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Introdução
Este relatório foi elaborado no seguimento da visita da turma B do 11º ano e da
professora de Biologia e Geologia, Alexandra Esteves, ao Laboratório Aberto, no Porto, com
vista à realização da atividade “Herança genética”.
À chegada a turma foi recebida numa sala de reuniões, onde foi feita uma introdução
teórica sobre algumas das técnicas utilizadas em biologia molecular, as quais seriam postas
em prática durante a atividade laboratorial. A hereditariedade é um processo biológico que
se caracteriza pela transmissão de informações genéticas de geração em geração. Através
da realização de um teste genético de transmissão das características hereditárias
(autossómicas), os alunos puderam identificar a presença ou ausência da sequência Alu no
locus PV92 do cromossoma 16, com recurso à técnica de PCR (onde se obtêm biliões de
cópias do fragmento de DNA em causa) e de eletroforese. Numa tina de eletroforese, com
gel de agarose, os fragmentos obtidos para cada amostra foram postos a correr e
compararam-se os resultados com os do DNA dos 3 controlos (homozigótico -, homozigótico
+ e heterozigótico).
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Fundamentação teórica
As células são unidades estruturais e funcionais dos organismos e ao utilizarem o seu
programa genético, produzem moléculas específicas, que permitem
o crescimento e a renovação celulares.
O programa genético está presente no DNA, molécula que
coordena toda a atividade celular.
O DNA é o material genético de todos os seres vivos, excetuando
alguns vírus constituídos por RNA. Como material hereditário, o
DNA possui três características fundamentais:
1. É reproduzido com alta precisão (replicação), para que haja uma
conservação das espécies
2. É capaz de sofrer alterações (recombinação e mutação), para
que as espécies possam evoluir
3. Contem informação para a formação de proteínas, que são –
suporte estrutural e funcional de uma célula.
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O dogma central da genética molecular, sugerido em meados dos anos 50 por
Francis Crick, propõe que a informação contida no DNA é utilizada para sintetizar
moléculas de RNA, através de um processo conhecido por transcrição, e que a
informação de parte do RNA é usada para a síntese de proteínas, por um processo
chamado tradução e nos seres eucariontes, a regulação da expressão dos genes
pode ocorrer durante várias fases:
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A descoberta de como ocorre a transmissão das
caraterísticas inscritas nos genes deve-se a Gregor
Mendel, e às suas experiências com ervilheiras.
Como os cromossomas formam pares, em que o
cromossoma de origem materna e o cromossoma de
origem paterna são idênticos (cromossomas
homólogos), e como em cada cromossoma existe
uma molécula de DNA, podemos dizer que existem
normalmente 2 genes, um em cada cromossoma,
responsáveis pelo aparecimento de uma determinada
caraterística.
Atualmente sabe-se que cada caraterística depende da constituição de dois genes,
um de cada cromossoma homólogo, que podem ser iguais ou diferentes para a
característica. Ao conjunto destes dois genes chama-se genótipo. À caraterística
que se observa no indivíduo, como resultado do genótipo, chama-se fenótipo. O
nosso fenótipo não é totalmente dependente do nosso genótipo. Por sua vez,
ao gene que se manifesta no fenótipo do indivíduo chamamos gene dominante e
àquele que não se manifesta chamamos gene recessivo.
Em alguns casos existe correspondência entre o genótipo e o fenótipo expresso,
quer dizer que os genes relativos ao fenótipo se expressaram a 100%, mas na maioria
dos casos, não existe esta correspondência total de expressividade de um gene. Esta
expressividade pode ser influenciada por diversos fatores, exógenos, por exemplo o
ambiente influencia a cor da pele, e endógenos, por exemplo as hormonas, ou a
existência de genes letais ou supressores.
Um teste genético é uma análise a parte do
DNA, que pode ajudar a determinar se existe
uma alteração num determinado gene ou
cromossoma. Essa alteração (geralmente
chamada mutação) pode afetar todas as
células do organismo e ser transmissível às
gerações futuras. É habitualmente uma análise
de sangue ou outro tecido.
A herança genética é o processo pelo qual
um organismo ou célula adquire ou torna-se predisposto a adquirir caraterísticas
semelhantes à do organismo ou da célula que o gerou, através de informações
codificadas (código genético) que são transmitidas à descendência, mas nunca
iguais: cada gâmeta tem informação genética um pouco diferente da célula que o
gerou, graças a processos de recombinação genética durante a sua formação
(meiose); e no processo de fecundação, quando os dois gâmetas (masculino e
feminino) se unem aleatoriamente, consequentemente, metade das informações
genéticas de cada progenitor se unem para formar o genoma da célula embrionária
resultante.
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Assim, esta célula embrionária resultante contém informações genéticas
maternas e paternas. A formação do embrião dá-se por subdivisões celulares
sucessivas a partir dessa primeira célula. Na divisão celular, as informações
genéticas são replicadas. Assim, cada nova célula do indivíduo possui a mesma
informação genética presente na primeira célula zigótica.
Aos pares de genes que se encontram no
mesmo lócus nos cromossomas homólogos
chamamos alelos (Por exemplo, se tivermos
dois livros do mesmo autor e com o mesmo
título, porém de edições diferentes, iremos
supor que os livros tratam do mesmo assunto,
mas têm informações ligeiramente diferentes e
que, por analogia, a página em que estamos é
um gene. Abrindo a página 100 dos dois livros,
verifica-se que existe uma diferença entre as
duas páginas. Essas páginas que tratam da mesma informação são os alelos). Há
uns que são dominantes e outros recessivos. Individuos homozigóticos possuem
alelos iguais e estes podem ser: dominantes ou recessivos (as caraterististicas
recessivas só se manifestam quando os dois alelos tiverem a mesma informação), e
quando têm informação diferente são antogónios e os índividuos são
heterozigóticos.
A estrutura química do DNA de todos é a mesma. A única diferença entre
as pessoas (ou qualquer animal) é a ordem dos pares de bases. Há tantos
milhões de pares de bases no DNA de cada pessoa que cada pessoa tem uma
seqüência diferente. Usando estas sequências, cada pessoa pode ser identificada
unicamente pela sua sequência de pares de bases. No entanto, porque há tantos
milhões de pares de bases, a tarefa seria muito demorada. Em vez disso, os
cientistas são capazes de usar um método mais rápido, por causa da repetição de
padrões de DNA. A reação em cadeia da polimerase (PCR), desenvolvida por
Kary Mullis, é uma técnica rotineira de laboratório usada para fazer muitas cópias
(milhões ou bilhões) de uma região específica do DNA, em poucas horas e in vitro.
Essa região do DNA pode ser qualquer, dependendo do local que iria ser objeto de
interesse do pesquisador.
Nesta técnica, a obtenção dos fragmentos de DNA que se pretende usar para
criar novas moléculas, baseia-se no uso de enzimas de restrição, que fazem cortes
específicos e com precisão no material genético. O nome destas está associado à
especificidade da sequência de DNA que reconhecem bem. O exemplo que
estudamos é a sequência inserida no local PV92 no cromossoma 16, a
inserção Alu, que se chama assim pois a endonuclease de restrição Alu1
reconhece um local específico nesta sequência, sendo, em específico, um caso em
que não há propriamente uma manifestação fenotípica, mas que tem algumas
caraterísticas especiais e que nos interessam.
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Ao longo dos séculos, foram surgindo mutações nestas sequências,
acumulando-se, porque como se encontram na zona dos intrões (zonas que não
sofrem pressão seletiva, ocorrendo coisas interessantes, como por exemplo
repetições) estas mutações não têm qualquer implicação no funcionamento da
célula, levando a que a célula não as corrija; as mutações nos exões são mais
importantes sendo preciso evitá-las para que não ocorram graves complicações,
sendo por isso que os estudos populacionais não são realizados nestas zonas.
Este elemento Alu está presente em alguns indivíduos e outros não. Algumas
pessoas têm em ambos os cromossomas homólogos, ou não, a sequência em
causa. Os primers neste kit foram projetados para amplificar uma sequência dentro
da região PV92, se o intrão não contivesse a inserção Alu, com 641 pares de bases,
ou 941 pares de base se a sequência Alu estivesse presente.
Este aumento no tamanho é devido à sequência de 300 pares de bases da
inserção Alu. Quando os seus produtos de PCR são analisados por
eletroforese em gel de agarose, três distintos resultados são possíveis.
A Eletroforese em gel de agarose é uma técnica usada para separar
fragmentos de DNA (ou outras macromoléculas, como o RNA e proteínas) com
base no tamanho e carga. A eletroforese envolve a passagem de uma corrente
através de um gel contendo as moléculas de interesse. Em função de seu tamanho
e carga, as moléculas vão se mover através do gel em diferentes direções ou em
diferentes velocidades, o que permite que sejam separadas umas das outras
Se ambos os alelos contiverem inserções Alu, cada produto amplificado de PCR
terá 941 pares de bases, e eles irão migrar para uma banda que corresponde a
941 pares de bases.
Se nenhum alelo contiver o elemento Alu, cada produto amplificado de PCR terá
641 pares de bases e eles irão migrar para uma banda que corresponde a 641
pares de bases.
Se houver uma inserção Alu num alelo, mas não no outro, haverá um produto de
PCR de 641 pares de bases e um de 941 pares de bases. O gel vai revelar duas
bandas para tal amostra.
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Procedimento
Etapa 1: Extração de ADN a partir de células de esfregaço bucal (nota: a extração de
ADN das células de esfregaço bucal não foi realizada pelos alunos, estando esta
extração já realizada)
1. Rotulou-se o número adequado de microtubos necessários para as amostras a analisar;
2. Adicionou-se 500µl de solução “QuickExtract DNA Extraction Solution 1.0” a cada tubo;
3. Cortou-se uma pequena porção da ponta da zaragatoa para um microtubo;
4. Fechou-se o tubo e agitou-se-o no vortex (equipamento utilizado para a agitação e
homogeneização de líquidos contidos em pequenos tubos ou frascos) durante 10 segundos;
5. Incubou-se o tubo a 65ºC durante 1 minuto;
6. Voltou-se a agitar no vortex por 15 segundos;
7. Incubou-se o tubo a 98ºC durante 2 minutos;
8. Voltou-se a agitar no vortex por 15 segundos;
9. O ADN estava pronto para ser utilizado. Manteve-se a 4ºC (ou a -20ºC para
armazenamento mais adequado).
Etapa 2: Amplificação do ADN – PCR
1. No microtubo de PCR já se encontravam 5µl de primers;
2. Adicionou-se a cada microtubo 15 µl de MasterMix PCR (utilizou-se sempre uma ponta
nova);
3. Colocou-se os microtubos de PCR no termociclador (o programa de amplificação já se
encontrava inserido), (nota: o ciclo de uma reação de PCR é referido na página 4).
4. Transferiu-se 20µl de ADN (Controlos ou Amostras) para cada microtubo de PCR (utilizou-
se sempre uma ponta nova);
Etapa 3: Eletroforese e observação dos resultados
1. No gel de agarose (1%), que
se encontrava na tina de
eletroforese, carregaram-se as
amostras pela seguinte ordem:
(nota: o gel de agarose utilizado
não foi o feito pela presença dos
alunos);
2. Fechou-se a tina de
eletroforese e ligou-se a fonte de alimentação;
3. Programou-se a fonte para 100V durante 40 minutos;
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5. Os resultados foram observados e interpretados (nota: os resultados observados e
interpretados não foram realizados pelos os alunos, já se encontravam realizados, pois o
tempo de espera seria grande).
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1. Desnaturação (96°C): Aquece fortemente
a reação para separar as fitas de DNA.
Isso proporciona um molde de fita simples
para a próxima etapa.
Ciclo do PCR
Quando uma solução sofre eletrólise, as moléculas de água vão ficar agitadas,
separando-se em oxigénio e hidrógenios, isto irá provocar um desequilíbrio no DNA e não
queremos que isso aconteça porque irá fazer com que o DNA fique desfragmentado. Para
o impedir, a solução tem de ter os três componentes: - se o desiquilibrio for ácido está lá a
base para compensar, se o desequilibrio for básico está lá o ácido para compensar e se
faltar de um lado ou do outro está lá uma carga neutra que é o sal, levando ao equilíbrio.
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De seguida, quando a corrente elétrica foi aplicada, os
fragmentos de DNA avançaram pelo gel do polo negativo
para o polo positivo tendo os fragmentos menores
atravessado o gel mais rapidamente do que os maiores.
Após a revelação do gel foi possível observar três perfis
genéticos diferentes.
movimento
Direção do
se dizer que é heterozigótico possuindo um alelo
com 647 pares de bases, e o outro com 947. Polo negativo
Conclusão
Esta atividade permitiu estabelecer a ponte entre a teoria e a prática, na medida em que
foi possível aplicar os nossos conhecimentos adquiridos no âmbito da disciplina de Biologia e
Geologia. Nesta área de grande importância para o Homem que é a biologia molecular,
ficamos a saber um pouco mais da sua grande complexidade.
Tivemos alguma pena pelos nossos conhecimentos serem ainda muito limitados, porque não
pudemos participar ao nível experimental tanto como pretendíamos embora tenhamos
manipulado e feito coisas que noutro lado não teríamos oportunidade de realizar. Por tudo
isto, só tenho a agradecer a oportunidade, a simpatia e o conhecimento que nos foi transmitido
durante esta visita, cujo objetivo principal (aplicação prática de alguns conceitos estudados
em Biologia) foi cumprido.
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Bibliografia e Webgrafia
CARRAJOLA, Cristina; CASTRO, Maria; HILÁRIO, Teresa – Planeta com Vida 11; Santillana
Editores
http://engeneticaonline.blogspot.pt/2010/01/engenharia-genetica-principios-basicos.html
http://www.colegiovascodagama.pt/ciencias3c/onze/biologiaunidade5dna.html
https://pt.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-technology/dna-sequencing-pcr-
electrophoresis/a/polymerase-chain-reaction-pcr
https://pt.wikipedia.org/wiki/Eletroforese_em_gel
http://hereditas.com/dna-saiba-mais/identificacao-individual-pelo-dna/
https://www.portaldafamilia.org/artigos/artigo103.shtml
https://pt.wikipedia.org/wiki/Introdu%C3%A7%C3%A3o_%C3%A0_gen%C3%A9tica
http://www.labtestsonline.org.br/understanding/features/genetics?start=2
https://www.dnalc.org/resources/animations/pcr.html
https://www.dnalc.org/resources/animations/gelelectrophoresis.html
https://pt.wikipedia.org/wiki/Usu%C3%A1rio:Yleite/DNA_n%C3%A3o-codificante
http://home.dbio.uevora.pt/~oliveira/Bio/Manual/43.htm
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