PROVAS BIOQUÍMICAS PARA IDENTIFICAÇÃO DE BACILOS GRAM-

NEGATIVOS

Esta aula tem como objetivo a identificação de enterobactérias em

gêneros ou espécies, através da utilização de meios de cultura especiais que
possibilitam a verificação da presença de enzimas bacterianas relacionadas ao
metabolismo de vários substratos. As alterações nos meios produzidas pelo
metabolismo bacteriano servirão de base para sua identificação de acordo com
o esquema a seguir:

1) PLAQUEAMENTO SELETIVO

É a etapa de isolamento bacteriano a partir do espécime clínico,

utilizando meios seletivo-indicadores como o Agar EMB. A presença dos
corantes eosina amarela e azul de metileno inibem as bactérias Gram positivas.
Ao prepararmos este meio, a eosina e o azul de metileno reagem e formam o
eosinato de azul de metileno (sal). As bactérias Gram negativas que fermentam
lactose (LAC+) e, consequentemente, produzem ácidos que dissociam este sal,
apresentando-se como colônias rosa-avermelhadas com ou sem um centro
negro, devido ao azul de metileno, enquanto as não fermentadoras (LAC-)
formam colônias transparentes.

2) CONFIRMAÇÃO BIOQUÍMICA
É um conjunto de provas bioquímicas necessárias para a identificação das
colônias suspeitas. Serão utilizados os meios abaixo. Estes meios totalizam
oito testes que somados ao da fermentação da lactose permitem identificar
com fidelidade a grande maioria das enterobactérias isoladas em espécimens
clínicos.
A) Meio EPM
O meio EPM contém os testes de fermentação e produção de gás a partir de
glicose, produção de H2S, hidrólise da uréia e desaminação de triptofano.
B) Meio MILi
O Meio MILi contém os testes de motilidade, indol e descarboxilação de
lisina.
C) Citrato de Simons
Este teste permite identificar espécies que utilizam citrato como única fonte
de carbono.
 2.1) Fundamento teórico:

 Hídrólise da uréia: Este teste verifica a habilidade de um microrganismo

em utilizar a uréia, formando duas moléculas de amônia pela ação da
enzima urease (uréia  2 NH3 + CO2 + H2O).
 Motilidade: O teste visa verificar se a bactéria é móvel ou imóvel. Logo
pode ajudar na diferenciação de alguns gêneros como por exemplo
Enterobacter (usualmente +) e Klebsiella (-). A mobilidade das bactérias
é proporcionada pela presença de um ou mais flagelos. As bactérias
imóveis não possuem flagelos.
 Produção de indol: Este teste tem como princípio determinar a
habilidade de um microrganismo em produzir indol a partir da molécula
de triptofano. Pode ajudar na diferenciação de alguns gêneros de
bactérias como, por exemplo: E. coli (usualmente +) do grupo Klebsiella-
Enterobacter (-).
 Citrato de Simmons: Este teste visa determinar se um microrganismo é
capaz de utilizar citrato como uma única fonte de carbono para o seu
metabolismo, resultando em uma alcalinidade no meio. As bactérias
citrato positivas crescem usando sais de amônia como fonte de
nitrogênio, liberando amônia e conseqüentemente deixando o meio
alcalino. O indicador de pH é o azul de bromotimol, que em meio ácido
fica amarelo e em meio básico, azul.
 Produção de H 2S: Este teste visa determinar a capacidade de produção
de íons S-2 a partir do metabolismo bacteriano.
 Produção de gás: Este teste visa determinar a capacidade de produção
de gás CO2 a partir da fermentação da glicose.
 Descarboxilação de lisina: Este teste visa determinar a capacidade de
descarboxilar a lisina, por ação da enzima lisina descarboxilase.

2.2) Procedimento:
Tocar a colônia com agulha bacteriológica e semear os 3 meios na
seguinte ordem: Citrato, EPM e MILi. Para inocular o meio de citrato deslizar a
agulha pelo centro estriando toda a superfície inclinanda. No meio EPM
introduzir a agulha até o fundo do tubo e ao retirá-la semear a superfície do
meio enquanto o MILi deve ser semeado por picada central que deve atingir o
fundo do tubo.
 2.3) Leitura e interpretação:
A) Meio EPM:
 Produção de gás: Aparecimento de bolhas ou deslocamento do meio de
cultura do fundo do tubo.
 Produção de H 2S: Enegrecimento do meio em qualquer intensidade.
 Hidrólise da uréia: Aparecimento de cor azul ou verde azulada (reação
fraca) que se estende para a base do meio, envolvendo-a totalmente ou
não.
 Desaminação do triptofano: Aparecimento de cor verde-garrafa na
superfície do meio.

B) Meio MILi
 Motilidade: A bactéria móvel cresce além da linha de picada. A
imóvel somente nesta linha.

Resultado Cor do meio

Positivo (+) Crescimento fora do local da picada
Negativo (-) Crescimento ao redor da picada

 Descarboxilação da lisina: Quando a lisina é descarboxilada o meio

adquire cor púrpura acentuada ou discreta. Quando o aminoácido não é
utilizado, o meio adquire cor amarelada nos seus 2/3 inferiores.
Considerar o teste positivo sempre que o meio não estiver amarelo.
 Produção de indol: Adicionar 3 gotas a 4 gotas do reativo de Kovacs à
superfície do meio e agitar levemente. Quando a bactéria produz indol, o
reativo adquire cor rosa ou vermelha. Quando não produz, o reativo
mantém sua cor inalterada.

Resultado Cor do reagente

Positivo (+) Rosa
Negativo (-) Amarelo

C) Meio Citrato de Simmons

 A utilização do citrato revela-se pelo aparecimento de cor
azul na superfície do meio. O teste deve ser considerado negativo quando a cor
do meio não sofre alteração.

Resultado Cor do meio

Positivo (+) Azul
Negativo (-) Verde

SISTEMA NUMÉRICO PARA ENTEROKIT B

As 9 reações bioquímicas do Enterokit B foram agrupadas em 3 conjuntos

de provas. O resultado de cada um destes conjuntos produz um algarismo, de
modo que o resultado dos 3 conjuntos produz um número de 3 dígitos, que
identifica uma espécie bacteriana.

Os 3 conjuntos de provas e seus valores são:

Primeiro algarismo (A) Segundo algarismo(B) Terceiro algarismo(C)

Lactose 4 Urease 4 Indol 4

Gás 2 LTD 2 Lisina 2
H2S 1 Mot 1 Citrato 1

Observações:
1) Para a interpretação das provas ver item Leitura e Interpretação.
2) Quando a reação da cepa investigada é positiva (+), colocamos o número
correspondente. Exemplos: Urease + = 4, Lisina + = 2. Se a reação é negativa
(-), colocamos para a mesma o valor 0. 3) Em seguida somamos os valores
obtidos em cada série. O valor de A dá o primeiro algarismo, o valor de B dá o
segundo e o valor de C dá o terceiro algarismo.

Assim por exemplo uma cepa que apresente o seguinte resultado bioquímico:

Lactose - 0 Urease +4 Indol -0

Gás -0 LTD +2 Lisina -0
H2S +1 Mot +1 Citrato +1
 Total: 1 Total: 7 Total:1

terá o número 171 que corresponde na relação à bactéria Proteus mirabillis