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Pontifícia Universidade Católica do Paraná

Curso de Farmácia
Disciplina de Fitoquímica
Prof. Joceline Franco

ROTEIRO DE PESQUISA DOS


METABOLITOS SECUNDARIOS

Quercetina*

* (Fonte: http://it.wikipedia.org/wiki/Immagine:Quercetina_struttura.PNG)

Curitiba
2016
ROTEIRO DE PESQUISA DOS METABOLITOS SECUNDARIOS – EXTRATO AQUOSO

PREPARO DO EXTRATO AQUOSO A 20%

Para o preparo do extrato, o material botânico deve ser seco, triturado a fragmentos menores
ou reduzido a pó (idealmente).

Preparar 200 mL de extrato aquoso para as analises, segundo o fluxograma abaixo:

Amostras secas pulverizadas (anotar peso)

Extrato com água – anotar volume

Maceração (B.M. a 60° C por 2 horas)

Variação: Maceração por 72 horas à


temperatura ambiente

Filtrar

Resíduo (marco)

Extrato aquoso

Para os grupos que trouxerem o extrato pronto, proceder conforme orientação da


professora.

No nosso caso das aulas, o extrato inicial obtido após a filtração será utilizado para as
pesquisas e será armazenado em geladeira em frascos de vidro.

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1) Caracterização dos extratos:
a. cor
b. odor
c. sabor
d. pH
e. aspecto

2) Teste do Resíduo Seco (Teor de Sólidos solúveis)


 Em cápsula de porcelana devidamente preparada e pesada, acrescentar 5 ml da solução
extrativa em teste;
 Pesar em balança analítica a solução extrativa;
 Evaporar o solvente em banho-maria
 Colocar o material em estufa de ar circulante calibrada a 105 °C;
 Quando todo líquido estiver evaporado e o peso da cápsula de porcelana estiver constante
(em 3 pesagens consecutivas com intervalo de 15 minutos entre elas, o peso não
apresentar variações consideráveis), retirar da estufa;
 Anotar o peso do resíduo seco.

3) Calcular o peso do resíduo seco por ml de solução extrativa e por g de solução extrativa;

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4) Pesquisa de glicosídeos antociânicos
Separar três porções de 2 mL do extrato aquoso em tubos de ensaio.
Tubo 1: acidificar com acido sulfúrico 1N (pH3)
Tubo 2: alcalinizar com hidróxido de sódio 1N (pH 10)
Tubo 3: neutralizar (pH7)
Observar se houver ou não desenvolvimento de coloração.
Em meio acido  tons avermelhados
Em meio alcalino  tons azulados
Em meio neutro --. Tons violáceos
Coloração verde  flavonóides.
As antocianinas são pigmentos hidrossolúveis, encontram-se na forma de sais, são
encontradas principalmente em flores, frutos e tecidos em coloração que vão do roxo ao violeta e
azul. Comportam-se como indicadores de acido base. Possuem caráter anfóero, com ácidos
formam sais de oxônio corados de vermelho, com base reagem com as hidroxilas fenólicas livres e
adquirem a coloração azul devido à estrutura quinóide. A união de acido glicosídeo ocorre através
da hidroxila C3. As colorações dos compostos antociânicos variam com o pH.

5) Pesquisa de glicosídeos saponínicos.


A) Pesquisa de saponinas - Teste qualitativo de espuma
- Agitar energicamente os três tubos de ensaio anteriores (glicosídeos antociânicos) por 5 minutos.
- Medir a altura da espuma formada e deixar em repouso por 30 minutos.
- Observar a presença de espuma persistente (por 15 minutos).
- Reação positiva = permanência da espuma.
- Reação negativa = desaparecimento da espuma.
- As saponinas possuem propriedades emulsiva. As soluções aquosas são coloidais e a formação
de espuma é devido à tensão superficial elevada das soluções.

B) Pesquisa de saponinas – porção genina após hidrólise.


HIDRÓLISE DE SAPONINAS
- coloque em um aparelho de refluxo 20 mL de extrato aquoso e adicione 80 mL de água.
- adicione 10 ml de acido clorídrico
- deixe o processo em refluxo por 1 hora e deixe esfriar (GUARDAR EM FRASCO DE VIDRO
ÄMBAR NA GELADEIRA)
- transfira o liquido já resfriado para um funil de separação de 200 ml e adicione 20 ml de
clorofórmio
- Aguardar separação de fases e coletar a fração clorofórmica em 6 tubos de ensaio.
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PROCESSOS GERAIS DE IDENTIFICAÇÃO DAS SAPONINAS
Para cada identificação, evapore a fase orgânica obtida anteriormente em tubo de ensaio e
proceda as reações, conforme descrição abaixo.

 Reação de Rossol
- No tubo de ensaio onde foi realizado a evaporação de 5 ml da fase orgânica, adicione 1 gota de
acido sulfúrico concentrado
- o desenvolvimento de uma coloração vermelha ou violeta, indica a presença de sapogenina

 Reação de Mitchell
- no tubo de ensaio onde foi realizado a evaporação de 5 ml da fase orgânica, adicione 1 gota de
acido sulfúrico concentrado e vestígios de nitrato de prata
- o desenvolvimento de uma coloração avermelhada indica a presença de sapogenina

 Reação de Rosenthalen
- no tubo de ensaio onde foi realizado a evaporação de 5 ml da fase orgânica, adicione 1 ou 2
gotas de vanilina a 1% em acido clorídrico diluido
- aqueça esse essa solução até aparecimento de coloração azul

 Reação com reativo de Sulfo-vanílico


- no tubo de ensaio onde se realizou a evaporação de 5 ml da fase orgânica, adicione 1 ou 2 gotas
de vanilina a 1% em ácido sulfúrico diluido
- verifique o aparecimento de uma coloração violeta-azulada

 Reação de Libermann
- no tubo de ensaio onde foi realizado a evaporação de 5 ml da fase orgânica, dissolva o resíduo
em 2 ml de acido acético glacial
- adicione 1 ou 2 gotas de cloreto férrico a 3%
- adicione pela parede do tubo 1 ou 2 ml de acido sulfúrico sem agitar
- a presença de um anel avermelhado ou verde entre os dois líquidos indica a presença de
derivados esteroidais
- a presença de uma anel azul entre os dois líquidos indica a presença de derivados triterpenóides.

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6) Pesquisa de cianogênicos
TESTE DE GUIGNARD (PAPEL PICRO-SÓDICO)

Preparação do papel de filtro picro-sódico: (já preparado)

 Impregnar tiras de papel de filtro da seguinte maneira: gotejar 2-3 gts no papel de filtro
solução a 10% de ácido pícrico.
 Logo a seguir, gotejar 3-4 gts de solução de carbonato de sódio a 10%.
 Colocar este papel para secar antes do uso. Reservar.

- Transferir para um tubo de ensaio 5 mL de extrato aquoso de modo a não umedecer as paredes
do tubo e 1 mL de solução aquosa de acido sulfúrico 1N.
- Suspender uma tira de papel picri-sódico com auxilio de uma rolha de cortiça, de modo que o
papel não toque o extrato.
- Levar o tubo de ensaio ao banho maria a 60°, durante 30 minutos.
- Se houver HCN, após alguns minutos, o papel passará do amarelo para o alaranjado e, depois
para o vermelho.
Reação + = papel adquire coloração vermelha, devido ao desprendimento de HCN.
Reação + falsa = quando o papel tocar nas paredes do tubo ou na solução.

R C N + Reagente de Guignard Ácido Isopurpúrico


(c oloração vermelha)

7) Pesquisa de aminogrupos

- Concentrar 5 mL de extrato aquoso até 1 mL (a 50° C).


- depositar em cromatoplaca de CCD em pontos previamente determinado, 3 gotas de extrato
concentrado.
- Deixar secar e nebulizar o reativo de Ninhidrina, (seg. FAHNY e col.) ou colocar uma gota do
reativo sobre a mancha.
- Aquecer em estufa 90-100° C durante 15 minutos.
- Desenvolvimento de coloração azul-violacea indica a presença de aminogrupos. Exceção: prolina
e hidroxiprolina- cor amarela.
- Proceder a análise para o extrato hidroalcoólico

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8) Pesquisa de taninos

A) TESTES DE IDENTIFICAÇÃO:

TUBO 1 – GELATINA
2 mL da extrato aquoso + 2 gotas de HCl diluído + solução de gelatina a 2,5% gota a gota.
Se ocorrer formação de precipitado: reação positiva para taninos.

TUBO 2 – CLORETO FÉRRICO


2 ml da extrato aquoso + 10 ml de água destilada + 2-4 gotas da solução de FeCl3 a 1% em
metanol. Observar colocaração.
Cor Azul: taninos hidrolisáveis ou gálico
Cor Verde: taninos condensados ou catéquico

TUBO 3 - ACETATO DE CHUMBO


5ml da extrato aquoso + 10 ml da solução de ácido acético a 10% + 5 ml da solução de acetato de
chumbo a 10%.
Formação de um precipitado esbranquiçado: presença de taninos hidrolisáveis.

TUBO 4 - BRANCO
Contém apenas 5 mL do extrato aquoso para comparação.

B) REAÇÃO DE STIASNY - SEPARAÇÃO DOS TANINOS HIDROLISÁVEIS E


CONDENSADOS
- Submeter a refluxo por 30 minutos, 50 ml da solução A + 15 ml do reativo de Stiasny.
- Os taninos condensados originam um precipitado vermelho (flobafenos).
- Os taninos hidrolisáveis permanecem em solução e podem ser assim detectados: 10 ml do filtrado
+ 5 g de acetato de sódio + 2-4 gotas da solução de FeCl3 a 1% em metanol.
Cor Azul: reação positiva.
Obs.: Reativo de Stiasny (reparar no momento de uso): 5 ml de HCl conc. + 10 ml de formol sob
refluxo por 20 minutos. Também chamada de reação formol-clorídrica.

Para pesquisa de taninos, outras reações podem ser úteis, por exemplo: Cloridrato de emetina (ou
outros alcalóides), Água de bromo, Cianeto de potássio, Acido nitroso, Dicromato de potássio e
outros sais férricos.
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ROTEIRO DE PESQUISA DOS METAB. SECUNDARIOS – EXTRATO HIDROALCOÓLICO

PREPARO DO EXTRATO HIDROALCOÓLICO A 20%.

Para o preparo do extrato, o material botânico deve ser seco, triturado a fragmentos menores
ou reduzido a pó (idealmente).

Preparar 200 mL de extrato hidroalcoólico para as analises, segundo o fluxograma abaixo:

Amostras secas pulverizadas (anotar peso)

Extrato com etanol a 70% (v/v) – anotar volume

Maceração (B.M. a 60° C por 2 horas)

Variação: Maceração por 72 horas à


temperatura ambiente

Filtrar

Resíduo (marco)

Extrato hidroalcoolico

Concentrar no rotavapor até 1/3 do volume

Extrato concentrado

Extração sucessiva com: éter de petróleo (fração 1),


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Clorofórmio (fração 2), acetato de etila (fração 3),

n-Butanol (fração 4) e o extrato restante (fração 5).


O solvente deve ser evaporado a cada etapa da extração em banho-maria até que não haja
mais a presença do mesmo. No extrato residual acrescenta-se etanol a 70%, completando o
volume inicial.
Com as frações obtidas, realizam-se os ensaios fitoquímicos.
Para os grupos que trouxerem o extrato pronto, proceder conforme orientação da
professora.
No nosso caso das aulas, o extrato inicial obtido após a filtração será utilizado para as
pesquisas e será armazenado em geladeira em frascos de vidro.

1) Caracterização dos extratos:


f. cor
g. odor
h. sabor
i. pH
j. aspecto

2) Teste do Resíduo Seco (Teor de Sólidos solúveis)


 Em cápsula de porcelana devidamente preparada e pesada, acrescentar 5 ml da solução
extrativa em teste;
 Pesar em balança analítica a solução extrativa;
 Evaporar o solvente em banho-maria
 Colocar o material em estufa de ar circulante calibrada a 105 °C;
 Quando todo líquido estiver evaporado e o peso da cápsula de porcelana estiver constante
(em 3 pesagens consecutivas com intervalo de 15 minutos entre elas, o peso não
apresentar variações consideráveis), retirar da estufa;
 Anotar o peso do resíduo seco.

3) Calcular o peso do resíduo seco por ml de solução extrativa e por g de solução extrativa;

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4) Pesquisa de flavonóides

NÚCLEO FUNDAMENTAL
3'

2' 4'

8
B
O 2 5'
7
6'
A C
6 4 3

5
O
2-fenil-crom ona
(2-fenil-benzopinona)

A) Reação de Shinoda ou Reação de Cianidina


o Colocar 2 mL do extrato hidroetanólico em uma cápsula de porcelana e evaporar em
Banho Maria (45ºC) até secura (+/- 25-40min).
o Lavar o resíduo da cápsula com 0,2mL de clorofórmio para eliminação da clorofila,
ainda no BMº.
o Redissolver o resíduo da cápsula com 1mL de etanol 70% e transferi-lo para um
tubo de ensaio.
o Adicionar 200mg de magnésio metálico em pó ou raspas no tubo.
o Verter cuidadosamente, pelas paredes do tubo, inclinado, cerca de 1mL de HCl
concentrado (CUIDADO! Pode ocorrer projeções, reação exotérmica).
o Observar a coloração, esperando-se que se desenvolva uma coloração róseo-
avermelhada.
REAÇÃO POSITIVA (COM COR) REAÇÃO NEGATIVA ( SEM COR)
-Flavona - amarelo a vermelho -Chalconas
-Flavonol - vermelho a vermelho-sangue -Auronas
-Dihidroflavonol - vermelho a vermelho- Dihidrochalconas
sangue -Isoflavonas
-Flavanona - vermelho a violeta -Isoflavononas
-Deriv. antociânicos – vermelho para rosa

Deve aparecer coloração vermelha, quanto mais intensa a cor, maior a concentração dos
flavonóides.

B) Reação de cloreto férrico


- dilua o extrato com água na proporção de 1:5
- coloque em dois tubos de ensaio 5ml da solução

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- em um dos tubos, coloque 1 gota de cloreto férrico a 2% pela parede do tubo
- a cor pode variar entre verde, amarelo-castanho e violeta de acordo com o tipo de composto
flavonoídicos.

C) Reação oxalo-bórica
- evaporar 2 mL do extrato hidroalcoolico a secura num tubo de ensaio,
- ao resíduo adicionar 5 gotas de acetona e 30 mg da mistura de acido bórico e acido oxálico,
agitar.
- Evaporar a secura,
- ao resíduo adicionar 5 mL de éter etílico, agitar.
- Examinar a solução etérea sob luz UV. O aparecimento de fluorescência indica reação positiva.

5) Pesquisa de cumarinas:
- Aquecer em chapa-quente, durante cerca de 10 minutos, o pó da droga vegetal em uma câmara
de microssublimação (o sublimado apresenta-se sob a forma de gotas incolores ou cristais
aciculares).
- Dissolver o sublimado obtido com 0,5 ml de metanol.
- Em uma folha de papel filtro (10cm x 4cm), pingar 5 gotas em cada ponto, de modo a obter 2
manchas de 1cm de diâmetro. A uma delas adicionar 1 gota de sol alcoólica de KOH ou NaOH
10% e secá-la.
- Depois de seco, pingar na mesma mancha, 1 gota de solução alcoólica de hidróxido de potássio;
cobrir uma mancha com papel preto e coloca-las em exposição às radiações ultravioletas (lâmpada
UV com de 254 a 366nm). A mancha exposta adquire, pouco a pouco, fluorescência verde, já
aparente ao final do primeiro minuto.
- Descubra depois a outra mancha e verifique que, de início, esta não possui fluorescência, mas
também a adquire por idêntica exposição às radiações ultravioleta.
- Reação + para cumarinas : Fluorescência azul-verde

O O OH OH
COOH

KOH /s ol. alco ólica luz U V


COOH

cumarin a ácido cis-o-hidróxicinâmico ácido o -cumárico


(flu ores cência verd e)

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6) Pesquisa de antraquinonas

A) REAÇÃO DE BORNTRÄGER DIRETA


- Transferir 5 mL de extrato hidroalcoólico para um tubo de ensaio;
- Adicionar ao filtrado 1mL da solução de NaOH a 10%.
- Verificar coloração formada (rósea-vermelho para antraquinonas)

B) REAÇÃO DE BORNTRÄEGER INDIRETA COM HIDRÓLISE


- Transferir 20 mL do extrato hidroalcoólico para um béquer
- Adicionar 30 ml de ácido sulfúrico a 5 %, aquecer em banho Maria por 15 minutos, agitando e
esfriar.
- Transferir para um funil de separação;
- Adicionar 20 ml de hexano e agitar vagarosamente, por inversão.
- Decantar e transferir em torno de 5 ml da camada hexânica para tubo de ensaio.
- Adicionar 2 a 3 ml de hidróxido de amônio diluído.
- Observar a coloração da camada amoniacal.

7) Pesquisa de esteróides ou triterpenos


- Evaporar o extrato hidroalcoólico ate secura em banho Maria.
- O resíduo seco dissolver com 5 mL de clorofórmio.
- Separar alíquotas de 0,1:0,5 e 1,0 mL do extrato cloroformico para tubos de ensaio e completar o
volume para 2,0 mL com clorofórmio (conforme tabela abaixo).
- Efetuar a reação de Liberman- Bouchardart (1 mL anidrido acético + 2 gotas de cloreto férrico a
3% + 2 mL de acido sulfúrico concentrado = adicionar lentamente o acido, reação exotérmica
violenta).
A formação de uma coloração rósea ou azul esverdeado indica a presença da função cetona na
posição C3 e duplo enlace no C5-C6, enquanto que a coloração verde indica função –OH na
posição C3 e duplo enlace no C5-C6 e quando ocorrer coloração amarela indica possivelmente
presença de –CH3 em C14.
Pesquisa de esteróides e/ ou triterpenóides
Extrato a ser pesquisado clorofórmio Volume total resultado
0,1 mL 1,9 mL 2,0 mL +
0,5 mL 1,5 mL 2,0 mL ++
1,0 mL 1,0 mL 2,0 mL +++

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8) Pesquisa de Alcalóides.
Método geral:
- Evaporar 25 mL do extrato hidroalcoólico até secura.
- Dissolver o resíduo com 1 mL do etanol e adicionar 10 mL de HCL a 1%,
- Transferir para 5 tubos de ensaio, 0,5 mL de extrato hidrocloridrico (em cada tubo), o quinto tubo
é usado como referencia.
- Acrescente a cada tubo de ensaio 3 gotas dos reagentes de MAYER, DRAGENDORFF,
BOUCHARDAT, BERTRAND, respectivamente;
- Observe a formação de turvação e/ou turvação
Reativo de MAYER  precipitado branco ou leve turvação
Reativo de DRAGENDORFF precipitado de coloração tijolo
Reativo de BOUCHARDAT  precipitado de coloração alaranjada
Reativo de BERTRAND  precipitado branco ou leve turvação

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PESQUISA DE ÓLEOS ESSENCIAIS

A) Doseamento do óleo essencial

 Montar o aparelho de Clevenger, utilizando o balão de 500ml.


 Colocar em torno de 30g da droga em balão de fundo redondo. Juntar cerca de 250ml de
água destilada/deionizada.
 Adaptar o balão ao aparelho de Clevenger. Colocar água destilada no coletor graduado do
aparelho até transbordar pelo tubo de retorno.
 Ligar o aquecedor ao máximo até o início da fervura. Depois baixar em temperatura
suficiente para destilar.
 Destilar até que o volume de óleo essencial separado se mantenha constante, durante meia
hora. Tempo de destilação de 4-5 horas.
 Deixar esfriar e fazer a leitura de óleo essencial no coletor graduado do aparelho.

A1) Cálculo
% de óleo volátil = volume de óleo volátil coletado (ml) x 100
(V/P) Peso da amostra (g)

B) Verificação de adulterações de óleos essenciais - Teste no papel de filtro


Depositar algumas gotas de óleo essencial em uma folha de papel filtro. Secar. Observar:
Se estiver diluído com etanol, não haverá formação de manchas translúcidas.
Se estiver diluído com óleo fixo, vai formar uma mancha bem translúcida.
Se estiver diluído com outro óleo essencial, não vai formar mancha translúcida, porém
cheiro diferente do óleo puro.

P AE AF

P = Óleo essencial padrão


AE = Amostra do óleo essencial
AF = Amostra do óleo fixo

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REFERÊNCIAS

DINIZ, A. ROTEIRO PARA EXECUÇÃO DAS AULAS PRÁTICAS DE FARMACOGNOSIA.


Disponível em: http://www.docstoc.com/docs/downloaddoc.aspx/?doc_id=395309. Acesso em:
08/03/2010.

MATOS, F. J. de Abreu. Introdução à fitoquímica vegetal. Fortaleza: EUFC, 1988. 126 p.

MOUCO, G.; BERNARDINO., N.J.; CORNÉLIO, M.L.. Controle de qualidade de Phyllanthus niruri
L. (Quebra-pedra). Revista Biotecnologia Ciência e Desenvolvimento. n. 31, p. 68-73, 2003.

NAKASHIMA, T. Manual prático de fitoquímica. Curitiba: Departamento de Farmácia - UFPR,


1993. 25p.

NAKASHIMA, T. Étude Phytochemique Évaluation dês Activités Antifongiques et antivirales


de trois Verbenaceae:Lippia alba N. B. Brown, Lippia multiflora Mold., Citharexylum
myrianthum Cham. These de Docteur de INP, Toulouse, France, 198p., 1993.

SIMÕES, C. M. O.; SCHENKEL, E. P.; GOSMANN, G.; MELLO, J. C. P.; MENTZ, L. A.;
PETROVICK, P. R. Farmacognosia: da planta ao medicamento, 5. Ed., Porto Alegre - RS:
Editora UFRGS e UFSC, 2005.

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