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EXTRAÇÃO, PURIFICAÇÃO E DETERMINAÇÃO DO

PONTO ISOELÉTRICO DA CASEÍNA DO LEITE


AULA PRÁTICA

Introdução

Os aminoácidos apresentam pelo menos dois grupos que são passíveis de sofrer
protonação (adição de H) e desprotonação (remoção de H+). Estas alterações estão
representadas na Figura 1.

Fig. 1 - Etapas de ionização dos aminoácidos.

A Figura demonstra as etapas de ionização em que podem ser encontrados os


aminoácidos:
1. Forma positivamente carregada ou catião;
2. Forma eletricamente neutra. Existe uma densidade de carga negativa e uma
densidade de carga positiva sobre a molécula, conferindo carga total nula. Essa forma
também é denominada isoelétrica ou zwitteriónica.
3. Forma negativamente carregada ou anião.

Estas formas são encontradas em maior ou menor quantidade dependendo do pH em


que a solução do aminoácido se encontra. Isso porque quanto menor o valor de pH,
maior a concentração de iões H+ em solução e, consequentemente, maior a prevalência
da forma positivamente carregada (1). Em contrapartida, quanto maior o valor de pH,
menor a quantidade de iões H+ em solução, havendo prevalência da forma
negativamente carregada (3). A forma eletricamente neutra (2) só poderá existir numa
condição de pH intermédia à existência predominante da forma positiva e negativa do
aminoácido. Esses valores de pH podem ser facilmente determinados
experimentalmente, sendo obtida uma curva de titulação do aminoácido (Figura 2).

- Início da titulação: aa em pH ácido


- Adição de base
- pH aumenta e ocorre a ionização do
grupo carboxílico
- pI (ponto isoelétrico) – carga líquida
igual a zero
- início da ionização do grupo amínico

𝑝𝐾1 − 𝑝𝐾2
𝑝𝐼 = = 5.97
2

Fig. 2 - Curva de titulação de um aminoácido (glicina).

A caseína é uma proteína encontrada no leite e, assim como outras proteínas, a sua
solubilidade depende de vários fatores, dentre eles o pH. Para todas as proteínas existe
um valor de pH no qual elas apresenta carga elétrica líquida igual a zero. Essa forma
também é também denominada de isoelétrica ou zwitteriónica.
A solubilidade das proteínas depende de vários fatores. Dentre eles, destaca-se a
presença das cargas elétricas ao longo da molécula. A existência de uma carga positiva
ou negativa determina a interação com o meio aquoso, além de estabelecer um estado
de repulsão entre as próprias moléculas de proteína, aumentando a interação com o
solvente e, consequentemente, favorecendo a solubilidade. Uma vez que no ponto
isoelétrico existe um equilíbrio entre o número de cargas positivas e negativas, o que
gera uma situação em que as forças de repulsão entre as moléculas de proteína e as
forças de interação com o solvente são mínimas. Assim, as proteínas vão formando
aglomerados que, cada vez maiores, e acabam por precipitar.

Materiais
Leite desnatado;
solução de ácido acético 1M
solução de hidróxido de sódio 1M;
etanol 95% (v/v);
éter etílico
copo de vidro;
proveta - 100 mL;
conta-gotas ou pipeta de Pasteur;
funil;
papel de filtro;
tubos de ensaio.

Procedimento
Obtenção da caseína
 Aquecer 150 mL de água destilada a 38°C e em seguida adicionar50 mL de leite.
 A essa solução adicionar ácido acético (aproximadamente 0,7 mL) gota a gota
até o aparecimento de um precipitado abundante.
 Deixar a solução em repouso (~ 20 minutos) para a proteína sedimentar.
Decantar e remover o sobrenadante.
 Adicionar ao precipitado 20 mL de etanol, misturar bem, filtrar ou centrifugar
(3000 rpm durante 5 minutos) e remover a componente líquida.
 Ao precipitado (ou sedimentado) adicionar 5 mL de éter etílico e, após agitação,
filtrar novamente. Secar o filtrado em papel de filtro.
Preparação da solução da caseína
 Colocar 1g do precipitado num copo de vidro;
 Adicionar 50ml de água destilada;
 Adicionar 25 ml de NaOH 1M;
 Agitar lentamente para evitar formar espuma;
 Adicionar 25ml de ácido acético 1M e agitar cuidadosamente;
 Acertar pH até à neutralidade usando as soluções de ácido ou base.

Determinação do ponto isoelétrico da caseína


 Preparar 9 tubos de ensaio numerados com os conteúdos: 1º tubo: 3,2 mL de
ácido acético e 6,8 mL de água destilada (misturado vigorosamente após a
adição);
 Preparar os restantes tubos (tubo 2 a tubo 9) com 8 mL de água destilada.
 Retirar 2 mL do tubo de ensaio 1 para o tubo de ensaio 2 e agitar.
 Transferir 2 mL do tubo 2 para o tubo 3 e assim sucessivamente até ao tubo 9.
Os 2 mL retirados do tubo 9 são desprezados de forma a que todos os tubos
mantenham o mesmo volume.
 Medir o pH de cada tubo e registar os valores.
 Adicionar 1 mL da solução de caseína a cada tubo e agitar.
 Aguardar 15 minutos com os tubos em repouso e registar as alterações no que
respeita à turbidez, em cada tubo.
 Determinar o ponto isoelétrico da caseína.

Registo de resultados:
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 Tubo 7 Tubo 8 Tubo 9
pH
Turbidez