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INTRODUCCIÓN
las últimas pocas décadas. Los inmunoensayos son uno de los progresos analíticos más
Mientras que las variantes de los inmunoensayos son demasiado numerosas como para ser
los residuos presentes en los alimentos, la identificación de las bacterias y los virus, y la
los vegetales modificados genéticamente. Con cualquier campo científico nuevo se elabora
una jerga para los términos importantes. Para comprender completamente los
Las dos partes claves de cualquier inmunoensayo son los antígenos y los anticuerpos. Un
son proteínas producidas por los animales como respuesta a un antígeno. Dichas proteínas
Los anticuerpos pueden desarrollar afinidades de unión notablemente fuertes por sus
covalentes más fuertes conocidas entre las moléculas. No es excepcional que se obtengan
constantes de afinidad, para la unión entre el anticuerpo y el antígeno, que alcancen los
1012 L/mol. Esto significa que, en el equilibrio, con concentraciones similares del a¡¡
Puesto que el anticuerpo y el antígeno son cruciales para cualquier inmunoensayo, resulta
útil comprender mejor la estructura básica del anticuerpo y cómo se une al antígeno. La
una molécula con forma de «Y», compuesta por cuatro cadenas poli peptídicas que se
encuentran unidas por enlaces disulfuros dentro y entre las cadenas. Dos de las cadenas
poli peptídicas son idénticas y, aproximadamente, el doble de grandes que las otras dos
cadenas poli peptídicas idénticas entre sí. A causa de sus tamaños relativos primer par se
conoce como las cadenas pesadas (H) y el segundo par como las cadenas ligeras (L). En
150.000.
El antígeno es ligado por dos lugares de unión idénticos, formados por las porciones
Los diferentes anticuerpos, producidos por las distintas. Células B, pueden presentar
unión, tanto para la cadena pesada como para la ligera. Esto conduce a una diversidad
extraordinaria
de lugares de unión para los diferentes anticuerpos. Por ejemplo, un ratón posee 107-108
anticuerpos diferentes (y, como mínimo, el mismo número de células B distintas), cada cual
con un Jugar de unión exclusivo. El resto, del anticuerpo (apartado del lugar de unión) es
bastan1c constante y las pequeñas variaciones en esta región dan como resultado las
diferentes clases de anticuerpos. La Figura 17-1 es, en realidad, un ejemplo de la clase más
Para comprender los inmunoensayos, la parte a estudiar más importante del anticuerpo es el
lugar de unión El lugar de unión del antígeno es una hendidura entre lazos de una cadena
poli peptídica pesada y una ligera Desde un punto de vista molecular, esta hendidura es
bastante grande. Algunos experimentos con hidratos de carbono han indicado que el lugar
de unión está relleno de un oligosacárido dextrano formado por siete unid des de glucosa.
Dicho de otra manera, el peso molecular de la porción del antígeno que puede ocupar dicha
La comprensión del lugar de unión del anticuerpo ayuda a definir más a fondo el antígeno
ligado. El anticuerpo se une a la parte exterior del antígeno en una región especifica. Esta
región específica ligada por un único lugar de unión del anticuerpo se conoce como el
epítopo (o determinante antigénico). Por otra parte, la unión del anticuerpo al antígeno no
supone un enlace covalente sino las mismas interacciones que son responsables de la
estructura terciaria de las proteínas. Estas interacciones incluyen las electrostáticas, los
enlaces de hidrógeno y las fuerzas de van der Waals. Mientras que estas últimas
interacciones, las de van der Waals, ·son las más débiles, a menudo pueden ser las más
importantes debido a que cada uno de los átomos puede contribuir a la unión anticuerpo-
antígeno, siempre que los átomos se encuentren muy próximos unos a otros (general
aproximadamente 0,3-0,4 nm). Este requisito de una es- trecha proximidad es la causa de
que la unión del anti- cuerpo al antígeno sea considerada como algo parecido a la
interacción entre una cerradura y una llave, en la cual las superficies del lugar de unión del
se utiliza anticuerpo sérico de cualquier animal, hay muchos anticuerpos diferentes que
conoce como anticuerpos policlonales. Los científicos sabían que las células B individuales
producían anticuerpos con sólo un tipo de lugar de unión, pero eran incapaces de cultivar
las células B fuera del animal. Sin embargo, en 1975, Kohler y Milstein (1) fusionaron con
éxito células de mieloma, o cáncer, 'con células B. Las nuevas células fusionadas, o
hibridomas, retenía las propiedades de ambas células progenitoras. Es decir, podían ser
cultivadas, al igual que las células cancerosas, y producían anticuerpos como las células B.
Los anticuerpos producidos por medio de este procedimiento pasaron a ser conocidos como
aspectos y se unen al antígeno con sólo un tipo de lugar de unión; es decir, un único epitopo
es ligado. Por otra parte, los hibridomas eran «inmortalizados» mediante el procedimiento
y, con un cuidado apropiado, podían producir tanta cantidad de anticuerpo idéntico como
fuese requerida. No le llevó mucho tiempo a la comunidad científica apreciar las tremendas
galardonados con el Premio Nobel por su trabajo. Mientras que, de entrada, los anticuerpos
monoclonales son mucho más costosos de producir, hay la posibilidad de obtener ilimitados
los hibridomas a gran escala, en cámaras para el crecimiento de células. Para muchos
fabricantes de inmunoensayos, estas ventajas pesaron más que lo costes iniciales de
desarrollo.
II. LA TEORIA
Todos los inmunoensayos deben cumplir dos requisitos. El primero es que debe haber
algún método para separar o distinguir entre el antígeno libre y el antígeno ligado. En
fructuosos fue desarrollado por Yalow y Berson (2), en 1960. Este procedimiento hace uso
131
de yodo radioactivo; ·_ I, un radioisótopo «caliente» con una vida media de tan. sólo
ocho días. Esta rápida desintegración radioactiva permitió cumplir el segundo requisito de
antígeno libre, satisfaciendo así el primer requisito para un inmunoensayo. Para otros
la adsorción del antígeno libre sobre carbón activo o la precipitación selectiva con sulfato
permaneció el marcaje con yodo radioactivo y estos ensayos pasaron a ser conocidos como
Una característica común de las proteínas, la cual resulta útil en los inmunoensayos, es la
unión de las pro- teínas a las diversas superficies hidrófobas. Las proteínas presentan
amplias regiones que contienen grupos hidrófobos, los cuales prefieren no ser expuestos al
agua. Estos grupos hidrófobos apolares incluyen los hidrocarburos y los grupos aromáticos,
los cuales prefieren interactuar con grupos semejantes, antes que con un di- solvente polar
tal como el agua. En condiciones acuosas, estas regiones se unirán a otras superficies
hidrófobas por medio de interacciones de van der Waals, excluyen- do el agua. Las
este tipo de unión incluyen el carbón vegetal, la nitrocelulosa y el plástico. Para los
los más populares se encuentran las microplacas, hechas de plásticos tales como el
poliestireno. Típica- mente, dichas microplacas se fabrican con un formato de 96 pocillos
individuales, cada uno de ellos con una capacidad de, aproximadamente, 300 µL de
disolución. Para identificar los pocillos, las filas se etiquetan verticalmente desde la A hasta
de que las proteínas se unen aleatoriamente al fondo y las paredes de los pocillos de la
placa, por me- dio de interacciones hidrófobas. Las interacciones hidrófobas entre las
proteínas y estas superficies aumentan a temperaturas más bajas (a causa de una menor
agitación molecular) y con una fuerza iónica de la disolución incrementada (que aumenta la
polaridad del disolvente). Además, los detergentes pueden recubrir las superficies
hidrófobas y deben ser utilizados con cuidado, de tal modo que no interfieran con la unión
(ELISA)
Por más que los RIAs daban buenos resultados, estaban confinados a laboratorios
especialmente equipados, debido a los peligros asociados con la utilización del yodo
uso de campo, hasta que se desarrollaron los marcadores enzimáticos. Unos pioneros de
El enzima ideal para un ELISA o un inmunoensayo enzimático es uno que sea muy estable,
se enlace fácil- mente a los anticuerpos o los antígenos, y catalice rápidamente un cambio
observable frente a un sustrato sim- ple. En la etapa final de un ELISA, el enzima sobrante
reacciona con un sustrato para generar una molécula que es coloreada y que puede ser
seguimiento del desarrollo de la coloración causada por la acción del enzima se conoce
como un lector de placas para ELISA. Sorprendentemente, con los muchos enzimas
disponibles, un enzima, la peroxidasa de rábano silvestre (o rábano picante) es, con mucho,
el más popular (4). La peroxidasa de rábano silvestre es muy estable, con muchos
de moléculas. Sin embargo, lo más importante es el hecho de que este enzima presenta, con
muchos sustratos incoloros, con velocidad de reacción catalítica muy rápida, para producir
una coloración. Otros enzimas utilizados para los inmunoensayos incluyen la fosfatasa
fosfatasa alcalina ha sido el siguiente enzima más popular para los ínmunoensayos
enzimáticos.
de ELISA competitivo, hay una relación inversa entre la cantidad de color desarrollada y la
exceso de anticuerpo se elimina por me- dio del lavado y la prueba está lista para el
muchos compuestos que podrían actuar como antígenos. Sin embargo, el anticuerpo
eliminada por lavado. Observe que las flechas entre las secciones de la Figura 17-3
indican una etapa de lavado seguida por la introducción de una disolución distinta.
antígeno presente. Es decir, hay una proporcionalidad directa entre la intensidad del
color observado en la etapa final y la cantidad de antígeno presente en la muestra
emparedado, se pueden utilizar más anticuerpos para la captura del antígeno. Este
partes una disolución de un anticuerpo policlonal. Una parte se une al plástico para
monoclonales, pero en ese caso hay que extremar las precauciones puesto que no se
captura como para el de detección, puesto que sólo un único tipo de epítopo es
debe ser capaz de unirse a dos anticuerpos al mismo tiempo y, por consiguiente,
debe poseer al menos dos epítopos distintos, reconocidos por anticuerpos diferentes.
Sin embargo, muchas de las moléculas analizadas en los alimentos no son tan grandes
como las proteínas, sino que son moléculas pequeñas tales como las. toxinas, o los
restos de antibióticos o pesticidas. En estos casos hay varios problemas que describen
una molécula debe presentar un peso molecular superior 5.000 para ser percibida
pequeña se conoce como un hapteno. Las moléculas más comunes utilizadas como
portadoras son proteínas que sean bastante solubles, por sencillez en el enlazado
Las moléculas portadoras típicas incluyen las proteínas de la albúmina de una especie
diferente, tales como la albúmina de suero bovino, y las hemocianinas, las cuales se
que se requieren dos epítopos diferentes para que se unan ambos· anticuerpos. Una
la forma de un hapteno, o bien la inmovilización del anticuerpo. Para unir el hapteno a una
superficie tal como la nitrocelulosa o el plástico, una vez más puede ser enlazado en primer
lugar a una proteína que se una a estas superficies hidrófobas. Sin embargo, la proteína
V. LAS APLICACIONES
VI. RESUMEN
VIII. REFERENCIAS