UNIVERSITE DE REIMS CHAMPAGNE-ARDENNE

U.F.R. DE SCIENCES

Licence :
Sciences de la Vie et de la Terre
METH0501
Thème : Immunologie – « Défendez-vous »

Fascicule de Travaux Pratiques

Immunocytochimie

M. TARPIN
B. BRASSART
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A lire attentivement :

Les Travaux Pratiques ne commencent pas le 1er jour du T.P. mais bien avant
par la lecture et la compréhension de vos fascicules.

Par exemple :

* les quantités de poudres ou les volumes de solutions mères pour effectuer

vos solutions ou vos dilutions doivent être calculées,

* l’organisation de vos manipulations doit être planifiée afin de gerer au mieux

la chronologie de votre séance de T.P. (aucun retard possible),

* le but et le principe du T.P. doivent être compris afin de pouvoir interpréter

les résultats que vous allez obtenir lors de la séance de T.P.,

* les technologies (méthodes et principes) utilisées lors de séances

précédentes (semaines, mois ou années précédents votre séance de T.P.)
doivent être revues, comprises et acquises.

Rappelez-vous que vous êtes en troisième année d’études supérieures dans une Unité
d'enseignement que vous avez choisie de suivre. Les enseignants sont là pour
harmoniser l’autonomie de chaque groupe, pour vous apprendre des technologies
nouvelles et pour vous conseiller dans votre organisation.

Ils ne sont en aucun cas là pour faire le T.P. à votre place.

L’équipe enseignante
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 1ère partie : Rappels Théoriques sur les Techniques utilisées.

1°) Techniques d’immunocytochimie :

Le but de ces techniques est de localiser un ou plusieurs antigènes au niveau cellulaire,

tissulaire, organismique, en se basant sur la spécificité de la réaction antigène/anticorps.

Immunocytochimie directe :

Réhydratation des coupes. Saturation des sites aspécifiques avec une solution « neutre » (solution ne
présentant pas de réactivité avec les anticorps utilisés). Lavages des coupes. Dépôts sur les coupes de
la solution d’anticorps marqués anti-antigène(s) recherché(s). Incubation avec cette solution
d’anticorps. Lavages pour éliminer l’excès d’anticorps n’ayant pas réagi. Détection des anticorps.
Observation.

L’immunocytochimie directe permet de visualiser directement les antigènes que l’on cherche à
mettre en évidence.

Immunocytochimie indirecte :

Réhydratation des coupes. Saturation des sites aspécifiques avec une solution « neutre » (solution ne
présentant pas de réactivité avec les anticorps utilisés). Lavages des coupes. Dépôts sur les coupes de
la solution d’anticorps non marqués anti-antigène(s) recherché(s). Incubation avec cette solution
d’anticorps. Lavages pour éliminer l’excès d’anticorps n’ayant pas réagi. Détection des anticorps
primaires par adjonction d’anticorps secondaires marqués anti-anticorps primaires. Incubation avec les
anticorps secondaires marqués. Lavages pour éliminer l’excès d’anticorps secondaires n’ayant pas réagi.
Détection des anticorps secondaires. Observation.

L’immunocytochimie indirecte permet de visualiser indirectement les anticorps que l’on cherche
à mettre en évidence.

Marquage des anticorps :

Quelque soient les marqueurs utilisés, ils sont liés de manière covalente aux niveau des parties
terminales des fragments Fc des immunoglobulines afin d’interférer le moins possible avec les
paratopes. Les principaux marqueurs sont soient :

Des fluorochromes (FITC, rhodamine, phycoérythrine…)

Des enzymes ( galactosidase, phosphatase alcaline, peroxydase)
Des radioéléments à rayonnement faible (3H)

Témoins :

Comme pour toute expérience les témoins sont nécessaires pour valider le résultat expérimental
obtenu. Ils permettent de savoir si le signal positif obtenu est imputable soit à une fixation aspécifique
des anticorps marqués, soit à une fluorescence naturelle du tissu, soit encore à la présence endogène
du marqueur utilisé.
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 2ème partie : Travaux Pratiques.

REACTION ANTIGENES/ANTICORPS sur COUPE (IMMUNOCYTOCHIMIE).
APPLICATION à l'ETUDE d'ORGANES LYMPHOÏDES PRIMAIRES et SECONDAIRES.

Vous observerez, au microscope optique, des coupes histologiques de thymus, ganglions lymphatiques,
intestin et rate de souris et/ou de rat, colorées à l'hémalun/éosine pour repérer les différentes structures des
tissus . Vous observerez ensuite au microscope optique, (en allant du plus petit grossissement jusqu'à l'objectif
suivant [pas celui à immersion qui est cerclé de rouge]), des coupes traitées par la technique directe avec un anti-
IgG de souris fait chez la chèvre (GAM-IgG-HRP : Goat Anti Mouse-IgG-Horse Raddish Peroxidase) et marqué par
la peroxydase du raifort ou un anti-IgM de souris fait chez la chèvre (GAM-IgM-HRP : Goat Anti Mouse-IgM-
Horse Raddish Peroxidase) et marqué par la peroxydase du raifort.

Le protocole expérimental qui a permis d’obtenir les lames d’immunocytochimie que vous allez
observer est le suivant :

1. Récupération du tissu,
2. Fixation de l’objet,
3. Déshydratation de l’objet,
4. Inclusion dans la paraffine,
5. Réalisation des coupes au microtome,
6. Fixation des coupes sur lame,
7. Réhydratation des coupes,
8. Incubation en présence d’H2O2 3%,
9. Lavages,
10. Saturation avec une solution de sérum albumine bovine (BSA) à 3%,
11. Dépôt des anticorps marqués à la peroxydase du raifort (GAM-IgG ou GAM-IgM),
12. Incubation 1 heure à 37°C,
13. Lavages,
14. Dépôt de la solution de révélation (H2O2 0,03%, DAB 0.05%),
15. Lavages,
16. Déshydratation,
17. Montage entre lame et lamelle
Lame [GAM-IgG] ou [GAM-IgM] : les étapes 1 à 17 sont réalisées
Pour les plaques de Peyer vous disposez en plus de 2 lames contrôle :
Lame [+ DAB] : les étapes 8 à 12 ne sont pas réalisées
Lame [+3% H2O2 + DAB] : les étapes 10 à 13 ne sont pas réalisées
Aidez-vous des schémas ci-après pour retrouver les différentes structures observées, légender
vos dessins et positionner les marquages observés.

Thymus de souris :
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Rate de souris :

Cellules B
Travée de conjonctif.

Zone T

Manchons périartériolaires
avec ou sans centre
germinatif.
Artérioles

Pulpe blanche : follicules

spléniques = zones marginales +
Pulpe rouge : hématies, manchons périartériolaires.
macrophages et plasmocytes

Zone marginale (cellules de séparation entre pulpe rouge et

pulpe blanche). Cellules dendritiques, macrophages
spécialisés dans la présentation d’antigènes.

Ganglion lymphatique de souris :

Follicules primaires.

Follicules secondaires.

Zone paracorticale.

Médulla.

Cordons médullaires.

Vaisseau lymphatique efférent.

Capsule conjonctive.
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Tissu lymphoïde associé aux muqueuses (type GALT) : Plaque de Peyer de Rat

Paroi du tube digestif

Diverticules intestinaux

Lumière
Lamina propria

Ilots de Lüberkün

Dômes, chapeaux Plaques de Peyer, éventuellement

ou couronnes des organisées en follicules secondaires
follicules

Vous disposez des lames suivantes (nombre de lames disponibles) :

Hémalun-Eosine + DAB + 3% H2O2 + DAB Anti-IgM Anti-IgG

Plaque Peyer 8 8 8 8 8
Rate 8 - - 1 1
Ganglion 8 - - 1 1
Thymus 8 - - 1 1

Faire un dessin légendé des 4 organes lynphoïdes et positionner sur le dessin la localisation des immuno marquages
avec les anti-IgG et anti-IgM. Interpréter le rôle des 2 lames témoins : [+DAB] et [+ 3% H2O2 + DAB].