ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

PRÁCTICA Nº 14
Aislamiento e Identificación de
Clostridium perfringens
ASIGNATURA :

Microbiología de los Alimentos I

DOCENTE :

Dra. Graciela Albino Cornejo

ALUMNO :

Rómulo Aycachi Inga

CICLO :

2007 - II

Lambayeque, 03 de abril de 2008.

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 PRÁCTICA Nº 14
Aislamiento e Identificación de
Clostridium perfringens
I. Introducción:

El género Clostridium está formado por más de cien especies con limitada relación
genética y propiedades bioquímicas diversas. Comprende a bacilos grampositivos,
anaerobios, esporulados. Son ubicuos pudiendo ser encontrados en el suelo y aguas
residuales así como también en la flora intestinal de hombres y animales. En su mayoría
son saprofitos, pero los patógenos pueden causar graves enfermedades como gangrena
gaseosa, botulismo, tétanos, infecciones de piel y partes blandas, colitis asociada a
antibióticos e intoxicaciones alimentarias.
La capacidad para provocar enfermedad esta vinculada a la posibilidad de sobrevivir
en condiciones ambientales adversas mediante la formación de esporas, crecer
rápidamente y producir toxinas histolíticas, enterotoxinas y neurotoxinas.
Clostridium perfringens es la especie del género Clostridium más frecuentemente
aislada en materiales clínicos. Es un bacilo gram positivo grande (1μm de ancho por 4
μm de largo, en promedio) de bordes rectos y extremos romos. Desarrolla rápidamente
en anaerobiosis, produciendo colonias grandes (1 a 3 μm de diámetro) que muestran
doble halo de hemólisis en las placas de agar sangre.
Sus características morfológicas, la demostración de presencia de esporas, el rápido
desarrollo en anaerobiosis y algunas propiedades bioquímicas (lecitinasa) conforman un
perfil que facilita su rápida detección en el laboratorio.
C. perfringens es agente etiológico de muchas enfermedades y es la tercera causa de
toxinfección alimentaria bacteriana después Samonella spp. y Saphylococcus aureus.
Existen dentro de la especie cinco tipos llamados A, B, C, D y E. C. perfringens A
es el responsable de la mayoría de los procesos infecciosos. Produce una enterotoxina
(polipéptido de 35.000 daltons de peso molecular) que se comporta como un
superantígeno promoviendo la liberación de mediadores de inflamación en forma
masiva.
La enterotoxina es susceptible a pronasa pero no a tripsina ni quimiotripsina. En el
intestino delgado, la enterotoxina se une a un receptor de membrana del ribete en cepillo
e induce una alteración de la permeabilidad calcio dependiente resultando en una
pérdida de iones y metabolitos. Esta pérdida electrolítica altera la función metabólica
intracelular provocando daño morfológico y eventual lisis.
La enfermedad se produce cuando el individuo ingiere alimento contaminado con un
elevado número de organismos productores de enterotoxinas (100 millones).
Los alimentos que pueden estar contaminados son carnes vacuna, pollo, salsas
cocinadas y no refrigeradas. Cuando los alimentos llegan al intestino delgado se
produce la esporulación y la liberación de enterotoxinas.
No son comunes los brotes familiares pero si los producidos a través de alimentos
preparados comercialmente y destinados a restaurantes o instituciones.
Para confirmar la existencia de una enfermedad de este tipo es necesario recuperar
el agente de la muestra clínica y del paciente. Se deben recuperar al menos 100.000
UFC de C. perfringens por gramo de alimento y 1.000.000 de microorganismos por
gramo de heces en las primeras 24 horas. Es posible detectar anticuerpos contra la
enterotoxina pero ellos no tienen valor protector

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II. Objetivos:

- Determinar la presencia de C. perfringens sulfito reductores de muestras de

alimentos.
- Familiarizarse con los métodos de aislamientos de bacterias anaeróbicas en
alimentos.
- Tomar conciencia de los peligros que ocasionan la presencia de estos
microorganismos en los alimentos.

III. Materiales:

- Medios de Cultivo: Agar - Tubos de ensayo con tapa rosca

Wilson-Blair. - Pipetas
- Diluyente: Agua peptonada - Frascos estériles
- Muestras: Agua de acequia, - Gradillas
pescado fresco salado. - Mechero Bunsen
- Baño María

IV. Procedimiento:

- Para muestra de agua:

a. Tomamos 5 tubos de ensayo a los cuales les agregaremos 5 mL de aguas
servidas a cada uno.
b. Luego agregaremos el medio Wilson-Blair, previamente calentado
(disuelto) en el baño María.
c. El agua servida debe haber sido también calentada, previamente, en el
baño María a 80 ºC por 10 min.
d. Al medio le agregamos la solución sulfato-ferrosa.
e. Luego incubamos los tubos en anaerobiosis a 37 ºC por 48 h.
f. Se observarán, de ser positivas, colonias negras en la profundidad.
g. Los resultados se dan en “esporas de Clostridium sulfito reductoras/100
mL”.

- Para muestra de alimentos:

a. La muestra de pescado es eviscerada, le sacamos la piel, las agallas y si
hubiera, los intestinos.
b. Luego, ponemos todo eso en un frasco estéril y le agregamos el diluyente
(agua peptonada) la cantidad suficiente. Homogenizamos.
c. Luego realizamos las diluciones respetivas (10-1, 10-2, 10-3).
d. De las diluciones realizadas sembramos por método de “siembra en
profundidad”, una placa por cada dilución.
e. Luego enviamos a incubar, en anaerobiosis, a 37 ºC por 48 h.
f. Al igual que en la anterior, la positividad de las colonias se verá por su
característico color negro.

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 V. Resultados:

- En la muestra de alimentos (pescado fresco salado), no se llegó a aislar C.

perfringens. En las placas utilizadas crecieron otro tipo de bacterias, pero no con
las características deseadas, típicas del género a estudiar.

10-1 10-2 10-3

- El grupo que trabajó con la muestra de agua obtuvo resultados positivos (sulfito-
reductores).

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VI. Preguntas:

- ¿Cuáles son las pruebas bioquímicas utilizadas para identificar C. perfringens?

a. Para la identificación bioquímica de C. perfringens se realizan las sgte.
Pruebas bioquímicas:
 Fermentación de azúcares: glucosa, lactosa, ramnosa, manitol.
 Hidrólisis de: almidón, gelatina, esculina, caseína, DNA, lecitina.
 Producción de: hidrógeno sulfurado, indol, gas.

- ¿Cómo se consigue un medio anaerobio para la incubación de las bacterias de

este tipo?
 Como los anaerobios estrictos varían en su sensibilidad al oxígeno,
existen diferentes métodos para disminuir la cantidad de oxígeno en los
cultivos; algunos sencillos y otros mucho más complejos.
 Botellas, tubos o matraces completamente llenos con el medio de cultivo
y los tapones apropiados, proporcionan condiciones anóxicas
suficientemente buenas para el crecimiento de muchos anaerobios.
 También es posible añadir algún compuesto químico que reacciona con
el oxígeno del aire y la reduce hasta H2O. Un buen ejemplo de esto es el
tioglicolato, comúnmente utilizado para ensayar el requerimiento de
oxígeno de un microorganismo. Después de que el tioglicolato reaccione
con el oxígeno del tubo, el oxígeno puede penetrar solamente en la parte
superior, donde el medio contacta con el aire.
 Para quitar todas las trazas de oxígeno para el cultivo de anaerobios
puede utilizarse una “jarra de anaerobios”. El aire de la jarra de sustituye
por una mezcla de hidrógeno y anhídrido carbónico y, en presencia de un
catalizador, se consumen las trazas de oxígeno que todavía quedan, esto
proporciona condiciones totalmente anóxicas para el crecimiento de
anaerobios estrictos.

VII. Referencias:

- Apuntes sobre bacteriología (2003) Clostridium perfringens y Clostridium

botulinum. Obtenido el 15 de marzo de 2008 en
http://www.bvsops.org.uy/pdf/clostridium.pdf
- PINEDA, Yuraima, APONTE, Fanny y SANTANDER, Jorge. AISLAMIENTO
DE Clostridium perfringens EN UN TERNERO DE VENEZUELA. RC, jun.
2004, vol.14, no.3, p.226-229. ISSN 0798-2259.
- MADIGAN, M., J. MARTINKO, P. PACK. 1998. Biología de los
Microorganismos de Brock. 8º edic. Edit. Prentice Hall. Madrid.