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TESIS
PARA OPTAR AL TÍTULO DE:
QUÍMICO FARMACÉUTICO
PRESENTADO POR:
Bach. Sánchez Llamosa Miguel Jesús
Bach. Anicama Pariona Nataly Esther
ASESOR
Mg Juan José A. Palomino Jhong
Co- ASESOR
Mg. Oscar Herrera Calderon
ICA-PERÚ
2015
Dedicatoria:
4
AGRADECIMIENTOS
3
ÍNDICE
Página
RESUMEN 7
ABSTRACT 8
INTRODUCCIÓN 9
1.4 FLAVONOIDES 18
(FRAP) 24
2,2-Difenil-1-picrilhidraizil (DPPH) 28
4
1.5.5 Trolox. 29
2.1 MATERIAL 31
2.1.5 Equipos 33
5
3.3 Evaluación de la actividad antioxidante frente al radical DPPH 55
Trolox (TEAC-ABTS) 59
DISCUSIÓN 61
CONCLUSIONES 66
RECOMENDACIONES 67
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 68
ANEXOS 74
6
RESUMEN
7
ABSTRACT
8
INTRODUCCIÓN
radicales libres 1.
9
ciertos cánceres y desordenes cardíacos derivados de su poderosa
actividad antioxidante3.
utilidad4.
10
asociado a su actividad antioxidante in vitro frente al radical DPPH Y
ABTS?
específicos correspondientes:
OBJETIVO GENERAL:
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
“huamanpinta”.
11
CAPÍTULO I
ASPECTOS GENERALES
estambres con los filamentos libres y soldados por las anteras (sinanterio),
12
1.1.2. Clasificación Sistemática de la Especie
DIVISIÓN: MAGNOLIOPHYTA
CLASE: MAGNOLIOPSIDA
SUBCLASE: ASTERIDAE
ORDEN: ASTERALES
FAMILIA: ASTERACEAE
GENERO: Chuquiraga
distrito de Totos, por encima de los 3,000 metros sobre el nivel del mar.
Subtropical.
13
1.1.4. Composición química y usos tradicionales.
una taza tres veces al día y se emplea como: Antiinflamatorio de las vías
14
H. Chávez et al. (2011)8estudiaron los metabolitos secundarios
autores.
15
J. Arenas (2000)11, demostró la actividad diurética de la Chuquiraga
taninos.
16
antirradicalaria o estabilizadora de radicales libres; b) capacidad para
Ante un incesante daño que ejercen los radicales libres en los sistemas vivos
provistos del medio ambiente (alimentos, plantas, etc.) que han sido
17
Licopenos, Cobre,
Cofactor Zinc, Hierro y
Manganeso.
Endógenos
Glutatión
Coenzima Q
ANTIOXIDANTES
Catalasa
Ácido tiótico Superóxidodismutasa
Glutatiónperoxidasa
Enzimas
Enzimas Glutatión reductasa,
Glutatión S-transferasa
Vitamina E
Vitamina C
Exógenos
Flavonoides
B-caroteno
1.4. FLAVONOIDES
glicósidos pueden ser de dos clases con los carbohidratos ligados a través
18
ligados a través de enlaces C-C, es decir como C-glicósidos; los O-
como sales en flores, frutos con coloraciones que van del color rojo hasta
Los flavonoides tienen una estructura química definida, son moléculas que
tienen dos anillos bencénicos unidos a través de una cadena de tres átomos
19
pterocarpanos, rotenoides, etc. Los flavonoides tienen propiedades
propiedad antioxidante17.
20
Se han desarrollado un gran número de métodos hasta la actualidad
por medio de un solo método, por tal razón es necesario combinar varios.
se deben completar con ensayos in vivo, así como con estudios sobre el
21
en estos compuestos existe un delicado equilibrio entre actividad
mecanismos por los que los antioxidantes reaccionan con los radicales
dos mecanismos.
libre y AH el antioxidante:
22
X• + AH XH + A•
antioxidante:
X•+ AH X + AH• +
X• + H3O+ XH + H2O
Estas reacciones son también dependientes del pH. Son métodos muy
potencial de ionización.
23
A continuación, se describen tres de los métodos utilizados para la
de capacidad antioxidante.
24
Como el potencial de reducción del Fe (III) a Fe (II) es de 0,77
A 593 nm pueden absorber otros compuestos, como la
valor de FRAP.
Hay compuestos como el ácido ascórbico que, además de
El FRAP no implica a ningún prooxidante ni a ningún sustrato
tras una reacción que puede ser química (persulfato potasio), enzimática
25
Con este método, se puede medir la actividad de compuestos de naturaleza
734 y 815 nm), pero se mide a una longitud de onda λ 734 nm. Una de las
Persulfato de Potasio
-e *
26
Figura 05. Mecanismo de estabilización del catión radical ABTS• (arriba), reacción del
catión radical ABTS• con el trolox (centro) y mecanismo de estabilización del radical
picrilhidraizil (DPPH)
desventaja que tiene este método es que sólo puede disolverse en medio
27
algunos antioxidantes pueden causar interferencias si poseen un espectro
1995)
1.5.5 Trolox.
28
derivado de la vitamina E. Las reacciones entre el Trolox (radical fenoxilo) y
tioles, pero no por urato, NADH o galato de propilo. Las pruebas evidencian
que el Trolox repara proteínas que se han oxidado por radicales libres28.
CAPÍTULO II
29
MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 MATERIALES
Less.
Material de vidrio
Pipetas graduadas de 1, 3, 5, 10 mL
Fiola de 100 mL
Gradillas
Jeringas
30
2,2’-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfonato de amonio) (ABTS).
Trolox ®
Reactivo de Liebermann-Burchard
Reactivo de Shinoda
Reactivo de Dragendorff
Reactivo de Mayer
Metanol (Fisher®)
Etanol (Fisher®)
Cloroformo (Merck®)
2.1.5 Equipos
Rotaevaporador (Büchi ®)
Estufa (Memmert®)
31
Centrífuga (internacional Equipment Co®)
0.00001 g (Bennet®)
(Anexo 1).
32
Obtención del extracto etanólico de hojas y flores de Chuquiraga
una estufa controlada con aire circulante a 40 ºC (para obtener los extractos
(Anexo 3 y 4).
33
1. Determinación de Saponinas:
Prueba de la espuma:
saponinas.
2. Determinación de Flavonoides:
Reacción de Shinoda:
34
4. Determinación de Taninos
Reacción de la Gelatina
5. Determinación de Alcaloides
Reacción de Dragendorff
presencia de alcaloides.
Reacción de Mayer
presencia de alcaloides.
Reacción de Wagner
presencia de alcaloides.
35
6. Determinación de Quinonas
Reacción de Bornträger
Reacción de Lieberman-Burchard
Reacción de la Ninhidrina
36
produce una reacción óxido-reducción entre el reactivo de Folin-
reacción.
ug/mL
de la tabla 1.
37
Tabla 01.- Preparación del estándar de polifenoles.
c) Reacciones
38
Tabla 02. Batería de reacción final del estándar de polifenoles.
Acido
Reactivo Na2CO3 Agua
gálico VF CF
Tubo de Folin 20% destilada
(100 ug/mL) (mL) (ug/mL)
(uL) (uL) (uL)
uL
0 - 450 450 2100 3 0
1 300 450 450 1800 3 1
2 300 450 450 1800 3 3
3 300 450 450 1800 3 5
4 300 450 450 1800 3 7,5
VF: volumen final, CF: concentración final.
Fuente: Datos de los autores.
d) Preparación de la muestra:
de metanol.
ensayo respectivamente.
39
Se adicionó 450 uL de carbonato de sodio a cada tubo de
Se disolvió en 5 mL de metanol
Se distribuye en Se distribuye en
tres tubos de tres tubos de
ensayos. ensayos.
40
2.3EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE IN VITRO.
espectrofotómetro UV/VIS.
41
nm esté ente 0,6 y 0.7. El matraz aforado se cubrió con papel de
Se preparó una solución stock 1 mM, para ello se pesó 2.4 mg ácido
destilada.
por cada uno de las concentraciones, para ello se hizo reaccionar 300
42
Tabla 03. Concentraciones finales del estándar de trolox en la reacción
a) Reacción de la muestra:
Determinación de la CI50:
43
Extracto etanólico de flores: Se pesó 2 mg de extracto
517 nm.
44
Tabla 04. Batería de reacción del extracto etanólico de hojas de
huamanpinta
TUBO Muestra DPPH VF CC de muestra CF en tubo
uL uL mL ug/mL ug/mL
1 300 2700 3 300 30
2 300 2700 3 150 15
3 300 2700 3 75 7.5
4 300 2700 3 37.5 3.75
5 300 2700 3 18.75 1.875
6 300 2700 3 0 0
45
2.3.2 Método reacción con el radical 2,2’-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-
siguiente manera:
Reacciones:
46
Dilución 1 (0,5 nM): (1 mL de Solución 1mM + 1 mL de agua destilada.
CC de
TROLOX ABTS VF CF en tubo CF en tubo
TUBO trolox
(uL) (uL) uL (mM) (uM)
(mM)
1 0.5 100 1900 2000 0.025 25
2 0.25 100 1900 2000 0.0125 12.5
3 0.125 100 1900 2000 0.00625 6.25
4 0.0625 100 1900 2000 0.003125 3.12
5 0.03125 100 1900 2000 0.001563 1.5
6 0 100 1900 2000 0 0
VF: volumen final, CF: concentración final.
Fuente: Datos de los autores.
47
Tabla 07. Batería de reacción del extracto etanólico de hojas y
48
CAPÍTULO III
RESULTADOSY DISCUSIÓN
expresión:
50g
%EES= X 100
500 g
%EES hojas= 10 %
expresión:
49
22 g
%EES= X 100
250 g
50
Tabla 09. Prueba preliminar cualitativa de los metabolitos secundarios
del extracto etanólico de flores de Chuquiraga spinosa Less
“huamanpinta”
Prueba de caracterización Resultado Metabolito secundario
Reacción de la NINHIDRINA (+) Grupos aminos libres
Reacción de la GELATINA (+) Taninos
Reacción con CLORURO (+) Compuestos Fenólicos
FERRICO (FeCl3)
Reacción de DRAGENDÖRFF (+) Alcaloides
Reacción de WAGNER (+) Alcaloides
Reacción MAYER (+) Alcaloides
Reacción de SHINODA (+) Flavonoides
Reacción de BORNTRAGER (-) Quinonas
Reacción de LIEBERMAN- (+) Triterpeno y/o
BURCHARD esteroides
Prueba de la ESPUMA (-) Saponinas
(-) = Ausencia; (+) = Presencia
0.600
0.500
0.400
y = 0.0709x + 0.2104
0.300 R² = 0.9998
0.200
0.100
0.000
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Concentración de Acido gálico (ug/mL)
51
Tabla 10. Determinación del contenido de polifenoles totales en el
“huamanpinta”.
Peso de muestra 50 mg
0,510 0,525 0,515
Absorbancia de la muestra
60 60 60
Factor de dilución (FD)
ug EAG 4,22 4,43 4,30
ug EAG X FD 253,2 265,8 258,0
(ug EAG X FD)/1000 0,2532 0,2658 0,258
5 mg/mL 5mg/mL 5 mg/mL
mg de extracto /mL
mgEAG /g extracto 50,64 53,16 51,60
mgEAG/g extracto 51,8 ±1,27
Fórmula: [[[[ABS-0,2104/0,0709] x FD] / 1000 ] / 5mg/mL] X 1000
52
Tabla 11. Determinación del contenido de polifenoles totales en el
60 60 60
Factor de dilución (FD)
53
3.3 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE IN VITRO
FRENTE AL RADICAL DPPH DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE
Chuquiraga spinosa Less “Huamanpinta”.
0.7
0.6
Absorbancia leida a 517 nm
0.3
0
0 10 20 30 40 50 60
Concentración de Trolox (µmol/L)
54
Tabla 13. Absorbancias promedio del extracto etanólico de
hojas de huamanpinta frente al radical DPPH
TUBO CF de muestra CF en tubo PROM
(µg/mL) (µg/mL) ABS
1 300 30 0.063
2 150 15 0.28
3 75 7.5 0.392
4 37.5 3.75 0.472
0.7
0.6
Absorbancia leida a 517 nm
0.5
y = -0.0172x + 0.5576
0.4 R² = 0.9759
0.3
0.2
CI50 = 14,98µg/mL
0.1
0
0 5 10 15 20 25 30 35
Concentración de extracto etanolico de hojas de huamanpinta (ug/mL)
55
Tabla 14. Absorbancias promedio del extracto etanólico de flores
de huamanpinta frente al radical DPPH
TUBO CC de muestra CF en tubo PROM
µg/mL µg/mL ABS
1 100 10 0.102
2 50 5 0.326
3 25 2.5 0.452
6 0 0 0.612
0.7
0.6
Absorbancia leida a 517 nm
0.3
0.1
0
0 2 4 6 8 10 12
Concentración de extracto etanólico de flores de huamanpinta (µg/mL)
Figura 11. Determinación dela CI50 del extracto etanólico de flores Chuquiraga
spinosa
56
3.4 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE IN VITRO
ABTS
0.8
0.7
y = -0.0266x + 0.6761
0.6
absorbancia 734 nm
R² = 0.9912
0.5
0.4
CI50= 12,071 µM
0.3
0.2
0.1
0
0 5 10 15 20 25 30
uM trolox
Figura 12. Determinación dela CI50 del TROLOX frente al radical ABTS
57
3.5 DETERMINACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE
spinosa Less.
5 5 5
Factor de dilución (FD)
58
Tabla 14. Determinación de la capacidad antioxidante equivalente a
spinosa Less.
59
DISCUSIÓN
El empleo de las plantas medicinales con fines curativos es una práctica que
se viene utilizando desde hace mucho tiempo. Durante largos períodos, los
recurso del que disponían los médicos. Esto hizo que se profundizara en el
también fueron reportados por Casado et al., (2011)7 y Torres (2000)9, pero
resultados muestran que son los flavonoides, los triterpenos y esteroides los
60
procedencia de la especie. La complejidad estructural de los polifenoles
1,27 mgEAG/g extracto) y flores (354,2 ± 1,9 mg EAG/g extracto) y que los
reconocidas como la tara y el camu camu (29,5 ± 0,11; 11,7 ± 0,05 mgEAG/g
(aguaymanto) 33.
Los compuestos extraídos por el etanol son ligeramente más polares que los
polifenoles más polares en flores que en las hojas, lo cual también explicaría
61
del extracto etanólico de hojas y flores de Chuquiraga spinosa Less,
alta en los dos métodos de evaluación: DPPH (CI50 flores: 5,69 y CI50 hojas:
presente estudio pero que las diferentes sustituciones como la posición del
62
antioxidante 36. Un doble enlace entre los carbonos C-2 y C-3, conjugado
como es el caso del canferol. Una sustitución del grupo 3-OH produce un
Grupos 3-OH y 5-OH con función 4-oxo en los anillos A y C son necesarios
azúcar.
63
apoptosis, y de estimular el sistema inmune 39,40. Las actividades
64
CONCLUSIONES
respectivamente.
65
RECOMENDACIONES
muy promisorio.
66
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
free radial scavenging activities of extract and fractions from corn silk
(Zea mays L.) and related flavone glycosides. Food Chem. 2011; 126,
261–269.
67
8. Chávez H, Molina A, Ramos R, Ferreyra C, Revatta L. Aislamiento e
Huamanga-Ayacucho. 2003.
68
15. Arroyo J, Rojas J, Chenguayen J. Manual de Modelos Experimentales
drugs over the period 1981 - 2002. J Nat Prod. 2003; 66: 1022 -1037.
69
24. Amir Jhorfran Z, Azadbacht H, Karimi M. Evaluation of the
27. Benzie IFF, Strain JJ. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as
a measure of “antioxidant power”: the FRAP assay. Anal Biochem.
1996; 239:70–6.
35(5):523-534.
29. Trease E, Evans WC. Pharmacognosy. 15th ed. San Diego, CA:
70
et al. Total antioxidant capacity of plant foods, beverages and oils
33. Soares JR, Dinis TCP, Cunha AP, Ameida LM. Antioxidant activity of
34. Duh PD, Tu YY, Yen GC. Antioxidant activity of water extract of harng
35. Halliwell B, Gutteridge JMC. In: Free radicals, ageing and disease.
39. Lin JM, Lin CC, Chen MF. Scavenging effects of Mallotus repandus on
40. Houghton PJ. Pharmacognosy: the basis for quality herbal medicinal
71
ANEXOS
ANEXO N° 01
72
ANEXO N° 02
Obtención de la planta
Humectación de hojas y
flores de huamanpinta,
con etanol. Previamente
protegido de la luz.
73
Filtración
Extracto
Extracto Extracto
etanólico etanólico
seco de seco de
Hojas Flores
74
ANEXO N°03
Preparación de la muestra
75
ANEXO N°04
Preparación de la
Reacción de la muestra
Con el DPPH.
Lectura en el
espectrofotómetro
76
ANEXO N°05
Preparación de la muestra:
Hojas , flores y reacción
Con el radical libre
77