UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE QUERÉTARO

FACULTAD DE QUÍMICA Pre-

CLAVE requisito
Laboratorio de Experimentación
Biológica-Farmacéutica 956
Academia de QFB

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ALTERACIÓN AL METABOLISMO DE
LÍPIDOS 6 5 42

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Contenido Página
I. INTRODUCCIÓN

II. CONOCIMIENTOS PREVIOS

III. OBJETIVO
III. 1. Objetivo General
III. 2. Objetivos Particulares

IV. METODOLOGÍA
IV. 1. Material y equipo.
IV. 2. Reactivos y soluciones
IV. 3. Requerimientos de seguridad
IV. 4. Disposición de residuos

IV. 5. Procedimiento

V. RESULTADOS

VI. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

VII. CONCLUSIÓN

VIII. BIBLIOGRAFÍA
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I. INTRODUCCIÓN.
Los lípidos son almacenes de gran capacidad, debido a su naturaleza anfifílica
algunos constituyen el material básico de la estructura de membranas. Son
sustancias de origen biológico, solubles en solventes orgánicos. El factor común
estructural de este grupo de moléculas es la presencia de cadenas relativamente
largas de átomos de carbono, donde también predomina el H, esta característica
determina que las moléculas sean en mayor o menor grado apolares o anfifílica.
Los lípidos se clasifican en: ácidos grasos, triacilgliceroles, glicerofosfolípido,
esfingolípidos y colesterol. Las fuentes para la obtención de ácidos grasos
requeridos por el cuerpo humano son la dieta y la biosíntesis, se necesitan tanto
para la obtención de energía y la obtención de las partes hidrófobas de las
biomoleculas. La segunda fuente principal de ácidos grasos en los humanos es su
biosíntesis a partir de intermediarios de tamaño pequeño, los cuales pueden
provenir de la degradación metabólica del azúcar, de algunos aminoácidos y de
otros ácidos grasos. En la mayoría de casos se sintetiza primero el ácido palmítico,
un ácido saturado de cadena lineal de 16C y los demás se obtienen modificándolo.
En los sistemas de los mamíferos la secuencia de reacciones se lleva cabo por la
ácido graso sintasa, un complejo enzimático. Y la unidad cebadora de la síntesis de
ácidos grasos es el acetil CoA o el butiril CoA, y el extremo metilo de estos
cebadores es el extremo metilo del palmitato. La adición del resto de unidades
bicarbonadas requiere la activación del carbono metílico del acetil CoA mediante la
carboxilacion para producir malonil CoA

La síntesis de los ácidos grasos se inicia a partir de moléculas de acetil - S - CoA,

aunque las reacciones son bastante diferentes a las de degradación. La β oxidación
se realiza en la matriz mitocondrial y el anabolismo de estos compuestos ocurre en
el citoplasma.
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Las enfermedades del metabolismo de los ácidos grasos pueden ser:

hipertrigliceridemia (niveles demasiado altos de triglicéridos en sangre), u otros
tipos de hiperlipidemias. Estas enfermedades pueden ser hereditarias o adquiridas.
Surgen de defectos en las enzimas que afectan la capacidad del organismo para
oxidar los ácidos grasos para producir energía en los músculos, hígado y otros tipos
de células.

II. CONOCIMIENTOS PREVIOS.

1.- Propiedades físicas y químicas de los lípidos
5.- lipólisis y lipogénesis
6.- Generalidades de los metabolismos de TAG y colesterol.
7.- fundamento para la determinación de TAG y HDL
7.- ¿Cómo actúan los fibratos en la disminución de triglicéridos en sangre?
8.- ¿Qué papel juega la fibra en la disminución de lípidos en la sangre?

III. OBJETIVO

III. 1. Objetivo General

El alumno comprobará el metabolismo de lípidos y mediante una alteración dirigida
evaluara su efecto en lípidos totales, ácidos grasos y triacilglicéridos.

III. 2. Objetivos Particulares

Serán definidos por el alumno.
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IV. METODOLOGÍA

La toronja o también llamado pomelo es un fruto del árbol pomelo. Fruto hibrido
probablemente producido de manera espontanea entre la pampelmusa y la naranja,
en las plantaciones del mar Caribe en el siglo XVll. Este fruto es una fuente
importante en vitamina C, beta-caroteno y flavonoides, estudios han sustentado su
actividad nutricional y antioxidante en el organismo. Además se ha encontrado que
la composición de la toronja es rica en fibra y furanocumarina, Estos últimos útiles
en el tratamiento para la alteración de metabolismo de lípidos. Se sabe que la fibra
soluble entra al torrente sanguíneo y es capaz de unirse al colesterol para su
eliminación.

Tabla 1.- Valores de referencia para un perfil lipídico

Por tal motivo en este estudio se escogió al jugo de toronja como posible tratamiento
en una población de ratas que presentan alteración en el metabolismo, y de esta
manera cuantificar la eficacia en la mejora de los valores presentes de colesterol
HDL, colesterol LDL y triglicéridos en sangre después de 12 semanas con una dieta
rica en sacarosa . De igual forma se determinará si la concentración de la dosis
tiene algún efecto en los resultados esperados.

Para este estudio se utilizaron 12 ratas (Mus-musculus) proporcionadas por el

bioterio del Instituto de Biotecnologia de la UNAM, con un peso promedio de 200 g.
En la tabla 1 se muestra la distribución de grupos experimentales.
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Tabla 2. Distribución de las ratas y la dieta implementada

Número de
Grupos experimentales Dieta implementada
ratas
3 A0 Dieta balanceada
3 AI Solución de sacarosa 35 %
3 AII Solución de sacarosa 35 %
3 AIII Solución de sacarosa 35 %
Total de ratas =12

Las ratas del grupo A0 fueron usadas como control negativo para conocer los
parámetros de una rata saludable, la dieta que se les suministró contenía; 24% de
proteína, 7% fibra, 8% minerales, 1.2% calcio y 13 % humedad.
Las ratas del grupo AI fueron utilizadas como control positivo induciendo un modelo
de obesidad con una dieta rica en sacarosa, la cual consistía en una solución de
35% sacarosa, se suministró como agua de bebida por aproximadamente 6
semanas, una vez que la dieta concluyó las ratas alcanzaron un peso corporal de
500g. Los grupos restantes AII y AIII siguieron el mismo tratamiento que el grupo
AI.

Se suministró al grupo AII una dosis de 0.02ml/g peso de rata, de jugo de toronja
en dilución 1:9 en agua, cada 8 horas por 9 semanas mediante vía oral con ayuda
de una cánula, mientras que al grupo Alll se le suministró una dosis 0.02 ml/g peso
de rata , de jugo de toronja en dilución 1:19 en agua, con la misma duración de
tratamiento y características que el grupo All.

Una vez concluido el tratamiento todas las ratas fueron sometidas a un ayuno de un
día con únicamente agua para poder realizar las muestras de sangre por punción
cardiaca. La cual requirió de .03ml de pentobarbital sódico como anestesia por vía
intraperitoneal, enseguida sin demorar demasiado se realizó el muestreo. Se extrajo
aproximadamente 1ml de sangre por roedor en un tubo recolector sin
anticoagulante. Debido a lo invasivo que puede ser la punción cardiaca, los roedores
fueron sacrificados de acuerdo a los aspectos éticos en el manejo de animales para
experimentación.

Las muestras de sangre serán utilizadas para la determinación de colesterol HDL,

LDL, triglicéridos y colesterol total siguiendo los procedimientos basados en la
metodología de Spin React.
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IV. 5. Procedimiento

Parte A. Obtención de suero sanguíneo

Las muestras de sangre se colocan en tubos de centrifugador sin anticoagulante y

se centrifugan por 5min a 3500 r.p.m., el sobrenadante se recolecta y es utilizado
para las determinaciones posteriores.

Parte B. Determinación de Colesterol (LDL)

Fundamento: Determinación directa del LDLc (colesterol de lipoproteínas de baja

densidad) sin necesidad de pre-tratamiento o centrifugado de la muestra. La
determinación se realiza en dos pasos.

A. Composición de reactivos

Reactivo R1:
 Tampón PIPES pH 7.0, 50mmol/L
 Colesterol esterasa (CHE) >600U/L
 Colesterol oxidasa (CHOD) > 500U/L
 Catalasa >600KU/L
 TOOS 2mmol/L

Reactivo R2:
 Tampón PIPES pH 7.0, 50mmol/L
 4-Aminoantipirina 4mmol/L
 Peroxidasa >4KU/L

B. Procedimiento

Pipetear en tubos de ensayos las siguientes cantidades de acuerdo al cuadro.

 Mezclar adecuadamente e incubar durante 5 min a 37°C

 Añadir 100 microlitros del reactivo R2 a cada tubo
 Mezclar nuevamente e incubar durante 5min a 37°C
 Medir la absorbancia a 600nm
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Para calcular la concentración de LDL utilizar la siguiente relación

Parte C. Determinación de Colesterol (HDL)

Fundamento: Las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) y baja densidad (LDL)
del suero o plasma, se precipitan con fosfotungstato en presencia de iones
magnesio. Tras la centrifugación, el sobrenadante contiene lipoproteínas de alta
densidad (HDL). La fracción de HDL colesterol se determina utilizando el reactivo
enzimático de colesterol total.

A. Composición del reactivo

Reactivo R

 Ácido fosfotúngstico 14mmol/L

 Cloruro magnésico 2mmol/L

B. Procedimiento

Se dosifica en tubos de centrifuga las siguientes sustancias en base al cuadro

siguiente.

 Se mezclan y se dejan reposar 10 minutos a temperatura ambiente.

 Se centrifuga 20min a 4000 r.p.m. o 2min a 12000 r.p.m.
 Recoger el sobrenadante y procesar como muestra en la determinación de
colesterol total.

La determinación de HDL se determinara con el siguiente cálculo

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Parte D. Determinación de triacilglicéridos (LPL)

Fundamento: Los triglicéridos incubados con lipoproteinlipasa (LPL) liberan glicerol

y ácidos grasos libres. El glicerol es fosforilado por glicerolfosfato deshidrogenasa
(GPO) y ATP en presencia de glicerol quinasa (GK) para producir glicerol-3-fosfato
(G3P) y adenosina-5-difosfato (ADP). El G3P es entonces convertido a
dihidroxiacetona fosfato (DAP) y peróxido de hidrogeno (H2O2) por GPO. Al final,
el peróxido de hidrogeno (H2O2) reacciona con 4-aminofenazona (4-AF) y p-
clorofenol, reacción catalizada por la peroxidasa (POD) dando una coloración roja

A. Composición del reactivo

Reactivo R:

 GOOD pH 6.3, 50mmol/L

 p-Clorofenol 2mmol/L
 Lipoproteína lipasa (LPL) 150000U/L
 Glicerol quinasa (GK) 500U/L
 Glicerol-3-oxidasa (GPO) 3500U/L
 Peroxidasa (POD) 440U/L
 4 - Aminofenazona (4-AF) 0.1mmol/L
 ATP 0.1mmol/L

B. Procedimiento

En tubos de ensayo se agregaran las siguientes soluciones de acuerdo a al

cuadro siguiente y después se medirán las absorbancias de la muestra y del
patrón. Calibrar usando el blanco de reactivos.

 Mezclar adecuadamente e incubar durante 10min a 25°C

 El color es estable como mínimo 30min
 Medir la absorbancia a 500nm
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La concentración de triglicéridos se determinara usando la siguiente relación

Parte E. Determinación de colesterol total

Fundamento: El colesterol es determinado después de la hidrólisis enzimática y

oxidación. El indicador quinoneimine esta formada por el peróxido de hidrógeno y
4-aminofenazona en la presencia de fenol y peroxidasa

A. Composición del reactivo

Reactivo RI:
 4-aminofenazona 0.4mmol/L
 Fenol 26mmol/L
 Peroxidasa 650U/L
 Colesterol esterasa 1000U/L
 Colesterol oxidasa 300U/L
 Tampón de pipes 90mmol/L pH:6.9

B. Procedimiento
En tubos de ensayo se agregaran las siguientes soluciones de acuerdo al cuadro
siguiente y después se medirán la absorbancia de la muestra y del patrón.
Calibrar usando el blanco de reactivos.

 Mezclar adecuadamente e incubar durante 10min a 25°C

 El color es estable como mínimo 60minutos
 Medir la absorbancia a 500nm

La concentración de colesterol se determinara con la siguiente relación:

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V. RESULTADOS

Cuadro 16. Determinación de lípidos totales, triacilglicéridos y colesterol en suero

Tratamiento Triacilglicéridos Colesterol Colesterol Colesterol

(mg/dL) HDL LDL total
(mg/dL) mg/dL
Antes
Después

VI. DISCUSIÓN

VII. CONCLUSIONES

VIII. BIBLIOGRAFÍA

Alberts, B. Jonson, A. Lewis, J. Raff, M. Roberts, K. Walter, P. 2002. Molecular

Biology of The Cell. Ari S, Heldin CH, Krauss G, Purton M, Eds. Garland Science,
USA.

Boyer R.F. 2005. Concepts in Biochemistry. 3th Edition. Wiley, Hoboken. NJ.

Lehninger L. A. 1982. Bioquímica: Las Bases Moleculares de la Estructura y

Función Celular. 2da. Ediciones Omega, S. A. Barcelona.

Mathews, CK. 2002. Bioquímica. Nishizuka Y, Fantl WJ, Marshall CJ, Egan SE,
Eds. McGraw-Hill – Interamericana, España.