mediante PCR; existen diferentes métodos, algunos parecidos a la PCR dígital
donde se realizan mulütud de PCRs diferentes en microgotas que posteriormente se
juntan y pasan a secuenciacion. Otros métodos están basados en microarrays con
diferentes muestras, donde se obtienen diferentes amplicones que posteriormente se
iuntan para su secuenciación. También se realizan PCR multiplex que generan miles de
amplicones en un solo tubo de reacción.

La Pfepaxación de librerías depende del posterior equipo de ultrasecuenciación que se

vaya a utilizar, pero normalmente consta de dos pasos principales partiendo del DNA de
partida que puede o no estar fragmentado en función del método de captura. Lo primero
e§ por tanto reparar ese DNA porque presenta unos e)$remos cohesivos o colas
[según
método de captural de partida y añadirle unos adaptadores que son los que uülizará el
equipo para iniciar la secudnciación y por tanto dichos adaptadores son específicos del
posterior equipo de ultrasecuenciación. El otro aspecto principal en la preparación de
librerías, es que se pueden mezclar muchas muestras diferentes de DNA, marcadas de
forma diferencial mediante secuencias de referencias comerciales
IBAR CODE§, INDEXs], y
secuenciarlas a la vez, haciendo por tanto que la secuenciación sea más eficiente.

Tipos de tecnologfas NG§

Existen 4 métodos principales copados en tres casas comerciales:

En Ia pirosecuenciación la ultrasecuenciación se basa en una PCR en emulsión donde el

DNA se une a unas partículas [bolasJ y en una microgota se hace Ia reacción de pCR a
partir de una única hebra del DNA. Cada una de las bolas en cada microreactor debe haber
una única cadena de DNA que vamos a amplificar para obtener las copias suficientes para
después poder §ecuenciar. Hay una reacción química en la cual se produce luz mediante la
luciferasa cada vez que se incorpora un nucleótido, La luz la detecta el equipo y va
almacenando todas las señales que va recibiendo. El equipo introduce un nucleétido,
detecta si se incorpora, Iava si no se ha incorporado y así sucesivamente. Es un proceso
lento, tarda alrededor de una semana, pero se obüenen millones de secuencias.

Certificado de Genética Médica Z0t4-Z0ts Página 14

 rÉcxrces o¡ meirósno MoLEcut AR
Materúal ditáctirp: Módulo 2{lase 6

BJ Secuenciación por ligación [SOIJD]:

También se basa en una emulsión: en cada microreactor debe haber una única cadena de
DNA que vamos a amplificar para obtener las copias suficientes para después poder
secuenciar. Hay unos pequeños primers marcados con un fluoróforo que se van liberando
mirando si hibridan o no con e1 DNA. si hibridan hay una sonda que
a las secuencias y se va
mediante una Iigasa los une y conünúa con el siguiente proceso. Cada una de las bases se
analiza dos veces. las secuencias empiezan por A y dependiendo de la base y del color
sabemos qué nucleótido se ha incorporado. El problema es que no se obüene una
secuencia real sino que la secuencia se obtiene por comparacfón de varias reacciones, por
ello esta tecnología se está descatalogando. La ventaja es que cada base se analiza dos
veces con dos primers disüntos.

CJ Terminadores reversibles [HiSeq 2000 / MiSEd;

Hay librerfa pero no hay PCR en emulsión. Existe una superficie llena de adaptadores que
se unen a las hebras de ADN. Hay un PCR en un puente enffe los distintos adapudores del
array. incorporando 4 nucleótidos marcados con fluoróforos distintos. Cada vez que
Se van
se incorpora un nucleóüdo a esa superficie o cluster se detecta su señal de fluorescencia.
Luego se hace el análisis bioinformático.

l-tlDetección de iones ( Ion To¡'rent]:

No tiene un sistema de captación de imagen. Se detecta la liberación de iones. Cada vez

que se incorpora un nucleétido se libera un ion de forma que lo que se detecta es una
variacién de potencial cada vez que se libera un ion, Si no se incorpora el nucleótido no
hay señal, si se incorpora un nucleétido hay señal y si se incorpora más de uno hay más
señal. Es un sistema parecido a la pirosecuenciación pero más automáEico.

Retos de la ultrasecuenciación

La ultrasecuenciacién es una metodología muy joven y en evolución y aunque presenta un

gran potencial en investigación, todavía üene grandes limitaciones en el análisis de datos
ya que se obüenen millones de datos que resulhn costosos de procesar.

En cuanto a las aplicaciones en Salud Humana, la indicación clínica debe justificar el uso de
esta tecnología. Otro punto críüco es la información al paciente sobre resultados que
pueden enconffarse sin ser solicitados por el paciente.

También la Validación clínica todavía requiere de una calidad alta, una sensibilidad y
especificidad similares a la secuenciación §angery unos costes justificables,

Todavía hoy por hoy los resultados deben validarse con la secuenciación Sanger que es Ia
técnica por ref'erencia.

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