Você está na página 1de 30

Marcus Vinicius Carina

Eficiência Antibacteriana da Própolis


Sobre as Bactérias das Vias
Respiratórias

Trabalho de conclusão de curso


apresentado ao Senac – Unidade
Osasco , como exigência parcial para
obtenção do grau de Especialista em
Gestão da Segurança de Alimentos.

Mediado por Prof. Tarcila N. Lange

Validação Técnica: MARCUCCI, Maria


Cristina e PARK, Yong Kun.

Osasco

2016
S999p Carina, Marcus Vinicius

Eficiência Antibacteriana da Própolis Sobre


as Bactérias das Vias Respiratórias /
Marcus Vinicius Carina – São Paulo, 2016.30 f. ; il.

Orientador: Mediado por Prof. Tarcila Neves Lange.


Trabalho de Conclusão de Curso (Pós-Graduação em Gestão
da Segurança de Alimentos) – Centro Universitário Senac,
São Paulo, 2016.

1. Própolis. 2. Staphylococcus aureus 3. Streptococcus


pyogenes 4. Streptococcus pneumoniae 5.
Mycobacterium tuberculosis I. Carina, Marcus Vinicius
(Media.) II. Título

Marcus Vinicius Carina

2
Eficiência Antibacteriana da Própolis Sobre as Bactérias das

Vias Respiratórias

Trabalho de conclusão de curso apresentado ao Centro


Universitário Senac São Paulo – Santo Amaro, como
exigência parcial para obtenção do título de especialista em
Gestão da Segurança de Alimentos.

Mediado por Prof. Tarcila Neves Lange

A banca examinadora dos Trabalhos de Conclusão, em sessão pública


realizada em 12 / 02 /_2017, considerou os(as) candidatos(as):

1) Examinador (a)

2) Examinador (a)

3) Presidente

Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio
convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, DESTE QUE CITADA ESTA
FONTE INDIRETA: Marcus Vinicius Carina, ou as fontes consultadas conforme ABNT..

3
AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, por me proporcionar a oportunidade de viver, em


seguida a minha família pela paciência nos momentos difíceis e de minha
esposa Malu por me dar fôlego e vontade de progredir todos os dias.

Ao SENAC: especialmente a Dra. Suzana Cristina Camacho Coordenadora do


Curso, que sempre me orientou nos momentos de dificuldades, e também a
Prof. Tarcila Neves Lange, e Flávia Auler que compartilharam com sabedoria
suas experiências como pesquisadoras, agradeço pelo, companheirismo e
paciência, aos professores, em especial Prof. Daniela Pane por suas dicas.

Amostras de Própolis Verde Especial : gentilmente cedidas por Leila Rodrigues


Nunes de Formiga- MG.

Laboratórios de Apoio: Diretora Cientifica Ivone F. Silva do Laboratório


Analytical Science (Campinas), pela amizade e empenho na coordenação do
método e esboço do Projeto e interpretação dos ensaios, Dr. Ewerton
Hernandez do Cefar Laboratório Avançado de Culturas de Cepas e
Diagnóstica, pelo cultivo e desenvolvimento de Cepas biológicas.

A Polenectar: Celso Dall'Agnol, que cedeu as instalações da empresa e os


materiais nescesários para fabricação dos Extratos, e realização de ensaios.

UNICAMP e Ensaios: Ao Prof. Marcelo. Lancellotti do Instituto de Biologia da

Unicamp (USP Campinas), e pelo prof. Marcelo Sato do Instituto de Biociências

da USP São Paulo, pela tarefa de ambos em realizarem os diversos ensaios,

sem o quais este trabalho não seria possível.

Validação Técnica: Em especial a Dra. Prof. Maria Cristina Marcucci, pelo


apoio, validação e revisão do projeto, pela ajuda também nos ensaios.

4
Isso é para os loucos, os desajustados, os rebeldes, os
desordeiros, para os peixes fora d’água, para aqueles que
veem as coisas de forma diferente. Eles não gostam de regras
e não nutrem o menor respeito pelo status quo. Você pode
excitá-los, discordar deles, glorificá-los ou difamá-los. A única
coisa que você não pode fazer é ignorá-los. Porque eles
transformam as coisas, eles impulsionam a raça humana pra
frente. E enquanto alguns podem vê-los como loucos. Nós
vemos o gênio. Porque as pessoas que são loucas o suficiente
para achar que podem mudar o mundo são aquelas que o
fazem (Steve Jobs, 1997)

Discurso Think Different (pense diferente.).

5
RESUMO

A própolis é um alimento amplamente utilizado no auxilio do tratamento de doenças


respiratórias, portanto é válido um estudo para comprovar a sua eficácia para
estas aplicações. Esta pesquisa possui o objetivo, de comprovar esta eficácia
antibiótica. Deste modo foram elaborados dois extratos de própolis, sendo um a
base de água (aquoso) e outro a base de álcool de cereais (alcoólico). E
ambos foram testados, em quatro concentrações diferentes, contra as bactérias
mais comuns, causadoras de doenças no sistema respiratório humano,
(Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae,
Mycobacterium tuberculosis e Haemophilus influenzae). A pesquisa apresenta
os resultados encontrados nestes ensaios microbiológicos realizados conforme
a norma Metodologia de ensaios de Sensibilidade a Agentes Antimicrobianos
por Diluição (M7-A6, Vol. 23, n°2) da CLSI nos microrganismos alvo. Este
estudo também realizou uma revisão bibliográfica do assunto. Foram
comprovadas as propriedades antimicrobianas e medicinais esperadas. Os
extratos de própolis apresentaram boa atividade antimicrobiana contra todos os
isolados, particularmente a S. pneumoniae, H. influenzae . O objetivo deste
estudo foi alcançado, e encoraja pesquisadores da área encontrarem outros
alimentos naturais que possuem propriedades medicinais como a Própolis, que
podem além de nutrir, auxiliar também na prevenção e tratamento de doenças.
Por fim, o trabalho apresenta os cuidados e riscos na segurança destes
alimentos referente a toxidade e possíveis efeitos alérgicos, e discute
sucintamente os resultados obtidos.

Palavras-Chave: 1. Própolis. 2. Staphylococcus aureus 3. Streptococcus


pyogenes 4. Streptococcus pneumoniae 5. Mycobacterium tuberculosis.

6
ABSTRACT

Propolis is a food widely used aid in the treatment of respiratory diseases, so a


valid study is to demonstrate its effectiveness for these applications. This
research has the objective to prove this antibiotic effectiveness. Thus they were
prepared two propolis extracts, being a water-based (aqueous) and the other to
grain alcohol base (alcohol). And both were tested at four different
concentrations, against the most common bacteria causing diseases in human
respiratory system, (Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes,
Streptococcus pneumoniae, Mycobacterium tuberculosis and Haemophilus
influenzae). The survey shows the results found in these microbiological tests
carried out according to standard assays sensitivity Methodology for Dilution
Antimicrobial Agents (M7-A6, Vol. 23, No. 2) of target microorganisms in the
CLSI. This study also conducted a literature review of the subject. antibiotic and
medicinal properties expected were proven. propolis extracts showed good
antimicrobial activity against all isolates, particularly S. pneumoniae, H.
influenzae. The aim of this study was achieved, and encourages researchers in
the field to find other natural foods that have medicinal properties such as
propolis, which can in addition to nourish also aid in the prevention and
treatment of diseases. Finally, the work shows the care and safety risks of these
foods regarding the toxicity and potential allergenicity, and briefly discusses the
results obtained.

Keywords: 1. Própolis. 2. Staphylococcus aureus 3. Streptococcus pyogenes


4.Streptococcus pneumoniae 5. Mycobacterium tuberculosis.

7
LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 01 – Cromatografia gasosa da propolis verde de Minas Gerais....................15

Figura 02 – Cromatografia de Flavonóides em camada delgada ............................15

Figura 03 – Cromatografia de Compostos fenólicos em camada delgada ..............16

Figura 04 – Obtenção dos extratos de propolis alcoólico e aquoso .........................20

Gráfico 01 – Analise de favonoides Extratos Alcólico e Aquoso ..............................21

Gráfico 02 – Analise de compostos fenólicos dos extratos alcoólico e aquoso ........22

Gráfico 03 – Analise de favonoides dos extratos alcóolico e aquoso .......................22

Figura 05 – Preparação dos discos para cultura de bactérias ................................23

Figura 06 – Inoculação dos microrganismos alvo nas placas de cultura..................23

Figura 07 – Avaliação dos resultados das placas de ensaios microbiológicos ........25

Gráfico 04 – Nível inibição microbiológico alcançado pelo extrato alcoólico ...........24

Gráfico 05 – Nível inibição microbiológico alcançado pelo extrato aquoso ..............24

8
LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Resultado e interpretação das análises de flavonóides ..........................22

Tabela 2 - Resultado e interpretação das análises de compostos fenólicos ............22

Tabela 3 - Resultados dos ensaios de diluicáo e inibição no extrato alcoólico .........25

Tabela 4 - Resultados dos ensaios de diluicáo e inibição no extrato aquoso ...........25

9
SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO .......................................................................................................13

1.1 Objetivo .............................................................................................................14

1.1 Objetivos especificos.........................................................................................14

2 DESENVOLVIMENTO ...........................................................................................15

2.1 Própolis .............................................................................................................15

2.2 Composição química .........................................................................................15

2.2.1 Flavonoides .................................................................................................16

2.2.2 Compostos fenólicos ...................................................................................17

2.3 Atividade antimicrobiana ..................................................................................18

2.4 Segurança alimentar toxidade e alergia ...........................................................18

2.5 Microrganismos alvo .........................................................................................19

2.5.1 Staphylococcus aureus ..............................................................................19

2.5.2 Streptococcus pneumoniae .......................................................................19

2.5.3 Mycobacterium tuberculosis ........................................................................20

2.5.4 Strptococcus pyogenes ...............................................................................20

2.5.5 Haemophilus influenzae .............................................................................20

3. METODOLOGIA...................................................................................................21

3.1 Preparo dos Extratos .......................................................................................21

10
3.2 Ensaios experimentais ..................................................................................22

3.2.1 Análise e ensaios nos extratos ...................................................................22

3.2.2 Análises de flavonóides totais dos extratos .................................................23

3.2.3 Análises de compostos fenólicos totais ......................................................23

3.3. Resultados dos ensaios microbiológicos nos microrganismos alvo .................24

3.3.1 Ensaios e Métodos Analíticos ......................................................................24

3.4 Resultados e discussões ..................................................................................25

4. CONCLUSÕES ...................................................................................................26

4.1 Considerações finais e segurança alimentar ...................................................28

REFERÊNCIAS ........................................................................................................28

11
1. INTRODUÇÃO

A palavra própolis tem sua origem no idioma grego, sendo que pro
significa “em defesa de” e polis significa “cidade”, (MARCUCCI, 1996;
BURDOCK, 1998). É uma substância com consistência de resina ou cera
(KUJUMGIEV et al., 1999). Seus componentes químicos (mais de 200
substâncias) estão distribuídos entre os seguintes princípios ativos: ácidos
fenólicos, flavonoides, sesquiterpenos, lignanas, aldeídos aromáticos, álcoois,
aminoácidos, ácidos graxos, vitaminas e minerais (PARK et al., 2002), além de
ácido cinâmico e seus ésteres (MARCUCCI, 1995).

A principal substância biologicamente ativa da própolis são os


compostos denominados de flavonoides (GUISALBERTI, 1979; PARK et al.,
1998), e são os principais responsáveis pelas ações anti-inflamatória,
antimicrobiana e antifúngica (CUSNHIE e LAMB, 2005). Marcucci (1995)
estudando as propriedades de extratos de própolis verificou uma intensa
atividade antibacteriana, anti-inflamatória e, sobretudo, imune estimulante.

. As investigações sobre as propriedades antibióticas da própolis têm


sido conduzidas, sobretudo na área médica e veterinária, onde o produto tem
demonstrado uma eficiente atividade bacteriostática e bactericida em relação a
diversos gêneros de bactérias Gram positivas e Gram negativas. O efeito da
própolis tem se revelado altamente inibitório para determinados gêneros, tais
como Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus e Mycobacterium, (Prado Filho
et al., 1962; Grange & Davey, 1990).

Tem sido sugerido que a atividade antibacteriana possa estar associada ao alto
conteúdo de substâncias do tipo flavonóides presentes na própolis (Grange &
Davey, 1990).

O Motivo da escolha pelas bactérias Staphylococcus aureus,


Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Mycobacterium
tuberculosis e Haemophilus influenzae é que elas são as bactérias, mais
comuns do aparelho Respiratório. Elas provocam diversas enfermidades e

12
principalmente tem apresentado uma maior resistência a agentes
antimicrobianos sintéticos de hoje em dia, a exemplo da banalização que se
deu, por exemplo, com a penicilina (CONTRERAS, et al., 2007).

Apesar da própolis ser considerada no Brasil um alimento e não um


medicamento, os componentes da própolis conferem-lhe um grande valor
antibiótico atuando contra doenças respiratórias como gripes, resfriados,
faringites, laringites, amidalites, meningites, tuberculoses bronquites e asma. E
como existem vários estudos publicados sobre a eficácia do extrato de própolis
alcoólico, e suas restrições de uso, (por conter álcool), é de grande valia hoje
também comprovar a eficiência do extrato a base de água (aquoso).

1.1 Objetivos

A presente pesquisa tem como principal objetivo avaliar a ação


antimicrobiana da própolis verde em extratos alcoólicos e aquosos, frente os
microrganismos das vias respiratórias, buscando sempre alternativas naturais
para o combate destas enfermidades.

1.1.2. Objetivos Específicos

Analisar a propriedade antimicrobiana do extrato de própolis a base de água


isentando-se a ação esterilizadora do álcool (contida nos extratos alcoólicos).
Comparar a eficácia entre os dois extratos, aquoso e alcoólico frente às
bactérias Respiratórias. Verificar nos extratos alcoólicos se a capacidade
esterilizadora do álcool de cereais, é incorporada á ação antibiótica da própolis
resultando assim em um extrato com ação antibacteriana mais eficaz.

Analisar se o teor dos compostos ativos no extrato de própolis que são os


flavonoides e os compostos fenólicos (quantidade total) realmente influenciam
diretamente nas propriedades antimicrobianas, bactericidas e bacteriostáticas e
influenciem na inibição dos microrganismos alvo das vias respiratórias.

13
2. Desenvolvimento

2.1 Própolis

A própolis é um material de consistência viscosa elaborado pelas


abelhas que coletam a matéria-prima de diversas partes de plantas como
brotos, cascas e exsudatos, transformando-as dentro da colmeia pela adição
de secreções salivares e cera. É um produto natural utilizado durante séculos,
com objetivo medicinal e possui diversas atividades biológicas já comprovadas
como antimicrobiana (MARCUCCI et al., 2001; PARK e IKEGAKI,1998a).

No Brasil a própolis é considerada um alimento, com isto muitos


produtos à base de própolis comercializados hoje no Brasil possuem o seu
registro no Ministério da Agricultura, assim como o mel a geléia real e o pólem.
O MAPA preconiza os limites para fixação de identidade e qualidade da
própolis na Instrução Normativa nº 3, de 19 de janeiro de 2001 (Brasil,
2001). A própolis é usada na maior parte do mundo onde é indicada para
melhorar a saúde e prevenir doenças como inflamação, doenças do coração,
diabetes e câncer (BANSKOTA et al., 2002).

Os produtos apícolas são considerados apenas alimentos no Brasil,


porem são comercializados no exterior, segundo as suas propriedades
medicinais, farmacêuticas, nutricionais; e possuem em nosso país registro
apenas de alimentos, o que obviamente não corresponde à plena verdade de
suas funções (Paulino, 2004).

Costuma-se encontrar na colmeia insetos envoltos em própolis, em


perfeito estado de conservação (Marcucci, 1996), pois a própolis possui é ação
antimicrobiana, o que impede a decomposição do cadáver (Park et al., 1998b).

2.2. Composição química

A própolis é composta por 50% de resina e bálsamo vegetal, 30% de


cera, 10% de óleos, 5% de pólen e 5% de várias outras substâncias e seu

14
emprego na vida da colônia está relacionado com suas propriedades
mecânicas e antimicrobianas, sendo utilizada na construção e adaptação da
colmeia e na garantia de um ambiente asséptico (BURDOCK, 1998;
FUNARI, 2006; MENEZES, 2005; WOISKY et al., 1998).

Figura 1 Cromatografia de Própolis O maior grupo de compostos isolados


Verde Região de Minas Gerais
PROPÓLIS CROMATOGRAFIA da própolis são os flavonóides, os quais junto
com os Compostos Fenólicos e ácidos
carboxílicos modificados são componentes
estratégicos na própolis, pois são
responsáveis pela bioatividade contra vários
microrganismos patogênicos (Burdock, 1998).

Fonte: Evidencias Científicas para Ação Anti Câncer da Própolis de Baccharis Dracunculifolia
Disponível em: https://plus.google.com/111429618210301733135/posts/Nx8dhmnAAdf

2.2.1 Flavonoides

Figura 02 - Cromatografia dos Os flavonóides podem representar uma barreira


Flavonoides camada delgada
a 366 nm. (Padrão Quercertina) química de defesa contra microrganismos
(bactérias, fungos e vírus) e insetos Mas os
flavonóides atuam também em relacionamentos
harmônicos entre plantas e insetos, atraindo e
orientando esses animais até o néctar, contribuindo
enormemente para a polinização (Marcucci, 1998).

Fonte: Revista Brasileira de Farmácia 89(1): 59-63, 2008 disponível:


http://www.rbfarma.org.br/files/pag_59a63_avaliacao_fisico_quimica.pdf.

Existem diversas classes de compostos fenólicos que podem


desempenhar importantes papéis na biologia dos animais, Como os ácidos
fenólicos, como os ácidos benzoicos, cafeico, cumárico e ferúlico, e os
flavonóides, como a apigenina, o canferol e a quercetina (Marcucci, 1998).

15
2.2.2 Compostos Fenólicos

Figura 03 - Cromatografia de Fenóis Em termos de ação farmacológica, a principal


em própolis camada delgada a 366
nm. (Padrão Ácido Gálico) classe de constituintes da própolis são os
compostos fenólicos. Essas substâncias
caracterizam-se pela presença de pelo menos um
grupo hidroxila ligado diretamente a um anel
aromático (Marcucci, 1998).

Fonte: Revista Brasileira de Farmácia 89(1): 59-63, 2008 disponível:


http://www.rbfarma.org.br/files/pag_59a63_avaliacao_fisico_quimica.pdf

Os flavonóides podem representar uma barreira química de defesa


contra microrganismos (bactérias, fungos e vírus), insetos e outros animais
herbívoros. Mas os flavonóides atuam também em relacionamentos
harmônicos entre plantas e insetos, atraindo e orientando esses animais até o
néctar, contribuindo enormemente para a polinização (Marcucci, 1998).

De acordo com as características químicas e biosintéticas, os


flavonoides são separados em diversas classes: flavonas, flavonóis,
dihidroflavonóides (flavanonas e flavonóis), antocianidinas, isoflavonóides,
auronas, neoflavonóides, biflavonóides, catequinas e seus precursores
metabólicos conhecidos como chalconas e podem ocorrer como agliconas,
glicosilados e como derivados metilados (OLDONI, 2007; STALIKAS, 2007).

Atualmente, já foram identificadas mais de quatro mil substâncias


pertencentes ao grupo dos flavonóides (Peterson e Dwyer, 1998). Os
flavonoides mais comuns encontrados na própolis são: o canferol, a quercetina,
a isorramnetina e a galangina são flavonóis; a apigenina, a luteolina, a crisina e
a tectocrisina são exemplos de flavonas; a pinocembrina é uma flavanona e a
pinobanksina é um diidroflavonol (Marcucci, 1998).

16
2.3 Atividade Antimicrobiana

A atividade antimicrobiana in vitro da própolis que se deve aos flavonóides,


ácidos aromáticos e ésteres presentes na resina natural, a galangina,
pinocembrina e pinostrombina são tidos como os flavonóides mais efetivos
contra bactérias. Os ácidos ferúlicos e cafeico também contribuem para a ação
bactericida da própolis (Bosio, 2000).

A própolis possui uma ação marcante sobre bactérias gram-positivas e


uma atividade limitada contra as gram-negativas (Marcucci et al.(2001).

Estudos realizados in vitro com extratos de própolis vêm demonstrando


sua intensa atividade antimicrobiana, pela presença de compostos flavonoides,
ácidos aromáticos e ésteres ( Menezes, 2005, Havsteen, 2002)

2.4 Segurança Alimentar Toxicidade e Alergia

Pode-se afirmar por vários estudos que extratos de própolis possuem


uma baixa toxicidade inata. Estes resultados já eram esperados já que os
flavonóides, principais constituintes da própolis, possuem uma relativamente
baixa toxicidade. Apenar da Baixa toxidade da própolis, devido a sua ampla
utilização, existem vários relatos de reações alérgicas já foram descritos, para
praticamente todas as partes do corpo (Marcucci, 1995; Burdock, 1998).

Foi constatado por A. W. Artomasowa, Rússia, que geralmente as


pessoas alérgicas a picadas de abelhas também são alérgicas ao uso ou à
aplicação de própolis, mel, geleia real e pólen. Explica-se a alergia causada
pelas secreções glandulares das abelhas, que se encontram nos produtos
apícolas em forma de enzimas. (Breyer, 1980; Burdock, 1998).

As partes do corpo afetadas incluem, dentre outras, as mãos, braços,


rosto, pescoço, peito, pés, pálpebra, orelha, vulva e pênis (Burdock, 1998).

Alguns autores relataram que os constituintes dos brotos de álamo são


os possíveis responsáveis pelas alergias à própolis, principalmente derivados

17
do ácido cafeico (Burdock, 1998). A própolis pode induzir dermatites alérgicas,
e segundo Hausen et al. o alergênico principal é o cafeato de 3-metil-but-2-enil,
composto responsável pela atividade antiviral de algumas própolis, como citado
por Amoros et al. (1994).

O flavonoide tectocrisina foi considerado um segundo alérgeno, mas


com atividade muito fraca. Além disso, foram observadas as propriedades
alérgicas dos ésteres fenetílicos e prenílicos do ácido cafeico (Marcucci, 1995).

2.5 Microrganismos alvo

2.5.1 Staphylococcus aureus


Ë um dos mais importantes patógenos para o homem. Encontrada e nas
fossas nasais e vias respiratórias superiores de pessoas saudáveis, porem
pode provocar varias doenças, como uma simples infeção: espinhas, eczemas,
furúnculos e celulites, e infeções mais graves como pneumonia, meningite,
endocardite, síndrome do choque tóxico e septicemia e outras. Podem
sobreviver por meses em amostras clínicas secas, Ë um dos mais importantes
patógenos para o homem (HOLT et al., 1994).

2.5.2 Streptococcus pneumoniae


O Streptococcus pneumoniae, pertencente à família Streptococcaceae,
comumente encontrada na mucosa da nasofaringe e orofaringe de seres
humanos sadios. É o patógeno bacteriano mais comum em casos de otite
média aguda e pneumonia, e o segundo mais importante em casos de
meningite em crianças menores de 2 anos. Nos Estados Unidos e Europa, 25 a
40 % dos casos de meningite são causados por esse agente Considerando-se
a alta incidência, de cepas de pneumococo resistentes à penicilina, novas
drogas devem ser desenvolvidas (Haudorf WP et al., 2000).

18
2.5.3 Mycobacterium tuberculosis
O Mycobacterium tuberculosis ou bacilo de koch, é uma espécie de
bactéria patogênica na família Mycobacteriaceae é o agente causador da
maioria dos casos de tuberculose. A TB é uma das mais importantes causas de
morbidade e mortalidade no mundo atualmente. Do ponto de vista
epidemiológico, verifica-se que cerca de um terço da população mundial seja
portadora do Mycobacterium tuberculosis, agente etiológico da TB, capaz de
propiciar o desenvolvimento da doença no indivíduo infectado. Durante o curso
da doença ativa, os pacientes contaminam, em média, dez outros indivíduos,
perpetuando a cadeia de transmissão (Brasil, 2002).

2.5.4 Streptococcus pyogenes


O Grupo de bactérias Streptococcus é muito comum nas vias
respiratórias e na cavidade bucal. Esta dividido em 6 espécies, sendo a cepa
pyogenes a mais importante. É uma bactéria super-resistente, imune há muitos
antibióticos de hoje em dia. Esta associada a infecções, e casos de septicemia,
endocardite e osteomielite. Causa ainda doenças como: a Faringite
estreptocócica , Laringite estreptocócica, e complicações em erisipelas, febre
puerperal (pós-parto); febre reumática; glomerulone frite aguda (Brasil, 2002).

2.5.5 Haemophilus influenzae


O Haemophilus influenzae é uma bactéria que se apresenta como
bastonete pleomórfico, aeróbico, gram-negativo, classificada em 6 sorotipos (A, B,
C, D, E, F), pela diferença antigênica da cápsula polissacarídica. O Haemophilus
influenzae, se encontra nas vias respiratórias de forma saprófita, podendo causar
infecções assintomáticas ou doenças não-invasivas como otites, bronquite e
sinusites, tanto em crianças como em adultos (BRASIL, 2005).

19
3. METODOLOGIA

3.1 Preparo dos extratos alcoólicos (etanólico) e aquosos (base Agua), para
serem testados sua eficiência antimicrobiana, contra os microrganismos alvos.

O extrato alcoólico foi obtido com a amostra de 2 gramas da própolis triturada e


homogeneizada. As amostras foram transferidas para tubos de ensaio
(25x180mm). Em seguida, foram adicionados 25 ml de Álcool de cereais,
respectivamente, e feita a extração a 70 oC em banho de água termostatizada
por 30 minutos, sob agitação constante. Após a extração, as amostras foram
centrifugadas a 8.800 x g por 10 minutos a 20 oC. Os sobrenadantes obtidos
foram armazenados em tubos de ensaio (15x160mm) com tampa de rosca.

O extrato aquoso de própolis foi obtido como descrito por MATSUSHIGE et al.,
(1996). Em 2 gramas da própolis triturada e homogeneizada, foram
adicionados 25 ml de água deionizada, sendo a mistura incubada por 2 horas a
95 oC. Após a extração, a mistura foi centrifugada e armazenada nas mesmas
condições descritas anteriormente.

MISTURADOR
AUTOMÁTICO

Para a validação de estudos é muito importante a realização de ensaios do teor


de flavonoides totais e dos compostos fenólicos totais pois a eles é que são

20
atribuídas as propriedades inibitórias, bactericidas e bacteriostáticas ativas e
são os agentes ativos da própolis (Park et al, 1998c).

Local dos Ensaios: O experimento foi executado na Unicamp, Universidade


Estadual de Campinas no instituto de Biologia, Dep. Bioquímica, laboratório de
Microbiologia pela equipe do Pesquisador Marcelo Lancellotti, e na USP
Universidade de São Paulo pelo Instituto de Biociências, Dep. De genética e
biologia evolutiva pela equipe prof. Marcelo Sato.

Procedência das amostras: As amostras de própolis verde bruta, foram


doadas pela apicultora Leila Rodrigues Nunes de Formiga- MG. Os extratos de
própolis verde, foram fabricados no laboratório do Apiário Polenectar, SP.

3.2 Ensaios experimentais

3.2.1 Análise e ensaios nos extratos

Gráfico 01 – Análise de Flavonoides O gráfico 1 ao lado demonstra os teores


Extrato Alcoólico e Aquoso de flavonoides totais encontrados nas 6
amostras analisadas 3 de extratos
aquosos e 3 de extratos alcoólicos.
Todas as amostras estão dentro do
esperado, porem os extratos aquosos
obtiveram uma média ligeiramente maior
de flavonoides 1,74 gr /ml contra
FONTE: USP – Universidade de São Paulo
Instituto de Biociências- Campus Butantã. 1,51 gr/ml do extrato alcoólico.

Tabela 1: Apresenta os teores encontrados de flavonoides nas 6 amostras de


extratos de própolis analisadas (extrato aquoso em triplicata, e extrato alcoólico
em triplicata). Os teores encontrados variaram de 111,36 a 116,32 ± 0,13 mg
equivalente de quercetina por gr para flavonoides totais.

21
Tabela 1 Resultados das análises de Flavonoides totais Gráfico 02 - Análise de Flavonoides
e limites estabelecidos pelo Ministério da Agricultura Extratos Alcoólico e Aquoso
Extrato Alcoólico Extrato Aquoso ANÁLISE DAS AMOSTRAS EM TRIPLICATA
Teor de 1º Amostra: 1,52 1º Amostra: 1,73
Flavonoides 2º Amostra: 1,58 2º Amostra: 1,79
Totais em mg 3º Amostra: 1,43 3º Amostra: 1,70 EXTRATO EXTRATO
ALCOÓLICO AQUOSO
Requisito MAPA: Teor Flavonoides Mínimo 0,25
Média 1,51 1,74 AMOSTRAS AMOSTRAS
1 2 3 1 2 3
Desvio Padrão 0,0755 0, 0458
Variação 0,0057 0,0021
Valores expressos como equivalente de Quercetina, sobre extrato de própolis (m/m). E. Aquoso Média: 1,70 - E. Alcoólico Média: 1,43

Fonte: Elaborado a partir dos resultados dos ensaios do Teor de Flavonoides totais realizados nos Extratos de própolis pela USP – Universidade de
São Paulo Instituto de Biociências- Campus Butantã, foi determinado usando o método de Dowd adaptado (Arvouet-Grand et al., 1994).

Tabela 2: Apresenta os teores encontrados de compostos fenólicos totais das 6


amostras de própolis analisadas, que variaram de 520,00 a 544,20 ± 1,00 mg
equivalente de ácido gálico por grama para fenólicos totais e de 111,36.

Tabela 2 Resultados das análises de C.Fenólicos totais Gráfico 3 - Análise de Comp. Fenólicos
e limites estabelecidos pelo Ministério da Agricultura Extratos Alcoólico e Aquoso
Extrato Alcoólico Extrato Aquoso ANÁLISE DAS AMOSTRAS EM TRIPLICATA
Teor de
1º Amostra: 3,43 1º Amostra: 4,20
Compostos
2º Amostra: 3,61 2º Amostra: 4,81
Fenólicos Totais
3º Amostra: 3,39 3º Amostra: 4,33 EXTRATO
Requisito MAPA: Teor C. Fenólicos Mínimo 0,50 EXTRATO
AQUOSO
ALCOÓLICO
Média 3,47 4,44 AMOSTRAS AMOSTRAS
Desvio Padrão 0,1171 0,3213 1 2 3 1 2 3

Variação 0,0137 0,1032


Valores expressos como equivalente de acido gálico, sobre extrato de própolis (m/m) E. Aquoso Média: 4,44 - E. Alcoólico Média: 3,47

Fonte: Elaborado a partir dos resultados dos ensaios do Teor de Flavonoides totais realizados nos Extratos de própolis pela USP – Universidade de
São Paulo Instituto de Biociências- Campus Butantã, foi determinado usando o método de Dowd adaptado (Arvouet-Grand et al., 1994).

3.2.2 Análises de flavonóides totais dos extratos foram feitas por reação,
a partir da mistura de 0,5 mL do EEP, 4,3 mL de etanol 80%, 0,1 mL de nitrato
de alumínio 10% e 0,1 mL de acetato de potássio 1 mol/L. Após 40 min, a
absorbância foi medida em espectrofotômetro a 420 nm e o conteúdo de
flavonóides expresso em equivalente de quercetina (mg/gr) (Park et al, 1998 c).

3.2.3 Análises de compostos fenólicos totais dos extratos foram feitas de


acordo com o método espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau, utilizando ácido
gálico como padrão. A absorbância foi medida em espectrofotômetro (Uv Mini
1240) a 740 nm e os resultados expressos em equivalentes de ácido gálico
(mg/g). (Woisky et al., 1998).

22
3.3 Resultados dos Ensaios microbiológicos nos Microrganismos Alvo

3.3.1 Ensaios e Métodos Analíticos

Para se determinar a capacidade antimicrobiana frente as amostras de própolis


foi utilizado o método padrão recomendado pelo National Committee for Clinical
Laboratory Standards – NCCLS (2003), denominado difusão em disco. A
metodologia de todos os ensaios de atividade antimicrobiana foram realizados
conforme norma Metodologia dos Testes de Sensibilidade a Agentes
Antimicrobianos por Diluição (M7-A6, Vol. 23, n°2) da CLSI – Clinical and
laboratorial Standards Institute /ANVISA 2005, (NCCLS, 2003).

3.3.2 Métodos de ensaios e avaliação dos testes microbiológicos

Figura 05: Preparação dos Discos Para Ensaios Microbiológicos


Conforme norma da NCCLS M7-A6. Foram preparadas
meios de cultura em triplicata, com quatro diferentes
concentrações para cada um dos dois tipos de extratos
de própolis (base alcoólica e base aquosa), conforme a
norma. Foram realizados os ensaios nas seguintes
concentrações 1:1, 1:2, 1:3 e 1:4 e despois inoculadas
pelo processo de difusão em discos.

Fonte: USP Universidade de São Paulo Instituto de Biociências

Figura 06: Inoculação das bactérias nos meios de cultura


Discos de papel Whatman de 5 mm de diâmetro foram
impregnados com 1500 µg (sólidos solúveis totais) de
extratos de própolis, posteriormente liofilizados no
aparelho Freezer Dryer 4.5 por duas horas, o inócuo é
então espalhado, nas placas testes com o auxílio de
swab, (com 5 x 105 UFC/ml) dos 5 micro-organismos.

Fonte: USP Universidade de São Paulo Instituto de Biociências

23
Figura 07: Avaliação e Resultado das Placas de Ensaios Microbiológicos
Após a inoculação, os discos
foram incubados a 36°C e foi
determinada a MIC (Minimum
Concentration Inhibitory) de
cada extrato das 4
concentrações propostas. O
ensaio do extrato é realizado
frente aos 5 microrganismos
alvo observando a turvação ou
não do meio de cultura.

Fonte: USP Universidade de São Paulo Instituto de Biociências

Tabela 3 :Resultado dos Ensaios Microbiológicos – Extrato Alcoólico

Tabela 03 Resultado dos Ensaios Microbiológicos de Gráfico 04


Extrato Alcoólico Diluição e Inibição de Patógenos – Difusão de Disco Inibição Alcançada
Diluição Diluição Diluição Diluição Grau de Diluição
Microrganismo Alvo 1:1 1:2 1:4 1:8
1:1 1:2 1:4 1:8
Streptococcus Pneumoniae INIBE INIBE INIBE INIBE
Haemophilus Influenzae INIBE INIBE INIBE INIBE
Staphylococcus Aureus INIBE INIBE INIBE NÃO INIBE

Mycobaterium Turberculosis NÃO INIBE


INIBE INIBE INIBE
Streptococcus Pyogenes INIBE INIBE NÃO INIBE NÃO INIBE

Ensaios realizados conforme a norma: Metologia de Ensaios de Sensibilidade Por EXTRATO ALCOÓLICO
Diluição (M7-A6, Vol.23, No 2) da CLSI, ANVISA 2005 (Conforme NCCL, 2003). NÍVEL DE INIBIÇÃO

Fonte: Elaborado a partir dos resultados dos ensaios microbiológicos em difusão em discos
realizados pela USP – Universidade de São Paulo Instituto de Biociências- campus Butantã.

Tabela 4 : Resultado dos Ensaios Microbiológicos – Extrato Aquoso


Tabela 04 Resultado dos Ensaios Microbiológicos de Gráfico 05
Extrato Aquoso Diluição e Inibição de Patógenos – Difusão de Disco Inibição Alcançada
Diluição Diluição Diluição Diluição Grau de Diluição
Microrganismo Alvo 1:1 1:2 1:4 1:8
1:1 1:2 1:4 1:8
Streptococcus Pneumoniae INIBE INIBE INIBE INIBE
NÃO INIBE
Haemophilus Influenzae INIBE INIBE INIBE
Staphylococcus Aureus INIBE INIBE INIBE INIBE
Mycobaterium Turberculosis INIBE INIBE INIBE INIBE
Streptococcus Pyogenes INIBE INIBE INIBE NÃO INIBE

Ensaios realizados conforme a norma: Metologia de Ensaios de Sensibilidade EXTRATO AQUOSO


Por Diluição (M7-A6, Vol.23, No 2) da CLSI, ANVISA 2005 (Conforme NCCL, 2003). NÍVEL DE INIBIÇÃO

Fonte: Elaborado a partir dos resultados dos ensaios microbiológicos em difusão em discos
realizados pela USP – Universidade de São Paulo Instituto de Biociências- campus Butantã

24
3.4 Resultados e Discussões:

Foi comprovado o efeito antimicrobiano e antibiótico da própolis


verde, em todas as 5 bactérias patogênicas mais comuns do sistema
respiratório humano. Demostrando uma grande sensibilidade á própolis
tanto em forma de extratos Aquosos como em alcoólicos.

Extrato Alcoólico Diluição e Inibição Encontrada:


a) Quando diluído a 50% (1:1) Inibe todos os microrganismos avaliados
b) Quando diluído a 25% (1:2) Inibe todos os microrganismos avaliados
c) Quando diluído a 20% (1:4) Inibe todos exceto S.Pyogenes
d) Quando diluído a 11% (1:8) Inibe apenas S.Pyogenes e
Haemophilus Influenzae

Extrato Aquoso Diluição e Inibição Encontrada:


a) Quando diluído a 50% (1:1) Inibe todos os microrganismos avaliados.
b) Quando diluído a 25% (1:2) Inibe todos os microrganismos avaliados.
c) Quando diluído a 20% (1:4) Inibe todos os microrganismos avaliados.
d) Quando diluído a 11% (1:8) Inibe todos exceto o Haemophilus.
Influenzae e Streptococcus Pyogenes.

4. CONCLUSÕES:
Os extratos de própolis, alcoólico, a base de álcool de cereais e o aquoso (a
base de agua) foram agentes eficientes e conseguiram o seu proposito de inibir
os microrganismos alvo. Porem o extrato alcoólico foi mais efetivo que o
aquoso contra S. Pneumoniae e H. Influenzae enquanto que o extrato aquoso
foi mais efetivo contra S. Pneumoniae, S. Aureus e M. Tuberculosis.
Foi comprovado que poderá ser continuado este estudo, diluindo ainda mais
os extratos, nos casos em que a menor diluição feita no extrato ainda foi muito
efetiva e inibiu a totalmente a bactéria alvo. Iniciando os ensaios com diluições
1:10 nos extratos até ser encontrada a MIC (Minimum Concentration Inhibitory)
efetiva de cada extrato para todos os agentes patogênicos.

25
A própolis apresenta um grande potencial antimicrobiano no combate de
microrganismos patogênicos em especial as bactérias gram positivas e por se
tratar de um fitoterápico, e não deixar resíduos tóxicos a saúde , além de
não representar riscos para o meio ambiente, como os antimicrobianos
convencionais.

Comparando a eficiência antibiótica entre os dois extratos, de um modo geral o


extrato aquoso obteve um comportamento antibiótico mais efetivo. Sugerindo
que devido ao extrato aquoso possuir teores superiores tanto em compostos
fenólicos (> 27,95%) quanto em flavonoides (> 15,23%), e serem estes
elementos os responsáveis pelas propriedades antimicrobianas, com isto foi
confirmada também esta superioridade na inibição microbiana. Resultados
semelhantes foram encontrados e por GHISALBERTI, 1979; Marcucci 1995,
comprovando que as propriedades antimicrobianas e medicinais da própolis
estão relacionados com a quantidade de flavonoides e de compostos fenólicos.

Referente a propriedade de esterilização contida do álcool de cereais que é


utilizado como base no extrato alcoólico, ficou evidenciado que esta
propriedade contribui para potencializar o efeito bactericida do extrato alcoólico.
“em algumas bactérias”, como a Haemophilus Influenzae, o extrato alcoólico
foi mais eficiente que o Aquoso, mesmo tendo um teor de flavonoides e
compostos fenólicos inferiores ao extrato aquoso, contribuindo para uma
sinergia total para inibição de patógenos.

Os valores das análises encontrados nos extratos estão dentro dos


padrões encontrados por outros autores (Kalogeropoulos et al., 2009; Moreira
et al., 2008), Os extratos etanólicos de própolis devem conter, no mínimo,
0,25% de flavonoides e 0,50% de fenólicos (Brasil, 2001).

Como os extratos aquosos bem eficientes contra os microrganismos das vias


respiratórias e também possuem varias vantagens sobre os extratos
alcoólicos, como não possuir o forte cheiro do álcool, possuir maior facilidade

26
de absorção pelo organismo pois a base é agua, ph é mais neutro, podem ser
administrados para crianças, não interferirem no sistema digestivo, pode ser
utilizado na cura de doenças do Fígado, devem ser melhores estudados.

4.1 Considerações Finais - Segurança Alimentar

A própolis é um alimento natural carreador de múltiplas atividades


biológicas benéficas no tratamento e prevenção de doenças decorrente de seu
efeito antioxidante. Além do mais, poderá ser um ótimo substituto dos
antioxidantes artificiais usados na conservação de alimentos. Devido sua ação
antimicrobiana, a própolis é usada em cremes dentais, enxágue bucal bem
como em cosméticos. Todavia, profissionais da saúde devem ser cautelosos na
indicação do mesmo, pois a própolis pode sensibilizar o sistema imunológico.
Referencias:

AMOROS, M. et al. Comparison of the anti-herpes simplex virus activities of


propolis and 3-methyl-but-2-enyl caffeate. Journal of natural products, v. 57,
n. 5, p. 644-647, 1994.

ARVOUET-GRAND, A. et al. Standardization of a propolis extract and


identification of the main constituents. Journal de pharmacie de Belgique, v.
49, n. 6, p. 462-468, 1994.

As Dez Citações Mais Inspiradoras de Steve Jobs, artigo Think Different,


1997 [ Lomografhy Magazine, 29 out 2011, São Paulo, Brasil ] disponível: em:
http://www.lomography.com.br/ magazine/ 116452-10-most-inspiring-quotes-by-
steve-jobs

BOSIO, K. et al. In vitro activity of propolis against Streptococcus pyogenes.


Letters in applied microbiology, v. 31, n. 2, p. 174-177, 2000.

Brasil MINISTÉRIO DA SAÚDE (BR). Programa Nacional de Controle da


tuberculose. Manual técnico para controle da tuberculose. 6ª ed. Brasília (DF):
MS; 2002. Disponível em:
<http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes/manual_recomendacoes_controle_
tuberculose_brasil.pdf> Acesso em: 23 de ago. 2015.

27
BRASIL. Instrução Normativa n.3, de 19 de janeiro de 2001. Regulamentos
técnicos de identidade e qualidade de apitoxina, cera de abelha, geleia real,
geleia real liofilizada, pólen apícola, própolis e extrato de própolis. Diário Oficial
da União, Brasília, 23 de jan. de 2001. Seção 1, p. 18-23.

BRASIL. Meningites. Guia de vigilância epidemiológica. 6. ed. Brasília,


2005, p. 541-569. Disponível em: <http://bvsms.saude.gov.br/bvs/publicacoes
/Guia_Vig_Epid_novo2.pdf>. Acesso em: 24 de outubro de 2014.

Breyer, E. U. Abelhas e saúde. União da Vitória: Uniporto Gráfica e Editora


Ltda., 1980. 40 p.

BURDOCK, G. A. Review of the biological properties and toxicity of bee


propolis (propolis). Food and Chemical toxicology, v. 36, n. 4, p. 347-363,
1998.

CONTRERAS, A. et al. Mastitis in small ruminants. Small Ruminant Research,


v. 68, n. 1, p. 145-153, 2007.

FUNARI, CS.; FERRO, V.O. Análise de Própolis. Ciênc. Tecnol. Aliment, v


26(1), p 171-178, 2006.

Grange, J. M. e Davey, R. W. Antibacterial properties of propolis (bee glue).


Journal of the Royal Society of Medicine, v. 83 (3), p. 159-160, 1990.

GHISALBERTI, E. L. Propolis: a review. Bee world, v. 60, n. 2, p. 59-84, 1979.

HAUSDORFF, William P. et al. Which pneumococcal serogroups cause the


most invasive disease: implications for conjugate vaccine formulation and use,
part I. Clinical Infectious Diseases, v. 30, n. 1, p. 100-121, 2000.

Havsteen, B. Flavonoids, a class of natural products of high


pharmacological potency. Biochemical Pharmacology, v. 32, p. 1141-1148,
1983.

Havsteen, B. H. The biochemistry and medical significance of the


flavonoids. Pharmacology & Therapeutics, v. 96, p. 67-202, 2002.

HOLT, J.G.; KRIEG, N.R.; SNEATH, P.H.A.; STALEY, J.T.; WILLIAMS, S.T.
Facultatively anaerobic gram-negative roads. In: Bergey´s Manual of
determinative bacteriology. 9. ed., Baltimore: Williams & Wilkins, 1994. 787p

28
BANSKOTA, Arjun H. et al. Antiproliferative activity of the Netherlands propolis
and its active principles in cancer cell lines. Journal of ethnopharmacology, v.
80, n. 1, p. 67-73, 2002.

KALOGEROPOULOS, Nick et al. Chemical composition, antioxidant activity


and antimicrobial properties of propolis extracts from Greece and Cyprus. Food
Chemistry, v. 116, n. 2, p. 452-461, 2009.

KUJUMGIEV, A. et al. Antibacterial, antifungal and antiviral activity of propolis


of different geographic origin. Journal of ethnopharmacology, v. 64, n. 3, p.
235-240, 1999.

Marcucci, M. C. Propolis: chemical composition, biological properties and


therapeutic activity. Apidologie, v. 26, p. 83-99, 1995.

Marcucci, M. C. Propriedades biológicas e terapêuticas dos constituintes


químicos da própolis. Química Nova, v. 19 (5), p. 529-535, 1996.

MARCUCCI, Maria Cristina; WOISKY, Ricardo Gomide; SALATINO, Antonio.


Uso de cloreto de alumínio na quantificação de flavonóides em amostras de
própolis. Mensagem doce, v. 46, p. 3-8, 1998.

MARCUCCI, María Cristina et al. Phenolic compounds from Brazilian propolis


with pharmacological activities. Journal of ethnopharmacology, v. 74, n. 2, p.
105-112, 2001.

MATSUSHIGE, K.; BASNET, P.; HASE, K.; KADOTA, S.; TANAKA, K.;
NAMBA, T. Phytomedicine, v.3, p.139-145, 1996

MENEZES, H. Própolis: uma revisão dos recentes estudos de suas


propriedades farmacológicas. Arq. Inst. Biol, v. 72, n. 3, p. 405-411, 2005.

MOREIRA, Leandro et al. Antioxidant properties, total phenols and pollen


analysis of propolis samples from Portugal. Food and Chemical toxicology, v.
46, n. 11, p. 3482-3485, 2008.

NCCLS. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That
Grow Aerobically;Approved Standard—Sixth Edition. NCCLS document M7-A6
[ISBN 1-56238-486-4]. NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne,
Pennsylvania 19087-1898 USA, 2003.)

OLDONI, Tatiane Luiza Cadorin. Isolamento e identificação de compostos

29
com atividade antioxidante de uma nova variedade de própolis brasileira
produzida por abelhas da espécie Apis mellifera. 2007. Tese de Doutorado.
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz.

PARK, Yong K. et al. Antimicrobial activity of propolis on oral microorganisms.


Current microbiology, v. 36, n. 1, p. 24-28, 1998a.

PARK, Yong Kun et al. Estudo da preparação dos extratos de própolis e suas
aplicações. Food Science and Technology (Campinas), 1998b.

PARK, Yong Kun; IKEGAKI, Masaharu. Preparation of water and ethanolic


extracts of propolis and evaluation of the preparations. Bioscience,
biotechnology, and biochemistry, v. 62, n. 11, p. 2230-2232, 1998c.

PARK, Yong Kun et al. Própolis produzida no sul do Brasil, Argentina e


Uruguai: Evidências fitoquímicas de sua origem vegetal. Ciência rural, v. 32, n.
6, p. 997-1003, 2002.

Paulino, N. Disponível em: <http://www.prodapys.com.br/br/pdp_pesq_51.htm>


Acesso em: 22 out. 2004.

Peterson, J. e Dwyer, J. Flavonoids: dietary occurrence and biochemical


activity. Nutrition Research, v. 18 (12), p. 1995-2018, 1998.

PRADO FILHO, L.G.; AZEVEDO, J.L.; FLECHTMANN, C.H. Antimicrobianos


em própolis de Apis mellifera l. Boletim da Indústria Animal, v.20, p.399-403,
1962.

STALIKAS, C. D. Extraction, separation, and detection methods for phenolic


acids and flavonoids. Journal of Separation Science, Eaton, v. 30, p. 3268-
3295, 2007.

WOISKY, R. G.; SALATINO, A. Analysis of propolis: some parameters and


procedures for chemical quality control. Journal of apicultural research, 1998.

30